nghiên cứu bệnh do potyvirus gây ra trên cây hoa trồng bằng củ tại hà nội

Chỉ trình 4.16 Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên cây hoa loa kèn 4.17 Thí nghiệm ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích 4.18 So sánh triệu chứng ở cây ñược xử lý chấ

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Mã số: 60.62.10

Người hướng dẫn khoa học: TS HÀ VIẾT CƯỜNG

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan!

Bản luận văn tốt nghiệp này ñược hoàn thành bằng sự nhận thức chính xác của bản thân

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa ñược sử dụng và công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cám ơn sự hướng dẫn tận tình, với tinh thần trách nhiệm cao của Tiến sĩ Hà Viết Cường, Giáo viên bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Trân trọng cám ơn các Giảng viên bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học; các cán bộ công nhân viên của Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ về mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho quá trình ñiều tra, tiến hành các thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình ñến tất cả các bạn bè, người thân và gia ñình ñã luôn ñộng viên và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Thu

4.1.2 ðiều tra tình hình bệnh virus trên hoa trồng bằng củ vụ ñông

DANH MỤC BẢNG BIỂU

4.1 Triệu chứng chính của 3 bệnh giống bị nhiễm virus trên 3 cây

4.11 So sánh trình tự gen CP của mẫu virus dòng LKð-1-3 với các

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Hình thái virion của potyvirus (http://viralzone.expasy.org/) 5

4.4 RT-PCR phát hiện potyvirrus trên loa kèn trắng và loa kèn ñỏ

4.6 Phát hiện LMoV bằng RT-PCR trên các mẫu loa kèn trắng và loa

4.11 Kiểm tra sản phẩm miniprep bằng cắt kép với BamHI và ECoRI

M là thang DNA (GeneRuler 1 kp, Fermentas) với các băng tham

4.12 Trình tự sản phẩm RT-PCR và minh họa một phần ñồ thị trình tự 53

4.13 Trình tự amino acid của protein CP của 3 mẫu virus và motif

4.15 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen CP của các potyvirus Chỉ trình

4.16 Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên cây hoa loa kèn

4.17 Thí nghiệm ñánh giá hiệu lực phòng trừ LMoV của chất kích

4.18 So sánh triệu chứng ở cây ñược xử lý chất kích kháng Salicylic

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Hoa ñóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm vừa mang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế Hiện nay ở nước ta, trong chương trình chuyển dịch cơ cấu cây trồng, cây hoa lại càng ñược quan tâm Hàng năm có nhiều giống hoa ñược lai tạo và nhập nội, nhiều tiến bộ kỹ thuật mới ñược nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên diện tích trồng hoa ngày càng ñược nâng cao

Hoa ñược trồng lâu ñời và tập trung một số vùng trồng hoa truyền thống như Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), ðằng Hải, ðằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn (Thanh hoá), Gò Vấp, Hóc Môn (TP Hồ Chí Minh) với tổng diện tích trồng khoảng 3500 ha

Trong các loại hoa tươi ñược tiêu thụ ở Việt Nam thì hoa ly, lily trắng, lay ơn là những loại hoa trồng bằng củ ñược ưa chuộng nhất ðây có thể ñược coi là những loài hoa cao cấp không chỉ bởi vẻ ñẹp, sự sang trọng mà còn bởi chi phí ñầu tư cho sản xuất cũng như chăm sóc vô cùng tốn kém Chủng loại của chúng ngày càng ña dạng và phong phú theo thị hiếu của người tiêu dùng Ngày nay, việc sản xuất hoa trồng bằng củ chịu nhiều thiệt hại ñáng kể do

virus gây ra Hầu hết các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus - chi lớn nhất trong sáu chi của họ Potyviridae Bệnh do Potyvirus gây thiệt hại nghiêm

trọng ñến thẩm mỹ và kinh tế cho nhà trồng hoa Chi virus này xuất hiện phổ biến ở các nước nhiệt ñới và cận nhiệt ñới như Việt Nam Virus có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau ở cây ký chủ như khảm, ñốm, sáng gân, lùn cây, héo, còi cọc…

Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về Potyvirus trên

cây hoa trồng bằng củ Vì vậy, ñể có thể góp phần cung cấp thêm thông tin về loài virus này ñể từ ñó có biện pháp phòng trừ hợp lý, ñạt hiệu quả cao, dưới

sự hướng dẫn của TS Hà Viết Cường, bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học

chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu bệnh do Potyvirus gây

ra trên cây hoa trồng bằng củ tại Hà Nội”

1.2 Mục ñích - Yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Tìm hiểm khả năng phòng trừ bệnh khảm lá hoa loa kèn trăng

(Lily mottle virus, LMoV) bằng chất kích kháng

1.2.2 Yêu cầu

trắng, hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly) tại Hà Nội

hoa loa kèn ñỏ, hoa Ly

kèn trắng, cây hoa loa kèn ñỏ

Nhân dòng và giải trình tự mẫu loa kèn ñỏ phản ứng RT-PCR

dương tính

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây hoa ñược trồng bằng củ

Cây hoa trồng bằng củ thuộc hơn 800 chi khác nhau, rất ña dạng về

hình thái, có thể thuộc nhiều họ thực vật khác nhau như: Liliaceae (white lily, easter lily, tulip, hoa hiên), Iridaceae (lay ơn, diên vĩ, nghệ tây - Crocus spp.),

Agavaceae (hoa huệ, thùa), Amaryllidaceae (loa kèn ñỏ, thủy tiên, náng, ngọc

trâm), Asteraceae (thược dược), Cannaceae (chuối hoa)…

Cây hoa trồng bằng củ ñược ñánh giá là loài hoa sang trọng, có giá trị thẩm mỹ cao nên ñược nhiều người tiêu dùng ưa chuộng Cây hoa trồng bằng

củ có ñóng góp ñáng kể cho ngành công nghiệp trang trí toàn cầu, ñược sử dụng ñể sản xuất thương mại hoa và củ Các cây hoa có thể ñược dùng làm hoa cắm lọ trong gia ñình, văn phòng, ñược sử dụng nhiều trong các ngày lễ tết, trang trí hội trường, làm quà tặng,… Ngoài giá trị thưởng thức, nhiều loài còn có tác dụng chữa bệnh Chẳng hạn như, hoa hiên có vị ngọt, tính mát, thường dùng làm thuốc lợi tiểu, giảm ñau, chữa sốt, thân thể bị vàng, tiểu tiện khó khăn, lỵ, chảy máu cam, sưng ñau khớp xương, nôn ra máu…(Võ Văn Chi, 1999)

