Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu

Một số ñặc tính ñặc trưng ở vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh [18] tế bào Màng tế bào ICM Carotenoid chính Sản phẩm oxy hóa sulfide Nhân tố tăng trưởng Môi trường nước thích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

= = = =


= = = =

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, ðÁNH GIÁ CÁC ðẶC ðIỂM SINH HỌC

VÀ ðỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC CHỦNG VI KHUẨN

QUANG HỢP TÍA PHỤC VỤ CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT HỮU HIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

= = = =


= = = =

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP, ðÁNH GIÁ CÁC ðẶC ðIỂM SINH HỌC

VÀ ðỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC CHỦNG VI KHUẨN

QUANG HỢP TÍA PHỤC VỤ CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT HỮU HIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyªn ngµnh : Công nghệ sinh học

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS NGUYÔN QUANG TH¹CH

TS NGUYỄN THỊ HOÀI HÀ

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng: số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Giang

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

GS.TS Nguyễn Quang Thạch, TS Nguyễn Thị Hoài Hà ñã tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện cho em học tập, nghiên cứu và hoàn thành báo cáo

Các thầy, cô trong bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và cho em những ý kiến quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Thầy cô và các anh chị, các bạn ñồng nghiệp trong Viện Sinh học Nông nghiệp – ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian qua

Gia ñình và bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ trong quá trình thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu của ñề tài 2

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía 3

2.2 Một số ñặc ñiểm sinh học cơ bản của VKQH tía 5

2.2.1 Sinh thái học VKQH tía 5

2.2.2 ðặc ñiểm phân loại VKQH tía 5

2.3 ðặc ñiểm của bộ máy quang hợp 8

2.3.1 Màng quang hợp 8

2.3.2 Sắc tố quang hợp 9

2.3.3 Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ lưu huỳnh trong vi khuẩn tía 20

2.3.4 ðiều hòa quá trình trao ñổi chất ở vi khuẩn quang hợp tía 21

2.4 Ứng dụng của VKQH tía 22

2.4.1 Sản xuất protein ñơn bào 23

2.4.2 Sản xuất ubiquinone 23

2.4.3 Sản xuất hoocmon thực vật 24

III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 ðối tượng nghiên cứu 26

3.2 Hóa chất 26

3.2.1 Môi trường phân lập, làm thuần và cấy chuyển VKQH tía 26

3.2.2 Môi trường khảo sát nhu cầu và khả năng sử dụng NaCl 28

3.2.3 Môi trường khảo sát khoảng pH 28

3.2.4 Môi trường khảo sát nhu cầu vitamin 28

3.2.5 Hóa chất dùng trong khuếch ñại và giải trình tự gen 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn quang hợp tía 30

3.3.2 Phương pháp ñịnh danh VKQH tía 30

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả thu thập mẫu 35

4.2 Kết quả nuôi tích lũy và phân lập VKQH tía 36

4.3 Kết quả tuyển chọn VKQH tía 37

4.4 ðịnh danh các chủng VKQH tía chọn lựa 39

4.4.1 Hình thái tế bào 39

4.4.2 ðặc ñiểm sắc tố quang hợp 39

4.4.3 Nhu cầu vitamin của các chủng VKQH tía lựa chọn 41

4.4.4 Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng của các chủng VKQH tía lựa chọn 41

4.4.5 Ảnh hưởng nồng ñộ NaCl ñến sinh trưởng của các chủng VKQH tía lựa chọn 42

4.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến tích lũy sinh khối của các chủng lựa chọn 43

4.4.7 Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của các chủng VKQH tía chọn lựa, tổng hợp các ñặc tính sinh lý ñể dự kiến tên loài 44

4.4.8 Giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S của chủng QN1 46

4.5 Ứng dụng các chủng VKQH tía lựa chọn trong sản xuất chế phẩm sinh học EMINA 48

4.5.1 Khả năng sử dụng sulfua của các chủng VKQH tía lựa chọn 48

4.5.2 Ứng dụng vi khuẩn quang hợp tía trong chế tạo chế phẩm sinh học

EMINA và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường chăn nuôi 50

V KẾT LUẬN VÀ KIỄN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn tía 4

Bảng 2.2 Một số ñặc tính ñặc trưng ở vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh 7

Bảng 2.3 Phổ cực ñại hấp thu của bacteriochlorophyll 9

Bảng 2.4 Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp 11

Bảng 2.5 Công thức hóa học của một số nhóm carotenoid trong tế bào loài

E ramosum 12

Bảng 2.6 Thành phần Quinones trong VKQH tía 16

Bảng 3.1 Trình tự các mồi sử dụng trong khuếch ñại và giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S 29

