đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ chọn tạo giống bông lai f1

đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng.... trong quá trình lai, chọn tạo giống thường sử dụng các chỉ tiêu hình thái ựể ựánh giá nguồn vật liệu bố m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

PHẠM ðÌNH ỔN

ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN VẬT LIỆU

BỐ MẸ PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BÔNG LAI F1

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

PHẠM ðÌNH ỔN

ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN VẬT LIỆU

BỐ MẸ PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BÔNG LAI F1

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 60.6205

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng ựược sử dung ựể bảo vệ một học vị nào

Các thông tin trắch dẫn trong Luận văn ựều ựã ựược chỉ rõ nguồn gốc./

Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011

Tác giả

Phạm đình Ổn

LỜI CẢM ƠN

Lời ựầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ựến PGS TS Phan Hữu Tôn người thầy ựã tận tình dìu dắt hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học và Viện đào tạo sau ựại học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tạo ựiều kiện giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh ựạo và các cán bộ Công ty C.P Bông Miền Bắc ựã ủng hộ, tạo ựiều kiện giúp ựỡ về mọi mặt ựể tôi thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……… ……vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH……….……… … ix

I MỞ ðẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 3

1.3 Ý nghĩa của ñề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

II TỔNG QUAN VỀ VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.1 Sơ lược về cây bông 4

2.1.2 Tình hình sản xuất bông trên thế giới 4

2.1.3 Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam 6

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng giống bông lai 7

2.3.Chọn giống ưu thế lai 8

2.3.1 Lai giống và nguyên tắc chọn cặp bố mẹ 8

2.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện ưu thế lai 12

2.4 Một số ñặc ñiểm chính của giống bông lai F1 12

2.5 đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây

trồng 13

2.5.1 đa dạng di truyền và khái niệm về chỉ thị di truyền 13

2.5.2 Một số chỉ thị ứng dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền thực vật 15 2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 17

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác 25

3.2 Nội dung nghiên cứu 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 đánh giá bố mẹ bằng các chỉ tiêu hình thái 26

3.3.2 đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị SSR 26

3.3.3 đánh giá, so sánh sơ bộ bố mẹ và các tổ hợp lai 27

3.4 Chỉ tiêu theo dõi 27

3.4.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng 27

3.4.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ựồng 27

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

4.1 Kết quả ựánh giá một số ựặc ựiểm hình thái của các bố mẹ 31

4.1.1 Một số ựặc ựiểm hình thái chắnh của các mẫu giống bố mẹ 31

4.1.2 Thời gian sinh trưởng và ựặc ựiểm thực vật học chắnh của các mẫu giống bố mẹ 34

4.1.3 Tình hình sâu, bệnh hại trên các giống bố mẹ 36

4.1.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống bố mẹ 39

4.1.5 Chất lượng xơ bông của các giống bố mẹ 42

4.1.6 Phân nhóm di truyền giữa các giống bố mẹ 44

4.2 Kết quả ựánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị phân tử SSR 51

4.2.1 Tách chiết ADN và chọn lọc mồi ựánh giá ựa hình vật liệu khởi ựầu 51

4.2.2 Phân nhóm di truyền vật liệu khởi ñầu 54

4.3 Kết quả so sánh một số tổ hợp lai trên một số tính trạng chính 60

4.3.1 Ưu thế lai tính trạng thời gian sinh trưởng và chiều cao cây 60

4.3.2 Ưu thế lai tính trạng số quả/m2 và khối lượng quả 62

4.3.3 Ưu thế lai tính trạng năng suất lý thuyết và năng suất thực thu 64

4 3.4 Ưu thế lai tính trạng ñộ dài và ñộ bền xơ 66

4.3.5 Tình hình sâu bệnh hại trên các tổ hợp lai 68

V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 74

5.1 Kết luận 74

5.2 ðề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤC LỤC 1: XỬ LÝ THỐNG KÊ 82

PHỤC LỤC 2 DANH SÁCH VÀ TRÌNH TỰ CÁC CẶP MỒI 89

PHỤ LỤC 3 91

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ICAC International Cotton Advisory Committee - Ủy ban tư ván bông thế giới

TGST Thời gian sinh trưởng

TGST3 Thời gian sinh trưởng từ gieo ñến 50% số cây có quả ñầu tiên nở

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1: Diện tích, năng suất và sản lượng bông của một số quốc gia ñứng ñầu thế

giới trong các liên vụ gần ñây 6

2.2: Diện tích, năng suất và sản lượng bông Việt Nam trong một số vụ gần ñây 6

4.1 Một số ñặc ñiểm hình thái của các mẫu giống bông bố mẹ (mã số) 32

4.2 Một số ñặc ñiểm hình thái của các mẫu giống bông bố mẹ (mã số) 33

4.3 Thời gian sinh trưởng và ñặc ñiểm thực vật học của các mẫu giống bố mẹ 35

4.4 : Tỷ lệ cây phản ứng với Kanamycin 0,50/00 và khả năng kháng sâu xanh của các giống thí nghiệm 37

4.5: Mức ñộ nhiễm rầy xanh và khả năng kháng bệnh xanh lùn, mốc sương và ñốm cháy lá của các mẫu giống bố mẹ 37

4.6 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giốngbố mẹ 41

4.7 Một số chỉ tiêu về chất lượng xơ bông của các mẫu giống bố mẹ. 43

4.8 Tương quan di truyền của các giống bố mẹ phân tích bằng chỉ thị hình thái 47

4.9 Một số ñặc ñiểm thực vật học và sinh trưởng của các nhóm 49

4.10 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các nhóm 50

4.11 Chất lượng xơ trung bình của các nhóm 50

4.12 Các tổ hợp lai dự kiến có triển vọng theo chỉ thị hình thái 51

4.13 Trình tự tổng số phân ñoạn nhân ñược và số ñoạn ña hình của các cặp mồi nghiên cứu 53

4.14 Tương quan di truyền của các giống bố mẹ (phân tích bằng chỉ thị phân tử) 56

4.15 Các tổ hợp lai dự kiến có triển vọng theo chỉ thị phân tử SSR 59

4.16 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng TGST và chiều cao cây 61

4.17 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng số quả/cây và khối lượng quả 63

4.18 Khoảng cách di truyền , ưu thế lai trên tính trạng năng suất lý thuyết và

năng suất thực thu 65

4.19 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng ñộ dài và ñộ bền xơ 67

4.20 Tỷ lệ cây phản ứng với Kanamycin 0,50/00 và khả năng kháng sâu xanh của các tổ hợp lai 68

4.21 Mức ñộ nhiễm rầy xanh và khả năng kháng bệnh xanh lùn mốc sương và ñốm cháy lá của các tổ hợp lai 70

4.22 Thời gian sinh trưởng và các ñặc ñiểm thực vật học chính của các tổ hợp lai triển vọng 72

4.23 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai triển vọng 72

4.24 Một số chỉ tiêu chất lượng xơ bông của các tổ hợp lai triển vọng 73

4.25 Một số chỉ tiêu sâu bệnh hại của các tổ hợp lai triển vọng 73

DANH MỤC CÁC HÌNH

4.1 Phân nhóm di truyền các bố mẹ theo chỉ thị hình thái 46

4.2: Kết quả ñiện di sản phẩm SSR với cặp mồi BNL 1317 trên agarose 3% 52

4.3: Kết quả ñiện di sản phẩm SSR với cặp mồi BNL 2882 trên agarose 3% 52

4.4 Sơ ñồ phân nhóm di truyền theo chỉ thị phân tử của các giống thí nghiệm 55

I MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Cây bông (Gossypium malvacearumL.) là cây công nghiệp quan trọng,

có giá trị kinh tế cao và sản phẩm ña dạng Hiện nay toàn thế giới có hơn 80 quốc gia trồng bông với diện tích 30-35 triệu ha/năm, tổng giá trị hàng hóa 35

tỷ USD; ñược trồng nhiều nhất ở Ấn ðộ, Mỹ, Trung Quốc, Pakistan, Uzbekistan, Braxin, Thổ Nhĩ Kỳ (ICAC, 2010) [30]

Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, ñược trồng chủ yếu ở miền Trung, miền Nam, Tây Nguyên và Tây Bắc Tuy nhiên, hiện nay diện tích và sản lượng bông của ta còn rất thấp niên vụ bông 2007-2008 diện tích chỉ còn 7446 ha và sản lượng 7324 tấn, chỉ ñáp ứng 1-2 % nhu cầu may mặc trong nước (Theo Công ty Bông Việt Nam) [15] Có nhiều nguyên nhân hạn chế việc mở rộng diện tích và tăng sản lượng bông của nước ta, trong ñó, vấn

ñề thiếu giống năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh hại và ngoại cảnh bất thuận là một nguyên nhân chính Ý thức ñược vấn ñề này, trong các năm qua ngành bông ñã chú trọng vào công tác chọn tạo giống bông, thể hiện qua các dự án ñầu tư phát triển giống bông giai ñoạn một (2001 - 2005) và giai ñoạn hai (2006 - 2010) Trong ñó, tập trung nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học cho chọn tạo giống bông có năng suất cao, chất lượng tốt chống chịu sâu bệnh và ngoại cảnh bất thuận

Bằng con ñường chọn tạo giống truyền thống trong những năm qua ngành bông ñã ñưa ra một số giống bông lai như GL03, VN15, VN01-2, VN01-4, VN02-2, VN04-3, VN04-4, VN04-5 Các giống bông lai này có UTL vượt trội so với các giống bông thuần Tuy nhiên, con ñường lai và chọn tạo truyền thống ñã bộc lộ nhiều hạn chế như: phải ñược tiến hành trên quy

mô lớn, tốn nhiều diện tích, thời gian, công sức và chi phí lớn Hơn nữa

trong quá trình lai, chọn tạo giống thường sử dụng các chỉ tiêu hình thái ựể ựánh giá nguồn vật liệu bố mẹ, ựôi lúc còn mang tắnh chủ quan và các tắnh trạng số lượng thường biến ựộng lớn dưới tác ựộng của ựiều kiện ngoại cảnh

vì thế hiệu quả chưa cao

Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học ựã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong nông nghiệp Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào chọn tạo giống cây trồng ựã ựược nhiều nhà khoa học quan tâm Trong ựó, việc sử dụng các chỉ thị phân tử ựã trở thành công cụ mạnh mẽ ựể phân tắch ựa dạng di truyền và xác ựịnh các mối quan hệ giữa các giống cây trồng, vật nuôi như RAPD, SSR, RFLP, AFLP Trong ựó, chỉ thị SSR là một loại chỉ thị ựược sử dụng khá phổ biến, chắnh xác và hữu hiệu trong nghiên cứu ựa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng vật nuôi khác nhau trong cùng một loài ựộng hay thực vật Ngày nay, sử dụng kỹ thuật SSR ựã ựược nhiều nhà khoa học quan tâm nhằm xây dựng bản ựồ liên kết, phân lập (gen) xác ựịnh quan hệ di truyền của các giống cây trồng, vật nuôi và chuẩn ựoán cặp lai trong lai tạo giống cho UTL cao

Vì vậy, ựể nâng cao hiệu quả trong công tác chọn giống bông thì việc

sử dụng kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử ựể ựáng giá sự ựa dạng di truyền của nguồn vật liệu bố mẹ nhằm tạo ra những giống bông lai F1

có UTL cao là việc làm hết sức cần thiết Chắnh vì vậy chúng tôi tiến hành ựề

tài: Ộđánh giá ựa dạng di truyền nguồn vật liệu bố mẹ phục vụ chọn tạo giống bông lai F1Ợ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

- đánh giá mức ựộ ựa dạng di truyền của các mẫu giống bố mẹ theo các chỉ thị hình thái và phân tử (SSR) làm cơ sở ựể phân nhóm và ghép cặp lai

- Xác ựịnh ựược một số tổ hợp lai có triển vọng cho ưu thế lai cao ựể phục

vụ việc sản xuất bông F1 hiện nay

1.2.2 Yêu cầu

- đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị hình thái

- Khảo sát, ựánh giá một số ựa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR và xác ựịnh khoảng cách di truyền ựể lựa chọn các tổ hợp lai thắch hợp có ưu thế lai cao

- đánh giá ưu thế lai của các tổ hợp lai giữa các bố mẹ có khoảng cách di truyền xa nhau

1.3 Ý nghĩa của ựề tài

- Sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR ựể xác ựịnh khoảng cách

di truyền và ghép cặp lai cho ưu thế lai cao làm giảm quy mô lai, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn tạo giống bông lai F1

- Kết quả nghiên cứu của ựề tài bước ựầu giới thiệu một số tổ hợp lai F1có triển vọng phù hợp cho sản xuất bông ở miền Bắc

II TỔNG QUAN VỀ VẤN đỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Sơ lược về cây bông

Cây bông (Gossypium sp.) thuộc chi bông (Gossypyum), họ Cẩm Quỳ (Malvaceae) Chi Bông có 45-50 loài, trong ựó , 40-45 loài nhị bội ( 2n = 2x = 26) và 5 loài tứ bội (2n = 4x = 52) Có 4 loài bông trồng trọt: 2 loài nhị bội là loài bông Cỏ châu Á (G arboreum L.) và bông Cỏ châu Phi (G herbaceum L.),

có trung tâm khởi nguyên ở Ấn độ, Tây Nam Châu Á (Cỏ châu Á) và đông Phi (Cỏ châu Phi); có 2 loài tứ bội là loài bông Luồi (G hirsutum L.) và bông Hải đảo (G barbadense L.), có trung tâm khởi nguyên ở trung Mỹ (Luồi) và trung tâm khởi nguyên ở Nam Mỹ (Hải đảo) (Brubaker et al., 1999 [16]; Endrizzi et al., 1984 [19]; Fryxell, 1992 [21])

Loài bông cỏ châu Á ựược trồng chủ yếu ở Ấn độ và Pakistan, loài bông Cỏ châu Phi chỉ ựược trồng ở vùng khô hạn của châu Phi và châu Á Hiện nay, loài bông Luồi và Hải đảo chiếm ưu thế về diện tắch và sản lượng trên thế giới Loài bông Hải đảo có chất lượng xơ tốt , ựược trồng ở Liên Xô (cũ), Xu đăng, Pêru, Ấn độ và một số quốc gia khác, cung cấp 8% sản lượng bông xơ Loài bông Luồi có chất lượng kém hơn bông Hải đảo, nhưng cho năng suất cao hơn và ựược trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, ựóng góp 90% sản lượng bông xơ (Zhang et al., 2007) [49]

2.1.2 Tình hình sản xuất bông trên thế giới

Theo Babacan et al (2010) [13] và ICAC (2010) [27], niên vụ 2009/2010, diện tắch trồng bông trên toàn thế giới khoảng 30,4 triệu ha, sản lượng ựạt 22,3 triệu tấn bông xơ và có giá trị trên 35 tỷ USD Trong ựó, gần 80% diện tắch trồng bông và 85% sản lượng bông xơ của Ấn độ (10,3 triệu ha

và 5,1 triệu tấn), Trung Quốc (5,3 triệu ha và 6,8 triệu tấn), Mỹ (3,1 triệu ha

và 2,7 triệu tấn), Pakistan (3,0 triệu ha và 2,1 triệu tấn), Uzbekistan (1,3 triệu

ha và 0,9 triệu tấn) và Braxin (0,8 triệu ha và 1,3 triệu tấn)