Trên thế giới, giá trị của ngành công nghiệp sản xuất hoa ước tính trên

1 tỷ ñô la, và loài phổ biến là tulip và lily Việc nhập khẩu và sử dụng hoa trồng bằng củ ñóng một vị trí ñáng kể trong sản xuất hoa cắt toàn cầu Hà Lan, nước ñứng ñầu thế giới về sản xuất củ hoa, năm 2005 ñã ñạt 29.491 ñôla Mỹ/ha, giá trị xuất khẩu là 34.048 ñô la/ha Tổng giá trị xuất khẩu năm 2005 ñạt 756 tỷ ñô la/ha, tron khi tổng giá trị xuất khẩu có các nước liên minh Châu

Âu ñạt trên 837 tỷ ñô la

Có ít nhất là 15 quốc gia sản xuất củ tulip, vùng sản xuất lớn nhất là Hà

lan với 10 800 ha (chiếm 88 % diện tắch toàn thế giới) Củ tulip cũng ựược sản xuất ở Nhật bản (300 ha), Pháp (293 ha), đức (155 ha), New Zealand (122 ha)

Trong các nước sản xuất củ Lily, vùng lớn nhất là Hà Lan với 4 280 ha chiếm 77%, tiếp ựó là Pháp (401 ha), Chi Lê (205 ha), Mỹ (200 ha), Nhật Bản (189 ha) và New Zealand (110 ha) (Benschop , 2010)

Tại Việt Nam hiện có nhiều vùng trồng hoa như: đà Lạt (Lâm đồng),

Mê Linh (Vĩnh Phúc), Tây Tựu, đằng Hải (Hải Phòng), Sapa (Lào Cai) đà Lạt là nơi hiện ựang có diện tắch trồng Lily nhiều nhất so với các ựịa phương khác trên cả nước (chiếm khoảng 8% trong tổng diện tắch trồng hoa), còn ở

Hà Nội, Hải Phòng chỉ mới trồng mang tắnh chất thử nghiệm Tình hình phát triển hoa Lily ở đà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu ựãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa Lily nói riêng, một phần

do kỹ thuật trồng Lily của đà Lạt tương ựối cao nên hoa sinh trưởng phát

triển khá tốt Lily, trong ựó hoa loa kèn (Lilium longiforum var Rairan) là

giống hoa mới có nguồn gốc tại Hà Lan Hiện nay cây hoa loa kèn trồng khá phổ biến ở Việt Nam đây là giống loa kèn cho hoa to, màu trắng, có mùi thơm dịu, thắch hợp với các ựiều kiện ựất ựai, khắ hậu thời tiết ở các tỉnh phắa Bắc nước ta, ựặc biệt là vùng ựồng bằng sông Hồng Thời gian từ trồng ựến thu hoạch ngắn, chỉ từ 80 ựến 90 ngày tùy theo từng thời vụ Giống ưa cường

ựộ ánh sáng trung bình; có khả năng chịu nóng khá, ưa khắ hậu lạnh và ẩm, nhiệt ựộ thắch hợp ban ngày 20-28oC, ban ựêm 13-17oC (có khả năng chịu ựược tới 32-35oC)

2.2 Potyvirus

2.2.1 Giới thiệu

Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng 200 loài Như vậy, cùng với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyvirus là chi

virus thực vật lớn nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật

Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cây có ý nghĩa kinh tế Ví dụ:

• Papaya ringspot virus (PRSV) là bệnh virus số 1 hại ñu ñủ và bầu bí

virus quan trọng thứ 2 trên cây rau

• Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác

ñào, táo, lê, mận

Phần lớn virus trong họ có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số ít lại có phổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm

2.2.2 ðặc ñiểm phân tử virus (virion)

 Phân tử potyvirus có hình sợi mềm, kích thước 11-15 x 650-950 nm (Dougherty, 1988) Mỗi phân tử virion ñược cấu tạo từ 1700-2000 tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn ñối xứng xung quanh phân tử RNA genome

(Shukla et al., 1998)

Hình 2.1: Hình thái virion của potyvirus (http://viralzone.expasy.org/) Acid nucleic: Tất cả các potyvirus có chứa 1 phân tử RNA genome sợi ñơn,

cực (+), kích thước khoảng 10 kb (Shukla et al., 1998) Tổ chức bộ gen của

các potyvirus giống nhau, tính từ trái sang phải là:

 Một khung ñọc mã ORF (open reading frame) ñơn, lớn gọi là

ORF chính (major ORF)

(Hari, et al., 1979; Takahashi, et al., 1997)

Hình 2.2: Tổ chức bộ gien và chiến lược dịch mã của potyvirus

(http://viralzone.expasy.org/)

 Protein:

protein P1, protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro), protein P3, protein 6K1, protein thể vùi tế bào chất (CI), protein 6K2, protein VPg (viral

protein genome-linked, Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Riechmann et al., 1989; Murphy et al., 1990), protein NIa-pro (major protease of small nuclear

inclusion protein - NIa), protein NIb (large nuclear inclusion protein) và

protein vỏ (coat protein, CP) (Shukla et al., 1998) Protein VPg gắn vào đầu

5’ của RNA genome

 Thể vùi: các potyvirus thường tạo các thể vùi đặc trưng

 Tất cả các potyvirus đều hình thành thể vùi trong tế bào chất hình trụ

inclusions, CI), cĩ hình dạng đặc trưng (hình vịng bánh xe, hình phiến,…) cho potyvirus và do đĩ cĩ giá trị chẩn đốn