Bảng 4.1 Kết quả thu thập mẫu 35

Bảng 4.2 Phân nhóm VKQH tía phân lập ñược theo môi trường làm giàu 37

Bảng 4.3 Thành phần ô nhiễm của một số nguồn nước thải 38

Bảng 4.4 Khả năng sinh trưởng (theo tích lũy sinh khối OD660 ) của các chủng VKQH tía trong các nguồn nước thải 38

Bảng 4.5 Phổ hấp thu cực ñại của sắc tố quang hợp của 4 chủng VKQH tía lựa chọn 40

Bảng 4.6 Nhu cầu vitamin của các chủng VKQH tía lựa chọn 41

Bảng 4.7 Khả năng sinh trưởng của các chủng VKQH tía trong khoảng pH khác nhau 42

Bảng 4.8 Khả năng sinh trưởng của các chủng VKQH tía trong các nồng ñộ muối khác nhau 42

Bảng 4.9 Tổng hợp ñặc tính sinh lý của các chủng VKQH tía lựa chọn 45

Bảng 4.10 Một số kết quả so sánh trình tự gen mã hóa rRNA 16S của chủng QN1 với dữ liệu trên ngân hàng gen 48

Bảng 4.11 Sự tích lũy sinh khối (OD660) của các chủng VKQH tía lựa chọn trong môi trường chứa sulfua với hàm lượng khác nhau 49

Bảng 4.12 Khả năng sử dụng sulfua của các chủng VKQH tía 50

Bảng 4.13 Hiệu suất xử lý khí H2S (mg/m3) của chế phẩm EMINA ở quy mô thí nghiệm 51

mô thí nghiệm 51

Bảng 4.15 Hiệu suất xử lý các khí ô nhiễm H2S, SO2, NH3 của chế phẩm EMINA ngoài tự nhiên 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học carotenoid cực cao nhóm iv của loài

R.thiosulfatophilus (A) và Erythroxanthin sulfate trong tế bào của loài E.ramosum, E longus, and E litoralis. 13

Hình 2.2, 2.3, 2.4 Hệ thống vận chuyển quang ñiện tử ở cây xanh, vi khuẩn lam và vi khuẩn quang hợp tía 19

Hình 2.5 Hệ thống Sox trong vi khuẩn tía không lưu huỳnh (A) và vi khuẩn tía lưu huỳnh (B) 20

Hình 4.1 Ảnh ñiện di DNA tổng số 46

Hình 4.2 Ảnh ñiện di sản phẩm PCR 46

Hình 4.3 Khuẩn lạc chủng HN5 thuộc loài Rhodopseudomonas palustris 55

Hình 4.4 Khuẩn lạc chủng QN1 thuộc loài Rhodobacter sphaeroides 55

Hình 4.5 Tế bào hình que chủng HN5 56

Hình 4.6 Tế bào hình que chủng QN1 56

I MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Nhóm vi sinh vật quang tự dưỡng bao gồm các vi tảo, vi khuẩn lam và các vi khuẩn quang hợp không thải oxy là những vi sinh vật có khả năng sử dụng năng lượng trực tiếp từ bức xạ mặt trời làm nguồn năng lượng ñể sinh trưởng và phát triển Nhóm vi khuẩn quang hợp không thải Oxy (bao gồm các

vi khuẩn quang hợp tía và xanh) là nhóm vi khuẩn sống kị khí, chúng ñồng hóa H2S, CO2 ñể xây dựng tế bào, ñồng thời với ñó chúng làm mất mùi và màu do H2S hoặc sulfua kim loại gây ra, làm giảm tính ñộc cho môi trường

Ở một số nước trên thế giới như Nhật Bản, Ấn ðộ, Nga…những nghiên cứu về vi khuẩn quang hợp tía ñã ñược chú trọng từ lâu Các ñặc ñiểm về dinh dưỡng của chúng ñã ñược ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực trong cuộc sống như y tế, nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản, và ñặc biệt là trong công nghệ môi trường Ở Việt Nam, ñã có những kết quả nghiên cứu cho thấy: khi bổ sung vi khuẩn tía vào thức ăn chăn nuôi hoặc nước nuôi tôm sẽ tăng khả năng phát triển của tôm, có thể loại trừ nhanh chóng NH3, H2S, axit hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lượng nước, cân bằng ñộ pH Với những vai trò này mà nhóm vi khuẩn quang hợp tía ñã trở thành một trong những nhóm vi sinh vật không thể thiếu trong các chế phẩm sinh học, trong ñó có chế phẩm EMINA do Viện Sinh học Nông nghiệp nghiên cứu và chế tạo