Trên thế giới, có gần 100 quốc gia trồng bông, nhưng diện tích trồng lớn tập trung chủ yếu ở một vài nước Hơn 3 thập kỷ gần ñây, có 4 quốc gia dẫn ñầu về sản lượng bông của thế giới là Trung Quốc, Ấn ðộ, Mỹ và Pakistan Ở niên vụ 1970/1971, 4 nước này ñóng góp 48% sản lượng bông xơ thế giới, ñến niên vụ 2009/2010, tỷ lệ này là 75% ðặc biệt, sự gia tăng sản lượng bông xơ của Trung Quốc và Ấn ðộ làm cho tỷ lệ ñóng góp của Châu Á vào sản lượng bông xơ thế giới tăng từ 35% (niên vụ 1980/1981) ñến 65% (niên vụ 2009/2010) (Babacan et al., 2010) [13]

Từ năm 1950 ñến nay, năng suất bông thế giới trải qua các giai ñoạn tăng trưởng chậm xen kẽ với giai ñoạn tăng trưởng nhanh, nhưng sản lượng bông xơ liên tục tăng từ niên vụ 1977/1978 (khoảng 12 triệu tấn) ñến niên vụ 2003/2004 (khoảng 26,3 triệu tấn) Việc chấp thuận và trồng ngày càng nhiều bông chuyển gen dẫn tới năng suất bông tăng vọt trong giai ñoạn 1999/2000-2003/2004 Tuy nhiên năng suất và sản lượng bông xơ dường như bước vào giai ñoạn tăng trưởng chậm từ niên vụ 2005/2006, do tỷ lệ mở rộng diện tích trồng bông chuyển gen bị chậm lại ( Babacan et al., 2010) [13] Trong vài thập kỷ tới, hy vọng những tiến bộ mới về công nghệ có thể tạo ra giai ñoạn tăng trưởng mới về năng suất và sản lượng bông xơ

Bảng 2.1: Diện tích, năng suất và sản lượng bông của một số quốc gia ñứng ñầu

thế giới trong các liên vụ gần ñây

Diện tích (triệu ha)

Năng suất bông hạt (tạ/ha)

Sản lượng bông hạt (triệu tấn)

2.1.3 Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam

Về năng suất, do phụ thuộc quá lớn về thời tiết nên năng suất bông trồng nhờ nước trời không ổn ñịnh Có thể nói trong 7 năm qua năng suất bông của nước ta không tăng mà dao ñộng từ 1,0 - 1,2 tấn/ha Riêng ở vụ

2004 và 2005 năng suất bông có giảm ñạt khoảng 0,8 - 0,9 tấn/ha do thời tiết không phù hợp

Bảng 2.2: Diện tích, năng suất và sản lượng bông Việt Nam trong một số vụ gần ñây

Vụ nhờ nước trời Vụ có tưới Tổng niên vụ

Niên

vụ DT

(ha)

NS (tạ/ha)

SL (tấn)

DT (ha)

NS (tạ/ha)

SL (tấn)

DT (ha)

NS (tạ/ha)

SL (tấn)

Bông

Xơ (tấn)

01-02 24112 11,01 26552 2654 9,94 2638 26766 10,91 29190 10735 02-03 28931 9,81 28367 3334 12,78 4260 32265 10,11 32627 12049 03-04 19316 11,48 22169 4317 15,01 6481 23633 12,12 28650 10237 04-05 18647 8,75 16308 1613 18.91 3050 20260 9,55 19358 6913 05-06 21390 8,32 17796 1708 20,24 3458 23098 9,20 21254 7558 06-07 14145 10,39 14700 1300 20,00 2600 15445 11,20 17300 6400 07-08 6830 9,00 6122 616 19,51 1202 7446 9,83 7324 2709

Ghi chú: DT: diện tích, NS: năng suất, SL: sản lượng

(nguồn công ty cổ phần bông Việt Nam, tháng 5/2009)

Về diện tích, từ năm 1995, nhờ có các tiến bộ kỹ thuật và ñổi mới về phương thức quản lý sản xuất nên sản lượng bông tăng mạnh, cao nhất là niên

vụ 2002 - 2003 ñạt 32267 ha, vụ 2003 - 2004, diện tích bắt ñầu giảm sút ðến năm 2006 - 2007, diện tích giảm mạnh còn 17300 ha (chỉ bằng hơn nửa diện tích năm 2002 - 2003) và hiện nay vụ 2007 - 2008 chỉ còn 7324 ha Theo Công ty Bông Việt Nam [12], thực trạng trên là do nhiều nguyên nhân, chủ yếu là: (1) - Năng suất và giá thu mua bông thấp; (2) - Khí hậu, thời tiết thay ñổi thất thường ñối với diện tích trồng bông nhờ nước trời, mà diện tích này chiếm rất lớn khoảng 90% tổng diện tích trồng bông; (3) - Những hạn chế trong việc thực hiện các dự án quy hoạch phát triển bông; (4) - Chính sách khuyến khích sản xuất bông chưa phát triển Hiện nay, diện tích sản xuát bông hàng năm của Việt Nam dao ñộng khoảng 8-10 nghìn ha (Viện nghiên cứu Bông và phát triền Nông nghiệp Nha Hố, 2010/ [12]

Cho nên, thời gian tới, ñể khôi phục và phát triển cây bông theo như các yêu cầu và chỉ tiêu nêu ra trong Quyết ñịnh 29/Qð-TTg [11], bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch, ñầu tư tài chính …, thì các giải pháp công nghệ

mà trong ñó có ñẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học ñể tạo giống bông chuyển gen kháng sâu mới, có năng suất cao, chất lượng tốt, phù hợp với ñiều kiện sinh thái Việt Nam là rất cần thiết

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng giống bông lai

Ưu thế lai là hiện tượng phổ biến ở nhiều loại cây trồng Trên cây bông,

ưu thế lai về sinh trưởng và năng suất lần ñầu tiên ñược công bố bởi Mell (1894, dẫn theo ðặng Minh Tâm [7]); sau ñó, Shull (1908), theo Basu và Paroda, 1994, [17]) là người ñặt nền móng cho khái niệm ưu thế lai hiện ñại Theo Moffett (1983) [35], Cook (1909) xác nhận có thể khai thác ưu thế lai thương mại ñối với các con lai khác loài giữa bông luồi với bông hải ñảo

Trên thế giới, Ấn ðộ là quốc gia tiên phong khai thác và sử dụng các giống bông ưu thế lai với mục ñích thương mại Ngay từ năm 1970, giống

bông lai ñầu tiên của thế giới Hybrid 4 (H4) ñã ñược ñưa vào sản xuất tại Ấn ðộ; kể từ ñó, nhiều giống bông lai mới lần lượt ra ñời và việc sử dụng các giống bông lai trong sản xuất gia tăng một cách nhanh chóng Nghiên cứu khai thác ưu thế lai cây bông rất thành công tại quốc gia này, nhiều giống bông lai cùng loài hay khác loài ñã chứng tỏ ưu thế lai về khả năng cho năng suất, tính thích nghi, ñặc biệt là ưu thế lai về chất lượng xơ Hiện tại, Ấn ðộ

là một trong những nước ñứng ñầu thế giới về sản xuất bông vải, hơn 40% diện tích trồng bông ở Ấn ðộ ñược trồng bằng các giống ưu thế lai Diện tích sản suất hàng năm chiếm 21% diện tích sản suất của cả thế giới, sản lượng chiếm 12% Mặc dù giá thành hạt giống bông lai còn cao hơn hạt giống thuần, nhưng bù lại các giống bông lai cho năng suất cao hơn (trung bình ñạt trên 0,8 tấn/ha) vì thế các giống bông lai vẫn ñược sử dụng rộng rãi trong sản xuất (Bhagirath Choudhary và Gaurav Laroia, 2001) [15]

