Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme

Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử đã phát triển nhanh chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn

MỞ ĐẦU

Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử đã phát triển nhanh chóng, đạtđược những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn Sự phát triển khôngngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở khoa học một

số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chống lại các bênh tật

và nâng cao sức khỏe đời sống Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngàycàng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt là cácsản phẩm chức năng

Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngàycàng được quan tâm Do đó các sản phẩm chức năng không ngừng được cảitiến nâng cao chất lượng Và khi những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh

lý học và dinh dưỡng học được cải tiến thì những thực phẩm chức năng, thựcphẩm điều trị bệnh được sản xuất nhiều hơn

Ngày nay, thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quantâm vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấpnhưng trong đó có chứa rất nhiều tác dụng Trong nhóm thực phẩm người taquan tâm khá nhiều đến đường chức năng Có rất nhiều loại đường chức năngnhư: đường Maltitol, đường Fructooligosaccharide, đường Sorbitol, đườngTrehalose…Trong số đó đường Trehalose là một trong những loại đường cónhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những ngườibéo phì, những người mắc bệnh tiểu đường, sâu răng,…

Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzyme ứngdụng trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụngTrehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điềuchỉnh quá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinhdưỡng Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzyme được sử dụng để sảnxuất Trehalose là nhu cầu cần thiết Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiệnnay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao

Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase không chỉ có ý nghĩakhoa học mà còn có giá trị kinh tế xã hội.

Từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu sau:

“Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các

tính chất của enzyme”

Mục tiêu của đề tài:

1 Biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli.

2 Tách và tinh chế enzyme

3 Xác định các đặc tính của enzyme

4 Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose

PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp

Kỹ thuật di truyền là thuật ngữ chung cho nhiều kỹ thuật cơ bản trongnghiên cứu di truyền phân tử Thuật ngữ kỹ thuật gen còn gọi công nghệ genhay kỹ thuật gen vấn đề cốt lõi của sinh học hiện đại

Năm 1983 Rudleg và Sediel: kỹ thuật di truyền là các kỹ thuật dẫn đếnkhả năng biến đổi định hướng gen, tần số kiểu gen của một quần thể, hoặclàm tăng căn bản khả năng sinh sản của một số cá thể để nâng cao vốn gen vàtăng số lượng hợp tử của quần thể Kỹ thuật gen được bắt đầu năm 1977, baogồm các thao tác kỹ thuật trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo

ra các gen mới từ đó tạo ra các cá thể mới Kỹ thuật gen bao gồm một số kỹthuật cơ bản là kỹ thuật DNA tái tổ hợp, phân lập gen, chuyển ghép gen, dunghợp gen vi thao tác gen

DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu ditruyền khác nhau Phân tử DNA được gép nối từ các đoạn DNA của các cáthể khác nhau trong loài, hoặc các loài khác nhau gọi DNA tái tổ hợp

Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm một số bướcsau Trước hết genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế vàcắt thành từng đoạn nhờ một loại Enzyme hạn chế Trong nhiều trường hợp(đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA gen nome được thay thế bằng DNAtương bù (cDNA) củ mRNA thành thục DNA này được tổng hợp từ khuônRNA thông tin nhờ xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase,rna-dependent DNA-polymerase) DNA vector có thể là một plasmid hoặcphage (nếu vật mang dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn

Agrobacterrium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật),

là Vius (retrovirus hoặc andovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa

gen là tế bào động vật) Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơthể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là nuôi cấy vật mang, sản xuất(chiết suất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu

Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầudính) các đoạn DNA mục tiêu và các đoạn DNA vector (chỉ cắt tại một điểmcủa mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành liên kết hidro tương

bù ở các đầu dính, rồi được ligase hàn gắn các đầu khác Kết quả trong hỗnhợp hình thành thể tái tổ hợp của vector với một hoặc một số mảnh DNA củagenome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tựkhép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổhợp hoặc tự tái tổ hợp) Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn đềuvới các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môitrường dinh dưỡng có yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóachất gây chết đối với các tế bào động vật thực vật) Trong điều kiện đó, chỉcác tế bào vật mang vector sống sót Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chếcắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tínhnhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ởvật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp Beta-galactosidase), nên chỉnhững vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó thì được chọn nuôicấy tạo dòng Bước tiếp theo là chọn những dòng tính trạng của gen mục tiêuhoặc những dòng gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệmmiễn dịch như ELISA, Westerm blot anlysis, Northern blot anlysis hoặc vớicác dò DNA hoặc RNA – southern blot anlysis, Norther blot anlysis), hoặcPCR Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật mang thỏa mãn các bước thửnghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sảnphẩm mục tiêu