 Một số virus lại hình thành thể vùi trong nhân gọi là thể vùi nhân

(nuclear inclusion, NI) Thể vùi nhân ñược cấu tạo bởi 2 protein là NIa và NIb Một số virus cũng hình thành thể vùi trong nhân nhưng hình dạng thể vùi không xác ñịnh gọi là thể vùi vô ñịnh hình (amorphor inclusion, AI) ñược cấu tạo bởi protein HC-Pro

2.2.3 Chức năng các protein

P1

 P1 là 1 proteinase P1 là vùng biến ñộng nhất của bộ gen P1 có hoạt

tính proteinase và sẽ tự cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã ñể giải phóng P1

 P1 tương tác với RNA P1 có khả năng liên kết với RNA của virus,

do vậy nó có vai trò trong quá trình vận chuyển virus

 P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông

qua cơ chế câm gen)

HC-Pro

 HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector Vai trò này của

protein HC-Pro ñược thể hiện qua cơ chế bắc cầu HC-Pro ñóng vai trò là một phân tử cầu nối, trong ñó phần ñầu N của nó (thông qua motif bảo thủ cao KITC) sẽ liên kết với receptor ở bề mặt phía trong của vòi aphid, còn phần trung tâm của nó (thông qua motif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ của virion Nhờ cầu nối này mà phân tử virus ñược giữ lại ở phần vector

 HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế

bào HC-Pro là một protein vận chuyển (MP) của potyvirus HC-Pro làm tăng

kích thước giới hạn (size exclusion limit, SEL) của sợi liên bào và do ñó cho phép RNA của virus có thể di chuyển giữa các tế bào

 HC-Pro có hoạt tính proteinase ðầu C của HC-Pro có hoạt tính

proteinase, cho phép nó tự cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3

 HC-Pro cần cho sự tái bản (thông qua motif IGN)

 HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào ðây là một chức

năng quan trọng của potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây

P3

P3 cũng là vùng biến ñộng và ít ñược nghiên cứu chức năng P3 ñược biết là quy ñịnh tính gây bệnh của virus thông qua tương tác với các protein khác của virus

CI

 CI là thành phần chính của phức hợp tái bản virus CI có hoạt tính

helicase, hoạt tính liên kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP Tất cả các hoạt tính này ñều cần thiết cho CI tháo xoắn cấu trúc trung gian sợi kép của RNA virus trong quá trình tái bản

 CI cần cho sự di chuyển của virus giữa các tế bào Quá trình di

chuyển giữa các tế bào yêu cầu năng lượng Do CI có hoạt tính ATPase nên

nó ñảm nhận vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển virus qua các tế bào Ngoài ra, CI tương tác trực tiếp với plasmodesmata và phức hợp ribonucleoprotein của virus ñể tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển

6K1 và 6K2

 6K2 là một protein mỏ neo giúp liên kết bộ máy tái bản của virus vào mạng lưới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái bản

VPg

vì ngoài protein CP, nó có mặt trong phân tử virus VPg liên kết vào ñầu 5’ của RNA virus và bảo vệ phân tử RNA khỏi bị phân hủy

 VPg cần cho quá trình tái bản bộ gen virus, di chuyển hệ thống của

virus trong cây

 VPg tương tác với yếu tố khởi ñầu dịch mã của tế bào như eIF4E và

eIF(iso)4E, do ñó cho phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi

tháo vỏ ñể thực hiện quá trình dịch mã Cần chú ý là potyvirus có bộ gen RNA sợi ñơn cực (+), phân tử RNA genome của virus không ñược mũ hóa nên quá trình dịch mã ORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã ñộc lập

mũ CAP

 VPg là một protein Avr cho potyvirus Nhiều gen kháng của thực vật ñối với potyvirus ñã ñực chứng minh là các gen lặn, ví dụ như pvr1 (ớt), mo1 (rau diếp), sbm1 (ñậu) và rym4/5 (lúa miến) Các gen này thực chất mã hóa

yếu tố khởi ñầu dịch mã eIF4E Khi các gen này (ở trạng thái ñồng hợp tử), mang các ñột biến phá vỡ tươnng tác VPg - eIF4E ñã dẫn tới kiểu hình kháng

NIa-Pro

NIa-Pro là phần ñầu C của protein NIa Nó là một protease chính của virus ðầu C của NIa-Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP ñể giải phóng ra các protein chức năng ñơn lẻ

Nib

NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp) ðây là một chức

năng quan trọng cho phép bộ gen virus ñược tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và ngược lại

CP

chia làm 3 phần (ñầu N, trung tâm và ñầu C) ðầu N là phần nhô lên bề mặt phân tử, khá biến ñộng về trình tự và chứa các epitope ñặc hiệu cho virus ở mức loài và mức chủng Phần trung tâm và ñầu C bảo thủ hơn và mức biến ñộng của 2 phần này tương ñương mức biến ñộng chung trên toàn bộ bộ gen Chính vì vậy, CP, ñặc biệt phần ñầu C và trung tâm hay ñược sử dụng trong ñánh giá ña dạng virus

 CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector ðầu N của CP

chứa 1 motif bảo thủ cao (DAG) Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên kết với HC-Pro theo lý thuyết bắc cầu ñể lan truyền qua vector rệp muội

 CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển

giữa các tế bào CP cùng với HC-Pro là 2 protein vận chuyển (MP) của

potyvirus Cả 2 protein này ñều làm tăng kích thước giới hạn (SEL) của lỗ liên bào và do ñó cho phép virus di chuyển giữa các tế bào

 CP là một protein cấu trúc tạo virion

 CP ñiều khiển quá trình tái bản RNA virus

2.2.4 Lan truyền

 Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững

 Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây; OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - ñậu ñỗ), qua phấn hoa (BCMV - ñậu ñỗ)

 Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học

2.3 Các phương pháp cơ bản dùng trong xác ñịnh virus

2.3.1 Chiết tách acid nucleic tổng số

Hiện nay có rất nhiều quy trình chiết tách acid nucleic tổng số khác

nhau nhưng nói chung ñều gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: phá vỡ màng tế bào cũng như màng nhân nhằm giải phóng acid nucleic