Theo Hsu và Gale, 2001 [22], ICAC, 2007 [26], Trung Quốc cũng là quốc gia ñứng ñầu thế giới về sản xuất và tiêu thụ bông vải với ña phần diện tích trồng các giống bông lai (chiếm khoảng 50% diện tích), việc sản xuất bông lai ở Trung Quốc chủ yếu tiến hành bằng phương pháp thủ công

2.3.Chọn giống ưu thế lai

2.3.1 Lai giống và nguyên tắc chọn cặp bố mẹ

Lai giống là sự giao phối giữa 2 hay nhiều nhiều dạng bố mẹ có tính di truyền khác nhau ñể tạo ra biến dị tổ hợp Các dạng thực vật do sự giao phối

tự nhiên hoặc nhân tạo ñã kết hợp ñược những tính trạng di truyền của bố mẹ

và tạo ra các cây (con) lai

Lai giống là phương pháp cơ bản ñể tạo ra biến dị tổ hợp phục vụ cho việc chọn tạo giống Thông qua quá trình lai giống mà có thể phối hợp ñược các ñặc tính và tính trạng có lợi giữa các dạng bố mẹ vào con lai Bố mẹ truyền cho con cái bộ gen của chúng và kết quả của quá trình tái tổ hợp mà

nhiều kiểu gen mới ựã ựược tạo ra, sau khi tương tác với môi trường ựã tạo ra các kiểu hình mới rất có ắch cho chọn giống (Nguyễn Văn Hiển)[3]

Mục ựắch của chọn giống là chọn ựược các kiểu gen mong muốn vì thế kết quả của phương pháp lai là ựiều quyết ựịnh Chọn ựược bố mẹ ựể thỏa mãn các yêu cầu ựặt ra là cơ sở ựể tạo ra các biến dị tổ hợp mong muốn Dựa vào kinh nghiệm và thành tựu của các nhà chọn giống thế giới, trên cơ sở di truyền học người ta ựã ựưa ra các nguyên tắc cơ bản ựể chọn cặp bố mẹ khi lai như nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái ựịa lý, các yếu tố cấu thành năng suất, thời gian các giai ựoạn sinh trưởng, tắnh chống chịu và các tắnh trạng bổ sung ựặc biệt

2.3.1.1 Nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái ựịa lý

Kiểu hình là kết quả của mối tương tác giữa kiểu gen và môi trường Trong quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo ựã hình thành những thắch nghi với các ựiều kiện môi trường nhất ựịnh

Thực chất của nguyên tắc chọn lọc bố mẹ theo loại hình sinh thái ựịa lý là liên kết các tắnh trạng và ựặc tắnh của các dạng hoặc giống xa về ựịa lý, sinh thái vào một giống mới Các dạng lai xa nhau về ựịa lý là sự tổ hợp các gen khác nhau của bố mẹ Sự khác biệt về mặt di truyền ựược biểu hiện ra bên ngoài bằng các tắnh trạng và ựặc tắnh như chịu hạn, chịu úng, chịu chua, chịu rét, thời gian sinh trưởng ngắn, dài Việc chọn bố mẹ xa nhau về ựịa lý nhằm tổ hợp ựược các kiểu gen kiểm tra tắnh trạng khác nhau Do ựó kết quả của lai giống sẽ chắc chắn hơn và vật liệu cung cấp cho quá trình chọn lọc sẽ phong phú hơn, xác suất chọn ựược giống tốt phù hợp với ựiều kiện sinh thái ựịa phương cao hơn

Ở Việt Nam, bằng nguyên tắc này các nhà chọn lọc giống ựã tạo ra ựược nhiều giống có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao như giống lúa NN1 do Bác sĩ Lương đình Của tạo ra bằng lai giữa giống Ba Thắc của Nam Bộ và Bunco của Nhật Bản, Giống VN10 do Trần Như Nguyện lai tạo giữa hai dạng

xa nhau về ựịa lý (A5 là dòng ựột biến có nguồn gốc đông Nam Á và Rumani

45 có nguồn gốc Châu Âu ôn ñới) có khả năng chịu rét tốt, trồng vụ xuân cho năng suất cao và ổn ñịnh (Nguyễn Văn Hiển, 2000) [3]

2.3.1.2 Nguyên tắc khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

Khi chọn bố mẹ nhằm nâng cao năng suất ở các thế hệ lai thì bố và mẹ phải có sự khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất Sự khác nhau này cần

có khả năng bổ sung lẫn nhau, phối hợp với nhau ñể tạo ra một giống mới hoàn chỉnh hơn

Các yếu tố cấu thành năng suất là các tính trạng số lượng Các tính trạng này hầu hết do hệ thống ña gen quyết ñịnh Cụ thể, khi xét năng suất của một cây trồng thì năng suất trên một ñơn vị diện tích do năng suất từng cá thể và số

cá thể trên ñơn vị diện tích ñó quyết ñịnh Năng suất cá thể cao và trồng ñược nhiều cá thể trên ñơn vị diện tích là mục tiêu phấn ñấu của nhà chọn giống Năng suất cá thể ñược tạo nên bởi các yếu tố cấu thành năng suất Ví dụ, ở nhóm cây ngũ cốc là số lượng bông, số hạt trên bông, khố lượng 1000 hạt

2.3.1.3 Nguyên tắc khác nhau về thời gian các giai ñoạn sinh trưởng

Tùy thuộc vào mục ñích của nhà chọn giống và nhu cầu của sản xuất

mà phải tạo ra các giống có thời gian sinh trưởng khác nhau từ ngắn, trung bình ñến dài ðặc biệt ñể tăng vụ tránh các ñiều kiện thời tiết bất lợi gây thiệt hại cho sản xuất cần có các giống có thời gian sinh trưởng từ ngắn ñến cực ngắn, song năng suất và chất lượng phải ñảm bảo yêu cầu

ðể phát huy tối ña tự do tổ hợp của các kiểu gen quyết ñịnh các pha sinh trưởng của cây trồng nhằm tạo ra giống mới có thời gian sinh trưởng như

ý muốn thì bố và mẹ dùng trong các phép lai cần có cấu trúc thời gian các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau Vì vậy, khi nghiên cứu nguồn vật liệu khởi ñầu của nguồn gen cần có các quan sát tỉ mỉ về thời gian hoàn thành các giai ñoạn sinh trưởng

2.3.1.4 Nguyên tắc khác nhau về tính chống chịu sâu bệnh

Cây trồng vốn có tính chống chịu sâu bệnh nhờ thừa hưởng tính di truyền của tổ tiên chúng Tính chống chịu này dần yếu ñi do có sự bảo vệ của con người trong quá trình canh tác Việc chọn tạo ra các giống vừa có năng suất cao vừa chống chịu tốt với các loài sâu bệnh gây hại là mục tiêu của bất

kỳ chương trình chọn giống nào

Mặt khác ở mỗi vùng sinh thái ñặc thù có các nòi sâu bệnh khác nhau

Vì thế một giống hoàn toàn kháng bệnh ở vùng này nhưng khi chuyển sang vùng khác lại bị nhiễm bệnh Một giống cây trồng có khả năng thích ứng rộng cần có phổ kháng sâu bệnh rộng, cùng lúc có thể chống ñược nhiều nòi sinh lý khác nhau Vì vậy, khi chọn các dạng bố mẹ cần chú ý sự khác nhau về tính kháng bệnh ngang ñể tổ hợp ñược một phổ kháng sâu bệnh rộng vào giống lai

Ví dụ CR203 là giống chống rầy với cả 3 biotyp nên ñược trồng rất nhiều vùng khác nhau từ vĩ tuyễn 17 trở ra, giống IRI 352 kháng ñạo ôn tổng hợp Các giống lúa này ñều ñược tạo ra nhờ phép lai các dạng bố mẹ có tính kháng rầy và kháng ñạo ôn khác nhau (Nguyễn Văn Hiển, 2000) [3]

