Đánh giá đặc điểm nông học và khả năng chịu hạn của nguồn gen lúa địa phương dựa trên kiểu hình và marker phân tử liên kết với tính trạng sinh trưởng rễ

Bộ rễ lúa là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu giống chống chịu khô hạn, các ựặc trưng như bộ rễ khở, ăn sâu, khả năng ựiểu chỉnh áp suất thẩm thấu tốt,Ầ ựều quyết ựịnh quan trọng ựến k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VỚI TÍNH TRẠNG SINH TRƯỞNG RỄ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Văn Liết

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu trong luận văn là kết quả lao ñộng của chính tác giả Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hảo

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS.Vũ Văn Liêt Người ựã hướng dẫn và chỉ bảo tôi cũng như tạo mọi ựiều kiện ựể tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình hoàn thành luận văn này, tôi luôn ựược sự quan tâm, giúp

ựỡ quý báu của tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền Ờ chọn giống cây trồng Khoa Nông học, bộ môn công nghệ sinh học thực vật Ờ Khoa công nghệ sinh học, Viện đào tạo Sau ựại học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và sự quan tâm, ựộng viên, giúp ựỡ nhiệt tình của gia ựình, bạn bè, ựồng nghiệp

Tự ựáy lòng mình, tôi xin chân thành cảm ơn ựối với mọi sự quan tâm, giúp ựỡ, ựộng viên quý báu ựó

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hảo

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.5 đánh giá mức ựộ tương quan giữa năng suất và các yếu tố cấu thành

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

FAO Tổ chức nông nghiệp và lương thực thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.10 Chiều cao cây cuối cùng của các mẫu dòng, giống ở hai ñiều kiện

Bảng 4.11 ðặc ñiểm hạt phấn, tỷ lệ hữu dục và khả năng ñậu hạt của các dong,

Bảng 4.12 ðiểm cuốn lá, ñộ tàn lá và mức ñộ khô ñầu lá của các dòng, giống

Bảng 4.14 Năng suất lý thuyết và năng suất thực thu của các dòng, giống thí

Bảng 4.17 ðộ cuốn vào của lá, ñộ tàn lá, mức ñộ khô ñầu lá và dạng cây của các

Bảng 4.18 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng, giống lúa

Bảng 4.19 Mức ñộ nhiễm sâu hại của các dòng, giống trong các ñiều kiện môi

Bảng 4.20 Mức ñộ nhiễm bệnh hại của các dòng, giống trong các ñiều kiện môi

DANH MỤC ðỒ THỊ

ðồ thị 1 Thời gian trỗ và trì hoãn trỗ của các mẫu dòng, giống ở hai ñiều kiện

ðồ thị 2 Tỷ lệ nhánh hữu hiệu của các mẫu giống lúa nghiên cứu trong hai ñiều

ðồ thị 5 Tương quan giữa số nhánh hữu hiệu và năng suất thực thu ở 3 ñiều

ðồ thị 6 Tương quan giữa tỷ lệ hạt chắc và năng suất thực thu của các mẫu

ðồ thị 7 Tương quan giữa khối lượng 1000 hạt với năng suất thực thu ở 3 ñiều

1 MỞ đẦU

1.1 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Năng suất của lúa (Oryza sativa L.), ở những vùng có tưới ựã tăng gấp hai ựến

ba lần so với những năm trước ựây, nhưng ở vùng canh tác nhờ nước trời năng suất tăng lên ở mức rất nhỏ Bởi vì những giống lúa cải tiến năng suất cao không thắch hợp cho những vùng có ựiều kiện bất thuận, nghèo dinh dưỡng và ựầu tư thấp, môi trường không ựồng nhất và biến ựộng mạnh Hơn nữa tạo giống chịu hạn thắch nghi cho ựiều kiện khó khăn về nước tưới còn rất hạn chế, trong khi những cây trồng khác ựã ựược quan tâm nghiên cứu và phát triển giống chịu hạn thành công (vắ dụ ngô, Băngziger và

cs, 2000) Khô hạn sẽ là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng ựến an ninh lương thực của thế giới, nó có thể làm giảm 70% năng suất cây trồng nói chung (Bray và cộng sự, 2000) đặc biệt là sự ổn ựịnh về năng suất vô cùng nhạy cảm với sự thiếu nước (Xiao

và cs, 2007) Hạn là một yếu tố bất thuận hạn chế năng suất và sản lượng cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng

đáp ứng lại hiện tượng thuận do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ từ việc nhận tắn hiệu ựến truyền nó ựi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kắch thắch hoạt ựộng của gen mục tiêu (Thomashow, 1999; Xiong và cs, 2002), và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về mội trường, vật lý, hóa học (Soltis và cộng sự, 2003) điều này làm cho những tiến bộ nhất ựịnh về cải biên di truyền tắnh chống chịu khô hạn xảy ra rất chậm chạp Chọn tạo giống lúa chịu hạn vô cùng quan trọng ựối với những vùng trồng lúa thiếu hụt nước tưới và phân bố lượng mưa không ựều trên thế giới (Akihiko Kamoshita và cộng sự, 2008)

Bộ rễ lúa là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu giống chống chịu khô hạn, các ựặc trưng như bộ rễ khở, ăn sâu, khả năng ựiểu chỉnh áp suất thẩm thấu tốt,Ầ ựều quyết ựịnh quan trọng ựến khả năng chống chiu khô hạn của cây trồng Bản ựồ di truyền liên quan ựến tắnh chịu hạn liên kết với các QTL ựã ựược thiết lập, trong ựó Bing Yue và cs,( 2006), bằng chỉ thị phân tử SSR ựã xác ựịnh ựược 27 QTL quyết ựịnh 7 ựặc ựiêm liên quan ựến sức ựề kháng của cây lúa, 36 QTL kiểm soát 5 ựặc ựiểm kiểm soát

rễ lúa và 38 QTL liên kết với tắnh trạng trên rễ lúa kiểm soát 7 ựặc ựiểm dưới ựiều kiện

khô hạn

Nguồn gen lúa bản ựịa và giống ựịa phương có biến dị di truyền rộng, mức ựộ

ựa dạng di truyền cao và có nhiều tắnh trạng quý, ựặc biệt khả năng thắch nghi tốt với ựiều kiện bất thuận là nguồn vật liệu di truyền cho các chương trình chọn tạo giống lúa chống chịu (Jérôme Bernier và cộng sự, 2008; A A Abd Allah và cộng sự, 2010) Các giống lúa ựịa phương Việt Nam rất ựa dạng và nhiều giống ựã ựược gieo trồng trên ựất nương của vùng núi phắa Bắc Việt Nam là nguồn vật liệu di truyền quý cho chọn tạo

giống lúa chịu hạn Vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài: Ộđánh giá ựặc ựiểm nông học và khả năng chịu hạn của nguồn gen lúa ựịa phương dựa trên kiểu hình

và marker phân tử liên kết với tắnh trạng sinh trưởng rễỢ

- Xác ựịnh vật liệu có khả năng chịu hạn trong ựiều kiện gây hạn nhân tạo

- Sử dụng chỉ thị phân tử ựể nhân biết vật liệu có gen quy ựịnh chiều dài rễ và tốc ựộ xuyên của rễ

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của ựề tài góp phần bổ sung nguồn vật liệu di truyền trong công tác chọn tạo giống lúa thắch ứng với ựiều kiện khô hạn

-Kết quả còn cung cấp thêm dẫn liệu khoa học phục vụ cho công tác chọn tạo

và canh tác lúa trong ựiều kiện khô hạn

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả của ựề tài góp phần vào công cuộc cải tạo giống lúa thắch ứng với biến ựổi khắ hậu ở Việt Nam

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thách thức và giải pháp với nghành nơng nghiệp trong điều kiện biến đổi khí hậu tồn cầu

Diện tích đất trồng trọt trên thế giới chiếm 10% trong tổng số 13 tỉ ha Trong đĩ 11,5 triệu ha đất đang canh tác được xem như khơng thuận lợi cho nơng nghiệp Hầu hết đất trồng trọt được xếp vào nhĩm dưới mức tối hảo cho cây trồng Bên cạnh những thiệt hại do sâu bệnh gây ra, người ta ước đốn cĩ 70% tiềm năng về năng suất bị mất