Tuy nhiên, vi khuẩn quang hợp tía là nhóm vi sinh vật khó trong việc phân lập và ñánh giá sâu sắc các ñặc ñiểm sinh học của chúng Do vậy, ñề tài:

“Phân lập, ñánh giá các ñặc ñiểm sinh học và ñịnh danh phân tử các chủng

vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu”

1.2 Mục tiêu của ựề tài

- Phân lập ựược một số chủng vi khuẩn quang hợp tắa

- đánh giá ựược một số ựặc ựiểm sinh học cơ bản các chủng vi khuẩn quang hợp tắa phân lập

- Xác ựịnh ựược trình tự gen mã hoã rRNA 16S của một số chủng vi khuẩn quang hợp tắa ựược phân lập

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía

VKQH tía là các tế bào gram âm, ñơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy… ñứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài vi khuẩn quang hợp tía ñều sinh sản bằng cách phân ñôi, một số loài sinh sản bằng cách nẩy chồi

Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí VKQH tía thường có màu hồng ñến màu ñỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b Cơ quan quang hợp là màng quang hợp ñược gắn với màng tế bào [31]

Năm 1907, Molisch là người ñầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc

tố màu ñỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi chung là vi khuẩn quang

hợp này là Rhodobacteria Molisch 1907 Nhóm này gồm hai họ là

Thiorhodaceae (là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt “S” bên

trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả năng

hình thành giọt “S” bên trong tế bào) Nhóm vi khuẩn tía bao gồm hai họ này

sau này ñược ñổi tên là bộ Rhodospirillales và hai họ Choromatiaceae và

Rhodospirillaceae

Năm 1984, Imhoff chia nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh thành

hai họ là Choromatiaceae, Ecthiorhodospiriaceae và họ vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh thành họ Rhodospirillaceae [16]

Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn quang hợp tía ñược trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn quang hợp tía [7]

Nhóm/loài

- Vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammaproteobacteria)

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh(alpha- hoặc betaproteobacteria) Một số loài chính Vi khuẩn tía lưu huỳnh: Allochromatium vinosum, Thiocapsa

2.2 Một số ñặc ñiểm sinh học cơ bản của VKQH tía

2.2.1 Sinh thái học VKQH tía

VKQH tía là nhóm vi khuẩn quang dưỡng, sống kị khí hoặc kị khí tùy tiện trong môi trường có ánh sáng chiếu rọi Chúng là các vi sinh vật ñiển hình, rất phổ biến ở nước ngọt cũng như nước mặn, thường cư trú nhiều trên

bề mặt bùn các ao ñầm tù, có nhiều bùn cặn các xác ñộng, thực vật [46]

Họ vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh thường ñược tìm thấy trong các thủy vực nước ngọt hoặc nước mặn có chứa hàm lượng sulfua cao Ở các ñộ sâu khác nhau có thể thu nhận ñược các loài khác nhau Ngoài ra còn có thể gặp họ vi khuẩn này ở một số thủy vực có ñiều kiện cực trị như các thủy vực kiềm hóa hoặc các suối nước nóng

Hệ sinh thái của họ vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh rất ña dạng, có thể gặp chúng trong các ao hồ tù ñọng, các vùng ñầm nước lợ hoặc mặn Nơi sống của chúng thường là các thủy vực có chứa hàm lượng chất hữu

cơ cao, hàm lượng oxy hòa tan thấp Ở một số vùng ñất axit có thể gặp các

chủng thuộc loài Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonas

palustris [30]

2.2.2 ðặc ñiểm phân loại VKQH tía

Các ñặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào và ñặc tính sinh lí ñều rất quan trọng trong việc ñịnh danh vi khuẩn quang dưỡng [35] Phổ hấp thu cực ñại của huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin về loại diệp lục khuẩn chính Sự hiện hiện ña dạng của bacterichlorophyl (bcl) là yếu tố hữu ích trong phân loại vi khuẩn quang hợp Hầu hết các loài vi khuẩn quang hợp tía ñều chỉ có bchl a

Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác ñịnh các loại carotenoid chính Spirilloxanthin là thành phần chính cho màu sắc ñỏ và

hồng, nếu có them rhodopin thì màu chuyển sang sắc nâu, okenon màu ñỏ tía,

và rhodoinal tạo màu tím tía Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từ nâu vàng ñến ñỏ nâu (màu ñược hình thành tùy thuộc vào các dẫn xuất bị oxy hóa khi có sự hiện diện của oxy) và màu nâu xanh khi trong môi trường có thể oxy hóa khử mạnh [17, 18] Kết quả phân tích ñịnh lượng sắc tố của một mẫu

tự nhiên có thể phản ánh mối liên hệ khá quan trọng của nhiều nhóm vi sinh vật quang dưỡng trong môi trường [22]

