đánh giá các đặc điểm nông sinh học và di truyền bằng chỉ thị dna của các dòng đậu tương đột biến

Vai trò của ñột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, những phương pháp chọn tạo giống ñã, ñang ñược quan tâm phát

BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO TRƯỜNG đẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

đỖ THỊ HỒNG

đÁNH GIÁ CÁC đẶC đIỂM NÔNG SINH HỌC

VÀ DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ DNA CỦA CÁC DÒNG đẬU TƯƠNG đỘT BIẾN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ đình Hòa

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2012

Tác giả luận văn

ðỗ Thị Hồng

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, ựược sự quan tâm giúp ựỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thắ nghiệm bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân thì em ựã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Với tấm lòng chân thành em xin bày tỏ lòng kắnh trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ đình Hòa, ựã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ em trong suốt quá trình thực tập

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Trịnh Hồng Kiên ựã chu ựáo, tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ và tạo ựiều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới KS Tống Văn Hải cán bộ tại phòng thắ nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, TS đặng Xuân Nghiêm

bộ môn Công nghệ vi sinh ựã giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành ựề tài thực tập tốt nghiệp của mình

Qua ựây em cũng xin gửi lời cảm ơn ựến toàn thể các phòng, ban của khoa Công nghệ sinh học, gia ựình và toàn thể bạn bè ựã giúp ựỡ, ựộng viên và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp

EM XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Học Viên

đỗ Thị Hồng

2.2.1 Cơ sở khoa học chọn tạo các giống ñậu tương ñột biến 72.2.2 Cơ sở khoa học của việc ứng dụng chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ña

2.2.3 Một số nghiên cứu di truyền ở thực vật sử dụng kỹ thuật RAPD 252.2.4 Nghiên cứu di truyền ở ñậu tương sử dụng kỹ thuật RAPD 292.3 Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới và Việt Nam 312.3.1 Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới 312.3.2 Tình hình sản xuất ñậu tương ở Việt Nam 33

3.1.3 Thời gian và ựịa ựiểm nghiêm cứu 36

3.2.1 Quy trình áp dụng cho thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng 36

3.2.3 đánh giá sai khác di truyền giữa các dòng 42

4.1 đánh giá các ựặc ựiểm nông sinh học của các dòng ựậu tương

4.1.1 đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố

cấu thành năng suất của các dòng ựậu tương ựột biến thế hệ M4 484.1.2 đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố

cấu thành năng suất của các dòng ựậu tương ựột biến thế hệ M5 56

4.3 đánh giá các dòng ựậu tương ựột biến dựa vào chỉ thị phân tử RAPD 654.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng ựậu tương 654.3.1 Kết quả thu ựược từ chỉ thị RAPD của các dòng ựậu tương 66

DANH MỤC BẢNG

2.1 Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới 31

2.2 Tình hình sản xuất ñậu tương của 4 nước ñứng ñầu thế giới trong

2.3 Sản xuất ñậu tương Việt Nam từ 2005 – 2011 34

3.3 Danh sách các mồi RAPD ñược dùng trong nghiên cứu 44

3.4 Thành phần hoá chất cho một phản ứng RAPD-PCR 44

4.1 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

4.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ñậu

tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðT12 thế hệ M4 50

4.3 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

4.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ñậu

tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðT20 thế hệ M4 54

4.5 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

có nguồn gốc từ giống giống ðVN6 thế hệ M4 55

4.6 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của của các dòng

ñậu tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðVN6 thế hệ M4 56

4.7 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

4.8 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ñậu

tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðT12 thế hệ M5 58

4.9 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

4.10 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ñậu

tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðT20 thế hệ M5 60

4.11 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng ñậu tương ñột biến

4.12 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng ñậu

tương ñột biến có nguồn gốc từ giống ðVN6 thế hệ M5 61

4.13 Hàm lượng protein và lipid của các dòng ñậu tương ñột biến có

4.16 Nồng ñộ và giá trị OD của DNA từ các dòng ñược tách chiết 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sản xuất ñậu tương ở Việt nam những năm gần ñây 34

Hình 3 ðiện di sản phẩm PCR với mồi OPC05 trên gel agarose 3% 66Hình 4 ðiện di sản phẩm PCR với mồi OPL11 trên gel agarose 3% 67

IITA The International Institute of Tropical Agriculture

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

NRCS National Research Center for Soybean

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

ðậu tương (Glycine max (L) Merrill) là cây trồng chiến lược của nhiều

quốc gia, nó không chỉ có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo ñộ phì và sử dụng lâu bền nguồn tài nguyên ñất

Trên thế giới lượng tiêu thụ ñậu tương mạnh vì ñậu tương là nguồn dầu thực vật và thức ăn giàu Protein (48% Protein thô) Sản phẩm ñược chế biến

từ ñậu tương rất phong phú ðậu tương còn chứa các hợp chất trao ñổi thứ cấp như Isoflavon, saponin, axit phytic, oligosaccharit, goitrogens và phytoestrogens Các sản phẩm từ ñậu tương có thể làm giảm khả năng phát

(http://www.Soymilkmaker.com/Soyhealth.html) [47] Hiện nay trên thế giới ñậu tương là cây ñứng ñầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu ñậu

tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật (Tổng cục thống kê,2010) Bên

cạnh ñó cây ñậu tương cũng ñược coi là một thành phần quan trọng trong hệ thống canh tác về phương diện sinh thái Do có khả năng cố ñịnh ñạm, ñậu tương ít bị phụ thuộc vào phân ñạm hơn so với các loài cây trồng khác Hơn thế, nó còn có khả năng cố ñịnh nitơ và cung cấp nguồn ñạm cho cây trồng vụ sau Vì thế ñậu tương trở thành cây trồng quan trọng trong luân canh và trồng xen ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới

Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái ñất ñang biến ñổi không ngừng, nhiệt ñộ trái ñất càng ngày càng tăng cao, từ ñó dẫn ñến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh dịch,…) gây ảnh hưởng không nhỏ ñến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây ñậu tương nói riêng Nước

ta là một nước nông nghiệp với ñặc ñiểm nổi bật là mật ñộ dân số cao vào loại

nhất thế giới, bình quân ñất nông nghiệp trên ñầu người chỉ ñạt khoảng 765m2/người Cùng với quá trình ñô thị hóa ñã làm cho diện tích ñang ngày càng thu hẹp Ước tính hàng năm chúng ta mất 50000-70000 ha ñất canh tác

(Tổng cục thống kê, 2010) Trong khi ñó biến ñổi khí hậu toàn cầu, kéo theo

sự xâm mặn nghiêm trọng, mưa gió bất thường gây ra hạn hán, lũ lụt, dịch bệnh ñang ñe dọa an ninh lương thực của ñất nước Liên hợp quốc ñã xếp Việt Nam vào một trong 8 nước có nguy cơ về an ninh lương thực ở Châu Á ðặc biệt, trong ñiều kiện mất ñất canh tác, với mức tăng dân số như hiện nay, ngành nông nghiệp phải cung cấp thêm cho ñất nước ít nhất 1 triệu tấn lương thực hàng năm

Trước tình hình ñó, ñậu tương là loại cây trồng ñược quan tâm và chú trọng nhất hiện nay, theo thống kê ñến tháng 03/2010 diện tích trồng ñậu

tương của nước ta ở thời ñiểm này là 123,9 nghìn ha (Bản tin tháng 3/2010,

ngành lương thưc, bộ NN&PTNT), sản lượng bình quân là 20 tạ/ha (Tổng cục thống kê, 2010) Tuy vậy nhưng hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số

lượng lớn ñậu tương 2300 tấn (2009) (Niên giám thống kê, 2009), ñứng thứ

hai trên toàn Châu Á sau Indonesia Chính vì thế, vấn ñề ñặt ra cho những nhà chọn giống là phải cải tiến những giống cũ, tạo ra giống mới ưu việt hơn cả về năng suất và chất lượng

Cho ñến nay các nhà chọn tạo giống ñậu tương ñã cố gắng tạo ra các giống ñậu mới với nhiều ñặc tính tốt, ñáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng

Phương pháp chọn giống truyền thống là chọn lọc cá thể mong muốn trong quần thể phân ly dựa vào kiểu hình Tuy nhiên việc chọn lọc dựa trên các ñặc ñiểm hình thái có ñộ tin cậy và hiệu quả không cao, ñặc biệt tính trạng năng suất và những tính trạng số lượng khác vì chúng bị chi phối bởi các ñiều kiện ngoại cảnh Mặc dù vậy, chọn giống theo phương pháp truyền thống ñã

gĩp phần đáng kể vào việc tăng năng suất chất lượng và khả năng kháng các loại sâu bệnh hại đậu tương