Thực chất của công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật trênmột gen, cải biến cấu trúc của gen, bộ gen tạo ra các gen mới trong bộ gen.Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm các bước cơ bản sau

- Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen)

- Tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị vector tách dòng)

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng

- Sàng lọc, theo dõi hoạt động và biểu hiện của gen

Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc.Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các vi sinh vật tái tổ hợp hay visinh vật biến đổi gen (gentically modified organisms – GMO) như giống ngũcốc đậu tương, hạt có dầu, bông,… mang gen chống sâu bệnh hoặc khángthuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứanhiều Protein, lúa nhiều vitamin A và sắt,… Tạo ra được những vacxin tái tổhợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sửdụng cho ăn uống, hoặc những động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩmhữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang khángnguyên người, hy vọng là vật có thể cho tim hoặc nội tạng khác để điều trịnhững trường hợp người bệnh cần thay thế nội quan,… Tuy nhiên, kỹ thuật ditruyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đedọa mới liên quan tới sức khỏe của người và sinh thái – môi trường Chưa thểchứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũngnhư chưa phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của Plasmid vector)trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ trong đường ruột)người và động vật Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ vàthuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trởthành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơmới đối với nông nghiệp Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinhvật tự nhiên sẽ là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinhvật hiện có gây hậu quả nghiêm trọng đến môi trường sinh thái…

I.2 Đại cương về vi khuẩn E.coli

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1973); Nguyễn Lân Dũng (1976), trực

khuẩn Escherchia Coli có tên khoa học là Bacterium Coli Comunis bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột (ruột già và phần cuối của ruột non),

ít khi có ở dạ dày hay phía trước ruột non của động vật (Nguyễn Vĩnh

Phước,1978) Tỉ lệ E.coli ở kết tràng là 58.3%, trực tràng 55.3%, manh tràng

là 39.3% E.coli xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật chết Loài ăn tạp và ăn thịt thải nhiều E.coli hơn loài ăn

cỏ Theo Kefman những chủng E.coli thường gặp về huyết thanh được chia

thành những Serotype riêng Trong số này một số serotype đóng vai trò quantrọng trong việc gây bệnh cho người và động vật

I.2.1 Đặc điểm hình thái

E.coli là loài trực khuẩn hình gậy gắn, hai đầu tròn, có lông, di động

được, không hình thành nha bào, giáp mô, bắt màu Gram âm, thường thẫm ởhai đầu ở giữa nhạt, kích thước vi khuẩn 2-3 uM x 0.4-0.6 um.Trong cơ thểgia súc, vi khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn

I.2.2 Đặc tính nuôi cấy

E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, dễ nuôi cấy, có thể sinh

trưởng và phát triển thích hợp nhất ở 37oC, pH thích hợp là 7.2-7.4 Tuy nhiênchúng vẫn có thể phát triển trong môi trường có pH = 5.5-8.0

Môi trường nước thịt: E.coli phát triển rất nhanh, môi trường đục đều,

có lắng cặn xuống đáy màu tro nhạt, trên mặt hình thành màng mỏng màu ghinhạt dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối

Môi trường thịt thường: nuôi cấy ở 37oC trong 24h hình thành khuẩnlạc tròn, ướt hới lối, không trong suốt, màu tro nhạt, đường kính khuẩn lạckhoảng 2-3mm

Môi trường Endo: hình thành khuẩn lạc có ánh kim

Môi trướng SS: trên môi trường này sau 24h nuôi cấy hình thành khuẩnlạc màu hồng nhạt hoặc màu đỏ cánh sen

Môi trường EMB: E.coli có khuẩn lạc màu tím đen.

Môi trường Macconkey: E.coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ.