đi do điều kiện bất lợi của mơi trường, ngay cả trong những quốc gia cĩ nền nơng nghiệp phát triển (FAO, 2002) Những thiệt hại do sâu bệnh gây ra được gọi với thuận ngữ “thiệt hại cĩ tính chất sinh học” (biotic stresses) Những thiệt hại do điều kiện bất lợi của mơi trường, thí dụ như khơ hạn, ngập úng, mặn, phèn, băng tan,… được gọi với thuật ngữ “thiệt hại cĩ tính chất khơng phải sinh học” (abiotic stresses) (Bùi Chí Bửu, 2003) Trong những thập kỷ tiếp theo, sẽ cĩ nhiều thác thức được đặt vào nguồn nước dành cho tưới tiêu cũng như cho canh tác dựa trên nước trời Khơ hạn sẽ là yếu tố quan trọng bậc nhất ảnh hưởng đến an tồn lương thực của thế giới Tài nguyên nước phục

vụ cho nơng nghiệp khơng phải vơ tận, bên cạnh đĩ áp lực dân số kèm theo sự phát triển đơ thị, sự kiện ấy sẽ làm gia tăng nhu cầu nước phục vụ dân sinh và cho phát triển cơng nghiệp Do đĩ, sự khan hiếm nước phục vụ nơng nghiệp là vấn đề đang được dự báo rất cấp thiết trên quy mơ tồn cầu

Những biến đổi khí hậu liên quan đến nước chủ yếu bao gồm những thay đổi về cường độ, khối lượng và biến đổi lượng mưa Thay đổi trong thời gian và phân phối lượng mưa, đây là những hiện tượng cực đoan của khí hậu Ở những khu vực cĩ lượng mưa lớn sẽ đối mặt với lũ lụt thường xuyên hơn và nghiêm trọng cũng như xĩi mịn và bồi lắng hồ chứa tăng, trong khi đĩ khu vực dự kiến giảm lượng mưa sẽ giảm lượng nước sẵn cĩ và hạn hán tăng (Kundzewixz va cs, 2008) Mực nước biển dâng lên do sự dãn nở nhiệt của nước biển và tan chảy của các lục địa, băng sẽ dẫn đến ngập lụt các vùng đất thấp ven biển, với những bất lợi lớn bao gồm xâm nhập mặn của vùng đất nơng nghiệp ven biển, thiệt hại do cơ sở hạ tầng, thủy chiều xâm nhập vào cửa sơng ven biển và tầng nước ngọt (Kundzewicz và cs, 2007) Khu vực sản xuất lương thực

quan trọng sẽ bị ảnh hưởng bởi mực nước biển dâng lên bao gồm Bangladesh và ựồng bằng sông Mekong ở đông Nam Á Ngoài ra, nhiệt ựộ cao sẽ làm tỷ lệ bay hơi trên sự bốc thoát hơi vì khả năng giữ nước cao hơn của khắ quyển, làm giảm lượng nước trong

hồ chứa và các loại ựất (Bates và cs, 2008)

Trước những thay ựổi cực ựoan của khắ hậu năm 2012, dự án FAO Ờ EU ựầu tư một chương trình nhằm xúc tiến canh tác thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu cho Malawi, Việt Nam và Zambia Trong chương trình này thì các giải pháp phù hợp sẽ là:

- Xác ựịnh các cơ hội ựặc thù quốc gia nhằm mở rộng những cách thức thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu hiện có hoặc thực hiện những cách thức mới

- Nghiên cứu những vướng mắc cần vượt qua ựể thúc ựẩy việc áp dụng rộng rãi hơn nông nghiệp thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu bao gồm cả các chi phắ ựầu tư

- Thúc ựẩy việc lồng ghép các chiến lược quốc gia về nông nghiệp và biến ựổi khắ hậu nhằm hỗ trợ việc thực hiện nông nghiệp thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu

- Xác ựịnh các cơ chế ựổi mới ựể kết nối tài chắnh cho biến ựổi khắ hậu với các ựầu tư vào nông nghiệp thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu

- Tăng cường năng lực lập kế hoạch và thực hiện các dự án thắch ứng khôn ngoan với khắ hậu ựể thu hút ựầu tư quốc tế

Chiến lược sử dụng ựúng nguồn vật liệu bản ựịa và nguồn bên ngoài (exotic) trong qui mô quần thể hồi giao cải tiến (advanced backcross) ựang ựược khuyến khắch ựối với cây trồng, ựặc biệt là những tắnh trạng số lượng có tương tác với môi trường vô cùng phức tạp (như tắnh chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, chống chịu thiếu lânẦ)

Chọn tạo giống lúa thắch nghi với kỹ thuật canh tác tiết kiệm nước (dạng hình

aerobic), hoặc thật sự chống chịu khô hạn Bên cạnh ựó, trong trường hợp lai xa, lai

khác loài, khác sub-species (dưới loài), hoặc khai thác thơm ngon từ cây cổ truyền, năng suất thấp vào cây trồng cao sản

2.2 Hạn hán ảnh hưởng ựến sản xuất lúa gạo Thế giới và Việt Nam

Hạn hán ựược xem như một trong những hậu quả nghiêm trọng do sự suy giảm của nguồn nước Do vậy, người ta ựã quy ựịnh ngày 22 tháng 3 hàng năm là Ngày Nước Thế Giới Hiện nay, mức ựảm bảo nước trung bình cho một người trong năm ựã giảm từ 12.800 m3/người vào năm 1990 xuống còn 10.900 m3/người vào năm 2000 và

có khả năng chỉ còn khoảng 8.500 m3/người vào năm 2020 (Bùi Chí Bửu, 2003) Hán hán cũng gây ảnh hưởng lớn ñến sản xuất nông nghiệp, nó làm giảm năng suất cây trồng, làm giảm diện tích gieo trồng và sau ñó làm giảm sản lượng cây trồng mà chủ yếu là sản lượng lương thực cung cấp hàng ngày cho con người

2.2.1 Vấn ñề khô hạn với sản xuất lúa trên thế giới

Cuộc cách mạng xanh ñã giúp sản lượng lương thực tăng lên ñáng kể và giải thoát một phần lương thực cho nhu cầu của con người Nhưng vấn ñề ảnh hưởng lớn nhất ñến sản xuất lúa gạo ở Châu Á lại là lũ lụt và hạn hán, ñặc biệt diện tích canh tác nhờ nước trời ở Châu Á và vùng ven sa mạc Sahara ở Châu Phi Ít nhất có 23 triệu ha lúa canh tác nhờ nước trời, nó chiếm tới 20% tổng diện tích trồng lúa Năm 2000 thế giới sản xuất gần 600 triệu tấn lúa, 155 triệu ha thu hoạch, trong ñó Châu Á sản xuất

và tiêu thụ 9%, Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh sản xuất ñộ 5% sản xuất lúa ở mỗi lục ñịa (FAO, 2001) Ở Châu Á ñược xác ñịnh là dễ xảy ra hạn hán nhất cho dù hình thức canh tác truyền thống có tưới chiếm 75% tổng sản lượng lúa, hạn trở thành vấn ñề lớn bởi sự khan hiếm nước ñang làm tăn nhu cầu và cạnh tranh sử dụng nước (Pandey, 2007)

Cuộc khủng hoảng nước ñang dần xuất hiện ñe dạo ñến nguồn cung cấp lương thực này Theo các nhà khoa học liên hợp quốc ñã cảnh báo trong năm 2005, trên thế giới cứ 6 quốc gia thì có một quốc gia phải ñối diện mặt với tình hình thiếu lương thực

vì những ñợt hạn hán liên tục do biến ñổi khí hậu Trong những năm tới không phải là

lũ lụt hay mưa bão mà là khô hạn sẽ quay trở lại ñe dọa khu vực Châu Á (FAO, 2001)

Bảng 2.1 Thiệt hại do hạn hán gây ra hàng năm tại một số nước trên thế giới Năm đất nước chịu

ảnh hưởng

Thiệt hại gây nên bởi hạn hán

1957-58a Ấn độ Sản xuất nông nghiệp giảm 50% so với năm trước 1980-84b Khu vực đông

Bắc Châu Phi

Khoảng 40 triệu người chịu ảnh hưởng

1980-85c Châu Phi Khoảng 150 triệu người bị ảnh hưởng

1983-84d Hoa Kỳ, Châu

Âu và Châu Phi

Sản lượng ngũ cố của thể giới giảm 5% so với năm trước ựó

1987a Ấn độ Ảnh hưởng ựến 60% diện tắch cây trồng và 285 triệu

dân 1991-92e Châu Phi Sản lượng ngô giảm 60%

2002f Vùng ven Sahara,

Châu Phi

Hơn 40 triệu người ựối mặt với khủng hoảng lương thực

2002k Ấn độ Tác ựộng ựến 55% diện tắch ựất và 300 triệu dân Sản

xuất cây lấy hạt và lúa gạo giảm 15% và 19% giá trị

2004h Châu Phi Khủng hoảng, suy sinh dưỡng và chết ựói xảy ra khắc

Châu Phi

2004i Trung Quốc Hạn ảnh hưởng ựến 23 triệu dân ở 52% các tỉnh, tác

ựộng ựến 16 triệu ha các cây trồng khác và mất ắt nhất 1,3% dóng góp GDP từ nông nghiệp