Isoprenoid Quinone có vai trò quan trọng trong chuỗi truyền ñiện tử VKQH tía tổng hợp nhiều loại Quinone khác nhau ở chiều dài và ñộ bão hòa của chuỗi polypreinyl ðặc ñiểm ña dạng này của quinone ở nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh có giá trị cao trong phân loại

Nhu cầu về vitamin và ñặc tính biến dưỡng nguồn cacbon là yêu cầu rất

quan trọng trong việc ñịnh danh một chủng thuộc họ Rhodospirillaceae

Giống và loài thường ñược phân biệt dựa trên sự so sánh nhiều ñặc tịnh

về hình dang, kích thước tế bào, kiểu tiêm mao, cấu trúc màng trong tế bào chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ các base của DNA và các ñặc tính sinh lí (như khả năng sử dụng hợp chất nito, cabon, khả năng hô hấp hiếu khí và kị khí trong tối, tính mẫn cảm với sulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt ñộ, pH), ñặc tính sinh

thái (môi trường tự nhiên mà vi sinh vật thường phân bố) [34]

Những thông tin về kích thước và trình tự cytochrome c, cấu trúc lipopolysaccharid và trình tự gen mã hóa rRNA 16S ñược dùng ñể xác ñịnh mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lai phân tử DNA –DNA là tiêu chí quan trọng ñể phân biệt các loài gần nhau [8] Việc xác ñịnh thành phần GC của

DNA có vai trò quan trọng ñể mô tả loài mới

Bảng 2.2 Một số ñặc tính ñặc trưng ở vi khuẩn quang hợp

tía không lưu huỳnh [18]

tế bào

Màng

tế bào ICM

Carotenoid chính

Sản phẩm oxy hóa sulfide

Nhân tố tăng trưởng

Môi trường nước thích hợp

ðặc tính phân biệt khác

Rhodospirillum

rubrum

ñộng

Rhodocyclus

purpureus

ñộng

Rhodopseudomonas

palustris

Chú thích:

glucoside ICM: Cấu trúc hệ thống bên trong

màng tế bào chất

p-aba Para aminobenzoic acid rh Rhodopin

S 0 /sul: Sulphat và lưu huỳnh nguyên

tố bên ngoài tế bào

+: Sulphide ñược ocid hóa thành

nhiều sản phẩm khác nhau

glucoside Neu * : 1,2-lihydroneurosporen ly * 1,2-dihydrolycopene rv rhodovibrin

cho rằng ICM có nguồn gốc từ CM và ñược gắn với CM.[10,37,38] Hầu hết

trong vi khuẩn quang hợp kí khí, ánh sáng và hàm lượng oxy có liên quan ñến

sự hình thành ICM, ví dụ ICM ñược cảm ứng hình thành khi có hàm lượng oxy thấp, ICM sẽ phát triển rộng khắp trong pha sinh trưởng kị khí Sắc tố quang hợp của vi khuẩn quang hợp ñược gắn vào trong màng ICM hoặc trong màng CM Khi tế bào chứa hàm lượng các sắc tố quang hợp cao, màng gập sâu vào phía trong vùng sinh chất Các kiểu gập khác nhau mang tính chất ñặc trưng cho loài và ñược chia thành các dạng: màng, dạng ống, dạng túi [9,31]

2.3.2 Sắc tố quang hợp

2.3.2.1 Bacteriochlorophyll

ðây là nhóm sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp tía Hiện nay, bacteriochlorophyll ñược chia thành 5 nhóm: a, b,c d, e dựa vào sự khác nhau về cấu trúc phân tử và cực ñại của phổ hấp thu trong vùng ánh sáng ñỏ.[ Bảng 1] Nhóm vi khuẩn quang hợp tía có chứa hai loại bacteriochlorophyll a

or b, nhóm vi khuẩn quang hợp màu xanh chứa chủ yếu nhóm bacteriochlorophyll c, d or e trong khi ñó, ở vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Rhodospirillum chỉ có bacteriochlorophyll a

Bảng 2.3 Phổ cực ñại hấp thu của bacteriochlorophyll [47]