Môi trường Billiant –Green–agar: khuẩn lạc của E.coli có dạng S, màu

vàng chanh

I.2.3.Đặc tính sinh hóa

Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường Glucose,

Galactose, Lactose, Mannitol…

E.coli lên men không sinh hơi các loại đường như Saccarose, Ramnose,

Xalixin, Valin, Glyxeron

Các phản ứng sinh hóa khác:

Phản ứng indol (+), phản ứng VP (=), phản ứng MR (+), phản ứng H2S(+), hoàn nguyên Nitrat thành Nitrit, Urease (-), Gelatin (-)

I.2.4 Sức đề kháng của E.coli

E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 55oC trong một giờ, 60oC trong 30 phút(Willon và Miles, 1995), (Nguyễn vĩnh Phước, 1973) Các chất sát trùng như:

Axit phenic, Clorua thủy ngân, Formol có thể tiêu diệt E.coli trong 5 phút.

I.3 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới và Việt Nam I.3.1 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme trên thế giới

Enzyme có vai trò vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phảnứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sốngchúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro) Bởi vậy, côngnghệ enzyme ngày càng phát triển Những thành tựu cơ bản về enzyme là cơ

sở để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzyme trong thực tiễn

Enzyme thường được sử dụng theo hai cách: không tách enzyme rakhỏi nguyên liệu mà tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của một số enzyme

có sẵn trong nguyên liệu để chúng chuyển hóa các chất có cùng trong nguyênliệu theo hướng mong muốn Hoặc tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạngchế phẩm khi cần thiết Enzyme hoạt động sinh học có thể được tách từ bất kỳ

cơ quan sống nào Ví dụ enzyme thương mại có thể được sản xuất từ

Acitinoplanes tới Zymomonas Từ rau chân vịt (spinach) đến nọc độc của rắn.

Do đó có thể tận dụng nguồn nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùngenzyme để chế biến các loại nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào nhữngmục đích khác nhau Hàng trăm enzyme thương mại được sản xuất ra, trong

đó hơn một nửa từ nấm mốc và nấm men, quá 1/3 từ vi khuẩn, còn lại 8% từđộng vật, 4% từ thực vật.

Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt nhất của công nghệ enzyme vìchúng có tốc độ sinh trưởng nhanh trên các môi trường dinh dưỡng không đắttiền, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể tự động hóa hoặc điều khiển, năngsuất cao…Hơn nữa, ta có thể chủ động điều khiển quá trình sinh tổng hợpenzyme, nâng cao hàm lượng enzyme trong tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn tếbào thực vật và động vật

Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzyme được sản xuất phục vụ chongành công nghiệp và y học Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấnprotease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn  – Amylase, 70 tấnglucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD

Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzyme chính vớitrên 60 nhà cung cấp lớn Hai hãng sản xuất enzyme lớn nhất hiện nay làNovo Nordisk (Đan Mạch) và Gist Brocades chiếm 60% lượng enzyme trênthị trường Tiếp đó là Mỹ 15%, trong đó 2/3 sử dụng nội địa chủ yếu dùng đểsản xuất cồn và đường nghịch đảo Năm 1993, trên thị trường Mỹ tiêu thụ 50triệu USD đối với renin, 27 triệu USD đối với glucoAmylase, 23 triệu USDđối với glucoisomerase… Khoảng 50 loại enzyme khác nhau được bán trênthị trường Mỹ Nhật chiếm 12-15% thị trường tiêu thụ với các sản phẩm đadạng Trung Quốc và Nga là hai thị trường sản xuất chủ yếu để phục vụtrong nước

Đến nay người ta đã biết và phân loại khoảng 3500 loại enzyme,khoảng vài trăm loại được sản xuất trên quy mô công nghiệp chủ yếu làenzyme Amylase, Protease Lipase…

- Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách acid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm)

L Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từtinh bột/năm

- Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42%(2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/ năm).