2004f Việt Nam Ảnh hưởng ựến 1 triệu dân ở 8 tỉnh miền núi và sản

xuất nông nghiệp bị mất gần 80 triệu ựô la mỹ

2004g Thái Lan Ảnh hưởng ựến 1 triệu dân ở 92% ựất nước với hơn 2

triệu ha canh tác bị gây hại và mất tới 2,2% ựóng góp của nông nghiệp cho GDP

Nguồn: a-FAO (2001), b -AMS (1997), c-Loftas và Ross (1995), d-Winsner và Chase (1984), e-Kumar (2005), FAO (2002), g-Ngân hàng Thái Lan (2005) ISDR-UN (2005), h-Reuters (2005), i-MWR (2004h-Pandey và Bhandari (2007) k- PACS (2004)

Ở Châu Á, khoảng 50% ựất trồng lúa là canh tác nhờ nước trời và mặc dù năng suất ở các vùng có tưới ựã tăng gấp 2-3 lần so với 30 năm trước ựây, nhưng những vùng canh tác nhờ nước trời năng suất tăng lên ở mức rất nhỏ, bời vì những vùng này

sử dụng giống lúa cải tiến khó khăn do môi trường không ựồng nhất Một phần vì chọn tạo giống chịu hạn còn rất ắt (Fischer và cs, 2003) Chương trình cải tiến giống lúa chịu hạn ựã ựược triển khai ở nhiều nước trên thế giới với sự giúp ựỡ của các trung tâm nghiên cứu nông nghiệp thế giới như IRAT, IITA, WARDA,Ầ ở Nigeria Viện Nghiên cứu ngũ cốc quốc gia ựã tạo ựược nhiều giống lúa cạn trong ựó có giống Agbele, FAR03 có năng suất cao và khả năng chịu hạn khá

2.2.2 Vấn ựề hạn hán ảnh hưởng tới sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Hạn hán là nguy cơ lớn nhất ựe dọa nghiêm trọng ựến sản xuất nông nghiệp và ảnh hưởng trực tiếp ựến ựời sống con người Theo cục thủy lợi từ năm 1960 Ờ 2005 hạn hán nặng ựã làm ảnh hưởng lớn ựến vụ ựông xuân các năm 1959, 1961, 1963,

1964, 1983, 1987, 1988, 1990, 1993 Năm 2004 hạn hán xảy ra ở các tỉnh miền núi phắa bắc với tổng thiệt hại lên tới 80 triệu ựô la và 1 triệu dân ở 8 tỉnh miền núi chịu ảnh hưởng

để khắc phục ựiều kiện hạn hán so với sản xuất lúa, chúng ta cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác phù hợp, trong ựó việc sử dụng giống chống chịu là một biện pháp tắch cực, lâu dài và hiệu quả (đào Xuân Học, 2002)

Trong chương trình lai tạo giống chịu hạn những thành công bước ựầu là viện cây lương thực thực phẩm, từ năm 1991 Ờ 1994 ựã chọn ựược từ thế hệ F3-F17, trong

ựó có 123 dòng từ F10-F17 và 11 dòng triển vọng Một số giống ựược công nhận giống Quốc gia như CH2, CH3, CH5, CH113 (Vũ Tuyên Hoàng và cs 1996) Các giống lúa chịu hạn như CH, X,Ầ ựang ựược trồng ở các vùng bán sơn ựịa (Sơn Tây,

Hà Bắc) và ựang ựược ổn ựịnh thay thế dần các giống ựịa phương năng suất thấp đây

là giống ựược chọn tạo theo phương pháp truyền thống, ựòi hỏi thời gian dài, chi phắ lớn, kết quả hạn chế (đinh Thị Phòng và cs, 1996)

Bên cạnh những giống lúa chịu hạn ựược chọn tạo thành công ở miền bắc thì các giống như CH207, CH208, LC931, N203, N97 DR2, DR3, phù hợp với ựất miền núi và có khả năng chịu hạn tốt Giống CH208 thuộc nhóm trung ngày có khả năng

chịu hạn trong ñiều kiện hạn nặng năng suất vẫn ñạt 30-35 tạ/ha (Nguyễn Thị Nương

và cs, 1996)

Trong nhiều năm qua, nhiều nhà khoa học trên nhiều quốc gia ñã quan tâm nghiên cứu trên các lĩnh vực như phân bố, nguồn gốc, ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của giống lúa chịu hạn ðặc biệt công tác giống ñã ñược nghiên cứu ñáng kể, ñã tạo ra ñược nhiều giống có năng suất cao ñưa vào sản xuất Nước ta tuy diện tích lúa chịu hạn chỉ bằng 2,4% diện tích lúa chịu hạn trên thế giới, nhưng nó lại nằm trên những vùn hết sức khó khăn về ñường giao thông , ñịa hình, ñiều kiện canh tác…trong vùng ñồng bào dân tộc ít người ñời sồng còn rất khó khăn, trình ñộ hiểu biết về khoa học kỹ thuật còn hạn chế Vì vậy, nghiên cứu và phát triển giống lúa chịu hạn ñáp ứng ñược nhu cầu của nông dân miền núi và ứng phó với sự biến ñổi khí hậu ngày càng phức tạp, ñang ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

2.3 Cơ chế chống chịu hạn và những tính trạng liên quan ở cây trồng

2.3.1 Khái niệm về hạn

Hạn hán tác hại lớn, trước triên nó phá vỡ sự cân bằng nước trong cây, từ ñó ảnh hưởng ñến các hoạt ñộng sinh lí khác nhau của cây như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng, vận chuyển và tích lũy chất hữu cơ Ảnh hưởng tổng hợp lên sinh trưởng và phát triển làm giảm năng suất thu hoạch (Hoàng Minh Tấn và cs, 2000) Do ñó muốn tồn tại trong ñiều kiện khô hạn cây lúa phải có ñặc tính chống chịu tương ứng

Theo J.H Hulse (1989), từ “hạn”, tiếng Anh là “drought”, xuất phát từ ngôn ngữ Anglo-Saxon có nghĩa là “ñất khô” (dryland) Bất cứ một loại cây trồng nào cũng cần phải có nước nhiều hay ít tùy thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai ñoạn sinh trưởng phát triển của chúng Hạn ñối với thực vật là khái niệm dùng ñể chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hoặc trong từng giai ñoạn làm ảnh hưởng ñến sinh trưởng và phát triển Mức ñộ tổn thương của cây trồng

do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau: Chết, chậm phát triển hoặc phát triển tương ñối bình thường Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương ñối ổn ñịnh trong ñiều kiện khô hạn ñược gọi là tính chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiểu mức ñộ tổ thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn

Tuy nhiên khó có thể xác ựịnh ựược thế nào là một trạng thái hạn ựặc trưng vì mức ựộ khô hạn do môi trường gây nên là khác nhau theo từng mùa, từng năm,từng vùng ựịa lắ và không thể dự ựoán trước ựược Hiện nay chưa có một ựịnh nghĩa tổng hợp hoàn chỉnh về hạn, song tùy góc ựộ nghiên cứu mà có những khái niệm khác nhau Theo De C Hsiao (1980) , khi thực vật ựược nghiên cứu trong mối liên quan hữu cơ với môi trường xung quanh gồm ựất và khắ quyển và ựược mô tả dưới dạng một bể nước về sự cân bằng nước: Hạn hán là sự mất cân bằng nước của thực vật thể hiện trong sự liên quan hữu cơ giữa ựất - thực vật - khắ quyển

Theo Rbert và cộng sự (1991), trắch dẫn qua, hạn ựược xem là nhân tố gây thiệt hại lớn nhất ựối với năng suất lúa Giáo sư Nguyễn đức Ngữ (2002) ựã ựịnh nghĩa: hạn hán là hiện tượng lượng mưa thiếu hụt nghiêm trọng, kéo dài, làm giảm hàm lượng ẩm trong không khắ và hàm lượng nước trong ựất, làm suy kiệt dòng chảy sông suối, hạ thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới ựất, gây ảnh hưởng xấu ựến sinh trưởng và phát dục của cây trồng, làm mùa màng thất bát, môi trường suy thoái, gây ra ựói nghèo và dịch bệnh

Theo Gibbs (1975), hạn hán hay ựúng hơn là sự thiếu hụt nước ở cây trồng là sự mất cân bằng giữa việc cung cấp nước và nhu cầu nước Còn Mather (1986), hiện tượng hạn trong sản xuất nông nghiệp thực chất là do thiếu nước cung cấp ựộ ẩm cho

sự sinh trưởng tối ựa của cây trồng từ lượng mưa hoặc từ lượng nước dự trữ trong ựất