Mặc dù chọn giống truyền thống đã gĩp phần tạo ra các giống đậu tương mới làm tăng năng suất cải thiện chất lượng sản phẩm, nhưng quá trình chọn giống quá dài, thời gian để tạo ra được giống đậu tương mới khoảng từ 8- 10

vụ Ngày nay cùng với sự phát triển của di truyền phân tử và cơng nghệ liên quan, việc ứng dụng chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà chọn giống những cơng cụ mới hiện đại giúp xác định nhanh sự cĩ mặt của các gen mục tiêu Việc chọn lọc cĩ thể được tiến hành ở các giai đoạn phát triển sớm của cây, khơng cần chờ đợi tới khi cây phát triển thành thục Hơn nữa, sử dụng chỉ thị DNA tạo điều kiện chọn lọc bố mẹ để lai hiệu quả hơn Khi kết hợp với dữ liệu kiểu hình, hiệu ứng liên quan với chỉ thị DNA đánh giá ở con lai thử sớm cĩ thể sử dụng để dự đốn năng suất con lai ở các thể hệ sau (Eathing ton, 1997) ðến nay nhiều nghiên cứu đang cố gắng kết hợp cơng nghệ chỉ thị phân

tử với các phương pháp chọn giống truyền thống Nhiều loại chỉ thị dựa trên PCR đã được xây dựng cho các loại cây trồng nĩi chung và cây đậu tương nĩi riêng như: RFLP, AFLP, SSR, RAPD… Chọn giống dựa vào chỉ thị đã khắc phục nhược điểm của các phương pháp chọn giống truyền thống bởi hiệu quả sàng lọc cao, nhanh và tin cậy Trong số các phương pháp kể trên thì RAPD là phương pháp được sử dụng rộng rãi bởi đây là phương pháp dễ thực hiện và chi phí thấp hơn Chỉ thị phân tử cũng rất hữu ích trong việc mơ tả, phân loại nguồn tài nguyên di truyền đậu tương

Các giống đậu tương ở nước ta tương đối đa dạng bao gồm các giống đậu tương nhập nội, tập đồn các giống đậu tương địa phương, giống lai tạo, các giống đậu tương đột biến Cảm ứng đột biến ở đậu tương đã tạo ra nguồn biến dị di truyền đáng kể cho cả tính trạng chất lượng và tính trạng số lượng (Rarxlling và CS, 1958; Papa và cs 1961; Santos và CS, 1970; Constantin và

cs 1976; Iman 1978) mà từ ựó có thể chọn lọc những biến dị mong muốn, có ắch Từ các giống ựậu tương đVN6, đT12 và đT20 Một số dòng ựậu tương ựột biến ựã ựược tạo ra thông qua xử lắ tia gamma (Vũ đình Hòa và Nguyễn

Văn Giang, 2012) Trong ựề tài này chúng tôi đánh giá các ựặc ựiểm nông

sinh học và di truyền bằng chỉ thị DNA của các dòng ựậu tương ựột biến

- đánh giá các biến dị ựột biến thông qua chỉ thị phân tử RAPD

- Tuyển chọn ra những dòng tốt làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống ựậu tương

so với giống gốc bằng chỉ thị phân tử RAPD

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vài nét sơ lược về cây ñậu tương

ðậu tương (Glycine Max(L) Merrill) là một trong những cây trồng có từ lâu ñời ðậu tương thuộc họ ñậu Fabaceae, họ phụ Faboideae, tộc

Phaseoleae, chi Glycine Willd Glycine bao gồm 2 chi phụ là Glycine và Soja

ðậu tương ñược thuần hóa từ ñậu tương dại Glycine Soja Sieb và Zucc, tên khoa học của ñậu tương Glycine Max (L) Merrill

2.1.1 Nguồn gốc

ðậu tương là một trong những loài cây trồng mà loài người ñã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu ñời, vì vậy nguồn gốc của ñậu tương cũng sớm ñược xác minh Những bằng chứng về lịch sử, ñịa lý và khảo cổ học ñều công nhận rằng ñậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây ñậu tương ñược thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều ñại phong kiến và ñược ñưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều ñại Shang (1700- 1100 trước công nguyên) sau ñó ñậu tương ñược phát tán ñến các nước Châu Á khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Philipines, Ấn ðộ, Thái Lan, Việt Nam và Nepal ðến thế kỷ 16- 17, ñậu tương ñược du nhập vào Châu Âu và Bắc Mỹ (Singh, R.j and T Hymowitz, 1999) [45]

2.1.2 Giá trị của cây ñậu tương

ðậu tương là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao khó có thể tìm thấy một loại cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây ñậu tương, sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người và làm thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo ñất tốt Vì thế ñậu tương ñược gọi là “Ông hoàng trong các cây họ ñậu”

Giá trị về mặt thực phẩm ðậu tương là cây hạt có dầu quan trọng trên thế giới Tiêu thụ ñậu tương tăng mạnh vì ñậu tương là nguồn dầu thực vật và

thức ăn giàu protein(48% protein thô) Sản phẩm ñược chế biến từ ñậu tương rất phong phú ðậu tương còn chứa các hợp chất trao ñổi thứ cấp như Isoflavoues (Sakai và Kogiso, 2008) Saponin Phytic Acid, Oligosaccharides, Goitrongens, (Liener, 1994), Phytoestrogens (Ososki và Kenenlly, 2003) Các sản phẩm từ ñậu tương có khả năng làm giảm ung thư, mỡ máu và bệnh tim Trong hạt ñậu tương còn chứa khá nhiều loại vitamin, ñăc biệt là hàm lượng vitamin B1, B2, ngoài ra còn có các vitamin PP, A, E, K, C, D… ñặc biệt trong hạt ñậu tương ñang nẩy mầm hàm lượng vitamin tăng nhiều Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên ñậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700calo/kg

Về mặt công nghiệp: ñậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất ñốt lỏng, dầu bôi trơn ngành hàng không, nhưng chủ yếu ñậu tương ñược dùng ñể ép dầu Hiện nay trên thế giới ñậu tương là cây ñứng ñầu về nguyên liệu cho ép dầu, dầu ñậu tương chiếm khoảng 50% tổng lượng dầu thực vật ðặc ñiểm của dầu ñậu tương: khô chậm, chỉ số IOD cao: 120- 127; ngưng tụ ở nhiệt ñộ từ (-50C) ñến (-180C) Từ dầu này người ta chế biến hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, nilon

Giá trị về mặt nông nghiệp: ðậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt ñậu tương ñương với 1,38 ñơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây ñậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng ñạm khá cao nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp cho giá súc (Ngô Thế Dân và cộng sự, 1999) [6]

ðậu tương cũng là cây luân canh cải tạo ñất tốt, 1ha trồng ñậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt sẽ ñể lại trong ñất từ 30-60Kg N Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây ñậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây

trồng ựồng thời giảm chi phắ cho việc bón ựạm

2.2 Cơ sở khoa học của ựề tài

2.2.1 Cơ sở khoa học chọn tạo các giống ựậu tương ựột biến

a Khái niệm và phân loại ựột biến

đột biến (mutation) là những biến ựổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tắnh biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật Tác ựộng của các ựột biến rất ựa dạng, nó có thể gây ra những biến ựổi bất kỳ tắnh trạng nào với những mức ựộ khác nhau, từ những biến ựổi rõ rệt, ựến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy Một số ựột biến ựược biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát ựược, nhưng cũng có những ựột biến chỉ ảnh hưởng tới sức sống Có những ựột biến lặn, nhưng cũng có những ựột biến trội Sự thay ựổi kiểu hình do ựột biến có thể biểu hiện ra ở các giai ựoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành (Trần đình Long, 1978) [12]

Căn cứ vào tắnh chất biến ựổi cấu trúc di truyền mà người ta chia ựột biến

ra thành hai dạng cơ bản: đột biến gen và ựột biến nhiễm sắc thể đột biến gen

là những biến ựổi trong cấu trúc của gen liên quan ựến một hoặc vài cặp nucleotide xảy ra ở một ựiểm nào ựó trong phân tử DNA Thường gặp dạng mất, thêm, thay thế hay ựảo vị trắ một cặp nucleotide đột biến nhiễm sắc thể là những biến ựổi về cấu trúc nhiễm sắc thể (mất ựoạn, ựảo ựoạn, lặp ựoạn, chuyển ựoạn) hay số lượng nhiễm sắc thể (thể nhị bội, thể ựa bội, Ầ) (Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên, 2006) [21]