Bước 2: ức chế hoạt ñộng của các enzym thủy phân acid nucleic bằng

những ion cần thiết cho sự hoạt ñộng của enzym

Bước 3: kết tủa protein, lipid và các tạp chất bằng hóa chất hoặc ly tâm Bước 4: kết tủa acid nucleic tổng số

Bước 5: rửa tủa bằng cồn tuyệt ñối hoặc cồn 75%, ñể khô và hòa tan

tủa bằng nước cất vô trùng, bảo quản trong tủ -20°C

2.3.2 Tinh chiết phân tử virus

Nguyên lý cơ bản của tinh chiết phân tử virus là ly tâm ở các tốc ñộ khác nhau

Các loài virus khác nhau có quy trình tinh chiết khác nhau

2.3.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR ñược Kary Mullis và cs phát minh vào năm 1985, là một phương pháp phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch ñại một ñoạn

DNA bên ngoài cơ thể sống trong thời gian ngắn

Thành phần phản ứng PCR gồm có:

1 DNA mẫu (template): ñoạn DNA cần khuếch ñại

2 Cặp mồi (primer): nhân tố khuếch ñại, xác ñịnh ñiểm bắt ñầu và kết thúc vùng cần khuếch ñại

3 DNA-polymerase chịu nhiệt: tổng hợp DNA

4 Nucleotides - dNTPs (A, T, G, C): là nguyên liệu ñể tổng hợp DNA mới

ñộng

Phản ứng PCR ñược thực hiện theo một chu trình nhiệt ñịnh sẵn tròng máy PCR Quy trình phản ứng PCR khoảng từ 20 - 30 chu kỳ nhiệt Mỗi chu

kỳ gồm 3 bước:

1 Giai ñoạn biến tính (denaturation): nhiệt ñộ tăng lên 94 - 96°C ñể

tách hai sợi DNA ra Thời gian: 1-2 phút

2 Giai ñoạn gắn mồi (annealing): nhiệt ñộ giảm xuống 45 – 60°C ñể

mồi có thể gắn vào sợi DNA ñơn Thời gian: 30 - 60s

3 Giai ñoạn tổng hợp (elongation): nhiệt ñộ tăng lên 70 - 72°C thích

hợp cho enzym DNA polymerase bám vào và hoạt ñộng dọc theo sợi DNA Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch ñại

2.3.4 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain

Reaction)

RT-PCR là phương pháp nhân một ñoạn DNA mục tiêu dựa trên khuôn

là RNA Phương pháp này gồm 2 bước:

1 Tổng hợp cDNA (DNA bổ sung) từ khuôn ARN nhờ enzym phiên

mã ngược, ngoài ra còn cần có mồi (mồi ngẫu nhiên – Random hexamer primer hoặc mồi ñặc hiệu)

2 Khuếch ñại ñoạn cADN bằng PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu

2.4 Bệnh virus hại cây hoa có củ

2.4.1 Hippeastrum mosaic virus (HiMV)

Hippeastrum là một chi trong họ Amaryllidaceae, có khoảng 90 loài

với hơn 600 giống cây trồng và cây lai (Stevens, 2001), có nguồn gốc từ vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của châu Mỹ từ phía Bắc Argentina tới Mexico và vùng Caribbean Chi này gồm các loài cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra

từ thân hành, thường có hoa sặc sỡ và nhiều loài ñược trồng làm cảnh

HiMV là một potyvirus Bệnh do HiMV gây ra ñược mô tả lần ñầu tiên

bởi Kunkel vào năm 1922 trên cây Hippeastrum hybridum (Kunkel, 1922)

Dọc theo phiến lá và cuống hoa của cây bệnh xuất hiện những vết khảm sọc,

ñứt quãng (Brunt et al., 1973) Phân tử HiMV có hình sợi mềm, kích thước

782 x 12 nm Mỗi phân tử virion ñược cấu tạo từ các tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn ñối xứng xung quanh 1 phân tử RNA genome (Brunt, 1973; Jayasinghe & Dijkstra, 1979)

HiMV không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa Virus

ñược truyền bằng tiếp xúc cơ học nhưng ñây không phải là con ñường lan truyền ngoài tự nhiên của virus Ngoài tự nhiên, virus lan truyền qua rệp như

Myzus persicae, Aphis fabae, A gossypii theo kiểu không bền vững

Virus có thể ñược xác ñịnh bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi chung cho Potyvirus Ngoài ra, có thể xác ñịnh virus bằng cách quan sát thể vùi trong tế bào cây bệnh với hình dạng ñặc trưng cho potyvirus như hình trụ, hình vòng bánh xe, hình phiến Hầu hết các tế bào bệnh ñều có chứa 1 thể vùi, nằm gần hoặc áp sát vào nhân tế bào và lục lạp của những tế bào này thường nhỏ hơn so với các tế bào bình thường

Ký chủ tự nhiên của HiMV mới chỉ tìm thấy trên các cây họ thuộc

Amaryllidaceae, nhưng thông qua phương pháp nhiễm bệnh bằng tiếp xúc cơ

học thì virus có thể gây bệnh trên một số cây thuộc các họ Amaranthaceae,

Chenopodiaceae và Solanaceae

2.4.2.Vallota speciosa virus

Cây Vallota speciosa (Scarborough Lily) thuộc chi Cyrtanthus, họ

Amaryllidaceae, là cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, có

nguồn gốc từ Nam Phi, hoa thường nở vào cuối mùa hè ñầu mùa thu (Stevens, 2001) Hoa hình phễu, có nhiều màu sắc khác nhau như ñỏ tươi, cam, vàng, hồng trắng

Vallota speciosa virus là một potyvirus mới ñược công bố gần ñây vào

năm 2006 tại New Zealand (Wei et al., 2006) Ký chủ tự nhiên của virus này mới chỉ ñược phát hiện trên cây hoa thủy tiên (chi Narcissus) (Wei et al., 2006; Nixon et al., 2008; Wylie et al., 2010)