2.3.2 Phân loại hạn

Chang và cộng sự, 1979 trắch dẫn qua những kiểu hạn chắnh ựược nhận thấy ở ựất thấp canh tác nhờ nước trời là:

+ Hạn xảy ra thời gian ựầu trong giai ựoạn sinh trưởng sinh dưỡng

+ Hạn giữa vụ không liên tục xảy ra ở giai ựoạn giữa ựẻ nhánh ựến kết hạt + Hạn muộn xảy ra trong thời kỳ trổ ựến chắc hạt

Theo một nhóm chuyên gia của WMO (Tổ chức khắ tượng thế giới) phân ựịnh 4 loại hạn là hạn khắ tượng,hạn nông nghiệp, hạn thủy văn và hạn kinh tế xã hội

Theo Gulialep và ctv,Lê Khả Kế, đào Thế Tuấn và ctv, ựã chia hạn thành 4 loại chắnh sau:

- Hạn không khắ: Do ựộ ẩm không khắ thấp 10-20% gây nên sự héo tạm thời cho

cây, vì khi nhiệt ñộ không khí cao gây nên ẩm ñộ không khí giảm, làm lượng nước bốc hơi dẫn ñến các bộ phận non của cây bị thiếu nước Nếu hạn kéo dài dễ làm cho keo nguyên sinh bị ñông kết và cây nhanh chóng bị chết còn gọi là cảm nắng, tác hại nhất

là gió khô Hạn không khí diễn ra trong thời gian dài sẽ dẫn ñến hạn ñất

- Hạn ñất: Gây nên hạn lâu dài, cây thiếu nước, không có ñủ nước ñể hút, mô cây

bị khô ñi nhiều và sự sinh trưởng trở nên khó khăn, hạn ñất luôn gây nên sự giảm thu hoạch, nếu hạn sớm có thể dẫn ñến mất trắng, không cho thu hoạch

- Hạn kết hợp: Khi có sự kết hợp cả hạn ñất và hạn không khí thường gây nên hạn trầm trọng, nếu kéo dài có thể làm tổn hại lớn ñến cây trồng

- Hạn sinh lý: Khi có ñầy ñủ nước mà cây vẫn không hút ñược nước có thể do: nhiệt ñộ quá thấp hoặc phần xung quanh rễ có quá nhiều chất gây ñộc cho rễ hoặc do nồng ñộ dinh dưỡng xung quanh rễ quá cao

Theo Nguyễn văn Hiển (2000) và một số tác giả khác thì hạn ñược chia làm 3 loại: Hạn ñất, hạn không khí, hạn tổng hợp

Theo số liệu tổng lượng mưa nhiều năm, thời gian phân bố mưa và ẩm ñộ ở các tháng của nước ta khi so sánh với bảng phân loại hạn của D.P.Garity 1984 thì hạn ở Việt Nam chủ yếu là hạn ñất, hạn không khí ñôi khi xảy ra nhưng cục bộ ở miền trung

và các vùng khác diễn ra trong thời gian ngắn

2.3.3 Các cơ chế chống chịu hạn

a/ Cơ chế tránh hạn (Avoidence)

ðể giảm sự mất nước có thể thông qua việc ñiều chỉnh ñóng mở khí khổng, hay lá

tự cuộn lại hoặc ñiều chỉnh diện tích lá Còn ñể tăng cường cung cấp nước thì nhờ vào bộ rễ

ăn sâu, ăn rộng và số lượng rễ nhiều, to…

Có một số ñặc tính liên quan ñến cơ chế này

- Bộ rễ ñược cho là dày, dài với mạch xylem lớn có thể hút nước ở các tầng ñất sâu (Fukai S and Cooper m, 1995), kiểu rễ này thường ñi liền với khả năng ñẻ nhánh vừa Nếu lúa ñẻ nhánh nhiều sẽ có nhiều rễ bất ñịnh như vậy sẽ giảm lượng ñồng hóa cho rễ có thể ăn sâu hơn (Nguyen và cs, 1997)

- Một hệ thống rễ ăn sâu sẽ làm tăng tổng lượng nước hữu hiệu trong cây Bộ rễ

ăn sâu của giống lúa cạn chỉ ra giống ñó có khả năng chịu hạn tốt Bộ rễ và hệ thống

mạch dẫn xylem lớn trong rễ và trong thân rạ ñảm bảo cho sự hút, dẫn nước tốt hơn;

- Lớp phủ cutin ñược coi là “hàng rào” ngăn cản sự mất nước không qua khí khổng

- Một cơ chế rất quan trọng làm giảm ảnh hưởng của hạn ñó là cơ chế ñóng khi khổng ở ñầu thời kỳ ñầu bị hạn ðặc trưng thích nghi này làm giảm sự mất nước và giảm sự hấp thu bức xạ mặt trời ðiều này có thể ñạt ñược bằng sự vận ñộng của lá song song với tia sáng ñể nhận ñược ánh sáng ít nhất, ñặc biệt là vào ban trưa (Hoàng Minh Tấn và cs, 2000)

- Diện tích lá: khuynh hướng giảm diện tích lá ñể hạn chế tối ña sự mất nước thông qua việc giảm quá trình thoát hơi nước Diện tích lá lớn ở các giống lúa cạn chịu hạn cổ truyền là một dấu hiệu phải quan tâm trong việc sử dụng ñặc tính liên quan ñến diện tích lá này

- Sự cuốn lá: tuy không phải là cơ chế bảo vệ nhưng là bằng chứng về tình trạng giảm sút nước

- Thời gian sinh trưởng phù hợp ñể có thể hoàn thành các giai ñoạn sinh trưởng mẫn cảm với hạn khi ngay trong khi có ñủ nước ñược coi như một cách trốn hạn, tránh hạn với bộ rễ có thể ăn sâu xuống tầng ñất dưới hoặc bằng cách giảm sự thoát hơi nước mà không ảnh hưởng tới năng suất cây trồng ñược coi là sự tránh hạn

b/ Cơ chế né (thoát) hạn (Escape)

Ở những vùng ñất Ấn ðộ và Bawngladesh, trốn hạn là cơ chế vô cùng quan trọng giúp cây lúa vẫn có thể cho năng suất trong ñiều kiện cực kỳ thiếu nước Ở những vùng này, thời ñiểm bắt ñầu của mùa mưa thường là tháng 6 và kết thúc rất sớm vào cuối tháng 9 Những giống lúa Aus ngắn ngày thường ñược trồng ở ñấy có thể thu hoạch chỉ sau 80 ngày, những giống này sẽ tránh ñược hạn ở giai ñoạn cuối Theo Tunner (1979), thực vật ở nhóm này thường là các loài có thời gian sinh trưởng ngắn, là các cây ñoản sinh, thường sống ở những vùng sa mạc Chúng nhanh chóng hoàn thành vòng ñời và kết hạt trước khi xảy ra hạn ðặc ñiểm của loài thực vật này là sự sinh trưởng và phát triển nhanh, có tính mềm dẻo

Người ta sử dụng 4 ñặc tính cơ bản sau ñể nghiên cứu cơ chế né hạn

- Tính chín sớm (early maturity) là một ñặc tính chung nhất và dễ nhất ñể chọn

giống Sự chín sớm dẫn tới khả năng cho thu hoạch trước khi bị hạn tấn công

- Tính cảm ứng ánh sáng: liên quan tới giai ñoạn sinh thực mà trùng khớp với thời kì có triển vọng mưa nhiều

- Tính trì hoãn sự hình thành hoa sớm

- Rối loạn sự hình thành chồi (sự ñẻ nhánh ở lúa)

c/ Cơ chế chịu hạn (Tolerance)

Những biểu hiện chống chịu hạn tốt của lúa cạn trên ñồng ruộng khi xảy ra hạn hán là có sức suy giảm chiều cao, số nhánh, kích thước lá, chiều dài bông, khối lượng

và kích thước hạt Cây sinh trưởng bình thường, ñầu lá ít bị khô hay biến vàng, ñiểm cuốn lá thấp, các bông lúa phải trỗ thoát và ñộ hữu dục cao Về khả năng sinh trưởng, quần thể giống lúa chịu hạn có khả năng sinh trưởng nhanh và mạnh, sớm tạo ra diện tích lá che phủ mặt ñất hạn chế cỏ dại, ñồng thời hạn chế sự thoát hơi nước qua bề mặt ruộng (Vũ Văn Liết, Vũ Thị Bích Hạnh, 2004)

Theo Tunner (1979), ñây là hoạt ñộng của cây trồng nhằm duy trì chức năng sinh

lý của mô tế bào và khả năng của thực vật thông qua việc ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu, tăng ñộ nhớt của chất nguyên sinh, làm tế bào chịu ñược sự mất nước Cơ chế này biểu hiện ở 3 ñặc tính sau:

- Sự vận chuyển, tích luỹ các chất ñồng hoá là sự di chuyển của các chất ñồng hoá từ thân lá vào hạt ở cây lúa cạn Theo nhiều tác giả nghiên cứu cơ chế của gen chịu hạn, chính hoạt ñộng tăng tích luỹ hyñrát các-bon, ñặc biệt là các axit amin, các loại ñường… làm tăng tính chịu hạn ở cây trồng và cây lúa;

- Sự ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu và tính thấm của tế bào: nó có thể trì hoãn và góp phần làm giảm sự chết các mô tế bào khi bị mất nước Một ít tính ña dạng di truyền ở cây lúa ñã ghi nhận vấn ñề này (O’Toole, 1982) Sự co dãn tế bào: kích thước

tế bào có thể thay ñổi theo sự tăng hoặc giảm của lượng nước có mặt

d/ Cơ chế chống hạn (Resistance)

Thực vật có cơ chế chống chịu hạn ñược thể hiện ở tất cả các ñặc tính về khả năng hút nước, giữ nước và sử dụng tiết kiệm nước, bao gồm:

- Giảm sự bốc hơi nước thông qua khả năng ñóng mở khí khổng, giảm diện tích

lá, góc ñộ lá hẹp và sự vận ñộng của bộ lá có hướng song song với ánh sáng mặt trời,

hoặc lá cuộn lại là ñể làm giảm sự bốc hơi qua bề mặt;

- ðể duy trì sự cung cấp nước thường có một bộ rễ cực phát triển, ăn sâu, rộng với số lượng rễ và mật ñộ rễ cao Các rễ to mập, có hệ thống mạch dẫn (xylem) lớn ñể việc vận chuyển nước trở nên dễ dàng;

- Khả năng ñiều chỉnh tính thấm cao, tăng khả năng tích luỹ chất ñồng hoá ñể giảm thế thẩm thấu, giúp cho việc ñiều chỉnh áp suất thẩm thấu và tăng sức trương mô

tế bào, có khả năng duy trì nguyên vẹn về cấu trúc cũng như các chức năng sinh lý của màng tế bào và các cơ quan tử, ñảm bảo ñộ nhớt của chất nguyên sinh làm cho chất nguyên sinh chịu ñược sự mất nước cao

Ngoài các cơ chế trên, một số tác giả khác còn ñưa ra các ý kiến sau:

- Theo Ebleringer (1976), sự phủ lông tơ hay sự mọc lông ñược coi là một ñặc ñiểm thích ứng với việc thiếu nước

- Góc lá: Các giống lúa mì có góc lá lỏng lẻo, xoè cho năng suất cao hơn và ổn ñịnh hơn ở các vùng ñịa phương sớm xảy ra hạn

- Số nhánh: Sự ñẻ nhánh nhiều là bất lợi ñối với cây lúa gạo và lúa mì khi có hạn xảy ra trước trỗ

- Râu hạt góp phần khá quan trọng ñể cây lúa mì quang hợp, ñược coi như là một nhân tố quyết ñịnh năng suất khi có khủng hoảng ñộ ẩm trầm trọng

Có rất nhiều các ñặc tính kể trên ñược các nhà chọn giống sử dụng khi tiến hành chọn giống chịu hạn Thế nhưng nó sẽ kéo theo các thay ñổi sau quá trình chọn lọc hay còn gọi là các “hiệu ứng pleiotropic”, tạm dịch là “hiệu ứng ña hướng của tính trạng” Một ñặc tính nào ñó làm tăng hiệu quả sử dụng nước thường ñi kèm với “hiệu ứng pleiotropic” Ngoài ra, ñể tăng khả năng chịu hạn sẽ nhận ñược kết quả là giảm năng suất

e/ Cơ chế phục hồi

Cơ chế phục hồi biểu hiện ở hai khía cạnh sau:

- Lớp rễ ăn nông góp phần thúc ñẩy nhanh sự hút nước khi có mưa xảy ra sau một thời kỳ bị hạn

- Phản ứng siêu cảm: tế bào thực vật phản ứng một cách nhanh chóng bằng việc ngủ nghỉ khi có sự thiếu nước xảy ra và cũng ngay lập tức, phục hồi hiệu quả làm việc của chúng khi có nước trở lại

2.4 Cơ sở di truyền tắnh chống chịu khô hạn

Nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bản ựồ gen, nhiều nhà khoa học ựã xác ựịnh vị trắ và vai trò của một số vùng gen liên quan ựến khả năng chống chịu hạn Các ựặc trưng như bộ rễ khỏe, ăn sâu, khả năng ựiều chỉnh áp suất thẩm thấu, khả năng duy trì thế nước ở lá trong các ựiều kiện khô hạn Ầ ựều quyết ựịnh quan trọng ựến khả năng chống chịu hạn của cây trồng (Bùi Chắ Bửu và cộng sự, 2003) đáp ứng lại hiện tượng stress do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ

từ việc nhận tắn hiệu ựến truyền nó ựi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kắch thắch hoạt ựộng của gen mục tiêu Chống chịu khô hạn là tắnh trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện ựồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về mội trường (Thomashow, 1999) điều này làm cho những tiến bộ nhất ựịnh về cải biên di truyền tắnh chống chịu khô hạn xảy ra rất chậm chạp

Sự phát triển nhanh chóng của ngành genome học chức năng và công nghệ sinh học trong thời gian gần ựây ựã cung cấp cho các nhà khoa học cơ hội mới ựể cải tiến tắnh trạng chống chịu khô hạn Chiến lược có hiệu quả ựã ựược ghi nhận là làm gia tăng lượng ựường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật chuyển nạp gen Những hợp chất ựó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, ựóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu; trong vài trường hợp, chúng ổn ựịnh ựược các phân tử chức năng dưới ựiều kiện bị stress (Garg và cs, 2002)

Hạn hán là một trong những yếu tố phi sinh học ảnh hướng rất lớn ựến năng suất cây trồng, lượng mưa phân bố không ựồng ựều làm cho vấn ựề hạn hán trở lên nghiêm trọng hơn (LUO and Zhang, 2001) Cây trồng ựã có hàng loạt các cơ chế ựể thắch ứng với sự biến ựổi này, cơ chế thoát hạn (DE) thông qua một chu kỳ sống ngắn hơn, sức sồng dẻo dai hơn, cơ chế tránh hạn (DA) thông qua sự tăng cường hấp thu nước, giảm sự thoát hơi nước của bề mặt lá, cơ chế chiu hạn (DT) thông qua ựiều chỉnh thẩm thấu (OA)Ầ Thông qua các kết quả nghiên cứu thì các tắnh trạng cây trồng nhằm ựáp ứng ựược sự biến ựổi của cây trồng cũng ựược giải mã dưới góc ựộ phân tử Bản ựồ di truyền liên quan ựến tắnh chịu hạn ựược giải mã với hàng loạt các locus tắnh trạng liên kết với tắnh trạng chịu hạn (Lilley và cs, 1996; Zhang và cs, 1999,

2001; Robin và cs, 2003) Khả năng chịu hạn (DT) và tránh hạn (DA) là hai cơ chế quan trọng nhất trong bộ máy hoạt động của cây trồng để chống lại hạn hán (Bing Yue

và cs, 2006) Trong nghiên cứu của ơng bằng chỉ thị phân tử SSR đã xác định được 27 QTL quyết định 7 đặc điêm liên quan đến sức đề kháng của cây lúa, 36 QTL kiểm sốt 5 đặc điểm kiểm sốt rễ lúa và 38 QTL liên kết với tính trạng trên rễ lúa kiểm sốt 7 đặc điểm dưới điều kiện khơ hạn (Bing Yue và cs, 2006)

ðặc tính chịu hạn của cây trồng là do nhiều yếu tố quyết định như đặc điểm hình thái, giải phẫu; các chỉ tiêu sinh lý, sinh hĩa…Trong đĩ sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu áp suất dịch bào là một phản ứng cơ bản đối với sự thiếu hụt nước (Nguyễn Thị Ngọc Lan và cs)

Theo các nhà khoa học IRRI (1997), hầu hết các nghiên cứu về marker phân tử đều quan tâm đến những thành phần rất đặc biệt trong sự kiện chống chịu khơ hạn,

đĩ là:

- Khả năng của rễ cây phát triển sâu xuống tầng đất bên dưới

- Tính trạng phun râu và tung phấn với thời gian cách quãng được xác định (ASI)

- Sự điều hịa áp suất thẩm thấu (OA)

- Hiện tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid)

- Hiện tượng nơng học WUE (water use efficiency)