Trong các dạng ựột biến nêu trên dạng làm biến ựổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn ựến những biến ựổi có hại ựối với cơ thể sinh vật Vì vậy, các nhà chọn giống chủ trọng chủ yếu ựến dạng ựột biến gen, dạng này liên quan ựến sự biến ựổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới (Trần đình Long và cs, 1999) [13]

Sự phát sinh ñột biến có thể là tự phát (ñột biến tự nhiên): ðột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác ñộng của tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học, …) có trong môi trường sống và do những biến loạn về trao ñổi chất trong tế bào ðột biến có thể do tác ñộng của con người (ñột biến nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây ñột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức

xạ cực tím UV, bức xạ neutron,…), các tác nhân hoá học (các chất ñồng phân

có tính base và những hợp chất có liên quan, chất khác sinh, những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid…)

Trong ñiều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện ñột biến thay ñổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số ñột biến thấp (khoảng 10-6) (Bùi Chính Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2006) [3] và khó phát hiện, số ñột biến có lợi cho sản xuất và ñời sống lại càng thấp hơn Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng ñột biến

tự phát Vì vậy việc nghiên cứu ñột biến nhân tạo ñược các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần suất xuất hiện ñột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù có nhiều hạn chế nhưng ñột biến thực nghiệm ñã và ñang ñóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới

b Vai trò của ñột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, những phương pháp chọn tạo giống ñã, ñang ñược quan tâm phát triển Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hoặc chọn lọc, ñể tạo ra một giống cây trồng năng suất cao ổn ñinh, cần ít nhất 6 – 10 thế hệ Trong khi ñó chọn giống bằng phương pháp ñột biến nhân tạo (ñột biến thực nghiệm) chỉ cần 3 –

6 thế hệ ðồng thời sử dụng phương pháp ñột biến có thể giải quyết những vấn ñề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện:

- Khi biến dị tự nhiên về một ñặc tính mong muốn không có sẵn trong

nguồn vật liệu di truyền

- Khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen ñó không ñược sử dụng

- Khi tạo ñặc tính mong muốn không thực hiện ñược bằng phương pháp lai

- Khi muốn thay ñổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược ñiểm của giống mà không làm thay ñổi những tính trạng của giống (Nguyễn ðức Thuận, Nguyễn Thị Lang, 2006) [20]

Với phương pháp ñột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hoá gây gột biến ñã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể

Do các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người ñã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học như colchicine, EMS, … trong công tác chọn giống cây trồng và ñã thu ñược các thành tựu ñáng kể Kết quả của nhiều nước thu ñược chứng tỏ ñây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất ñể tạo giống mới Nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã ñánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ XX là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây ñột biến thực nghiệm

c ðột biến phóng xạ

* Tác nhân phóng xạ gây ñột biến

Nhờ sự phát hiện mới trong vật lý nguyên tử ñã mở rộng phạm vi nghiên cứu, ứng dụng phóng xạ trong tạo giống cây trồng Có hai dạng phóng

xạ là phóng xạ hạt và phóng xạ ñiện từ

Phóng xạ hạt là dòng chuyển ñộng của những hạt cơ bản như neutron, proton, …

Phóng xạ ñiện từ là các sóng ñiện từ như tia gamma, tia X, …

Tia gamma và tia X là hai dạng tia ñược sử dụng như nguồn chiếu xạ

cơ bản trong các thực nghiệm, phổ biến nhất là tia gamma với nguồn Co60 và

Cs137 Do có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và

diện tích, không bị lệch trong ñiện trường và có sức xuyên khá lớn

* Cơ chế gây ñột biến của tác nhân phóng xạ

Theo lý thuyết của A M Kuzin cơ chế của quá trình tương tác gây ñột biến gồm ba giai ñoạn chính:

- Giai ñoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra quá trình ion hoá và sự biến ñổi các hợp chất ở mức ñộ dưới phân tử và phân tử

- Giai ñoạn 2: Có tính chất hoá học, ở giai ñoạn này diễn ra các phản ứng tương tác của các sản phẩn sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các ñại phân tử chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học, tạo ra các peoxit hữu cơ ñồng thời diễn ra các phản ứng oxy hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới và các gốc ñộc tính

- Giai ñoạn 3: có tính chất sinh học là giai ñoạn phát huy tác ñộng của các phản ứng lên hoạt ñộng của các tế bào sống Tức là các biến ñổi hoá học gây nên do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn làm thay ñổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào

Quá trình tác ñộng qua nhiều giai ñoạn như thế gọi là tác ñộng gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác ñộng trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào gây ảnh hưởng trực tiếp ñến quá trình tổng hợp DNA và tổng hợp protein trong tế bào sống ñặc biệt là các biến ñổi trong cấu trúc DNA, làm phát sinh ñột biến di truyền (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2005) [1]

Tia gamma không có khả năng ñiện li trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp Nó có khả năng biến ñổi các nguyên tử phân tử thành những phân tử mang ñiện tích và tạo nên sự ion hoá Nhờ sự ion hoá mà trong tế bào xảy ra những biến ñổi về mặt hoá học, vật liệu di truyền và những chất khác khi hấp thụ năng lượng bức xạ Kết quả quá trình này dẫn tới những biến ñổi trong phân tử DNA, gây ra ñột biến ñiểm, ñôi khi gây ra sự gẫy ñứt tạo nên ñột biến

cấu trúc nhiễm sắc thể

Quá trình phát sinh ñột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

- ðặc tính lý học của loại tia phóng xạ

- Liều lượng, cường ñộ phóng xạ

- Sự phục hồi các biến dị tiềm năng

- Các yếu tố khác: Dưỡng khí, nhiệt ñộ, lượng nước trong mô, một số chất hoá học, ñiều kiện sinh thái, giai ñoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý

d Một số nghiên cứu, thành tựu và triển vọng của ngành chọn tạo giống bằng ñột biến phóng xạ

Từ lâu, gây ñột biến thực nghiệm ñể làm vật liệu khởi ñầu cho chọn giống ñã ñược coi là một trong những kỹ thuật ứng dụng cao trong nông nghiệp Phương pháp này ñược biết ñến vào năm 1925 khi Natxon và Philippôp phát hiện rằng tia Roentgen có khả năng gây ra biến dị di truyền ở Nấm Hạ ðẳng

ðến năm 1926-1927, di truyền học phóng xạ trở thành nền tảng cho sự

ra ñời ngành chọn giống ñột biến phóng xạ Những năm 1970, Cơ quan IAEA

và Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) ñã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu gây ñột biến cải tạo cây nông nghiệp và cây công nghiệp nhiều nước trên thế giới nhằm tạo ra hàng loạt giống mới như: lúa, lúa mỳ, lúa mạch, táo, chanh, mía, chuối… Cho tới năm 2009, 3100 giống cây trồng ñã ñược tạo ra bằng gây ñội biến thực nghiệm trên phạm vi hơn 60 nước, trong số ñó có 2/3 giống cây trồng ñược trực tiếp sử dụng sau khi gây ñột biến và 1/3 giống ñược sử dụng một cách gián tiếp như là vật liệu trong các phép lai (FAO/IAEA Mutant Varieties Database,2009)[8]

Theo các kết quả công bố thì các tác nhân gây ñột biến ñược dùng chủ yếu

là chiếu xạ và hoá chất, trong ñó chiếu xạ chiếm ñến 88,8%, còn các tác nhân

hoá chất chỉ chiếm 9,5%; ngoài ra các tác nhân khác chiếm 1,7% tổng số các giống ñột biến Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân ñể cải tiến cây trồng ñã mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về mặt kinh tế Ước tính các nước ñã thu ñược hàng tỷ ñô la từ hàng triệu hecta gieo trồng những giống cây ñược tạo ra

từ ñột biến (FAO/IAEA Mutant Varieties Database, 2009) [8]