Phần lớn enzyme được sử dụng ở mức độ công nghiệp đều thuộc loạienzyme đơn cấu tử xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 70% chế phẩm làenzyme thủy phân sử dụng để thủy phân các cơ chất tự nhiên

Các protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay dùng trongquá trình đông tụ sữa sản xuất fomat, làm mềm thịt, sản xuất chất tẩy rửa,thuộc da Tiếp đến là các enzyme nhóm Hydaratcacbonat như Amylase,Cellulose, Pectinase… Sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, thức ăn giasúc, công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng với

4 mục đích chính:

- Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu Nguyên liệu củacông nghiệp thực phẩm là các sản phẩm phức tạp có nguồn gốc từ động vật vàthực vật được hình thành qua nhiều giai đoạn tổng hợp sinh học Do đó, thànhphần nguyên liệu phụ thuộc vào các yếu tố bên trong như giống loài và cácyếu tố bên ngoài như điều kiện canh tác khí hậu Các yếu tố này có thể làmthay đổi thành phần nguyên liệu và chuyển hóa nó Trong trường hợp này cácchế phẩm enzyme được sử dụng một phụ gia lấp đầy những thiếu hụt Trongcông nghiệp chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ sungAmylase để bù hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc Trong sản xuấtfomat, enzyme lipase và protease được sử dụng thay thế các enzyme từnguyên liệu sữa bị vô hoạt để thanh trùng

- Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánhbisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc của bia vàtính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp Amylase, pectinase, hemicellulasetạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả Protease trung tính làmmềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bisque

- Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên Enzyme có thể tham gia vào việc đadạng hóa sản phẩm nhận từ nguyên liệu tự nhiên Sự phát triển của công nghệenzyme đã cho ra đời một loạt các chế phẩm enzyme cho phép tạo ra nhiềusản phẩm: chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cảithiện đặc tính của enzyme về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sảnxuất chế phẩm enzyme mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn.

- Cải thiện chất lượng sản phẩm: các enzyme sử dụng để loại bỏ cácchất tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan của thực phẩm Chếphẩm enzyme còn cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm như lipase trongsản xuất fomat, lactase trong sản xuất sữa

Trong công nghiệp thực phẩm, protease được dùng để làm mềm thịt,công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị 9 chủ yếu là chimosin thu được từ dạ dày

bò được sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềm thịt

Enzyme trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuấtđường tinh bột Đầu tiên người ta sử dụng hai enzyme - Amylase và -Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm này chứa dextrin, glucose vàmaltose được dùng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo Glucose được sản xuấtnhờ - Amylase và - Amylase, tuy nhiên glucose dùng trong thực phẩm cónhược điểm độ ngọt thấp chỉ vào khoảng 0.8 lần đường kính vì vậy nó đượcdùng chủ yếu cho y dược

Năm 1970, người ta sản xuất được Fructose và xirogluco – fructose caoloại đường này có độ ngọt gấp 1.73 lần so với đường kính nhưng giá thànhcao hơn nhiều

Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ trên thế giới là 10 triệu tấn thìriêng Mỹ tiêu thụ 4.2 tấn Fructose (bao gồm cả xirogluco – fructose), Nhật là800.000 tấn, EU là 2 triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, cácnước đang phát triển là 500000 tấn

Sau công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng trongcông nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc Đặc

hiệu việc sử dụng enzyme của các hệ vi sinh vật trong nước thải trong côngnghiệp xử lý môi trường ngày càng được nghiên cứu khai thác sử dụng.

Trong công nghiệp dệt, việc sử dụng enzyme đã được áp dụng từ nhữngnăm 20 của thế kỷ 20 Enzyme từ nước chiết Malt và Pancrease được sử dụng

để rũ hồ Năm 1971, sử dụng enzyme Amylase của Bacillus subtilis rũ hồ ởnhiệt độ cao, rút ngắn thời gian Enzyme Glucanase, Pectinase, Estrase,Protese được sử dụng trong quá trình nấu nhằm loại bỏ những thành phầnkhông phải Cellulose ra ngoài

Trong công nghiệp thuộc da, hai quá trình sử dụng enzyme là tách lông

và làm mềm da Người ta sử dụng enzyme collagenase, trypsin, chymotripsin,cacboxypeptidase tách chất nhờn và phá hủy liên kết trong sợi collagen, nhờvậy lông được tách khỏi da và trở nên mềm hơn

Trong công nghiệp bột giặt và tẩy rửa, các chế phẩm enzyme được sửdụng là protease, lipase, cellulose, amylase, oxydoreductase tăng vận tốc vàhiệu quả quá trình tẩy rửa Một số enzyme được bổ xung vào các loại xàphòng và kem dưỡng da, thuốc đánh răng như bromelin, collagenase, lipase…các enzyme này có tác dụng tẩy hôi, tẩy các vết bẩn bám trên da khá tốt, đồngthời làm mịn và tăng độ đàn hồi cho da