Phổ cực ñại hấp thu (nm) Bacteriochlorophyll

Khi so sánh hàm lượng của Bchl trong hai nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí và vi khuẩn quang hợp hiếu khí thì hàm lượng Bchl trong nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí luôn cao hơn Ví dụ, trong tế bào của

loài vi khuẩn quang hợp tía R sphaeroides có chứa khoảng 20 nmol

Bchl/mg trọng lượng khô tế bào Trong khi ñó, hàm lượng Bchl ở các loài

vi khuẩn quang hợp hiếu khí như: E.longus là 2.0 nmol/mg trọng lượng khô của tế bào, R.hydrolyticum là 1 – 4 nmol/mg protein, A.rubrum là 0,7

nmol/mg trọng lượng khô tế bào [14,33, 39,42]

Tạo nên màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp không chỉ do bacteriochlorophyll mà còn do carotenoid trong tế bào của chúng

2.3.2.2 Carotenoids

Carotenoid bao gồm một lớp các sắc tố ñược tìm thấy trong các thể prokaryote quang và không quang tự dưỡng, và các sinh vật eukaryote Chức năng của carotenoid là bảo vệ tế bào không bị phá hủy bởi phản ứng quang oxy hóa, hấp thụ ánh sáng và là một thành phần cấu trúc sắc tố quang hợp

trong vi khuẩn quang hợp [1,6]

Sự phân biệt màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp trong tự nhiên

là do sự khác nhau về thành phần các bacteriochlorophyll và carotenoid Carotenoid ñược chia thành 5 nhóm dựa vào cấu trúc phân tử và quang phổ hấp thụ Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp:

Bảng 2.4 Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp [48]

1 Normal Spirilloxanthin Series Lycopene

Rhodopin Spirilloxanthin

2 Alternative Spirilloxanthin Series

and Ketocarotenoids

Spheroidene Hydroxyspheroidene Spheroidene

Hydroxyspheroidene

Lycopenol Rhodopin Rhodopinal Rhodopinol

5 Chlorobactene Series Chlorobactene

Hydroxychlorobactene Beta-Isorenieratene Isorenieratene

Khoảng 20 carotenoids khác nhau ñã ñược tìm thấy trong loài E

ramosum màu ñỏ cam, trong ñó có 10 loại ñã ñược tinh khiết và cấu trúc ñặc

trưng (Bảng 2.4) [41]

Tất cả các carotenoids tinh khiết này ñược xác ñịnh là C40 carotenoids, ñược phân loại thành bốn nhóm: (i) Các carotenoid bicyclic (β-carotene và các chất dẫn xuất hydroxyl như zeaxanthin, adonixanthin, caloxanthin, và nostoxanthin), (ii) monocyclic bacteriorubixanthinal carotenoid, (iii) spirilloxanthin mạch hở, và (iv) carotenoid sulfate erythroxanthin (Hình 2.1)

Bảng 2.5 Công thức hóa học của một số nhóm carotenoid trong tế bào

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học carotenoid cực cao nhóm iv của loài

R.thiosulfatophilus (A) và Erythroxanthin sulfate trong tế bào của loài

E.ramosum, E longus, and E litoralis [48]

Bicylic carotenoid như β-caroten và các chất dẫn xuất hydroxyl của nó

ñã ñược tìm thấy ở loài Erythrobacter và Erythromicrobium, và màu sắc của loài Erythromonas và Sandaracinobacter chỉ ra rằng các vi khuẩn này cũng

có chứa carotenoids carotene Trong khi ñó ở các loài vi khuẩn quang hợp tía hiếm khi xuất hiện loại carotenoid này trong tế bào của chúng (chỉ có một

lượng nhỏ β-carotene ñược phát hiện trong R vannielii [2, 28]. Thành phần

carotenoid của các loài Roseococcus màu hồng ñỏ không phong phú như của loài Erythrobacter và Erythromicrobium (ngoại trừ một số trường hợp không bình thường) Ví dụ loài R thiosulfatophilus chứa chủ yếu là hai sắc tố ñỏ

phân cực là C30 carotene-dioate t (4,4 '-diapocarotene-4, 4'-dioate) và ester diglucosyl tương ứng (di [β-d-glucopyranosyl] -4,4 - diapocarotene-4, 4'-dioate) Chúng chiếm tới 95% trong tổng số carotenoid của tế bào Carotenoid ñược tìm thấy chủ yếu trong loài vi khuẩn quang hợp tía

Rhodobacter là spheroidenone Carotenoid nhóm spirilloxanthin ñược tìm

thấy chủ yếu trong loài Rhodospirillum rubrum và một số vi khuẩn quang hợp

tía khác [40]

Như vậy: Các sắc tố hấp thụ ánh sáng chính trong tế bào vi khuẩn quang hợp là Bchl và carotenoids Những sắc tố này ñược gắn proteins màng bằng liên kết không cùng hóa trị tạo thành trung tâm phản ứng quang hóa (photochemical reaction center) và hệ thống thu nhận ánh sáng (LH – light harvesting) [6].