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của các tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen, và hoạt động của các luci bao gồm tương tác gen (epistasis) và tương tác QTL x E (mơi trường) Một mục tiêu khác của QTL là xác định những Marker mang tính chuẩn đốn với những kiểu hình đặc thù nào đĩ, sao cho việc áp dụng MAS trở nên cĩ hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dịng chống chịu khơ hạn Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản QTL là “cloning” các gen điều khiển tính trạng số lượng vơ cùng phức tạp, thơng qua tiếp cận kĩ thuật “map-based cloning” Số QTL được tìm thấy đối với tính trạng chống chịu khơ hạn thường thay đổi từ 1 đến 4 đối với một tính trạng thuộc thành phần trong sự kiện chống chịu hạn, và những QTL này thường trải rộng trên tồn bộ genome với nhiều nhĩm liên kết gen Thí dụ, tính trạng WUE (hiệu qủa sử dụng nước) được tìm thấy với rất ít QTL, từ 4 đến 5 trong genome cây

ñậu nành (Xiao và cs, 2007)

Bản ñồ “fine mapping ” cũng ñược thiết lập trên nhiễm sắc thể số 9 nhằm xác ñịnh chỉ thị phân tử chọn lọc dòng chống chịu hạn Bản ñồ QTL ñiều khiển chốn chịu khô hạn thể hiện trên các nhiễm sắc thể 2, 3, 4, 8, 9, 10 và 12 (Nguyễn Thị Lang và cs, 2008)

Trong một vài trường hợp, có những QTL ñịnh vị trên cùng một nhóm gen liên kết, ñiều khiển nhiều tính trạng quan trọng như khả năng ñiều tiết áp suất thẩm thấu (OA), Khả năng chống chịu sự thủy phân, chúng liên kết với tính trạng hình thái học của rễ lúa Biến thiên kiểu hình ñối với từng tính trạng xét trên mỗi vị trí QTL xoay quanh giá trị 10% Trong trường hợp ngoại lệ, QTL ñối với tính trạng chiều dài rễ ở giai ñoạn 28 ngày tuổi biến thiên 30% (Lilley và cs, 1996)

Mối quan hệ giữa năng suất và QTL thường cho kết quả âm tính trong vài trường hợp, nhưng ñối với tính trạng ASI, kết quả chống chịu hạn không ñối kháng với năng suất Những QTL ñối với tính trạng ASI có tính ổn ñịnh nhiều năm, trong ñiều kiện mức ñộ stress khác nhau (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 2003)

Hệ thống rễ phát triển tốt là một tính trạng vô cùng quan trọng giúp cây trồng chống chịu khô hạn Người ta ñã sử dụng quần thể ñơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI) Sau ñó ñã phát triển quần thể gần như ñẳng gen (NIL) của IR64 ñược du nhập với những QTL chủ lực Các tác giả

ñã ghi nhận bốn ñoạn trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, và 9 là nơi ñịnh vị các QTL chủ lực trong phân tích chọn lọc từng QTL mục tiêu (Shen và cs, 1999)

Người ta thực hiện nhiều cặp lai giữa các cây BC3F2 mang những ñoạn mục tiêu của vật liệu cho gen ñiều khiển rễ lúa phát triển tốt, ñể loại trừ ảnh hưởng

di truyền theo kiểu “genetic drag” và ảnh hưởng các QTL mục tiêu khác nhau chồng lấp theo hình tháp (Shen và cs, 1999)

Tại ðại học Texas Tech, Zhang và cs (1999) ñã thực hiện bản ñồ di truyền QTL ñối với 2 tính trạng quan trọng liên quan ñến sự kiện chống chịu khô hạn, ñó là: khả năng ñiều tiết áp suất thẩm thấu (OA), và những tính trạng hình thái của rễ lúa Hện tượng ñiều tiết áp suất thẩm thấu (OA) là một hợp phầm quan trọng trong

sự kiện chống chịu khô hạn Khả năng OA của cây giúp nó tích lũy chất hòa tan

một cách chủ ñộng trong tế bào, khi cây bị khô hạn Tính trạng OA kết hợp với tính trạng năng suất ổn ñịnh trong ñiều kiện hạn ñã ñược quan sát ở lúa mì và cao lương, nhưng hiện tượng này không ñược ghi nhận ở cây lúa

Purwantomo ñã khai thác vai trò của các gen có tính chất “homeobox” ñể phát triển giống lúa chống chịu khô hạn Trong khi ñó, nhóm nghiên cứu của CIRAD (Pháp) tập trung nghiên cứu ñặc tính của rễ lúa thích nghi với sự phát triển

Sự phát triển hệ thống rễ lúa tương thích với stress ñã ñược nghiên cứu và so sánh với cây Arabidopsis thaliana Một array biểu thị clone có qui mô 22 K ñối với áp suất thẩm thấu và stress do mặn (SSH), một receptor ñặc biệt và một oligo ñóng vai trò chuyển mã ñã ñược xác ñịnh Họ phát hiện ra gen mục tiêu có liên quan ñến rễ lúa trong ñiều kiện gặp bất thuận

Bằng việc sử dụng marker trợ giúp chọn lọc (MAS), các vùng gen liên quan ñến tính trạng này ñược ñịnh vị trên nhiễm sắc thể 1, 2, 3, 4, 5, 9 và 11 của cây lúa Một vùng gen trên nhiễm sắc thể số 4 ñược xác ñịnh là chứa locus tính trạng số lượng chính quyết ñịnh chiều cao cây, năng suất hạt, số hạt trên bông trong ñiều kiện thiếu nước (Wing, 2003)

Bên cạnh ñó, bằng việc so sánh sự trùng khớp ngẫu nhiên của locus tính trạng số lượng với một số tính trạng ñặc biệt khác, người ta ñã phân tích kỹ mối quan hệ tự nhiên giữa tính trạng bộ rễ và khả năng ñiều chỉnh tính thấm với tính trạng năng suất trong ñiều kiện hạn Nghiên cứu này chứng minh vùng gen có

kí hiệu RG939-RG476-RG214 trên nhiễm sắc thể số 4 quyết ñịnh quan hệ của bộ

rễ với tính trạng chịu hạn (Babu và cs., 2003) Thực hiện fine mapping gen chống chịu hạn cây lúa trên nhiễm sắc thể số 9 (Bùi Chí Bửu, 2008), sử dụng biện pháp chọn lọc giống chống chịu khô hạn bằng chỉ thị phân tử (MAS) trên quần thể lai OM1490/WAB880-1-38-18-20-P1-HB, OM1490/WAB881 SG9 229 BC2F2 và OM4495/IR65195-3b-2-2-2-2 Trong nghiên cứu này tác giả ñã xác ñịnh ñược locus RM201 trên nhiễm sắc thể số 9 liên kết chặt với tính trạng mục tiêu DRS (Drought Recovery Score), RM201 ñược ñề nghị sử dụng cho chọn tạo giống lúa chống chịu khô hạn nhờ chỉ thị phân tử (Bùi Chí Bửu, 2008)

Yinong Yang (2003) công bố gen MAPK5 có vai trò tăng cường sức chống

chịu của cây lúa với các khủng hoảng môi trường trong ñó có hạn

Theo Ray Wu (2003), hợp chất có khả năng cải tiến tính chống chịu hạn, mặn và nhiệt ñộ thấp của lúa là một loại ñường ñơn, gọi là trehalose Trehalose

có thể hoạt ñộng như nước thay thế trên bề mặt của protein ở lớp màng tế bào khi xảy ra thiếu hụt nước nghiêm trọng, ngăn chặn sự kết tinh hay biến chất các protein, giữ cho hoạt ñộng sinh lý, sinh hóa diễn ra bình thường Các gen mã hóa enzyme tổng hợp trehalose là trehalose-6-phosphate synthase (TPS) và trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 2003)

Giáo Sư Ray Wu, ðH Cornell, Mỹ, ñã phát triển 3 dòng lúa chuyển gen: (1) gen tổng hợp proline p5cs, (2) gen choline oxidase COX, (3) dung hợp cả hai gen TPS và TPP trong tổng hợp trehalose Gorantla ñã nghiên cứu phổ thể hiện các gen ñiều khiển tính chống chịu khô hạn với nhiều gen mục tiêu ñã ñược phát hiện Toojinda thực hiện bản ñồ QTL ñiều khiển tính trạng chống chịu khô hạn tại Thái Lan, với các tính trạng mục tiêu: năng suất hạt, sinh khối, chỉ số thu hoạch HI, số hạt chắc và lép, số hạt / bông, tỉ lệ bất thụ, trọng lượng 1000 hạt, số bông, số chối, chiều cao, số ngày từ gieo ñến trỗ,v.v QTL ñịnh vị trên các nhiễm sắc thể

1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 ñã ñược phân tích, trên cơ sở quần thể DH của tổ hợp lai IR62266 / CT9993 tại 3 ñịa ñiểm khác nhau trong 3 năm liên tục ðặc biệt chú ý nhiễm sắc thể số 3 và số 5, nó tập hợp nhiều QTL có liên quan ñến tính chống chịu khô hạn (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 2005)