Thành công to lớn của phương pháp chọn giống phóng xạ ñã ñạt ñược

ở rất nhiều ñối tượng cây trồng như cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh, cây rau, … với những giống ñột biến ñiển hình có thể kể là: cỏ Bermuda, lê Nhật Bản, giống lúa nửa lùn Remei Nhật Bản, khoai lang, khoai tây, hoa cúc, hoa hồng với màu sắc khác nhau và hình dạng cánh hoa ña dạng Những ñặc tính ñược cải tiến sau khi gây ra ñột biến như rút ngắn chiều cao cây; chín sớm; tăng cường chống chịu sâu bệnh, thích ứng với ñiều kiện bất lợi của môi trường; ña dạng màu sắc và kiểu hình ở hoa và cây cảnh Cùng với những phương pháp chọn tạo giống khác nhau, xử lý ñột biến phóng xạ ñã trở thành công cụ hữu hiệu trong chọn tạo giống cây trồng

Thành tựu ñột biến tạo giống trên thế giới tập trung chủ yếu ở Châu Á, chiếm 86% giống mới tạo ra (Nguyễn Thị Bình, 1990) [2] Theo số liệu thống

kê của IAEA năm 2007, ñi ñầu trong việc ứng dụng các tác nhân ñột biến trong chọn giống cây trồng nông nghiệp là Trung Quốc (với 638 giống), thứ hai là Ấn ðộ (với 272 giống) và thứ 3 là Nhật Bản (với 233 giống)

Tại Trung Quốc, việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công tác chọn giống cây trồng nông nghiệp ñược bắt ñầu từ cuối những năm 1950, trong ñó tập trung chủ yếu vào cây lúa Từ nửa cuối thập kỷ 50 ñến nửa ñầu thập kỷ 60 của thế kỷ XX, một số lượng lớn các dòng, giống ñột biến ñã ñược tạo ra nhằm phục vụ sự phát triển trong cuộc Cách Mạng Xanh Tuy nhiên công việc nghiên cứu vẫn chưa thu ñược thành tựu ñáng kể nào cho ñến giữa những năm 1970 khi giống ñột biến Yuanfengzao ñược công nhận và ñược trồng trên

1,5 triệu ha mỗi năm trong những năm sau 1970 Ngay sau ñó giống lúa ñột biến Zhefu 802 ñã ñược tạo ra và ñã trở thành giống lúa ñược trồng với diện tích lớn nhất trên thế giới (trên 10,5 triệu ha) và ñược sử dụng rộng rãi trong sản xuất trong thời gian khá dài gần 10 năm từ năm 1987 ñến năm 1994 Tiếp theo thành công ñó, một giống lúa ñột biến mới Yangdao 6 (ñược công nhận năm 1997) có năng suất cao và chất lượng hạt rất tốt ñã tạo nên một thời ñại hoàng kim mới của giống lúa Trung Quốc Yangdao 6 còn ñược sử dụng làm

bố của giống siêu lúa lai Liangyoupeijiu (Pai’ai 64s x Yangdao 6, ñã ñược công nhận năm 2001) Năm 2002, Yangdao 6 và Liangyoupeijiu ñã ñược trồng rộng rãi trên 3,5 triệu ha

Theo các số liệu ñã ñược công bố, trong thời gian từ năm 1966 ñến

2004 ở Trung Quốc có tổng số 78 giống lúa ñột biến ñược tạo thành bằng con ñường ñột biến Trong 78 giống này có hơn một nửa ñược phát triển trực tiếp

từ các dòng ñột biến triển vọng, trong ñó có trên 50% các giống ñược tạo ra bằng xử lý tia gamma Hầu hết các giống lúa ñột biến ñược thu nhận ở các tỉnh Chiết Giang (23 giống), Hồ Nam (15 giống), Giang Tô (12 giống) (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2005) [1]

Thành công của việc ứng dụng ñột biến thực nghiệm trong chọn giống tại Trung Quốc không chỉ giới hạn ở lúa mà còn ở nhiều ñối tượng cây trồng khác nhau trong ñó có thể kể ñến ñã có 29 giống lạc, 56 giống ñậu tương, 8 giống bông, 35 giống hoa hồng, … ñột biến ñã ñược tạo ra tính ñến năm 2004

Cùng với Trung Quốc, Nhật Bản là cũng là nước ñi tiên phong về bức

xạ tạo giống và có ảnh hưởng lớn nhất ñến thành tựu chung của Châu Á về công nghệ và ñào tạo Theo số liệu thống kê của IAEA ñến năm 2008, tổng số các giống ñột biến của Nhật Bản lên tới 242 giống với 61 loại giống cây trồng khác nhau Trong số ñó có tới trên 61% các giống ñược tạo ra nhờ ñột biến cảm ứng xử lý bằng tia gamma Trong số các giống ñó có 50 giống lạc, 31

giống lúa, 16 giống ñậu tương, 10 giống hoa hồng,…

Giống lúa ñột biến ñầu tiên là giống lúa nửa lùn Reimei, ñược tạo ra nhờ xử lý tia gamma trên giống lúa Fujiminori, với ñột biến ở locus sd-1 ñã làm cho Reimei rút ngắn chiều cao của Reimei 15cm so với giống gốc, với thành công này, các nhà khoa học Nhật Bản ñã tạo ra một cuộc cách mạng về kiểu cây ở lúa Không chỉ vậy, giống lúa nửa lùn này còn có khả năng cho năng suất, và ñạt năng suất cao kỷ lục của Nhật Bản năm 1967 (Bùi Chính Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2006) [3]

Ngoài việc sử dụng trực tiếp các ñột biến trên các giống cây trồng ñể tạo ra các giống cây trồng mới, các dòng giống ñột biến còn ñược sử dụng như những nguồn vật liệu khởi ñầu cho công tác chọn tạo giống khi kết hợp giữa gây tạo ñột biến với phương pháp lai Bằng phương pháp này, các tác giả Nhật bản ñã tạo ra tổng số 228 giống không ñược phát triển trực tiếp từ các ñột biến Trong ñó có 198 giống lúa, 9 giống ñậu tương, 7 giống lúa mạch, 3 giống lúa mì, 3 giống cà chua và nhiều giống cây trồng khác (Bùi Chính Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2006) [3]

Các kỹ thuật ñột biến cảm ứng cũng ñã ñược ứng dụng thành công ñể cải tiến giống lúa mì cứng ở Bulgaria từ ñầu những năm 1980 Tính ñến năm

2006 có tổng số 5 giống lúa mì ñột biến ñược phát triển làm tăng năng suất, khả năng chống chịu của lúa mì tại Bulgaria ðiển hình có thể kể ñến là giống Gergana ðây là giống lúa mì cứng ñột biến ñược tạo thành ñầu tiên tại Bulgaria,

có nguồn gốc từ phép lai giữa giống lúa mì cứng No.788 với dòng ñột biến 5574/109 Các hạt lai ở thế hệ F2 của phép lai trên ñược tiến hành xử lý ñột biến bằng tia gamma ở liều lượng 10 Krad và chọn lọc qua các thế hệ tiếp theo Gergana có chiều cao cây từ 90 – 100cm, khả năng kháng lodging tốt, kích thước hạt lớn với khối lượng 1000 hạt ñạt từ 55 – 58g, hàm lượng protêin trong hạt cao từ 14 – 16%, sản lượng ñạt 6 – 7 tấn/ha (FAO,1990) Năm 1992, giống

M-“Progess” ñược tạo thành từ phép lai giữa hai dòng ñột biến là M1193/238 x M5574/109, với chiều cao cây thấp chỉ từ 85 – 95cm, kích thước hạt rất lớn, khối lượng 1000 hạt ñạt 58 – 61g(A.A Yanev, 2006)

Tính ñến năm 2010, tại Bulgaria ñã có trên 76 giống ñột biến ñã ñược tạo

ra bao gồm lúa mạch (5 giống), lúa mì (5 giống), lúa mì cứng (9 giống), ngô (26 giống), hướng dương (3), ñậu tương (6 giống), cà chua (6 giống) (fao.org.vn) [49]

Giống lúa SCS114 Andosan ñược các nhà chọn giống Brazil chọn lọc qua các thế hệ phân ly (ñến M6) của giống IR841 sau khi xử lý bằng tia gamma lên hạt ở liều lượng 150 Gy SCS114 Andosan có năng suất tăng 7,4 – 9,6%

so với giống gốc (IR841), hàm lượng amylase (28%) cao hơn so 9% với IR841 (19%), ñồng thời có khả năng chống chịu tốt với kim loại nặng và bệnh bạc lá