2.3.1.5 Nguyên tắc bổ sung các tính trạng cần thiết

Giống cây trồng là sản phẩm của toàn thể loài người Một giống cây trồng tốt sẽ ñược con người nhân rộng ra nhiều vùng ñịa lý khác nhau Nhập nội giống cây trồng có tính trạng tốt là phương pháp nhanh ñể ñưa giống vào sản xuất Tuy nhiên, các giống cây trồng mới tạo ra khi di chuyển từ vùng sinh thái này sang vùng sinh thái khác tỏ ra còn khiếm khuyết hoặc thiếu một

số tính trạng quan trọng nào ñó như kém chịu rét, chống ñổ không tốt, chất lượng không cao Do vậy, các giống mới ñược tạo ra bằng các phương pháp hiện ñại ñều là các kiểu gen tốt, chúng chỉ còn thiếu một số tính trạng mà nếu ñược bổ sung sẽ thành một giống hoàn chỉnh

2.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện ưu thế lai

- Ưu thế lai giả ñịnh (heterosis): con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính

trạng nghiên cứu so với số ño trung bình của bố mẹ trên cùng tính trạng

( 1 2)

2 1

1

* 5 , 0

* 5 , 0

P P

P P

F1: Số ño trung bình của tính trạng ở con lai F1

P1: Số ño trung bình của tính trạng P1

P2: Số ño trung bình của tính trạng ở P2

- Ưu thế lai thực (heterobeltiosis): Con lai biểu hiện sự hơn hẳn tính

trạng nghiên cứu so với bố mẹ có số ño cao nhất

F1: Số ño của tính trạng ở con lai F1

Pb: Số ño tính trạng ở bố hoặc mẹ cao nhất

- Ưu thế lai chuẩn ( standard heterosis): Con lai biểu hiện sự hơn hẳn

trên tính trạng nghiên cứu so với một giống ñang phổ biến rộng trong vùng

F1: Số ño của tính trạng ở con lai F1

S: Số ño tính trạng ở giống chuẩn

2.4 Một số ñặc ñiểm chính của giống bông lai F1

Giống bông lai F1 là giống ñược tạo ra do giao phối giữa 2 giống bố mẹ mang nhiều ñặc ñiểm tốt của bố mẹ Ở ñời thứ nhất, con lai ñược tạo ra có ưu thế về sinh trưởng, phát dục, tính chống chịu và kết quả giống F1 có năng suất cao hơn bố mẹ, phẩm chất tương ñương hoặc cao hơn bố mẹ

Trong trường hợp các con lai cùng loài H x H có thể cho năng suất tăng

từ 30-60% thậm chắ tăng gấp 2-3 lần bông thường Ở Ấn ựộ, bình quân năng suất bông lai trên toàn quốc gấp 1,5 Ờ 1,6 lần bông thường

Nhìn chung các giống UTL F1 có xu hướng làm tăng chiều dài xơ (khoảng 90%), tăng ựộ bền xơ (6-7%), chống chịu tốt, sinh trưởng mạnh, các tắnh trạng khác giữ nguyên hoặc có phần cải tiến

Trong giai ựoạn ựầu cây mọc nhanh, ựều, khỏe Giai ựoạn trước khi nở hoa cây cao khỏe, nhiều cành lá, lá dày Với mật ựộ thưa 20 Ờ 25 ngàn cây/ha cây phát triển cân ựối, bón nhiều phân nhưng không bị lốp, duy trì bộ lá lâu

Ưu ựiểm này ựã làm cho giống F1 có năng suất rất cao, có cơ hội ựể thâm canh tăng hiệu quả trồng trọt (Phan Thanh Kiếm, 1998) [4]

2.5 đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

2.5.1 đa dạng di truyền và khái niệm về chỉ thị di truyền

2.5.1 1 đa dạng di truyền

đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức ựộ gen Các gen ựa hình là nguyên nhân dẫn ựến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể nhất là ựối với quần thể giao phối Sự khác biệt kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thắch nghi hơn quần thể khác khi chịu những thay ựổi của môi trường

Sự sai khác di truyền giữa hai bố mẹ là cơ sở ựể tạo nên ưu thế lai Trong một chừng mực nhất ựịnh, nếu sự sai khác di truyền của bố mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao

Nghiên cứu sự sai khác di truyền giữa các bố mẹ có ý nghĩa rất lớn trong chọn giống đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì ựược nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thắch nghi với những thay ựổi của ựiều kiện ngoại cảnh (La Tuấn Nghĩa, 2004) [6]

2.5.1.2 Khái niệm về chỉ thị di truyền

Chỉ thị di truyền là một thuộc tính hay một ñặc ñiểm có thể ño ñếm ñược và có khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Theo Paterson

và cộng sự, 1991 [37] một ñặc ñiểm ñược coi là chỉ thị di truyền nhất thiết phải ñảm bảo hai tiêu chuẩn:(i) phải khác biệt giữa bố và mẹ; (ii) phải ñược truyền lại cho chính thế hệ sau

Các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống luôn quan tâm ñến chỉ thị

di truyền và tính ưu việt của nó trong việc nghiên cứu sự kế thừa dấu hiệu di truyền và những biến ñổi của chúng trong quần thể, ñặc biệt là những tính trạng nông sinh học có lợi cho con người Chỉ thị di truyền có thể nhận biết sự sai khác về mặt thông tin di truyền giữa 2 hay nhiều cá thể Sự sai khác này có thể nhận biết bằng chỉ thị như: chỉ thị sinh hóa, chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử Những chỉ thị này từ lâu ñã là những công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống

Chỉ thị sinh hóa là chỉ thị có bản chất là ña hình protein gồm isozyme

và các loại protein dự trữ Những chỉ thị sinh hóa chỉ thể hiện ở một số giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể Cơ chế này ñược ñiều chỉnh bởi vật chất di truyền là ADN Một protein có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai ñoạn nào của quá trình phát triển cá thể cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN- ARN- Protein Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và phụ thuộc vào các giai ñoạn phát triển của cá thể nên chỉ thị sinh hóa hạn chế về mặt ứng dụng

Chỉ thị hình thái là chỉ thị có thể nhìn thấy và ño ñếm ñược; chúng ñược sử dụng như là chỉ thị di truyền và dễ dàng nhận biết ñược ở dạng trội lặn Tuy nhiên, chỉ thị hình thái chịu tác ñộng của quá trình tương tác gen, ñiều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể ( Bùi Chí Bửu và cs, 1995) [2] Vì thế, cần kết hợp chỉ

thị hình thái và các chỉ thị khác nhằm mang lại hiệu quả cao trong quá trình chọn tạo giống

Chỉ thị phân tử AND là những chỉ thị có bản chất ña hình ADN, nó có thể là một ñoạn gen hoặc một ñoạn ADN có vị trí xác ñịnh trên nhiễm sắc thể (NST) di truyền theo quy luật Menden

Trong những năm gần ñây, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu hệ gen của nhiều loại cây trồng Các nhà khoa học ñã thiết lập bản ñồ chi tiết về các chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng Trên cơ sở

ñó chọn lọc gián tiếp trên các chỉ thị này, ñây ñược gọi là phương pháp chọn lọc dựa vào chỉ thị ADN – Marker Assisted Selection (MAS) (Phan Hữu Tôn, 2004) [9]