Trong nông nghiệp, enzyme dùng để sản xuất thức ăn cho động vậtnhằm tăng giá trị thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng cho thức ăn Các enzyme sửdụng với mục đích này là các enzyme thủy phân như amylase, protease, đặchiệu là celluloase và hemicelluloase Chúng thủy phân các chất có phân tử lớnthành dạng dễ hấp thụ hơn thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn

Điều này có ý nghĩa quan trọng khi chuẩn bị thức ăn cho động vật cònnon vì hệ thống tiêu hóa của chúng chưa thích hợp với việc ăn các loại thức

ăn thô

Sự phát triển của y học phản ánh sự lớn mạnh của tiềm năng enzyme.Ngay từ thế kỷ 19 enzyme tụy tạng được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêuhóa Enzyme Tripsin, Chymotripsin sử dụng để làm tiêu viêm, lành vết

thương, vết bỏng, viêm phổi, viêm khí quản Tripsin chữa bệnh viêm tĩnhmạch huyết khối, viêm tụy Chymotripsin chữa bệnh loét dạ dày tá tràng Một

số enzyme tiêu hóa được sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng ở trẻ em,người già và người bệnh như Pepsin (từ dạ dày lợn) Ngày nay, một số thuốctổng hợp hóa học đã lần lượt được thay thế bằng các quá trình enzyme nhờnhững ưu điểm của nó Ví dụ việc sản xuất Pinicillin bán tổng hợp nhờenzyme penicillin acylase để sản xuất hai dẫn xuất ban đầu 6- APA và 7 –ADCA, từ đó tổng hợp lên kháng sinh thế hệ II, III, IV, V Cùng với sự pháttriển của kỹ thuật gen và lai tạo tế bào, người ta đã sản xuất được những chất

mà cơ thể sống chỉ có thể tổng hợp được với lượng cực nhỏ như interferon,hormone sinh trưởng người, isulin, vaccine… Trong những năm gần đây một

số công trình nói đến việc chữa bệnh của asparaginase…Sự giúp ích củaenzyme học đối với y học hiện nay tuy còn hạn chế nhưng với đà phát triểnmạnh mẽ của ngành khoa học nói chung và phát triển của enzyme học nóiriêng, cùng với sự tiến bộ về kỹ thuật thì nói chung tương lai enzyme sẽ giúpích nhiều hơn cho y học đặc biệt trong lĩnh vực phân tử

Ngoài việc nghiên cứu enzyme trong y học lâm sàng và trong điều trịhọc, người ta còn nghiên cứu sự phát triển của enzyme trong cơ thể từ giaiđoạn bào thai cho đến lúc già Bởi vậy ngày nay enzyme học còn đóng vai tròquan trọng trong di truyền học phân tử, trong nghiên cứu quá trình tiến hóacủa các giống nòi và trong nhiều lĩnh vực khác

Ngoài các enzyme thuộc nhóm trên, enzyme khác được sản xuất vớiquy mô nhỏ và nhiều enzyme đặc hiệu được dùng để cắt, nối gen trong kỹthuật gen, nghiên cứu phân tử protein (endonuclease), sử dụng enzym Urease

để định lượng ure trong nước tiểu…

Cho đến nay, người ta vẫn cho rằng 99% khả năng ứng dụng củaenzyme vẫn ở dạng tiềm năng Trên cơ sở nghiên cứu cơ bản về cấu trúc phân

tử và cơ chế sinh tổng hợp enzyme đã mở ra triển vọng của ngành enzyme học:

- Tổng hợp enzyme nhân tạo: các chất có hoạt tính tương tự enzyme có

thể tổng hợp bằng con đường nhân tạo thiết kế và tổng hợp các chất gắn rấtđơn giản xong việc thiết kế trung tâm xúc tác rất khó khăn Đến nay, một vàienzyme nhân tạo được sử dụng thành công như acid polyglutamic có hoạt tínhtương tự như estsrase.