Hiện tượng nông học WUE trong cây lúa ñã ñược Karaba và cộng sự (2007) nghiên cứu khá hệ thống với sự thể hiện của gen HRD chuyển nạp từ Arabidopsis Cây lúa chống hạn tiêu thụ nước ít biểu thị sự kiện sinh khối rễ tăng lên trong ñiều kiện có tưới trở lại Gen HDR với yếu tố chuyển mã AP2/ERF, ñược phân lập trong dòng ñột biến của Arabidopsis (theo kiểu gắn thêm chức năng) hrd-D, ñiều khiển tính trạng sức mạnh của rễ, sự phân nhánh, tế bào biểu bì, ñộ dầy của lá với tỷ lệ lục lạp tăng cao trong tế bào mesophyll, làm thúc ñẩy hiện tượng ñồng hóa quang hợp và hiệu suất quang hợp

Các tác giả còn ghi nhận 21 QTL ñối với tính trạng khác trong ñiều kiện stress do khô hạn Mặc dù 2 QTL với tính trạng chiều cao ñịnh vị ở nhiễm sắc

thể số 1 và số 3, khá phổ biến, nhưng khơng cĩ một luci nào đối với tính trạng hình thái học của rễ được ghi nhận phổ biến giữa hai giai đoạn phát triển Sự khơng cĩ mặt của những QTL phổ biến với tính trạng hình thái rễ giữa hai giai đoạn phát triển (65 ngày đầu cĩ nước, và từ 65 đến 85 ngày khơ hạn) cho thấy sự hiện diện của những cơ chế di truyền cùng tồn tại song song, cùng khởi động ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau, dưới điều kiện nước tưới khác nhau Thể tích rễ và tổng số

rễ trên một cây giảm cĩ ý nghĩa về mặt thống kê dưới điều kiện hạn, trong khi đĩ chiều dài rễ tối đa và chiều cao cây khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (Bùi Chí Bửu và cộng

sự, 2005)

ðặc biệt, Wang và cs (2007) đã so sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện bị stress do khơ hạn, sử dụng phương tiện cDNA microarray Giống lúa cạn IRAT109, Haogelao, Han 297 và giống lúa nước Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare đã được sử dụng Sau khi đọc chuỗi trình tự DNA, cĩ 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao ở giống lúa cạn và 79 ở giống lúa nước Tác giả dự đốn sự thể hiện của các gen mục tiêu ở mức độ cao trong lúa cạn cĩ thể cải tiến được khả năng chống chịu stress do khơ hạn trong lúa nước và những lồi cây trồng cĩ liên quan gần về huyết thống

Protein LEA (Late Embryogenesis Ebundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước (Goyal v à c s , 2005) Protein LEA được phân chia thành 5 nhĩm chính trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nĩ và chúng được xét nghiệm lại thơng qua cơng cụ tin sinh học (Wise và cs, 2003) Những protein như vậy đã đĩng gĩp phần nào vào sự tiến hĩa của nhĩm protein cĩ tên gọi là “hydrophilins” khi chúng đáp ứng với điều kiện thẩm thấu cực trọng (Garay-Arroyo và cs, 2000) Vai trị chính của protein LEA là hoạt hĩa những amino acid ưa nước và đã nạp năng lượng Sự thể hiện của các gen LEA thường xảy ra dưới dạng abscisic acid độc lập

Nĩ khơng những chỉ được phát hiện trong hạt mà cịn trong các mơ tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu nước, do mặn, và do lạnh Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nĩ cho thấy vai trị bảo vệ cây chốngchịu sự kiện mất nước (Grelet và cs.,2005) Mặc dù chúng ta cĩ nhiều số liệu về cấu trúc và sự thể hiện của protein này, nhưng rất ít cơng trình đề cập đến thao tác của các gen LEA

nhằm cải tiến tính chống chịu khô hạn trong ñiều kiện ñồng ruộng (Xiao và cs.,2007) Thí dụ, gen HVA1 mã hóa nhóm protein 3 LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.) Người ta ñã chuyển nạp gen này thành công vào cây lúa ñể tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu mặn, chỉ trong ñiều kiện ở nhà lưới Một clone cDNA có ñộ dài phân tử ñầy ñủ chứa gen LEA nhạy cảm với stress do mặn và gen OsLEA3-1 ñã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong ñiều kiện ñồng ruộng, nhờ promoter HVA1-like và promoter kiến trúc CaMV35S (Xu và cs., 1996) ðây có thể nói là sự kiện nổi bật trong thời gian gần ñây, nhờ kết quả của thí nghiệm ñồng ruộng mang lại

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các dòng và mẫu giống lúa có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ñịa phương như trình bày ở bảng sau

12 456 Nếp Trắng (Ngọ Clooc), ðiện Biên

15 459 Lúa nếp tròn (Ngọ Mồn), ðiện Biên

25 469 Tẻ Pơ Dệ, điện Biên

29 473 Nếp Pâu Cai u, điện Biên

31 475 Lúa tẻ (Thái Lan vàng), điện Biên

32 476 Nếp Thơm (Pe Hưa), điện Biên

36 480 Lúa tẻ Thái Lan, điện Biên

39 484 Lúa Nếp (Khẩu Biểng), Ba Bể, điện Biên

40 485 Lúa tẻ Pơ Khao, Trùng Khánh, Cao Bằng

- Các loại hóa chất và dụng cụ dùng trong chạy phản ứng PCR

* Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ 10/2011 Ờ 6/2012

- Viện Nghiên cứu lúa Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và phòng thắ nghiệm bộ môn công nghệ sinh học thực vật, Khoa công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

1 đánh giá thanh lọc khả năng chịu hạn trong phòng bằng xử lý KCLO3

2 đánh giá khả năng chịu hạn và ựặc ựiểm nông sinh học, khả năng chống chịu sâu bệnh, năng suất và yếu tố tạo thành năng suất của các dòng và mẫu giống trong ựiều kiện nhà có mái che gây hạn nhân tạo

3 đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học, khả năng chống chịu sậu bênh, năng suất và yếu

tố tạo thành năng suất của các dòng và mẫu giống ựã thành lọc trong ựiều kiện canh tác có tưới

4 đánh giá khả năng chịu hạn của mẫu giống ựã ựược thanh lọc ở thắ nghiệm 1 bằng phương pháp ống rễ

5 Xác ựịnh vật liệu có gen quy ựịnh chiều dài rễ và tốc ựộ xuyên của rễ bằng chỉ thị phân tử SSR

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1.Thắ nghiệm 1: đánh giá khả năng chịu hạn trong phòng bằng xử lý KCLO3

+ Vật liệu nghiện cứu

Vật liệu gồm các dòng giống như trình bày trong phần vật liệu

+ Phương pháp nghiên cứu

- Xử lý hạt thóc bằng dung dịch Kaliclorate (KCLO3) với nồng ựộ 2,5%, 3% và 3,5% Ngâm hạt giống trong dung dịch KCLO3 trong vòng 50 tiếng sau ựó rửa sạch bằng nước và chuyển sang ựĩa Petri có lót giấy lọc ẩm cho nẩy mầm đánh giá tỷ lệ mầm héo bằng xử lý ở giai ựoạn mạ 3 lá, ngâm rễ mạ trong dung dịch KCLO3 1% 8 tiếng sau ựó ựưa ra ựể quan sát (Vũ Tuyên Hoàng và cs, 1995)

- Thắ nghiệm ựược bố trắ 3 lần lặp lại với ựối chứng giống CH207

+ Chỉ tiêu theo dõi

Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu là những dòng ñã ñược ñánh giá thanh lọc trong phòng từ thí nghiệm 1 xác ñịnh có khả năng chịu hạn ñưa vào ñánh giá chịu hạn bằng gây hạn nhân tạo, hai ñối chứng là giống CH207 (ðC1) và Khang dân 18 (ðC2)

ðảm bảo ñủ nước ñến giai ñoạn gây hạn;

Chăm sóc làm cỏ, phương pháp bón phân, phòng trừ sâu bệnh áp dụng như sản xuất ñại trà

+ Gây hạn trước trỗ 10 ngày và kết thúc gây hạn sau trỗ 10 ngày, tháo cạn nước toàn

bộ các ô thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Các giai ñoạn sinh trưởng phát triển:

- Ngày gieo, ngày mọc;

- Ngày bắt ñầu ñẻ nhánh, ñẻ nhánh rộ, kết thúc ñẻ nhánh;

- Ngày trỗ;

- Ngày chín

+ Một số ñặc ñiểm nông sinh học:

- Chiều cao cây cuối cùng;

- Chiều dài, chiều rộng lá ñòng;