2.5.2 Một số chỉ thị ứng dụng trong nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật

2.5.2.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims)- ða hình

ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế

RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic dựa trên sự phân cắt ADN bằng các enzim giới hạn (Restriction enzymes) và kỹ thuật lai ADN với mẫu dò Kỹ thuật này tạo nên các ñoạn cắt khác nhau ñược phân biệt bằng ñiện di ñồ, các ñoạn cắt ñược gọi là “dấu vân tay” ñặc trưng cho từng phân tử ADN Ở thực vật, chỉ thị này lần ñầu tiên ñược áp dụng trong nghiên cứu gen tổng hợp ARN ribosome trong vùng cấu trúc nhân của lúa

mỳ Từ ñó chỉ thị này ñược ứng dụng ñể lập bản ñồ di truyền trên một số ñối tượng khác như cà chua, ngô, lúa … (Leister và cs, 1999) [31]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội, có khả năng biểu hiện trong tất cả các alen của cùng locus gen Vì thế, có thể phân biệt các cá thể ñồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) ñây là ñặc trưng ưu việt của chỉ thị RFLP Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP vẫn còn nhiều hạn chế do lượng mẫu lớn,

kỹ thuật phức tạp, thời gian kéo dài và ñầu tư trang thiết bị kỹ thuật lớn

2.5.2.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphims) – ða hình

ñộ dài các ñoạn nhân chọn lọc

Chỉ thị AFLP là sự khuếch ñại có chọn lọc các ñoạn ADN ñược cắt bởi enzyme giới hạn AFLP phát hiện ña hình thông qua sự khác nhau về ñộ dài của các ñoạn ADN ñược nhân lên Kỹ thuật linh hoạt, có thể phát hiện sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ ñoạn ADN nào

Kỹ thuật này có nhiều ưu ñiểm như cho ñộ ña hình cao, lượng ADN tổng số tiêu tốn rất ít, dễ dàng lặp lại và có thể phân tích ADN ở bất kỳ nguồn cốc hay mức ñộ phức tạp nào Tuy nhiên chỉ thị này không có khả năng phân biệt ñược giữ các ñồng hợp tử và dị hợp tử, kỹ thuật phức tạp và ñòi hỏi ñầu

tư trang thiết bị lớn

2.5.2.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphims)- ða hình các ñoạn ADN nhân ngẫu nhiên

Chỉ thị RAPD là kỹ thuật ñược dựa trên cơ sở PCR với các ñoạn mồi ñơn có trình tự ngẫu nhiên (10 nucleotid) Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở 2 ñầu có sự ñịnh hướng ngược nhau trong khoảng tối ña 2000 base dọc theo nhiễm sắc thể Do mồi ngắn nên phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều ñoạn ADN có kích thước và trình tự như nhau

Kỹ thuật RAPD có nhiều ưu ñiểm như phát hiện ña hình ñáng tin cậy, phương pháp tiến hành ñơn giản, dễ sử dụng, thời gian ngắn, giá thành thấp,

sử dụng lượng ADN khuôn ít, không cần trang thiết bị phức tạp … nhưng chỉ thị này cần phân biệt ñược thể dị hợp tử, ñộ nhảy của RAPD phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện phản ứng ( thành phần phản ứng, nhiệt ñộ gắn mồi…) không chắc chắn các ñoạn có cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau có thực sự tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen và ñôi khi không lặp lại ñược, ñặc biệt là những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mỳ (Devos K.M và cs, 1992) [18]

2.5.2.4 SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản cịn được gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsattellite)

Các đoạn lặp lại gồm từ 2 đến 6 cặp nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen ðoạn SSR điển hình là đoạn trình từ 2-3 cặp nucleotit, lặp lại 9-30 lần Các đoạn trình tự bảo thủ thường nằm trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT …Các đoạn lặp lại cĩ kích thước dài ngắn khác nhau tùy theo từng lồi, từng giống cây trồng và vật nuơi

Ngay trong một genome cũng cĩ mức độ lặp lại của nhiễm sắc thể khác nhau Ở động vật cĩ vú, một đoạn trình tự lặp lại một vài lần chiếm > 50%, cịn đoạn lặp lại hàng trăm nghìn lần chỉ chiếm 20-25% Các đoạn SSR thường ở vùng gần tâm động hoặc đầu mút của NST và cĩ vai trị điều hịa hoạt động của gen

Kỹ thuật SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu

đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuơi khác nhau trên cùng một lồi động vật hay thực vật Ngày nay sử dụng kỹ thuật SSR để xây dựng bản

đồ liên kết, phân lập (gen), xác định quan hệ di truyền giữa các dịng, giống cây trồng, vật nuơi và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (C.J.Bell, 1994 và D.Tautz, 1984) [14],[44]

2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Trước đây, việc ứng dụng các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nơng học quan trọng đã được nhiều nhà chọn giống quan tâm và sử dụng, nĩ được xem như là một phương tiện hữu ích trong quá trình chọn tạo giống mới Tuy nhiên việc ứng dụng cịn gặp nhiều hạn chế Vì thế, chỉ thị phân tử ra đời đã trở thành cơng cụ đắc lực hỗ trợ phương pháp truyền thống, giải phĩng cho các nhà chọn tạo giống một lượng lớn cơng việc khi tiến hành chọn lọc Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra các ưu thế của chỉ thị phân tử so với của chỉ thị hình thái như sau:

- Chỉ thị phân tử có thể xác ñịnh kiểu gen của mỗi locus tại bất kỳ giai ñoạn nào và bất cứ mức ñộ nào ( tế bào , mô hay toàn bộ cơ thể)

- Số lượng chỉ thị ADN là rất lớn, trong khi ñó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

- Các Alen khác nhau thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc ñánh giá các chỉ thị hình thái thường hay ñi kèm với hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

- Các alen của các chỉ thị phần lớn là ñồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào Các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác với kiểu trội - lặn, do ñó bị hạn chế sử dụng trong nhiều

tổ hợp lai

- ðối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc ñánh giá các cá thể trong quần thể phân ly Trong khi ñó, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp

Ngày nay, phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử là phương pháp hữu hiệu trợ giúp ñắc lực cho phương pháp truyền thống nhằm khắc phục các trở ngại mà chọn giống truyền thống không hoặc rất khó giải quyết Ngoài ra phương pháp này còn giúp cho chọn lọc các cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra

Gần ñây, các nhà khoa học ñã phân tích cặn kẽ một số mô hình MAS Theo ñó chỉ cần trải qua 3-4 thế hệ mà chưa phải ñến 6-8 thế hệ ( ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế) là có thể ñạt ñược mục tiêu của mình (Frey và cs,2004) [20]

2.5.3.1.Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Trong những năm gần ñây, với sự phát triển nhanh chóng của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng Ứng dụng chỉ thị phân

tử ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong việc

đánh giá mối qua hệ di truyền và việc lập bản đồ liên kết gen Qua đĩ đã tạo

ra nhiều giống mới thuộc nhiều lồi cây trồng khác nhau, mang các đặc tính mong muốn phù hợp với nhu cầu sản xuất

Những nghiên cứu gần đây sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền của nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, lúa mì, cà chua, khoai tây, đậu tương… đã mang lại nhiều thành cơng lớn cho các nhà chọn giống Các nhà khoa học Trung Quốc đã sử dụng 28 cặp mồi SSR phân tích 90 giống đậu đũa, kết quả đã nhân được 128 alen với mức tương đồng di truyền trung bình

là 44%

ðối với cây ăn quả sử dụng kết hợp kỹ thuật SSR và AFLP phân tích

đa dạng di truyền của tập đồn giống bưởi chùm cho thấy gần 99,1% của 335 SSR loci, 72 % của 343 AFLP loci là đa hình và 9,85 alen/SSR locus được phát hiện Giá trị đa dạng di truyền được thay đổi từ 0,19 đến 0,91 Tỷ lệ dị hợp tử giao động từ 0,13 đến 0,28 Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy tập đồn giống bưởi chùm phân thành 8 nhĩm, gồm một số nhĩm chính như nhĩm bưởi Shatain, Wendan và các giống lai Kết quả phân loại cho phép mở rộng các giống bưởi này làm genotyp nền để sử dụng cho mục tiêu chọn giống (Liu Yong và cs, 2005) [32]