2.4.3 Lily mottle virus (LMoV)

LMoV là một potyvirus LMoV ñược xem là virus phổ biến và nguy hiểm nhất trên cây hoa trồng bằng củ Virus còn ñược gọi dưới một số tên như

Lily streak mottle virus (Brierley & Smith, 1944) và cho ñến năm 1990 vẫn

ñược gọi là Tulip breaking virus (TBV) (Dekker et al., 1993; Derks et al.,

1994, dẫn theo Asjes, 2000)

Triệu chứng của LMoV trên lily biến ñổi theo tính mẫn cảm của cây Triệu chứng có thể biến ñổi từ sáng gân, ñốm lá, khảm lá, vệt vàng hoặc xanh nhạt, xoăn và co rút lá, những vết ñốm chết hoại màu hơi ñỏ nâu cho ñến các dạng nhẹ hơn của triệu chứng lá hay thậm chí là sự nhiễm không biểu hiện triệu chứng ở một số giai ñoạn phát triển trên ñồng ruộng Một số cây có thể biểu hiện vệt trên màu sắc hoa và hoa bị dị hình, không ñối xứng, trong khi những cây khác có thể biểu hiện các ñốm hình nhẫn chết hoại màu nâu trên các vảy của củ Cây thường thấp hơn và chết sớm, hoa cắt nhanh tàn

Việc phát hiện virus ở những cây bị nhiễm bệnh phụ thuộc vào virus,

ñộ mẫn cảm của cây trồng và ảnh hưởng của ñiều kiện trồng Mức ñộ ña dạng về triệu chứng của LMoV khiến cho việc loại bỏ các cây bị bệnh trên ñồng ruộng không dễ dàng

Trong những năm gần ñây, kỹ thuật RT-PCR và ELISA ñã ñược sử dụng ñể nhận biết những chủng virus trên các cây trồng LMoV ñược phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi ñặc hiệu Gen quy ñịnh protein vỏ ñã ñược giải trình tự sau khi phân lập dòng cDNA phần ñầu 3’ của bộ gen virus (Brierley & Smith, 1944 dẫn theo Derks et al., 1994) So sánh phương pháp ELISA và RT-PCR, Yoshiji (2002) chỉ ra rằng RT-PCR nhạy hơn là ELISA trong việc xác ñịnh sự có mặt của virus trong các cây lily ðộ tin cậy của các thử nghiệm thay ñổi rất ít khi tiến hành vào giữa tháng 11 và tháng 3 Sự khác nhau về mức ñộ tập trung của virus ñược xác ñịnh ở các vảy ñơn riêng rẽ của các củ (van Schadewijk, 1986)

Sự phát hiện ra virus trong củ của các cây thuộc họ Liliaceae phụ thuộc

vào virus, ký chủ và ñiều kiện bảo quản Bảo quản củ của các cây lai Châu Á

ở nhiệt ựộ 0-2 ồC trong thời gian ắt nhất từ 2-3 tuần trước khi ựem kiểm tra ELISA sẽ phát hiện ựược Lily symptomless virus (LSV) và LMoV một cách

ựáng tin cậy Nhưng nếu áp dụng qui trình này cho các cây Lilium

longiflorum thì hầu như không phát hiện ựược LMoV Việc phát hiện virus

này ựược cải thiện rõ rệt sau khi bảo quản vảy ở 20ồC trong 2-3 tuần dưới ánh sang huỳnh quang trắng (12 Ờ 16 giờ/ngày, 13- 16 W/ m2 ) Qui trình này không áp dụng ựược cho các giống lai phương đông để khắc phục khó khăn này có thể tiến hành thử nghiệm lá của những cây lai phát triển từ các củ bị bệnh từ vụ trước vào những thời ựiểm thắch hợp (P Narayanasamy , 2010 dẫn theo Derks, 1997)

LMoV truyền theo kiểu không bền vững bởi rệp muội Myzus persicae ,

Aphis gossypii, Macrosiphum euphorbiae Virus ựược truyền qua dịch cây và

không qua hạt giống của lily (Brierley và Smith, 1944 dẫn theo Derks, 1997) Nghiên cứu về mối quan hệ giữa vectơ và virus LMoV, Sharma ( 2005) thấy

rằng rệp ựào Myzus persicae là vectơ có hiệu quả, quá trình truyền virus chỉ

trong 2-3 phút Cây lily sử dụng trong thắ nghiệm xuất hiện triệu chứng khảm, ựốm và sáng gân chỉ trong 27-30 ngày

Những cá thể rệp có cánh bi bắt trong khi bay trên những cây lily truyền LMoV vào các cây thử nghiệm lây nhiễm với tỷ lệ 5.9, 4.8, 3.0% tương ứng với các năm 1990, 1991 và 1992 LMoV ựược truyền bởi 18 trong

số 76 loài rệp khác nhau bắt ựược bằng bẫy từ tháng 5 ựến tháng 10 Số lượng rệp bị bắt bằng bẫy tăng dần vào tháng tư và tháng năm Vào tháng 6 và tháng

7 thì số lượng tăng nhanh hơn, trong khi ựó vào tháng tám và tháng chắn lại xuống khá thấp ngoại trừ một khoảng thời gian ngắn vào cuối tháng chắn ựầu tháng mười Do vậy, sự khác nhau về mùa ựối với việc lan truyền virus có thể

dự tắnh ựược như ảnh hưởng của số lượng rệp có cánh và hoạt ựộng của chúng Sự lan truyền virus giảm vào tháng tám và tháng 9 là do số lượng rệp

có cánh ít ñi và ñộ mẫn cảm với virus của cây ký chủ giảm như tuổi cây ðiều này kết hợp với việc tạo thành các lá non, có ñộ mẫn cảm cao cho ñến khi ra hoa vào ñầu tháng bảy so với các lá già giảm dần ñộ mãn cảm hình thành sau

ñó (Asjes et al, 1996)