- Biến đổi cấu trúc enzyme: áp dụng kỹ thuật di truyền làm biến đổiđịnh hướng cấu trúc enzyme, biến đổi hoạt tính, hiệu suất… người ta sử dụngcông nghệ protein để cải biến trung tâm hoạt động của enzyme mục đích làmcho có hoạt tính cao hơn hoặc enzyme có hoạt tính mới

- Enzyme sử dụng trong phân tích, chuẩn đoán, điều trị

- Bảo vệ môi trường: sử dụng enzyme để xử lý chất thải, tái tạo vật liệuhay sử dụng vật liệu tái chế

I.3.2 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzyme ở Việt Nam.

Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme ở Việt Nam chỉ mới được tậptrung chú ý trong vài thập kỷ trở lại đây Cho đến nay Việt Nam chưa có mộtenzyme nào được sản xuất ở quy mô công nghiệp mà mới chỉ dừng lại ở quy

mô nhỏ, phạm vi phòng thí nghiệm của các trường đại học, các viện nghiêncứu Enzyme pepsin từ dạ dày bò (Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội),bromelin từ dứa (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), a- amylase glucoase amylase,protease từ vi sinh vật (viện công nghiệp thực phẩm)

Những chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất ở nước ta hiệnnay là amylase chủ yếu dùng trong công nghiệp sản xuất rượu bia, đườngglucose, đường nha, công nghiệp dệt…Enzyme phân giải protein (protease)tăng độ bền ngọt của bia, công nghiệp chất tẩy rửa, nước chấm, y học…

Một số enzyme (chủ yếu nhập từ nước ngoài) được sử dụng rộng rãitrong việc nâng cao chất lượng sản phẩm và đa dạng hóa sản phẩm sữa

Các chế phẩm protease (dùng trong công nghiệp sản xuất nước chấm, chếbiến thịt cá) và prozimabo (y học) là các chế phẩm có nguồn gốc từ thực vật

Sản lượng chế phẩm enzyme tiêu thụ hàng năm khoảng 100-300tấn/năm Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp ở

nước ta còn ở dạng tiềm năng, do vậy trong những năm tới khả năng ứngdụng của enzyme còn được khai thác và mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác: xử

lý rác thải sinh hoạt và rác công nghiệp, sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em, sảnxuất chế phẩm probiotic, prebiotic…

I.4 Trehalase

I.4.1 Giới thiệu về enzyme Trehalase

Trehalase là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên Nó được dùngkhá phổ biến trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác

Trehalase là một loại enzyme glycoside hydrolase có tác dụng xúc táccho quá trình chuyển đổi trehalose thành glucose Nó được tìm thấy trong hầuhết các động vật Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside) là một trong những nguồn carbohydrate quantrọng nhất xuất hiện trong hầu hết các loại sinh vật, trừ lớp động vật có vú.Disaccharide được thủy phân vào 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase

Có 2 loại Trehalase được tìm thấy trong Saccharomyces cerevisiae (nấm men), là Trehalase trung tính (NT)và Trehalase axit (AT) được phân loại dựa

vào độ pH của chúng [4] NT có độ pH là 7.0 trong khi AT là 4.5

Theo báo cáo mới đây, hơn 90% AT hoạt động trong S cerevisiae làngoại bào và tách ngoại bào Trehalose thành glucose trong môi trường chất bao

I.4.2 Trehalase trong vi khuẩn

Trehalose được tìm thấy như tích lũy carbonhydrate trong

Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium và trong rất nhiều khuẩn tia và là nguyên

nhân của khả năng kháng khuẩn Hầu hết các enzyme Trehalase tách biệt vớicác vi khuẩn có độ pH từ 6.5 đến 7.5

Enzyme Trehalase của Mycobacterium là một màng protein bị ràng buộc Tế bào chất Trehalase của Escherichiacoli K12 được kích thích bở sự

tăng cao trong nồng độ thẩm thấu Sự thủy phân của Trehalose thành glucosediễn ra trong bào chất, và sau đó glucose được chuyển vào các tế bào vi

khuẩn Một tế bào chất Trehalase khác cũng được tìm thấy từ E.coli Gen mã

hóa tế bào chất Trehalase có tính đồng đẳng cao với Trehalase tế bào chất

I.4.3 Trehalase trong thực vật

Trong thế giới thực vật, mặc dù Trehalose được tìm thấy từ rất nhiều

loài cây không hoa bao gồm Selaginella lepidophylla và Botrychium lunaria;