Trong nghiên cứu chọn giống cây trồng, việc xác định cấu trúc di truyền, đánh giá đa hình và phân nhĩm di truyền của quần thể bố mẹ là việc làm cần thiết và cĩ ý nghĩa Ứng dụng chỉ thị phân tử và cơng tác chọn tạo giống cây trồng là một hướng đi mới tại Việt Nam Song song với các phương pháp chọn tạo giống truyền thống thì đây được coi là cơng cụ hữu ích làm tăng hiệu quả và gĩp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống Tuy nhiên việc ứng dụng cơng nghệ sinh học nĩi chung và chỉ thị phân tử nĩi riêng trong chọn giống cây trồng ở Việt Nam cịn nhiều hạn chế, phần lớn các kết quả đạt được chỉ ở mức độ phịng thí nghiệm

Bùi Mạnh Cường và cs, 2003 [10] đã sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá

29 dịng ngơ thuần với 60 mồi ngẫu nhiên Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền biến động từ 0,47- 0,77 chứng tỏ các vật liệu nghiên cứu cĩ sự đa hình rất lớn Phân nhĩm ưu thế lai (UTL) theo phương pháp PCO (Principal coordinate analysis – Gower,1966) xác định 2 nhĩm chính, tồn tại tương quan tuyến tính dương với r=0,61-0,67, xác định được 3 tổ hợp lai năng suất cao hơn bố mẹ từ 9-14% Tương tự, Bùi Văn Thắng và cs, 2003 [10] sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn

33 giống lạc chống chịu bệnh gỉ sắt, thu được 109 phân đoạn ADN, trong đĩ

cĩ 66 phân đoạn đa hình (chiếm 60,6%) cho thấy cĩ sự khác biệt di truyền từ

4 – 18% Phân nhĩm theo GD cho thấy các giống cĩ cùng vùng địa lý, sinh thái cùng nhĩm; cĩ thể chọn làm bố mẹ phục vụ cho cơng tác lai tạo giống

Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 35 giống lạc cĩ phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn Lê Thị Muội và cs,

2005 [5] đã sử dụng 20 cặp mồi SSR để đánh giá Kết quả cho thấy, cĩ 19 cặp mồi đa hình, hệ số sai khac di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12 – 49% Kết quả đã ghi nhận các giống lạc cĩ cùng nguồn gốc hoặc cĩ cùng mức

độ kháng bệnh đều được xếp vào cùng một nhĩm nhỏ

Trong những năm gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tính trạng sâu bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trương, các tính trạng chất lượng…

2.5.3.2 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bơng vải

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của cơng nghệ sinh học, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bơng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

Theo Liu và cs, 2000 [33] sử dụng 65 cặp mồi để khuếch đại 70 locus trong genome (nhiễm sắc thể) của các lồi bơng Kết quả nghiên cứu chỉ thị SSR được xác định trong nghiên cứu này đã cung cấp những số liệu cĩ mức

ñộ tin cậy cao là cơ sở cho các nghiên cứu khác Hơn nữa, có thể sử dụng kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị khác ñể lập bản ñồ liên kết của genome bông Thật vậy, gần ñây bản ñồ liên kết ñã ñược tạo ra với sự kết hợp sản phẩm của

199 RAPD và SSR trong chọn lọc giống bông (Ulloa và cs, 2000) [45]

Một số nghiên cứu gần ñây khi sử dụng các chỉ thị như RAPD, AFLP

và SSR cho thấy mức ñộ ña hình của các loài bông trồng tương ñối thấp, có thể từ 1 – 3% (Wendel và cs, 1992; Tatineni và cs, 1996; Pilley và Myers, 1999; Lu và Myers, 2002) [48], [47], [34] và 1 – 8% (Multani và Lyon, 1995) [36] Một số kết quả ở Úc, Trung Quốc và Pakistan cũng có kết quả tương tự (Zuo và cs, 2000; Rahman và cs, 2002) [50], [38] Tuy nhiên, một số kết quả khác cho thấy mức ñộ ña hình của các giống bông khá cao M.K Rana và K.V Bhat, 2005 [40] nghiên cứu 59 giống bông thuộc 4 loài bông trồng cho thấy, ña hình giữa 59 giống bông ñạt 36% Trong ñó mức ñộ tương ñồng di truyền trung bình của 41 giống bông luồi (Gossypium hirsutum) ñạt 74, ñồng thời qua nghiên cứu các tác giả ñã khẳng ñịnh rằng ña hình giữa các loài bông nhị bội cao hơn các loài bông tứ bội

Trước ñó Rahman và cs, 2002 [40] nghiên cứu ña hình của 27 giống bông cho mức tương ñồng di truyền là 66,2% Sử dụng ñồng thời chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Tatineni và cs, 1996 [43] ñã ñánh giá quan hệ di truyền của 16 giống bông nhập nội, khẳng ñịnh tương quan tuyến tính dương (r= 0,63) giữa khoảng cách di truyền theo chỉ thị RAPD và khoảng cách phân loại theo chỉ thị hình thái Trong khi ñó, Ivan Schuster và cs, 2006 [29] sử dụng microsatellites nghiên cứu quan hệ di truyền của 53 giống bông cho kết quả tương quan tuyến tính trung bình ñạt 0,4 ± 0,01 Một số giống nghiên cứu khác, Iqbal và cs, 1997 [31] xác ñịnh tỷ lệ ña hình 89,1% trong 22 giống bông luồi trong ñó 17 giống phân vào cùng nhóm có tỷ lệ ñồng dạng di truyền 81,5 – 93,4%; chỉ riêng giống nhị bội mức tương ñồng thấp (55,7%) so với các giống tứ bội ðối với 2 loài bông cỏ Châu phi (G herbaceum) và bông cỏ

châu Á (G arboretum) mức ñộ tương ñồng ñạt 72% ñược ghi nhận trong một nghiên cứu khác (Rana và cs, 2002) [39]

Trong những năm gần ñây, chỉ thị SSR ñược sử dụng khá phổ biến ñể ñánh giá ña hình và lập bản ñồ gen Jinfa Zhang và cs, 2005 [30] ñã sử dụng

88 cặp mồi SSR nghiên cứu ña hình của 24 giống có nguồn gốc khac nhau ñã thu ñược 177 allen với tương ñồng di truyền dao ñộng từ 0,69 ñến 0,94 (trung bình 0,77)

Ngày nay nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã sử dụng kết hợp nhiều chỉ thị phân tử ñể nghiên cứu, ñánh giá ña hình bông Nhóm tác giả Ebtissam

H A Hussein và cs, 2007 [25] ñã sử dụng chỉ thị RAPD, SSR, AFLP ñồng thời kết hợp giữa các chỉ thị hình thái ñể ñánh giá 11 giống bông ( Luồi và Hải ñảo) Kết quả cho thấy mức ñộ tương ñồng di truyền tương ñối cao và dao ñộng tương ứng là 63,8 – 95,9%, 13,8 – 98,1%, 13,7 – 99,3 % và 78,2 – 98,0%; 11 giống bông ñược phân thành 2 nhóm chính (1 nhóm có 8 giống gồm cả bông Luồi và Hải ñảo, nhóm còn lại gồm 3 giống bông Luồi) Tương

tự, Hussein và cs, 2002 [24] sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, SSR, ISSR, AFLP phân tích 13 giống bông ñã chứng minh rằng giống bông Luồi (Hindi) ñược tách ra từ các giống bông Hải ñảo ở Ai Cập Trong khi ñó, Samina N Qureshi và cs, 2004 [41] sử dụng chỉ thị EST – SSR nghiên cứu ña hình giữa các loài bông cho thấy ña hình giữa các giống cùng loài bông luồi (Gossypium hirsutum L.) là 26%, giữa loài bông Luồi và bông Hải ñảo (Gossypium barbadense L.) là 52%