Các vi khuẩn quang hợp tía có một hệ thống LH tương ñối ñơn giản bao gồm một loại protein ăng – ten (LHI) liên kết chặt chẽ với trung tâm phản ứng RC, và ở nhiều loài một hoặc nhiều khu phức hợp ăng-ten ngoại vi (LHII) tất cả ñều ñược nằm trong ICM [45] Lượng tử ánh sáng ñược tế bào thu nhận qua hệ thống ăng ten Từ ñây năng lượng ánh sáng ñược chuyển vào trung tâm phản ứng Trung tâm phản ứng của vi khuẩn quang hợp tía ñược cấu tạo từ 3 tiểu phần protein (L, M và H), cùng với các cofactors: 4 phân tử Bchls, 2 phân tử bacteriopheophytins, 2 phân tử quoinones, và một phân tử nonheme – high spin Fe2+ Tâm phản ứng nằm trong mạch vận chuyển ñiện

tử Trong mạch chuyển ñiện tử này xuất hiện dòng ñiện tử khi ánh sáng gây ra

quá trình tách ñiện tích ở tâm phản ứng [10]

2.3.2.3 Hệ thống vận chuyển ñiện tử quang hợp

Ở vi khuẩn quang hợp chỉ có một hệ thống quang hóa với một tâm phản ứng ñiều này hoàn toàn khác biệt so với ở thực vật, có ít nhất hai hệ thống quang hóa với hai tâm phản ứng Hệ thống vận chuyển ñiện tử ở VKQH ñược thực hiện thông qua: quinones và cytochromes

Quoinones:

Quoines ñược tìm thấy trong tế bào của vi khuẩn, cây trồng và ñộng vật Nó là hợp chất oxy hóa khử trong hệ thống vận chuyển ñiện tử của quá

Thành phần quinonens trong các loài vi khuẩn quang hợp khác nhau là khác nhau (Bảng 2.6).Ví dụ, một số loài vi khuẩn quang hợp chỉ chứa một loại quoinone là Q10, trong khi ñó một số loài khác có chứa Q9 hoặc Q8 như

là menaquinone MK8 hoặc MK9 [ 4, 19]

Số lượng trung bình của ubiquinones trong tế bào vi khuẩn hiếu khí bắt

buộc (0.02 và 0.7 µmol/g chất khô tế bào loài E hydrolyticum và S.sibiricus)

thường thấp hơn so với trong tế bào của vi khuẩn quang hợp tía (2 ñến 4

µmol/g chất khô tế bào loài Rhodobacter) [ 12]

Bảng 2.6 Thành phần Quinones trong VKQH tía [4,19]

Absorption peak(s) (nm)

Ubiquinone (mmol/g of dry cells)

No and molecular mass (kDa) of soluble

cyt c

No and molecular mass (kDa)

of membrane-

ND 0.11

Roseococcus

thiosulfatophilus + 856 Absent 44.0 2 (4.0, 6.5)

4 (21.5, 23.0, 26.0, 44.0)

2 (30.0, 34.0) 0.02 0.3

2 (30.0,

Cytochrome

Cyts ñược tìm thấy trong hầu hết các sinh vật thực hiện vận chuyển ñiện tử Vì vậy, cyts không chỉ có lục lạp, ty thể, và chuỗi hô hấp ở vi khuẩn hiếu khí, mà còn có trong các vi khuẩn yếm khí tùy ý, các vi khuẩn yếm khí bắt buộc, vi khuẩn dị dưỡng quang năng tùy ý, và vi khuẩn cyanobacteria [13,

21, 25, 26, 36]

Quá trình cơ bản trong việc chuyển ñổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học trong vi khuẩn quang hợp kỵ khí là một loạt các phản ứng chuyển ñiện tử liên quan ñến việc vận chuyển các proton qua màng tế bào Quá trình này liên quan ñến hai phức hợp multisubunit trong màng tế bào là

trung tâm phản ứng quang hóa RC và cyt bc 1 Hai thành phần phân tán là

ubiquinone nằm trong vùng kị nước của màng tế bào và cyt c2 nằm trong gian

bào thường liên kết với hai phức hợp vận chuyển màng trên acceptor và thể cho của RC [29]

Trong tế bào loài R sphaeroides, R capsulatus, R rubrum, và R

Palustris, electron ñược vận chuyển từ phức hợp bc1 ñến RC qua một hoặc

nhiều dạng cyt linh ñộng [25]

Hệ thống vận chuyển quang ñiện tử chia sẻ bởi nhiều chất mang như các

phân tử cyts c linh ñộng, những phân tử quinones, và phức hợp cyt bc 1 với hệ thống vận chuyển electron hô hấp