2.4.4 Lily symptomless virus (LSV)

LSV là một virus thuộc chi Carlavirus, họ Flexiviridae LSV gây hại chủ yếu trên 3 loài thực vật thuộc 2 họ khác nhau là cây Alstroemeria (họ

Alstroemeriaceae), hoa ly (Lilium spp.) và cây hoa tulip (Tulipa) (họ Liliaceae)

LSV lan truyền theo kiểu không bền vững nhờ các loài rệp như Myzus

persicae (Mowat & Stefanac, 1974), Macrosiphum euphorbiae (Derks &

Abeele, 1980), Aphis gossypii, A fabae và Aulocorthum solani (Mowat &

Stefanac, 1974; Derks & Asjes, 1975) Bên cạnh ñó LSV có thể lan truyền

bằng con ñường tiếp xúc cơ học

2.4.5 Tulip breaking virus (TBV)

TBV là một potyvirus TBV nhiễm tự nhiên trên cây các cây Tulipa spp, Lilium spp Virus này gây hại nghiêm trọng trên cây hoa Tulip Truyền bệnh nhờ véc tơ truyền bệnh là côn trùng: Myzus persicae, Aphis gosypii,

Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Dysaphis tulipae, Aphididae.Virus

truyền không theo một cách thức cụ thể Virus truyền bệnh qua việc ghép cành, kỹ thuật cơ học gây xát thương, không truyền bệnh bằng tiếp xúc giữa

các cây với nhau, không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa

Phạm vi phân bố: Có thể Phân bố trên toàn thế giới (Brierley & Smith

1944)

2.4.6 Lily virus X (LVX)

LVX là virus thuộc chi Potexvirus Theo CABI, 2007, LVX chỉ gây hại

trên cây hoa ly (Lilium spp.) Tuy nhiên theo Takashi et al (2000), LVX có

thể xâm nhiễm trên 11 trong số 43 loài thuộc 10 họ khi lây nhiễm nhân tạo

bằng tiếp xúc cơ học

2.4.7 Narcissus mosaic virus (NMV)

NMV thuộc chi Potexvirus Theo CABI, 2005, NMV chỉ gây hại trên 2 loài hoa trồng là Lilium speciosum và Narcissus (cây thuỷ tiên vàng) Tuy

nhiên theo Brunt (1966), NMV có thể lây nhiễm trên một số loài cỏ nằm trong

Tính kháng tập nhiễm hệ thống (systemic acquired resistance, SAR) là

loại tính kháng tạo ñược có tính lưu dẫn (hệ thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh), thường dẫn tới biểu hiện protein liên quan ñến sự

gây bệnh (protein PR) và thông qua hệ ñường hướng dẫn truyền tín hiệu salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA)/ethylene (ET)

SAR có thể ñược hình thành trên nhiều loài cây bởi các tác nhân gây vết bệnh chết hoại (là biểu hiện của phản ứng siêu nhạy hoặc là biểu hiện của triệu chứng)

Con ñường dẫn truyền tín hiệu SAR xuất hiện ñể thực hiện chức năng như một bộ ñiều biến của cơ chế kháng bệnh khác SAR ñược kết hợp với sự cảm ứng của một phạm vi rộng của các gen Khi SAR ñược kích hoạt, một tương tác thực vật-tác nhân gây bệnh tương thích thông thường có thể ñược chuyển ñổi thành không tương thích Dấu hiệu phân tử tín hiệu ñặc trưng của SAR là SA có thể ñược tạo ra rất nhanh trong vòng vài giờ (4-6 giờ) sau lây

nhiễm và nhân lên nhanh chóng; sau khoảng 24 giờ SAR ñã biểu hiện toàn cây Sự di chuyển của SAR thường theo hướng từ dưới gốc lên trên ngọn Cây

có thể duy trì SAR trong thời gian rất lâu, trong nhiều trường hợp kéo dài cả ñời của cây

Ở một số giống cây trồng có mang tính kháng bệnh, khi bị mầm bệnh tấn công, cây sẽ có phản ứng ñể chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh, nhờ ñó cây thoát khoải bệnh hoặc chỉ bệnh nhẹ

Ở cây trồng có các gen ñiều khiển tế bào tiết ra các chất giúp mô cây kháng lại với một bệnh nào ñó Trong ñiều kiện bình thường, các gen này bị một gen ức chế bên cạnh ức chế Do bị ức chế nên các gen này không hoạt ñộng ñược Ta gọi ñó là các gen kháng bệnh ẩn

Khi ta sử dụng các tác nhân gây kích kháng lên lá cây, kích thích các thụ thể có ở bề mặt lá Các thụ thể này tạo ra tín hiệu và truyền ñến nhân tế bào và tác ñộng vào các gen ñiều tiết Gen ñiều tiết bị tác ñộng nên không hoạt ñộng và không còn gen ức chế các gen kháng bệnh ẩn, nhờ ñó tế bào cây có thể tiết ra các chất kháng bệnh

2.5.2 Tác nhân gây kích kháng

2.5.2.1 Tác nhân hữu sinh

Vi khuẩn và nấm là hai tác nhân thường ñược dùng trong nghiên cứu gây sự kích kháng chống lại bệnh trên cây trồng Các vi sinh vật không có tác ñộng ñối kháng với tác nhân gây bệnh thì mới ñược xem là tác nhân gây kích kháng Các loài vi khuẩn và nấm vùng rễ không gây bệnh cây là các ví dụ ñiển hình cho nhóm tác nhân hữu sinh tạo tính kháng SAR trên cây trồng

2.5.2.2 Tác nhân vô sinh

Sử dụng các hoá chất không phải là thuốc bảo vệ thực vật làm tác nhân gây kích kháng SAR hình thành khi có sự tấn công của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên nhiều thí nghiệm ñã chứng tỏ rằng SAR có thể ñược tạo ra khi xử

lý các hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp Tất cả các hóa chất có khả năng cảm ứng SAR ñược gọi là các chất kích hoạt SAR (chất kích kháng) Các hoá chất này không có tác ñộng trực tiếp lên mầm bệnh, mà chỉ gây kích thích tính kháng bệnh của cây