Tại Mexico, việc ñẩy mạnh công tác chọn giống ñột biến ñược bắt ñầu từ năm 1974 Hai giống lúa mì mới Centauro và Bajio Plus ñược phát triển từ giống các hạt của giống Salamanca ñược xử lý bằng tia gamma 500Gy, các giống này có năng suất cao và kháng bệnh lodging Hai giống ñậu tương Hector và Esperanza ñược phát triển từ việc xử lý hạt của giống Suaqui 86 bằng tia gamma ở liều lượng 150Gy, các giống này ñều có năng suất cao hơn

so với giống gốc ñồng thời có khả năng chống chịu khô hạn, kháng ñược bệnh lodging và white fly Salcer là một giống ñậu tương khác ñược tạo ra thông qua việc xử lý phóng xạ trên hạt của dòng ISAEGBM2 ở liều lượng 200Gy,

nó ñã cải tiến ñược các tính trạng quan trọng như năng suất cao hơn và làm tăng cao số quả trên cây, ñặc biệt là số quả trên mắt ñốt ñầu tiên (Singh, R.j and T Hymowitz, 1999) [45]

Trong các cây công nghiệp thì cây họ ñậu là ñối tượng quan trọng có nhiều nghiên cứu thành công với kỹ thuật chọn giống phóng xạ

Ở Ấn ðộ, tác giả Kerketta V., Haque M.F, bằng xử lý phóng xạ lên hạt ñậu tương Birsa 1 có vỏ hạt màu ñen ñã thu ñược những dòng ñột biến có vỏ hạt màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống gốc Năm 1965, Tedoradze X.G ñã sử dụng tia gamma liều lượng 17K xử lý hạt giống ñậu tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu ñược giống ñậu tương chín sớm, chống chịu lạnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha (Fernie AR, Tadmor Y, Zamir D, 2006) [30]

Từ năm 1989 ñến năm 2009, ñột biến thực nghiêm ñã ñược sử dụng như một phương pháp chọn giống nhằm nâng cao sự ña dạng di truyền của ñậu tương ở Bulgaria, trong ñó chủ yếu tập trung vào các tác nhân vật lý là tia gamma nguồn 60Co hoặc 137Cs

7 giống ñậu tương ñã ñược chọn tạo, trong ñó các giống Bisser, Zarya, Boryana và Zvezda do Viện di truyền Sofia chọn tạo, các giống ñột biến khác

do các nhà khoa học ở trung tâm thí nghiệm ñậu tương Pleven, Bulgaria chọn tạo Mới ñây nhất, giống ñậu tương ñột biến Rosa ñã ñược thử nghiệm vào công nhận năm 2009 Rosa ñược tạo ra bằng việc xử lý hạt của giống Hodson bằng tia gamma ở liều lượng 80 Gy Giống này có khả năng kháng các bệnh

vi khuẩn và nấm mốc sương ñồng thời còn có năng suất cao, ổn ñịnh trong cả ñiều kiện môi trường bất thuận và không bất thuận (Todorava, 2010) Mira

96 ñược tạo ra thông qua việc xử lý tia gamma (50 Gy) và ñược công nhận năm 2001 (Aleksieva và cộng sự, 2003) Srebrina ñược phát triển thông qua việc lai dòng ñột biến LN2 (ñược tạo ra từ việc xử lý giống Asgrow 2440 bằng tia gamma nguồn Co60/25 Gy) với giống ñột biến Zarya Srebrina ñã ñược công nhận giống năm 2004

Ở Thái Lan, công tác chọn giống ñột biến ñược tiến hành chủ yếu trên cây họ ñậu Với sự hỗ trợ của IAEA ba chương trình chọn giống ñậu tương ñột biến ñã ñược tiến hành

Thứ nhất là:Chọn giống ñậu tương ñột biến kháng với virus gây bệnh xoăn lá ñậu tương: ñây là bệnh chủ yếu trên ñậu tương ở Thái Lan và do virus gây ra với tác nhân truyền bệnh chính là bọ phấn trắng Hạt của một dòng ñậu tương linecm9238-54-1(ST) ñược xử lý bằng tia gamma với liều lượng 200Gy Tiến hành chọn lọc phả hệ dưới ñiều kiện tự nhiên trên ñồng ruộng kết hợp với ñánh giá trong phòng thí nghiệm các nhà khoa học Thái Lan ñã chọn lọc ñược và

6 dòng ñột biến kháng với virus gây bệnh xoăn lá ñậu tương

Thứ hai là: Chọn giống ñậu tương ñột biến có hàm lượng protein trong hạt cao: Hạt của ba giống ñậu tương Chang Mai 60, SSRSN 19-35-4 và EHP275 ñược xử lý bằng tia gamma với liều lượng 200Gy Các thế hệ sau ñược chọn lọc bằng phương pháp phả hệ với 32 dòng ñột biến ñã ñược chọn lọc Kết quả cho thấy các dòng ñột biến có hàm lượng protein có hàm lượng protein cao hơn 0,8 2,0, 1,0% so với giống gốc

Thứ ba là: Chọn giống ñậu tương ñột biến với tỷ lệ nảy mầm cao và sức nảy mầm tốt: Chang Mai 60 là giống ñậu tương có năng suất cao, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm và sức nảy mầm lại kém Người ta tiến hành xử lý hạt của giống Chang Mai 60 bằng tia gamma/ 100Gy Tiến hành chọn lọc phả hệ với các thế hệ sau Kết quả thử nghiệm trong ñiều kiện khô hạn, 8 dòng ñột biến có tỷ lệ nảy mầm ñạt 65 – 75% cao hơn so với dạng bố mẹ (30%) Trong mùa mưa, 12 dòng ñột biến có tỷ lệ nảy mầm ñạt 75-89% trong khi ñó dạng

bố mẹ chỉ ñạt 41%

e.Một số kết quả nghiên cứu về ñậu tương xử lý ñột biến trong và ngoài nước

* Trên thế giới

Cảm ứng ñột biến là một phương pháp hữu hiệu ñể tạo ra biến dị di

truyền bổ sung, ñặc biệt ñối với những loại cây trồng có nền tảng di truyền hẹp như ñậu tương Cảm ứng ñột biến ở ñậu tương ñã tạo ra nguồn biến dị di

truyền ựáng kể có cả tắnh trạng chất lượng và tắnh trạng số lượng (Rawling và cộng sự, 1985; Sapa và cộng sự, 1961, Santos và cộng sự, 1970; Constantin

và cộng sự, 1976, Iman, 1978)_ mà từ ựó có thể chọn lọc những biến mong muốn có ắch Những tắnh trạng ựược cải tiến hay thay ựổi ở ựậu tương do ựột biến nhân tạo gồm: hàm lượng axit Oleic cao, thành phần axit béo, hàm lượng protein cao, tăng số quả/ cây, khả năng chịu thuốc trừ cỏ, kiểu cây, ngắn ngày, phá vỡ liên kết Hơn nữa, lợi thế của tạo giống ựột biến là cải tiến một hay hai tắnh trạng mà không làm thay ựổi toàn bộ kiểu gen hay nên di truyền của giống thương mại Ngoài ra còn rất nhiều những nghiên cứu khác về ựậu tương xử lý ựột biến như: Nghiên cứu ựột biến Số 556 (2004) 35-44: gây ựột

biến ở ựậu tương (Glycine max (L) Merrill) với tia gammar và xác ựịnh với

RAPD James, AT 2003, biến dị di truyền của Soybean phản ứng lại với ựiều kiện khô hạn

*Trong nước

đậu tương ựược trồng ở Việt Nam rất lâu ựời tuy nhiên công tác nghiên cứu về ựậu tương trước ựây chưa ựược nhiều Từ năm 1986 nhà nước có chủ trương khuyến khắch công tác nghiên cứu về ựậu ựỗ, từ ựó các nhà nghiên cứu

về ựậu tương, ựậu xanh ựược triển khai mạnh mẽ hơn

Ngoài phương pháp lai và chọn lọc biến dị tái tổ hợp thì ựột biến nhân tạo cũng ựược coi là phương pháp mới mang lại nhiều triển vọng trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây tự thụ phấn như ựậu tương nói riêng Bằng việc sử dụng những biến dị tạo ra ựột biến nhân tạo ựã mang ựến những thành tựu nổi bật