- ðộ trỗ thoát;

- Kiểu cây;

- Số nhánh tối ña

Các chỉ tiêu theo dõi ñánh giá ñặc ñiểm liên quan ñến tính chịu hạn theo Fischer

- Xác ñịnh ñộ tàn lá: Quan sát chung triệu chứng của lá trong một ô trên

cơ sở tổng diện tích lá bị khô ñể cho ñiểm,

7 Hơn 2/3 các lá khô hoàn toàn

9 Tất cả các cây biểu hiện chết, các lá khô hoàn toàn

+ ðiểm cuốn lá

ðiểm cuốn lá trong gia ñoạn gây hạn nhân tạo

0 Các lá khỏe mạnh bình thường

1 Các lá bắt ñầu hơi cuốn(nông)

3 Các lá cuốn sâu (hình chữ V sâu)

WY: Năng suất của giống trong ựiều kiên có tưới

DYA: Tổng năng suất của các giống nghiên cứu trong ựiều kiện hạn

WYA: Tổng năng suất của các giống nghiên cứu trong ựiêu kiện có tưới

Nếu DI > 1 giống có khả năng chịu hạn cao

DI < 1 giống mẫn cảm với ựiều kiện hạn

+ Chỉ tiêu theo dõi năng suất và yếu tố tạo thành năng suất

- Năng suất cá thể( gam/khóm)

3.3.3 Thắ nghiệm 3: đánh giá các ựặc ựiểm nông sinh học, chống chịu sâu bệnh, năng suất và yếu tố tạo thành năng suất trong ựiều kiện canh tác có tưới

Vật liệu là những dòng ựã ựược ựánh giá thanh lọc trong phòng từ thắ nghiệm 1 xác ựịnh có khả năng chịu hạn, hai giống ựối chứng là CH207 (đC1) và Khang dân 18 (đC2)

* Các chỉ tiêu theo dõi như thắ nghiệm 2

* đánh giá mức ựộ suy giảm năng suất ở môi trường gây hạn nhân tạo và môi trường

ựủ tưới bằng công thức: %giảm = Chỉ tiêu môi trường hạn - chỉ tiêu môi trường ựối chứng/Môi trường ựối chứng x 100

3.3.4 Thắ nghiệm 4: đánh giá khả năng chịu hạn bằng phương pháp ống rễ (theo Big Yue, 2006)

* Vật liệu nghiên cứu: Vật liệu là những dòng ựã ựược ựánh giá thanh lọc

trong phòng từ thắ nghiệm 1 xác ựịnh có khả năng chịu hạn, hai giống ựối chứng là CH207 (đC1)

* Phương pháp nghiên cứu:

+ Thắ nghiệm bố trắ theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên CRD 3 lần nhắc lại (Nguyễn Thị Lan, Phạm Tiến Dũng, 2005)

1.Chuẩn bị ống nhựa PVC ựường kắnh 20 cm, cao 01m hai bên thành ông ựục lỗ thoát nước ở vị trắ 25cm, 50cm và 75 cm tắnh từ trên xuống Cho vào túi nilong 38 kg ựất phù sa sông Hồng ựã ựược phơi khô sàng sạch tạp chất, sau ựó trộn ựều với 25 g phân (gồm 03 g mỗi loại N, P2O5, và K2O)

2 Ngâm 5 hạt nảy mầm, mỗi dòng giống gieo vào một ống sau 30 ngày tỉa bỏ chỉ

ựể lại 01 cây khỏe

+ Giai ñoạn bắt ñầu ñẻ nhánh bón thúc mỗi ống 01 g urea ( hòa tan với nước ñể

tưới) Tưới nước ñầy ñủ cho ñến khi xử lý gây hạn

Gây hạn chu kỳ 1: khi lúa bắt ñầu làm ñòng, rút các nút tháo nước ở lỗ hai bên ống (25, 50 và 75cm), gây hạn cho ñến khi quan sát buổi trưa khi lá cuốn tròn, tương ứng

với ñộ ẩm liên kết 72-75%, tưới nước trở lại và duy trì nước ñủ ẩm 01 ngày, bắt ñầu

gây hạn chu kỳ 2 ñến khi lá cuốn tròn Sau chu kỳ 2 tưới nước ñể cây phát triển Các ống ñược xắp xếp 3 khối trong thiết kế khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh

*Chỉ tiêu theo dõi

7 Hơn 2/3 các lá khô hoàn toàn

9 Tất cả các cây biểu hiện chết, các lá khô hoàn toàn

- ðiểm cuốn lá :

0 : Lá bình thường

1: Lá bắt ñầu cuốn ( hình chữ V nông)

3: Lá cuốn lại (hình chữ V sâu)

5: Lá cuốn hoàn toàn (hình chữ U)

7:Mép lá chạm nhau (hình chữ O)

9: Lá cuộn chặt lại

+ Các tính trạng rễ theo dõi khi hạt lúa chín

- ðo chiều dài rễ dài nhất (cm)

- Thể tích rễ chia làm 2 phần : phần 1 từ ñốt cơ bản của cây ñến 30cm và phần còn lại dưới 30cm là phần ñộ sâu của bộ rễ

ðo thể tích rễ (mililít ) bằng phương pháp ống ñong nước của Price and Tomos năm

1997

Cho nước vào ống ựong ựo thể tắch lần 1, cho rễ vào ống ựong và ghi thể tắch lần 2

Thể tắch rễ = thể tắch 2 Ờ thể tắch 1

- Năng suất và yếu tố tạo thành năng suất ( số bông hữu hiệu, tỷ lệ hạt chắc, khối lượng 1000 hạt)

- Năng suất hạt trên khóm

3.3.5 đánh giá khả năng chịu hạn sử dụng chỉ thị phân tử SSR

RM307: độ sâu rễ tối ựa dưới ựiều kiện có tưới

5Ỗ- GTA CTA CCG ACC TAC CGT TCA C - 3Ỗ

5Ỗ - CTG CTA TGC ATG AAC TGC TC - 3Ỗ

RM471: Sinh trưởng của rễ ở ựộ sâu gây hạn (cm)

5Ỗ - ACG CAC AAG CAG ATG ATG AG - 3Ỗ

5Ỗ - GGG AGA AGA CGA ATG TTT GC - 3Ỗ

+ Sử dụng hai cặp mồi là MR219 và RM 296 (B Yue và cs, 2006) tắnh trạng trên NST số 9, trình tự mồi như sau:

RM219: Tỷ lệ sinh trưởng của rễ ở ựiều kiện hạn (cm/ngày) 5Ỗ - CGT CGG ATG ATG TAA AGC CT - 3Ỗ

5Ỗ - CAT ATC GGC ATT CGC CTG - 3ỖRM296: Tỷ lệ thể tắch rễ ở ựộ sâu (%) trong ựiều kiện gây hạn 5Ỗ - CAC ATG GCA CCA ACC TCC - 3Ỗ

5Ỗ - GCC AAG TCA TTC ACT ACT CTG G - 3Ỗ

Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp chiết tách DNA : Chiết tách DNA theo quy trình của Zheng & cs,1995,

có cải tiến:

Tiến hành cắt vào lúc sáng sớm, chọn những lá còn non dài 2cm, không bị sâu bệnh bỏ vào ống nghiệm có dung dịch 1,5cm, ựánh dấu tên giống rồi ựặt vào ựá lạnh

Trong phòng thí nghiệm, các cối chày sứ ñã ñược hấp khử trùng và ñặt trên ñá lạnh

1 Các mẫu lá 2cm ñược cắt nhỏ 0,5mm rồi bỏ trong cối chày sứ

2 Nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào chối chày sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá

3 Nghiền kỹ mô lá ñến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh ñen, chứng tỏ tế bào lá ñã vỡ và diệp lục ñược giải phóng ra

4 ðổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào, trộn lẫn và chuyển 400µl vào ống nghiệm ñã ñánh dấu theo tên giống ban ñầu

5 ðổ vào ống nghiệm 400µl (25 phenol: 24 chloroform: 1 isoaminachohol) trộn ñều, quay ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút sau ñó chuyển phần dung dịch lớp bên trên sang ống nghiệm mới ñã ñánh số theo từng tên giống

6 ðổ vào ống nghiệm 400µl (24 chlorofrom: 1 isoaminachohol) làm tương tự như bước 5

7 ðổ 800µl ethanol (Isopropanol) trộn ñều sau ñó ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút ðổ phần dung dịch phía trên ñi, giữ lại phần kết tủa ở ñáy ống nghiệm

8 Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt ñộ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm trên giấy thấm

Phần kết tủa chính là DNA, Hòa tan DNA kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt

ñộ -200C , dùng cho các giai ñoạn nghiên cứu tiếp theo

* Dung dịch ñệm chiết (Extraction buffer):