ðể có thể ñược xem là chất kích hoạt SAR thực sự, một hóa chất hoặc sản phẩm chuyển hóa của nó phải không có hoạt tính kháng sinh Một số thuốc hóa học trừ bệnh ngoài hoạt tính kháng nấm còn có khả năng cảm ứng

SAR phổ biến bao gồm:

SA (salicylic acid) Salicylic acid là một thành phần của ñường truyền

tín hiệu cần thiết ñể tăng cường tính kháng hệ thống tập nhiễm Sự kích hoạt tổng hợp SA và tăng cường tính kháng hệ thống tập nhiễm là sự nhận biết một

vi sinh vật xâm nhập bởi các sản phẩm của gen kháng Thông thường sự nhận biết này ñi kèm với phản ứng siêu nhạy, tạo thành các chết hoại xung quanh khu vực tác nhân gây bệnh xâm nhập

INA (dichloroisonicotinic acid) INA có cơ chế cảm ứng SAR giống như

SA chống lại nhiều tác nhân gây bệnh INA có thể cảm ứng SAR trước hoặc sau khi lây nhiễm ðiểm khác biệt so với SA là INA cảm ứng SAR ñộc lập với SA

và hoạt ñộng ở phía hạ lưu ñường hướng dẫn truyền tín hiệu so với SA

BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH,

acibenzolar-S-methyl) BTH là sản phẩm của hãng Novartis (bán tại Việt Nam với tên

thương mại là BION) BTH có thể cảm ứng SAR ở liều lượng thấp, do vậy tránh ñược hiệu ứng gây ñộc cho cây BTH có cơ chế tạo SAR giống như SA

và có thể chống ñược nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả virus BTH có hiệu

quả chống nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina, Phytophthora

parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sương mai khác, vi khuẩn Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV

Chitosan Các oligomer của chitosan hình thành từ sự loại bỏ nhóm

acetyl của chitin (dạng polymer mach thẳng của N-acetyl-D-glucosamine)

Chitosan có khả năng kháng nấm trực tiếp (biến ñổi cấu trúc vách tế bào nấm, ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp chitin của vách tế bào nấm) Ngoài ra, chitosan cũng ñược biết là cảm ứng hình thành SAR

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

bí ngồi, hoa huệ, hoa loa kèn ñỏ (Hippeastrum sp.), ñậu tương (Glycine max), ñậu ñũa (Vigna sinensis cv Black Eye), ñậu ñen (Vigna unguiculata ), ñậu cô

ve (Phaseolus vulgaris)

3.1.2.3 Các ñệm, dung dịch, kít, hóa chất và môi trường chính

• RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas): kít tổng hợp sợi cDNA

• ReverseDreamTaq (Fermentas): DNA polymerase chịu nhiệt

• AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer): kít tinh chiết plasmid

• AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer): kit thôi gel

• Tripure (Roche): kít tinh chiết RNA tổng số

• BamHI và ECoRI (Fermentas): enzyme cắt giới hạn

• ðệm 0.5X TAE dùng ñiện di: 5mM Tris-acetate và 0.25mM EDTA (pH 7.8)

• ðệm photphat 0.1M, pH 7.4: lây nhiễm bệnh nhân tạo

• Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1): loại bỏ lipid and protein trong tinh chiết RNA

• ðệm TE: 10mM Tris-Cl và 1mM EDTA (pH 8.0)

• Môi trường LB lỏng (1L): cân 10g Tryptone, 5g cao nấm men và 5g NaCl

ðiều chỉnh pH tới 7.0 bằng NaOH và hấp

• Môi trường LB ñặc chứa ampicillin (100 µg/mL): cho 15g agar vào 1L

môi trường LB lỏng Hấp vô trùng ðể môi trường nguội (~50°C) và bổ sung ampicillin tới nồng ñộ 100 µg/mL Rót môi trường ra ñĩa petri vô trùng ðể môi trường ñông lại và ñể khô bề mặt khoảng 30 phút trước khi bọc và bảo quản ở 4°C (khoảng 1 tháng)

• Môi trường SOB ñể chuẩn bị tế bào khả biến (1L): 20g Tryptone, 5g cao

(MgCl2.6H2O & MgSO4.7H2O) Hấp vô trùng

• Môi trường SOC ñể chuẩn bị tế bào khả biến: Cho 1mL dung dịch 2M

glucose vào 100mL môi trường SOB Hấp vô trùng

3.1.2.4 Tế bào vi khuẩn khả biến và vector biến nạp

• Tế bào vi khuẩn khả biến: Tế bào vi khuẩn E coli chủng XL1-Blue

(Stratagen) ñược sử dụng ñể chuẩn bị tế bào khả biến theo phương pháp

của Inoue et al (1990)

• Kit dòng hóa: InsTAclone™ PCR Cloning Kit với vector pTZ57R/T (hãng Fermentas)

http://www.fermentas.com

Hình 3.1: Bản ñồ giới hạn Vector pTZ57R/T

3.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu

Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học NN Hà Nội

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

ðề tài ñược tiến hành từ tháng 6 năm 2010 ñến tháng 8 năm 2011

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Nếu ruộng ñiều tra có diện tích trên 360m2 thì sẽ tiến hành ñiều tra theo phương pháp 5 ñiểm, mỗi ñiểm lấy 50 cây

3.2.2 Thu mẫu và xử lý mẫu

• Bảo quản khô: Mẫu thu về ñược ñể trong túi chứa hạt Silicagel Thay hạt Silicagel ñến khi mẫu khô

• Bảo quản tươi Mẫu thu về ngày hôm trước ñể nguyên trong túi giữ lạnh

ở tủ -20 OC hay bảo quản trong túi nilon và giữ ẩm ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới

3.2.3 Xác ñịnh bệnh bằng nhiễm bệnh nhân tạo trên một số cây chỉ thị

Lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học

 Bước 1: trồng cây chỉ thị

 Lấy 2 – 5 g lá bệnh (lá tươi) rửa sạch bụi ñất

 Tăm bông, khay ñá, lưới lọc, bột carborandum

(w/v), 0.2% Na2SO3 (w/v)