Năm 1979 Trần đình Long sử dụng tia Gamma và các loại hóa chất gây ựột biến tác ựộng vào vật liệu từ ựó phân lập các dòng, ựánh giá lựa chọn ựược một số giống có năng suất cao, chịu ựược khắ hậu nóng Trong các số giống ựó ựáng chú ý là giống M103 chọn tạo từ giống ựột biến của giống V70

năm 1987 thắch hợp với vụ hè thu (Trần đình Long, Ngô Thế Dân và cộng

sự, 1999) [13]

Cũng bằng phương pháp xử lý ựột biến dùng tia gamma, nguồn Co60năm 1985 tác giả Mai Quang Vinh và cộng sự ựã tạo ra giống ựậu tương DT

84 từ dòng lai 8-33, DT 84 có thời gian sinh trưởng 80-85 ngày, năng suất

15-20 tạ/ha, trồng ựược 3 vụ/năm, thắch hợp với vụ hè Hiện nay DT 84 là một trong 10 giống cây trồng ựược trồng diện tắch lớn nhất

Năm 2002 bằng phương pháp lai + ựột biến phóng xạ PGS TS.Mai Quang Vinh ựã chọn tạo thành công giống ựậu tương ựột biến chịu hạn chịu hạn DT 2008 Tuy mới ựược ựưa vào khảo nghiệm tắnh khác biệt, tắnh ựồng nhất, tắnh ổn ựịnh (DUS) và khảo nghiệm giá trị canh tác, giá trị sử dụng (VCU) ựồng thời triển khai khảo nghiệm sản xuất tại Hà Nội và một số tỉnh miền núi như: Cao Bằng, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Yên Bái, Quy Nhơn trên diện tắch khoảng 50ha Ngay vụ ựầu tiên giống ựậu tương DT2008 ựã tỏ

ra có ưu ựiểm vượt trội so với các giống khác: Năng suất cao (18-35 tạ/ha, trong ựiều kiện khó khăn có thể cho năng suất cao gấp 1.5-2 lần các giống thông thường); có khả năng chống chịu tổng hợp trên ựồng ruộng ở mức cao nhất với các ựiều kiện khó khăn như: hạn, úng, nóng, lạnh, ựất nghèo dinh dưỡng và một số bệnh hại do nấm và vi khuẩn gây ra (gỉ sắt, sương mù, phấn trắng, ựốm nâu, vi khuẩn, lở cổ rễ), chịu sâu hại khá

Ngoài ra còn một số ựề tài nghiên cứu về ựậu tương xử lý ựột biến như

ựề tài: đoàn Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Văn, Vũ đình Hòa, 2003, phản ứng của nguồn gen ựậu tương (Australia) với mật ựộ và thời vụ gieo trồng Hội thảo ựậu tương quốc gia Project CS1/1995/ những tắnh trạng thắch nghi và cải tiến ở Việt Nam và Autralia

Bằng việc ứng dụng ựột biến nhân tạo nhóm các nhà khoa học trường

đH Công Nghiệp Tp HCM ựã nghiên cứu thành công trong việc tạo ra nguồn

biến dị hình thái trên giống ñậu tương DT96, bằng xử lý tia gamma ðây là các biến dị có lợi mà các nhà chọn giống mong muốn nhằm nâng cao năng suất cây trồng trong thời gian tới

Theo thông tấn xã Việt Nam, các nhà khoa học ñã tiến hành nghiên cứu trên giống ñậu tương DT96, do Trung tâm chuyển giao tiến bộ kỹ thuật cung cấp làm mẫu gieo trồng Sau khi xử lý tia Gamma ở các liều khác nhau, bộ máy

di truyền của giống ñậu tương DT96 có sự biến ñổi Hầu hết các biến dị có sức sống bình thường, cá biệt xuất hiện một số biến dị có ñặc trưng nông sinh học cao hơn ñối chứng như thấp cây, số lượng quả cao hơn Kết quả so sánh với ñối chứng cho thấy, chiều cao của các cây biến dị ưu tú thấp hơn ñối chứng khoảng 15-20%(ñây là ñặc trưng có lợi về mặt canh tác) Các ñặc trưng nông sinh học như: số ñốt, số cành, tỉ lệ hạt vượt trội so với ñối chứng Các biến dị này thể hiện những ñặc tính quý theo hướng cải thiện năng suất(http://vietbao.vn/khoa hoc) [48]

Việc nghiên cứu ñột biến nhân tạo trong chọn giốn cây trồng nói chung

và ñậu tương nói riêng ở nước ta vẫn còn khá mới mẻ và hứa hẹn nhiều những thành công ðể tận dụng tối ña nguồn biến dị di truyền này thì công tác nghiên cứu và khảo sát các dòng giống ñậu tương vô cùng cần thiết nó là tiền

ñề quan trọng ñể chọn lọc và ñánh giá những biến ñộng di truyền có ý nghĩa trong công tác chọn tạo giống

2.2.2 Cơ sở khoa học của việc ứng dụng chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ña dạng di truyền

Chỉ thị phân tử là trình tự DNA ñặc trưng cho một cá thể Việc sử dụng chỉ thị phân tử ñã cung cấp một cơ hội mới không chỉ ñối với việc nghiên cứu

hệ gen mà cả trong việc nghiên cứu ña dạng cùng nguồn gốc phát sinh của các loài sinh vật Bởi lẽ sự ña dạng của acid nucleic là hết sức phong phú Dưới ñây là một số phương pháp sinh học phân tử trong ñánh giá ña dạng di truyền

a.Kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát sinh năm 1990, Wlellsh và cộng sự hồn thiện năm 1991 Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơn chứa trật tự Nucleoticle ngẫu nhiên ðến nay kỹ thuật này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta

đã sử dụng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đồn giống

+ Nguyên lý: Kỹ thuật RAPD cĩ cơ sở là kỹ thuật HCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hồn tồn ngẫu nhiên trong hệ gen

+ Thành phần phản ứng: cũng tương tự phản ứng PCR, các yếu tố để cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

- DNA khuơn (DNA template) với nồng độ 5,50ng trong 20-25µl DNA khuơn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD, được tách từ các mẫu virus,

vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật…DNA cĩ độ tinh sạch, cĩ thể là sợi đơi, mạch vịng hoặc mạch thẳng DNA khuơn được khuyếch đại dưới dạng thẳng

cĩ hiệu quả hơn dạng vịng, kích thước DNA khuơn nhỏ hơn 3kb cho kết quả tốt nhất (Phạm Thành Hổ, 2006) [9]

- ðoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đĩ là một Oligonucleoticle cĩ trật tự nucleoticle ngẫu nhiên và cĩ chiều dài 8- 10 nucleoticle (thường sử dụng mồi dài 10 nucleoticle) Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết Nếu nồng độ mồi quá cao cĩ thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác, do mồi bám vào các vị trí khơng đặc hiệu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ khơng đảm bảo

đủ lượng sản phẩm RAPD Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng

thường là 0,1–0,5µM

-Taq-polymerase: là một enzym quan trọng, có vai trò quyết ñịnh ñến

phản ứng PCR ðây là loại enzym chịu ñược nhiệt ñộ cao trong các loại enzym ðặc ñiểm là chúng có khả năng kéo dài mồi ñể tạo một sản phẩm có

chiều dài 8-13kb Taq-polymerase ñược tách chiết từ những vi khuẩn ở suối

nước nóng Thermus aquaticus không bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ biến tính (920- 950C) Taq-polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt ñộ cao, tồn tại ở nhiệt ñộ

ủ 950C kéo dài Enzym này có hoạt tính cao ở 720C - 800C làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác (Khuất Hữu Thanh, 2006) [17]

- dNTP: là các nucleoticle tự do ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng ñộ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50-200µM Nếu nồng ñộ các loại dNTP quá ít không ñủ ñể phát hiện, ngược lại, nồng ñộ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện (Khuất Hữu Thanh, 2006) [17]

- Dung dịch ñệm: là một trong những yếu tố quan trọng làm ảnh hưởng ñến chất lượng và hiệu quả của phản ứng, dung dịch ñệm của phản ứng phải ñảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt ñộng của enzym như: MgCl2, KCl, Tris HCl… Thành phần của dung dịch ñệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 100mM (PH= 8,3 ở nhiệt ñộ phòng), KCl 50mM, Mg Cl2 1,5mM khi ủ ở nhiệt ñộ phòng Nồng ñộ MgCl2 có thể dao ñộng từ 0,5-5mM Thành phần này ñóng vai trò quan trọng ñến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn

+ Chu kỳ phản ứng: phân tử RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn sau:

- Giai ñoạn biến tính DNA: ở nhiệt ñộ 950C trong 30-60 giây làm cho các liên kết hydro giữa các mạch bị ñứt khi ñó DNA sợi ñôi tách thành hai sợi ñơn tạo ñiều kiện cho sự bắt cặp mồi

- Giai ñoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt ñộ hạ xuống 320C - 400C mồi bám vào

ñầu 3’OH của mạch khuôn DNA và bắt ñầu quá trình tổng hợp sợi mới

- Giai ñoạn tổng hợp: Nhiệt ñộ ñược nâng lên 720C thì các ñoạn mồi ñã

bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của

Taq-polymerase

Một chu kỳ trên xảy ra, một ñoạn DNA ñược nhân lên thành hai, các ñoạn DNA ñược nhân tiếp tục ñược coi là các mạch khuôn ñể tổng hợp cho chu kỳ sau Như vậy sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2n các ñoạn DNA giống hệt ñoạn DNA khuôn ban ñầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 – 45 chu kỳ

b.Kỹ thuật AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Plymorphism – ña hình ñộ dài các ñoạn ñược nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR, kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các ñoạn DNA hệ gen ñã ñược cắt bởi enzym giới hạn và gắn với ñoạn tiếp hợp

Về nguyęn tắc kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có ñiểm khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố ñịnh dài khoảng 15bp chứa vị trí nhận biết của enzym giới hạn, phần thay ñổi dài khoảng 2- 4bp Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel polyacrylamide có ñộ phân giải cao, sự ña hình ñược xác ñịnh bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân tử ñoạn DNA

Kỹ thuật AFLP có ưu ñiểm là phân tích ña hình di truyền trong thời gian ngắn, lượng DNA dài hơi ít nhưng sự ña hình cao Kỹ thuật này ñược ñánh giá là nhanh chóng và hiệu quả trong việc xác ñịnh tính ña dạng và di truyền trong cây trồng như: lúa, lạc, ñậu,

c.Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction Fragme Length Polymorphism – ða hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các Endonuclease giới hạn cắt DNA, hệ gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác

ñịnh, số lượng các ñoạn phụ thuộc vào số ñiểm nhận biết trong hệ gen Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể xác ñịnh một tính trạng ở trạng thái ñồng hợp hay

dị hợp trong một cá thể Vì vậy RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược ñiểm là tốn kém và mất thời gian Kỹ thuật này ñòi hỏi phải có một lượng lớn DNA (50 – 200ng

d.Kỹ thuật SSR

SSR (Simple Sequence Repeats – Trình tự lặp lại ñơn giản) hay còn gọi

là vệ tinh (Microsatellites) Kỹ thuật này ñược Litt và Luty phát triển năm

1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PRC Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleoticle lặp lại nhiều lần Thông thường các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm ñông hoặc các ñầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc ñiều hòa hoạt ñộng của các gen, góp phần làm tăng tính ổn ñịnh cơ học của NST trong các quá trình phân bào và có thể chứa ñựng những thông tin di truyền liên quan ñến sự xác ñịnh giới tính ở cả ñộng vật và thực vật Do sự khác nhau về số lượng nucleoticle trong mỗi ñơn vị lặp lại mà sự ña hình về

ñộ dài của SSR ñược nhân bản sẽ ñược phát hiện sau quá trình ñiện di trên gel agarose hay polyacrylamide

SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng,

do khả năng phát hiện tính ña hình rất cao Song chỉ thị này có nhược ñiểm là phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trong thực tế chỉ thị

này ñược sử dụng ñể nghiên cứu một số tính trạng liên quan ñến năng suất, bệnh hại, xác ñịnh giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản ñồ gen…(Singh S., Reddy K.S., Jawali N., 2000) [42]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật SSR ñể nghiên cứu tính

ña dạng di truyền của một số giống ñậu xanh chịu hạn khác nhau (Nguyễn Vũ Thanh Thanh, 2008) [18]

e.Bản ñồ QTL

Bản ñồ QTL (Quantitative Trait Loci – Bản ñồ các Locus tính trạng số lượng) xác ñịnh mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng hình thái ñang ñược quan tâm Qua bản ñồ QTL có thể xác ñịnh ñược các vùng trên NST có liên quan ñến một tính trạng hình thái ðể lập bản ñồ QLT cần tiến hành:

- Xác ñịnh cặp lai

- Lai và tạo quần thể cho lập bản ñồ

- Theo dõi sự phân li của các chỉ thị trong quần thể

Bản ñồ QTL liên quan tới khối lượng hạt ñậu xanh ñã ñược Humphry

và cộng sự (2003) mô tả (Humphry M.E., Magner T., McIntyre C.L., Aitken E.A., Liu C.J., 2003) [32]

2.2.3 Một số nghiên cứu di truyền ở thực vật sử dụng kỹ thuật RAPD

Hiện nay kỹ thuật RAPD ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong

nghiên cứu và xác ựịnh quan hệ di truyền ở thực vật Kỹ thuật RAPD cũng ựược ứng dụng trong việc ựánh giá ựộ ựa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tắch và ựánh giá hệ gen thực vật nhằm xác ựịnh những thay ựổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử

Phương pháp này còn ựược ứng dụng trong việc ựánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tắch mối quan hệ di truyền giữa các loài (Lê đình Lương, Nguyễn đình Thi, 2002) [14]

Võ Thị Phương Lan và cộng sự (1999) nghiên cứu tắnh ựa dạng di truyền của loài rong câu biển ựã cho thấy tổng số có 66 băng rõ nét ựược nhân bản ngẫu nhiên với 2 mồi (OPA4, OPA10, OPL12) và ựã phát hiện ựược sự sai khác về mặt di truyền ngay trong một loài rong câu sinh trưởng trong các ựiều kiện khác nhau (Võ Thị Thương Lan và cs, 1999) [10]

đinh Thị Phòng và cộng sự (2001) ựã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên ựể ựánh giá sự thay ựổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, kết quả ựã chỉ ra sự sai khác ở mức ựộ phân tử giữa các dòng lúa (đinh Thi Phòng, 2001) [16]

Nguyễn Thị Tâm (2003) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên ựể phân tắch ựa hình DNA trong bộ gen của dòng lúa ựược chọn lọc, kết quả các dòng có sự sai khác ở mức ựộ phân tử, trong ựó dòng HR 128 có hệ số sai khác với giống gốc là lớn nhất

Năm 2008 Trương Quang Vinh và cộng sự ựánh giá sự ựa hình DNA của một số giống khoai tây nhập nội và của Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD Kết quả phân tắch ựa hình 8 giống khoai tây thu ựược 78 băng DNA, có kắch thước từ 0,25 Ờ 3kb ựược tạo ra từ 14 mồi ngẫu nhiên đã xác ựịnh có 11 mồi cho tắnh ựa hình Hệ số sai khác di truyền giữa 8 giống khoai tây nghiên cứu

từ 4,5% ựến 31,3% (Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh, 2008) [23]

Trần Thị Ngọc Diệp (2009), nghiên cứu sự ña dạng di tryền phân tử của

14 giống ngô với 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng kỹ thuật RAPD, kết quả thu ñược 674 băng rõ nét và ñã phát hiện ñược sự sai khác về mặt di truyền giữa các giống ngô nghiên cứu

Nguyễn Minh Quế (2009) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên ñể ñánh giá mối quan hệ di truyền của 5 giống dẻ bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân ñoạn ñược nhân bản ngẫu nhiên là 46 phân ñoạn Trong ñó có 14 phân ñoạn cho ña hình (chiếm 30,4%) và không cho ña hình là 32 phân ñoạn (chiếm 69,9%)

Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử ñể phân biệt các giống hay các loài khác nhau

Orozzco C và công sự (1994) ñã ứng dụng kỹ thuật RAPD ñể khảo sát mối quan sát di truyền và tiến hóa của các giống cà phê ñược lai tạo từ các loài bố mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau, làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục ñích tạo con lai có ñặc ñiểm quý (Orozco C., Chalmers K J., Powell W., Waugh R., 1996) [38]

Ranade R và cộng sự (2001) sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu ñặc ñiểm của 12 giống ñậu ñen Kết quả phân tích sản phẩm RAPD chỉ ra ñược một số băng ñặc hiệu, tương ứng với các mồi ngẫu nhiên ñể phân biệt một số giống trong nhóm nghiên cứu (Ranade R., Gopalakrishna T, 2001) [41]