Kế thừa những kết quả trên, Wang và cộng sự, 2004 [47] ñánh giá ña hình của 50 giống bông trồng dựa vào chỉ thị EST-SSR, tương quan tuyến tính giữa các giống từ 0,11 ñến 0,83 (trung bình 0,47); các giống ñược phân thành 2 nhóm chính và hầu hết ñều phù hợp với phả hẹ các giống bông (nguồn gốc các giống bông) ðiều ñó ñã chứng minh rằng, chỉ thị EST-SSR là công cụ hữu hiệu ñể phân tích, ñánh giá ña hình cây bông

Sử dụng ựồng thời các chỉ thị RAPD, ISSR, SSR Hussein và cs, 2006 [23] ựã ựánh giá 21 giống bông luồi cho kết quả về tương ựồng di truyền tương ứng là 72,1 - 95,7%; 79,1 Ờ 95,0% và 72,1 Ờ 96,6% Trong ựó, các nhà khoa học Trung Quốc ựã nghiên cứu tương quan di truyền của 36 giống bông

sử dụng các chỉ thị SSR, ISSR và RAPD thu ựược mức tương ựồng di truyền của các giống nghiên cứu dao ựộng từ 57,5 Ờ 92,9% Tác giả ựã phân tắch sơ

ựồ hình cây cho thấy, sử dụng chỉ thị RAPD cho kết quả thành 2 nhóm chắnh, nhóm 1 gồm tất cả các giống thuộc loài bông Hải ựảo ngoại trừ giống PEA

(Pima Early American) Tuy nhiên, chỉ thị ISSR và SSR cho kết quả là 2

nhóm chắnh nhưng nhóm 1 là các giống bông Hải ựảo và nhóm 2 gồm các giống bông Luồi và giống PEA Mặc dù kết quả phân tắch hình cây có những khác nhau giữa các chỉ thị nhưng phần lớn vẫn tương ựồng với nhau Nhóm tác giả cho rằng, những khác nhau ựó có thể là do ảnh hưởng của môi trường ựến các loài bông nghiên cứu hoặc do sự tiến hóa cơ học (Hussein và cs, 2002) [24]

Ở Việt Nam, việc chọn giống bông ựã ựược nghiên cứu từ rất lâu nhưng chủ yếu dựa vào các ựặc ựiểm hình thái (di truyền số lượng) Việc ứng dụng công nghệ sinh học mới ựược quan tâm và bắt ựầu nghiên cứu vào những năm gần ựây đánh giá ựa dạng di truyền nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị phân

tử kết hợp với chỉ thị hình thái ựể nhanh chóng tạo giống bông lai F1 phù hợp với nhu cầu sản xuất hiện nay là việc làm rất cần thiết

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Giống bông: 25 giống bông bố mẹ có nguồn gốc khác nhau

1 T1 Cỏ Thanh Sơn PT Việt Nam Giống bông cỏ thu thập T.Sơn PT

vào Việt Nam trước năm 1945

những năm gần ñây

những năm gần ñây

có chứa gen kháng sâu

nguồn thực liệu Israen

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác

- Gồm: 25 mẫu lá bông của nguồn vật liệu bố mẹ

- Sử dụng 10 cặp mồi ựược chọn lọc từ tổ hợp 50 cặp mồi SSR sử dụng

ựể ựánh giá tắnh ựa hình ADN Danh sách trình tự các cặp mồi theo bảng sau :

- Các vật tư và dụng cụ cần thiết cho các thắ nghiệm

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát, ựánh giá nguồn vật liệu khởi ựầu

- đánh giá ựa dạng di truyền nguồn vật liệu khởi ựầu bằng chỉ thị phân

tử SSR

- Lai tạo các tổ hợp lai

- Khảo sát, ựánh giá, so sánh các con lai F1 (ựánh giá ưu thế lai)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 đánh giá bố mẹ bằng các chỉ tiêu hình thái

Các bố mẹ ựược gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu theo quy ựịnh của

+ Chuẩn bị mẫu lá bông : mẫu lá của các dòng giống bông ựược thu từ

những cây ựược treo biển ựánh dấu, cho vào ống eppendorf 2ml, sau ựó

nhanh chóng cho vào Nitơ lỏng, mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong

tủ lạnh ở nhiệt ựộ - 850C

+ Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB với một số cải tiến

+ Kiểm tra ADN và sơ bộ xác ựịnh ựược tắnh trạng thông qua ựiện di trên agarose 0,8%

3.3.2.1 Phương pháp PCR - SSR

+ Phản ứng PCR ựược thực hiện trên máy PCR iCycler, với thể tắch phản

ứng 15ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng là H2O, 1X PCR buffer,

2,5 mM MgCl2, 100ộM dNTPs, 25pM mồi, 25-50ng ADN trong số và 0,5-1

U Taq DNA polymerase

+ Chu kỳ nhiệt ựộ cho phản ứng PCR-SSR (1) 950C trong 7 phút, (2) 940C

trong 30 giây, 50 Ờ 600C trong 01 phút, (4) 720C trong 01 phút, (5) các bước từ 2

ựến 4 ựược lặp lại 35 chu kỳ, (6) 720C trong 5 phút, (7) giữ lạnh ở 40C

+ điện di sản phẩm PCR trên agarose 3% ở 100V trong 03 giờ Nhuộm gen

trong Ethidium Bromide 0,5 ộg/ml 15 phút và soi dưới ựèn UV, chụp ảnh

Sử dụng chương trình NTSYSpc version 2.1 ựể phân tắch ựa dạng di truyền, dự ựoán các tổ hợp lai

3.3.3 đánh giá, so sánh sơ bộ bố mẹ và các tổ hợp lai

- Bố trắ thắ nghiệm theo khối ựầy ựủ ngẫu nhiên (RCBD), 3 lần nhắc lại, diện tắch mỗi ô là: 6 m2

- Khoảng cách cây: 1,00m x 0,25m x 1 cây Mật ựộ 4 vạn cây/ha

Kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật (theo quy trình kỹ thuật chung của giống bông lai).

- Giống ựối chứng là giống VN01-2

3.4 Chỉ tiêu theo dõi

3.4.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng

- Chất lượng và nồng ựộ ADN tổng số

- Số phân ựoạn ADN trên mỗi mồi và tổng số phân ựoạn

- Các hình ảnh của kết quả thắ nghiệm

3.4.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ựồng

3.4.2.1 Tiêu chuẩn ựánh giá ựối với một số ựặc ựiểm hình thái của giống bông

Theo tiêu chuẩn ngành do Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn ban hành 2004 bảng số liệu như sau:

Tiêu chuẩn Tính trạng

Theo dõi 10 cây ựại diện/ công thức/ lần nhắc (trừ những cây ở ựầu hàng)

đánh giá tại giai ựoạn có 50% số cây có quả ựầu tiên nở

3.4.2.4 Chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

+ Số quả/cây

+ Khối lượng quả (g)

+ Tỷ lệ xơ (%)

+ Khối lượng 100 hạt (gam)

+ Năng suất bông hạt lý thuyết (tạ/ha)

+ Năng suất bông hạt thực thu (tạ/ha)

Theo dõi toàn bộ số cây/ công thức/ lần nhắc ựối với chỉ tiêu năng suất bông hạt thực thu

3.4.2.5 Một số chỉ tiêu chắnh về chất lượng xơ bông của các giống

+ Chiều dài xơ (mm)

+ độ ựều xơ (%)

+ độ mịn xơ (mic)

+ độ chắn xơ (%)

+ độ bền xơ (g/tex)