đường rất hiếm trong cây có mạch và chỉ được tìm thấy trong quả chín của

các loại thuộc Apiaceae và trong lá cây của thực vật hạt kín có khả năng chịukhô hạn nhưMyrothamnus flabellifolius

Tuy nhiên enzyme Trehalase lại phổ biến trong các loại cây Điều nàyrất khó hiểu vì tuy thiếu cơ chất nhưng Trehalase lại có mặt ở các loại thựcvật bậc cao Không có sự chứng minh rõ ràng nào về vai trò hoạt động củaTrehalase trong thực vật Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho rằng Trehalases cóthể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai tròtrong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật

I.4.4 Trehalase trong nấm men

Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm

thấy Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation Hoạtđộng của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương Loại enzymehoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tươngứng Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nóđược cho vào cùng loại với Trehalase trung tính Trong khi đó, enzymeTrehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pHkhoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit Hai loại enzyme này mã hóa bởi hailoại gen khác nhau là NTH1 và ATH1

I.4.5 Thủy phân Trehalose

Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằngenzyme Trehalase Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến

hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot Fischer đã thấy được phản ứng này trong S cerevisiae vào năm 1895 Trehalase (α, α-

trehalose-1-C-glucohydrolase, EC 3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiềusinh vật bao gồm động vật và thực vật Mặc dù Trehalose không được tìm

thấy trong lớp động vật có vú nhưng enzyme Trehalase có trong màng biên tếbào thận và lông nhung của màng ruột Trong ruột, chức năng của enzymenày là giúp ruột hấp thụ được Trehalose Thủy phân Trehalose bằng enzymeTrehalase là một quá trình sinh lý học quan trọng của nhiều loại sinh vật nhưnảy mầm bào tử nấm, côn trùng bay và tăng trưởng lại trong tế bào khônghoạt động tích cực.

I.5 Tổng quan về đường chức năng Trehalose

I.5.1 Trehalose

Trehalose là đường đôi không khử glucopyranoside)

(α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đườngsucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn Trehalose là đường đa chứcnăng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose)

Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose

Thành phần các chất dinh dưỡng trong đường Trehalose:

Trehalose (%)

Lượng thực phẩm tiêuthụ mỗi ngày (g/ngày)

Hình 3: Sơ đồ phản ứng enzyme

I.5.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống

I.5.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon

Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nênkhi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động Trong gan, hoạtlực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thườnghóa bởi sự cung ứng Trehalose Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cựctrong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quanđến sự gia tăng của lipoprotein trong máu Vì thế Trehalose hiện nay đượcdùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bịbệnh tiểu đường

Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những ngườimắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đườngtrong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày

I.5.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sựhấp thụ canxi của tế bào Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho conngười phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương

Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già.

Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều cómột kết luận chung là do ba yếu tố sau:

+ Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lênmen, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi

+ Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môitrường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tánvào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi

+ Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyểncủa hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tếbào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu Ngoài canxi,Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie Điều này thúc đẩy quátrình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương

I.5.2.3 Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng

Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liêncầu khuẩn gây nên Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng củangười và động vật Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinhdưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh Vì thế nếu trong thànhphần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinhdưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh Để xét ảnhhưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên

cơ thể chuột Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose)

bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza)

Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môitrường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của

nó Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vậttrên phát triển

Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng Vì thế ngàynay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong

thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em

để phòng bệnh sâu răng

I.5.2.4 Tính kháng khuẩn của Trehalose

Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinhvật có lợi như lactobacillus và bifidobacteria Các vi sinh vật này có khả năngkháng khuẩn gây bệnh đi ngoài Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thịtrường thường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng

là cơ chất tốt cho sự phát triển của các vi sinh vật có lợi Chính sự có mặt vàđóng góp vai trò tích cực trên người ta đã nói rằng đường Trehalose có khảnăng kháng khuẩn (antibiotic)

I.5.2.5 Tính an toàn của Trehalose

Để khẳng định tính an toàn của Trehalose đối với cơ thể sống đã cónhiều nghiên cứu về tế bào và gen của động thực vật ăn Trehalose Cácnghiên cứu này chủ yếu tập trung để trả lời các câu hỏi là khi động vật sửdụng Trehalose có ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của tế bào haykhông? Có gây ra đột biến về gen dẫn đến sự tổng hợp AND bất quy tắc haykhông? Tất cả các nghiên cứu đã cho kết luận là Trehalose không gây độc haiđến tế bào chủ thể