Raina và cộng sự (2001) ñã sử dụng chỉ thị RAPD - SSR ñể phân tích sự

ña dạng hệ gen và xác ñịnh mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại (Raina S.N.V, Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M., 2001) [40]

Năm 2003, Jorge và cộng sự ñã ñánh giá sự tương ñồng di truyền giữa các giống chè ở Hy Lap nhờ kỹ thuật RAPD Họ sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên

ñể khuyếch ñại các ñoạn DNA của 7 giống chè, kết quả 282 băng trong ñó có

195 băng thể hiện tính đa hình Nghiên cứu cho thấy những giống chè ở Hy Lap cĩ thể hiện tính đa dạng, di truyền (Jorge, 2003) [33]

Paulos (2004) xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngơ (Zea May) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu được 225 băng từ kết quả này, cây phả

hệ được thành lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMH Kết quả nghiên cứu này sẽ được sử dụng để chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngơ

Dey N và cs (2005) nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 dịng lúa thơm

và 2 dịng đối chứng, nhĩm tác giả đã tiến hành phản ứng RAPD với 5 mẫu ngẫu nhiên, kết quả khuyếch đại được 44 băng DNA, với kích thước từ 500 – 350bp trong 44 băng cĩ 41 băng thể hiện tính đa hình (Dey N., Subarsana B., Chaudhuri T.R.,Dey S.R., mitu De,Ghose T.K., 2005) [28]

Subramanian V và cs (2000) đã nghiên cứu tính đa hình DNA ở cây lạc nhờ kỹ thuật RAPD Nhĩm tác giả đã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác định được 7 mồi (14.6%) đa hình Tổng số băng DNA được tạo ra từ mồi đĩ

là 408 băng, trong đĩ cĩ 27 băng thể hiện tính đa hình

Yiwu Chen và cs (2006) sử dụng 11 mồi ngẫu nhiên để đánh giá đa dạng của một số giống lạc trong tập đồn giống chống chịu bệnh gỉ sắt, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn DNA, trong đĩ 66 phân đoạn đa hình chiếm 60,6% ðiều này cho thấy trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc DNA, mức sai khác từ 4%- 18% Kết quả phân tích DNA cho thấy các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhĩm Giữa các giống chịu bệnh gỉ sắt của tập đồn giống ICRISAT và các giống năng suất khơng nằm trong cùng một nhánh vì thế cĩ thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho cơng tác lai giống (Chen Y., Wang D., Arelli P., Ebrahimi M., Nelson R.L., 2006) [27]

Awan F S (2007) sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh mối quan hệ di truyền của 7 giống lúa mỳ ở Pakistan (6 giống nhập nội và một số giống khác) kết quả có 112 băng DNA ñược tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên trong ñó có 50 băng thể hiện tính ña hình, mối tương ñồng di truyền là 86.2 – 93%, ñiều này cho biết mối quan hệ ngẫu nhiên của các giống lúa mỳ này (Awan F S., 2007)[24] Venkata C L và cộng sự (2007) ñã xác ñịnh tính ña hình DNA ở 21 giống chuối ở nam Ấn ðộ nhờ chỉ thị RAPD và SSR Phản ứng RAPD ñược thực hiện với 50 mồi và SSR với 12 mồi Kết quả thu ñược 641 DNA, có kích thước 200 – 3100bp trong ñó có 382 băng thể hiện tính ña hình, tương ứng với 60% tính ña dạng sinh học

Raghunathachavi P và cộng sự ñã xác ñịnh sự ña dạng của 18 giống lúa nhờ kỹ thuật RAPD, nhóm tác giả ñã sử dụng 10 mồi và thu ñược 144 băng DNA trong ñó các băng thể hiện tính ña hình chiếm 95,1% (Raghunathachari P., Khanna V K., Singh U S., Singh N K)[39]

MuthuSamy S và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật SSR với 37 cặp mồi ñể nghiên cứu quan hệ di truyền của 10 giống ñậu gạo và thu ñược 987 băng DNA (trong ñó có 719 băng ña hình Từ kỹ thuật RAPD và 479 băng DNA (trong ñó có 296 băng ña hình) từ

kỹ thuật SSR, mức ñộ ña hình của RAPD và SSR tương ứng là 70,3% và 60,79% (Muthusamy S., Kanagarajan S., Ponnusamy S., 2008)[37]

Trong những năm gần ñây kỹ thuật RAPD ñược sử dụng rộng rãi ñể phân tích di truyền hệ thống sinh học Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác ñịnh kiểu gen, phân tích quẩn thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền

và lập bản ñồ di truyền

2.2.4 Nghiên cứu di truyền ở ñậu tương sử dụng kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD ñược sử dụng khá phổ biến trong phân tích và xác ñịnh mối quan hệ di truyền giữ các loài hay giữa các cá thể nhằm phục vụ công tác

lai tạo, chọn giống, phân loại thực vật

Ở việt Nam, nghiên cứu di truyền ở cây ựậu tương cũng ựã ựược quan tâm, tuy nhiên các nghiên cứu chưa nhiều

Chu Hoàng Mậu và cộng sự (2002) ựã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên ựể

so sánh hệ gen của các cây ựậu tương ựột biến bằng kỹ thuật RAPD cho 3 ựoạn mồi có biểu hiện ựa hình và 6 dòng ựậu tương ựột biến có mức ựộ sai khác về bộ gen (Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Xuân đắc, đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, 2002)[15]

Vũ Thành Trà và cộng sự (2006) ựã sử dụng kỹ thuật SSR ựể ựánh giá tắnh ựa dạng di truyền của các giống ựậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt (Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên, 2006)[21]

Vũ Anh đào (2009) ựánh giá sự ựa dạng di truyền ở mức phân tử của 16 giống ựậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên băng kỹ thuật RAPD tổng số phân ựoạn thu ựược là 776 trong phạm vi phân tắch có 56 phân ựoạn DNA ựươc nhân bản trong ựó có 21 vạch cho tắnh ựa hình (tương ứng 37,5% )

Trên thế giới, việc áp dụng kỹ thuật RAPD ựể nghiên cứu ựa dạng di truyền có phần ựa dạng hơn

Doldi M.L.vacs (1997) sử dụng 33 mồi ngẫu nhiên ựể phân nhóm 18 giống ựậu tương có ựặc tắnh chắn sớm Kết quả ựã phân nhóm ựược một số giống có hàm lượng protein cao, sử dụng trong chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng ựạm các giống ựậu tương thắch nghi với ựiều kiện Châu Âu

Sự ựa dạng di truyền của các giống ựậu tương dại (Glycine Soja Sietbold et zuce) ở vùng viễn ựông nước Nga cũng ựã ựược ựánh giá ở mức phân tử bởi Seitova và cộng sự (2004)

Những nghiên cứu về di truyền và cấu trúc quần thể ựậu tương ở Hàn Quốc Gyu Taek Cso và cộng sự (2008) ựã ựược công bố

2.3 Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới và Việt Nam

2.3.1 Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới

ðậu tương là một trong nhưng cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới và là cây trông ñứng vị trí thứ 4 trong các cây làm lương thực thực phẩm sau cây lúa mỳ, lúa nước và ngô Vì vậy sản xuất ñậu tương tăng rất nhanh cả

về diện tích, năng xuất, và sản lượng ñược thể hiện qua bảng 2.1

Bảng 2.1: Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới

Năm Diện tích

(triệu/ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

(Nguồn: FAO Statistic Database, 2009 )

Về diện tích: năm 1960 thế giới trồng ñược 21,00 triệu ha thì sau 40 năm vào năm 2000 diện tích trồng ñậu tương ñã ñạt 74,34 triệu ha tăng 3,5 lần Năm 2005 diện tích trồng ñậu tương 91,39 triệu ha Năm 2008 cả thế giới trồng ñược 96,87 triệu ha tăng 4,61 lần so với năm 1960

Về năng suất: năm 1960 năng suất ñậu tương trên thế giới chỉ ñạt 12,00 tạ/ha ñến năm 1990 ñạt 19,17 tạ/ha tăng 59,75% ðến năm 2008 năng suất ñậu tương thế giới ñạt 23,84 tạ/ha tăng 98,67% so với năm 1960

Về sản lượng: Cùng với sự tăng lên về diện tích và năng suất sản lượng của ñật tương cũng tăng lên nhanh chóng Nếu năm 1960 sản lượng ñậu tương trên thế giới chỉ ñạt 25,20 triệu tấn thì ñến năm 1990 sản lượng ñạt 104,19 triệu