 Bước 3: nghiền lá bệnh bằng chày cối sứ, thêm 2 thể tích ñệm phosphate (1g lá : 2ml ñệm) tới khi thu ñược dung dịch ñồng nhất Lọc dịch thu ñược bằng lưới lọc Thêm bột carborandum vào dịch lọc (1%, w/v), hòa ñều bột Chú ý các thao tác tiến hành trên khay ñá, dịch thu ñược không ñược

ñể quá 2h

 Bước 4: dùng tăm bông tẩm dịch virus và miết nhẹ lên bề mặt lá theo 1 chiều từ cuống lá ñến chóp lá, từ 1 – 2 lần trên cùng một vị trí Chú ý không làm quá mạnh, không ñược làm rách lá

• Qui trình chiết theo phương pháp CTAB/LiCl như sau:

o Trước khi chiết: ủ ñệm CTAB + BME (10 µl/ ml ñệm) ở 60 oC trong 30 phút bằng bể nhiệt

sứ Cho dịch nghiền vào tube 1,5ml, ủ 60 oC 30 phút (ñể ở nhiệt ñộ phòng 10 phút cũng cho kết quả tốt ñối với một số loại mô dễ như cà chua)

o Li tâm 13000g 5 phút ñể loại bỏ tàn dư, thu dịch trên tủa Cho Chloroform/Isoamyl (24:1) vào tube với thể tích tương ñương, trộn ñều

o Li tâm 13000g 5 phút Hút dịch trên tủa chuyển sang tube mới

o Chiết lại lần 2 bằng Chloroform/Isoamyl Bổ sung vào tube dịch trên tủa vừa thu ñược một lượng LiCl 10M (= 1 /4 thể tích dịch trên tủa) ðể lạnh 15 phút

và bảo quản -80 oC

3.2.5 Các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Các mồi sử dụng trong nghiên cứu ñược trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Các mồi dùng trong nghiên cứu

của potyvirus N1 GACCACGCGTATCGATGTCGAC Trùng phần "N" của

mồi N1T VectorSeqFor GTTTTCCCAGTCACGACGTTG

VectorSeqRev CAGGAAACAGCTATGACCATG

Giải trình tự, bắt cặp trình tự vector pTZ57 Ghi chú: I: inosine, Y (C, T), R (G, A), W (A, T), V (A, C, G), S (C, G), D (A,G,T)

3.2.6 Phản ứng RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain

Sau ñó lấy tube ra ñể trên nước ñá 30 giây, cho vào trong tube các thành phần ở dưới và thực hiện quá trình tổng hợp sợi cDNA

3.2.7 ðiện di sản phẩm trên gel agarose

mL TAE 0.5X vào lọ Cho lọ vào lò vi sóng ñể hoà tan agarose Sau khi agarose ñã tan hoàn toàn, bổ sung 1µL Ethidium Bromide, lắc ñều,

ñể lọ ở nhiệt ñộ phòng tới nhiệt ñộ khoảng 60°C

• Gài lược vào khuôn gel ðổ gel vào khuôn (dày khoảng 1 cm) ðể khuôn ở nhiệt ñộ phòng 30 phút ñể ñông gel

• Sau 30 phút ñể khuôn gel ở nhiệt ñộ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút ñều tay ñể không vỡ giếng)

• ðặt cả khay gel vào bể ñiện di, ñổ ñệm TAE 0.5X phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm)

• Nhỏ mẫu PCR (RT-PCR) vào giếng Ngoài các mẫu PCR, luôn phải nhỏ thêm 1 giếng DNA marker làm chuẩn

• Cắm nguồn ñiện cho máy ñiện di, ñặt hiệu ñiện thế 100V và thời gian

25 phút

• Sau 25 phút, tắt máy ñiện di, ñặt bản agarose lên máy phát tia cực tím, quan sát kết quả và chụp ảnh

3.2.8 Thôi gel

Purification Kit (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Bước 4: Gây sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây

Bước 5: ðể tube trên ñá lạnh 5 phút, spin nhẹ

Bước 6: Bổ sung 600µl SOC vào tube, nuôi lắc trong 1h ở 37°C

Bước 7: Ly tâm 5 phút bằng máy ly tâm ñể bàn, bỏ bớt dịch trên tủa,

giữ lại trong tube khoảng 100µl dịch

Bước 8: Cấy dịch trên ñĩa petri có chứa LB agar + ampicillin (100µg/mL)

Bước 9: Nuôi qua ñêm trong tủ binder ở 37°C

Ngày tiếp theo, cấy các khuẩn lạc ñơn vào môi trường LB lỏng (tiến hành trong box cấy vô trùng) Nuôi khuẩn qua ñêm trong ñiều kiện lắc ở 37°C

Kiểm tra plasmid tái tổ hợp

Sau khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, các dòng vi khuẩn biến nạp ñược kiểm tra trực tiếp bằng PCR

Bước 1: Dùng pipet hút 50µl dịch vi khuẩn cho vào tube 1.5mL, ly tâm

1 phút bằng máy ly tâm ñể bàn, bỏ dịch trên tủa

Bước 2: Hút 500µl nước cất vô trùng cho vào tube, ly tâm 1 phút bằng máy ly tâm ñể bàn, bỏ dịch trên tủa

Bước 3: Lặp lại bước 2

Bước 4: Hòa tan cặn trong 50µl nước cất vô trùng

Tinh chiết plasmid tái tổ hợp (Miniprep)

Các plasmid tái tổ hợp ñược chiết từ khoảng 2mL dịch vi khuẩn dùng kít

Kiểm tra sản phẩm Miniprep bằng enzym cắt giới hạn

 Enzym cắt giới hạn ñược dùng là EcoRI và BamHI

3.2.10 Giải trình tự gen virus

 Sản phẩm Miniprep sẽ ñược dùng ñể giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều (potyvirus hoa loa kèn) hoặc 1 chiều (virus dâu) bằng cặp mồi