I.6 Ứng dụng của Trehalose

Một số sản phẩm đường Trehalose :

Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa trehalosePhụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại

là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%.Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩmhoặc như một loại chất ngọt bổ sung trong chế biến các loại thực phẩm khác.Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắcbệnh, các đối tượng ăn kiêng Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trongviệc phân tích hóa học

Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị vàtính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kínhtrong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinhdưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặtdinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vịcũng được cải tiến rất nhiều

Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặthàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sảnphẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua Ngày nay đã được dùngcho các sản phẩm đồ uống

Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau.Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôicấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trựctiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuậtphân tích.

Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều chocác đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sứckhỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuậntràng ăn tốt

Trehalose có tính hòa tan cao

Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose

I.7 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose trên thế giới

Trehalose có thể thu nhận được bằng cách chiết suất chúng từ các loạicây quả, hoặc bằng các phương pháp hóa học, hóa lý, hóa sinh Nhưng cho tớinay phương pháp được coi là có hiệu quả và có khả năng công nghiệp hóanhất là phương pháp công nghệ sinh học

Thông thường Trehalose được sản xuất theo phương pháp liên tục vàkhông liên tục Trong phương pháp sản xuất liên tục công nghệ cố định

enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuấtkhông liên tục thì sử dụng enzyme đã chiết tách Giải pháp cố định enzyme và

cố định tế bào trong sản xuất Trehalose cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất liêntục tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ… nhưng tính ổn định kém và cầnmáy móc thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn Tuy vậy, đây lại là phươngpháp có khả năng công nghiệp hóa cao và được tập trung nghiên cứu nhiều ởcác nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Hàn Quốc TrungQuốc, Pháp, Mỹ,…

I.8 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose ở Việt Nam

Công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nói chung và công nghiệpsản xuất đường Trehalose nói riêng đang được phát triển mạnh trên thế giới.Cùng với xu hướng phát triển chung của toàn cầu Ở Việt Nam lĩnh vực nàycũng đang được chú ý rất nhiều do nhu cầu thị trường ngày càng cấp bách

Ngoài viện Công nghiệp thực phẩm ra một số trường và các viện khácnhư trường đại học Bách Khoa Hà Nội, trường đại học Nông Nghiệp, Việnđại học Mở Hà Nội, viện nghiên cứu thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh cũngbắt đầu có những nghiên cứu thăm dò trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuấtloại đường chức năng này Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ ở quy mô phòngthí nghiệm

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất

II.1.1 Giống vi sinh vật

Chủng giống vi sinh vật Escherichia coli DH5 alpha.

E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1%tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin đểlàm nhân tố chọn lọc

Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (TrungQuốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc),APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc)

II.1.4 Máy móc và thiết bị

Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc(Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy

từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di(Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện

di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức)

Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ốngeppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt

Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bàothể cho sang thể nhận

Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xungđiện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sửdụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao Cơ chế biến nạp chủ yếubao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếpnhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhậnDNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường Những tếbào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến

Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế

bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA Tạo hỗn hợp vi khuẩnvới DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao(4oC) Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vikhuẩn Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và

cố định trong tế bào vi khuẩn Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứamôi trường có bổ sung kháng sinh

Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp

Phương pháp tiến hành như sau:

+ Tạo tế bào khả biến DH5 alpha

Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto

trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37oC, 24 giờ.Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng

Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc)

Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeastextract; 0.5 % NaCl

Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ) Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấytrên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 –

250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ) Tiếp đó chuyển dịchnuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000rpm trong 5 phút

Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dungdịch 50mM CaCl2 Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phúttrên đá Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên vàcho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl2 và làm tan hoàn toàncặn Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerolbảo quản trong nitơ lỏng

+ Biến nạp

Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µlDNA Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42oC Sau sốc nhiệt bổsung thêm 1ml LB và ủ ở 37oC trong 1h Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biếnnạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µlAmp) và để phát triển qua đêm ở 37oC

Hình 7: Vi khuẩn E.coli sau khi biến nạp trong LB rắn có kháng sinhTất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đềuđược hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

II.2.2 Tách DNA plasmid

DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhânlên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Sau đóvector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử

lý với NaOH, SDS Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạngmạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng

có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy Protein vàtạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol DNA