Dựa vào bản chất của chuỗi vận chuyển electron và thành phần cyt, người

ta ñã chia thành 3 nhóm cyt:

- cyt c gắn với RC: xuất hiện ở loài: R denitrificans, R

thiosulfatophilus, E ursincola, và S Sibiricus Khối lượng phân tử của nhóm

cyt c tương ứng là 42, 44, 37, và 40kDa

- Cyt c hòa tan Xuất hiện ở các loài E longus, E litoralis, ramosum E.,

hydrolyticum E., và E ezovicum

- Cyt c gắn với màng tế bào, xuất hiện ở các loài E ramosum, và E

Ở vi khuẩn quang hợp xanh, trung tâm phản ứng là P840 ñược kích thích, ñiện tử ñược chuyển ñến bacteriochlorophyll 663 (Bchl) > iron sulfur protein (FeS) ferredoxin (Fd) > menaquinone (MK) > cytochrome b (Cyt b)/FeS protein > cytochrome c555.Và sau ñó quay về P840

Vi khuẩn quang hợp tía có thể sản xuất lượng lớn ATP khi ñược chiếu sáng Trong tối chúng phải có các quá trình trao ñổi chất khác ñể sản xuất

giữa các quá trình trao ñổi chất ñể tạo năng lượng ở vi khuẩn quang hợp tía rất linh hoạt, ñược ñiều khiển bởi ánh sáng, oxy và các chất cho ñiện tử

Sự khác nhau giữa hệ thống vận chuyển quang ñiện tử ở cây xanh, vi khuẩn lam và vi khuẩn quang hợp tía ñược thể hiện qua hình dưới:

Hệ thống vận chuyển ñiện tử quang hợp ở cây

xanh

Hệ thống vận chuyển ñiện tử quang hợp ở vi khuẩn

quang hợp xanh

Hệ thống vận chuyển ñiện tử quang hợp ở vi khuẩn quang hợp tía

Hình 2.2, 2.3, 2.4 Hệ thống vận chuyển quang ñiện tử ở cây xanh, vi khuẩn

lam và vi khuẩn quang hợp tía

2.3.3 Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ lưu huỳnh trong vi khuẩn tía

ða số các loài vi khuẩn quang tía ñều có thể sử dụng các hợp chất khử của lưu huỳnh làm nguồn cho ñiện tử ñể cố ñịnh CO2 Quá trình oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh có sự tham gia của nhiều enzyme và ñược thực hiện theo nhiều cách khác nhau Trong ñó con ñường oxy hóa Sox (hình 5) ñược coi là quan trọng nhất Phức hợp Sox, là phức hợp nhiều enzyme periplasmic thiosulphate – oxidizing, lần ñầu tiên ñược tìm thấy trong

Paracoccus (Pcs.) versutus (Lu et al., 1985) và Pcs pantotrophus (Friedrich

et al., 2001; Rother et al., 2001) Trong Pcs Pantotrophus, phức hợp Sox rất

cần cho quá trình oxy hóa thiosulfate trong ñiều kiện in vivo, và xúc tác quá trình khử cặp cytochrome c coupled thành dạng oxy hóa của thiosulfate, sulfide, sulfite và hợp chất sulfua cơ bản trong ñiều kiện in vitro

Hình 2.5 Hệ thống Sox trong vi khuẩn tía không lưu huỳnh (A) và vi

khuẩn tía lưu huỳnh (B) [ 7]

Mức ñộ oxy hóa các hợp chất của lưu huỳnh ở các loài khác nhau là khác nhau Nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh tạo ra sản phẩm trung gian là các giọt lưu huỳnh ñược tích lũy bên trong tế bào khi sinh trưởng quang tự dưỡng với các hợp chất khử của lưu huỳnh làm nguồn cho ñiện tử

2.3.4 ðiều hòa quá trình trao ñổi chất ở vi khuẩn quang hợp tía

Trong ñiều kiện có ánh sáng, vi khuẩn quang hợp tía tiến hành quang hợp ñể thu nhận năng lượng sử dụng cho các hoạt ñộng sống của tế bào Phương trình tổng quát quá trình quang hợp:

CO2 + 2H2A + hv [CH2O]n + 2A + H2O

Ở tảo hay thực vật bậc cao: H2O ñóng vai trò của H2A Ở VKQH: H2A

có thể là các chất hữu cơ ñơn giản, các hợp chất khử của lưu huỳnh hoặc hydro phân tử Trong ñó, các chất hữu cơ vừa ñóng vai trò làm chất cho ñiện

tử, vừa làm nguồn cacbon trong quá trình quang hợp dị dưỡng

Ở ngoài sáng, tất cả các loài vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh ñều ưa thích ñiều kiện sinh trưởng dị dưỡng, sử dụng các chất hữu cơ ñơn vừa làm nguồn cho ñiện tử, vừa làm nguồn C Nhiều ñại diện của họ vi khuẩn này

có khả năng sinh trưởng quang tự dưỡng cacbon với sự có mặt nguồn cho ñiện tử là các hợp chất khử của lưu huỳnh hay H2 ða số các ñại diện của các loài ñã biết của họ vi khuẩn này ñều có khả năng sinh trưởng ở ñiều kiện vi hiếu khí trong tối theo kiểu hóa dưỡng tùy nghi, một số loài có thể sinh trưởng khá tốt ở ñiều kiện vi hiếu khí tối Tuy nhiên, khả năng chịu oxy hóa của các chủng rất khác nhau Trong ñiều kiện sinh trưởng quang hợp, khả năng dinh dưỡng hô hấp của các loài này bị ức chế bởi ánh sáng

Ở ñiều kiện kỵ khí tối, một số loài như Rhodobacter capsulatus,

Rhodospirillum rubrum có thể tồn tại nhờ quá trình trao ñổi chất theo kiểu hô

hấp kị khí với sự có mặt của các chất nhận ñiện tử như nitrat, nitrit, NO,dimethylsulfua, hay trimethylamin N – oxit

Khi quang hợp, chu trình Calvin, hệ thống cố ñịnh nito, hệ thống DMSO/DMSOR ñược tế bào sử dụng ñể duy trì thế oxy hóa khử Các phản ứng của chu trình Calvin cho phép CO2 có chức năng thu nhận các lực khử dư

thừa do trao ñổi chất các chất hữu cơ như malate, succinate Do ñó, vai trò của chu trình Calvin trong suốt quá trình sinh trưởng quang dị dưỡng là giữ thế cân bằng oxy hóa khử trong tế bào Khi tế bào sinh trưởng trong ñiều kiện quang tự dưỡng thị vai trò chủ yếu của chu trình calvin là cố ñịnh CO2 ñể tổng hợp các vật liệu tế bào Chính nhờ tính lưỡng cực này mà chu trình Calvin có vai trò ñiều khiển giữa hai quá trình quang tự dưỡng và quang dị dưỡng

Quá trình cố ñịnh nito luôn ñi kèm với việc khử các proton tạo hydro

và ñòi hỏi rất nhiều lực khử, là quá trình tiêu tốn năng lượng [ 3 ] Hệ thống này không chỉ ñóng vai trò chính là trao ñổi nito mà còn có vai trò ñiều khiển thế cân bằng oxy hóa trong tế bào Tế bào sẽ tổng hợp nitrogenase khi sinh trưởng quang dị dưỡng với nguồn N nghèo như glutamat ở những ñiều kiện sinh trưởng như vậy, lực khử dư thừa ñược tạo ra do quá trình oxy hóa cơ chất lại bị tiêu dùng vào việc khử các proton và giải phóng phân tử hydro do hoạt tính hydrogenase của hệ thống nitrogenase

Khi sinh trưởng ở ñiều kiện quang hợp, trong tế bào vi khuẩn quang hợp tía xuất hiện một mối tương tác giữa các hệ thống, giữ thế cân bằng oxy hóa khử của tế bào và hệ thống quang hợp Hệ thống ñiều hòa trao ñổi chất ở

vi khuẩn tía rất linh hoạt, bởi vậy chúng là những ñối tượng lý tưởng cho nghiên cứu về trao ñổi chất ở vi sinh vật

2.4 Ứng dụng của VKQH tía

Những ứng dụng nổi bật của VKQH tía là xử lý nước thải, cải thiện môi trường, sản xuất hydro phân tử, sinh khối Các VKQH tía nói chung là nguồn cung cấp các thành phần của chuỗi truyền ñiện tử trong quang hợp và tạo ATP, nguồn vitamin và các phân tử hữu cơ khác

2.4.1 Sản xuất protein ñơn bào

VKQH là nguồn cung cấp protein ñơn bào có giá trị vì sinh khối VKQH giàu protein, vitamin và carotenoid Ở tế bào VKQH hàm lượng protein thường chiếm 60 – 70% trọng lượng khô, số lượng cũng như hàm lượng các axit amin không thay thế của chúng có thể tương ñương với ñậu tương, thịt, trứng gà

Ở loài Rhodopseudomonas capsulatus, protein và axit nucleic chiếm

61% và 6% trọng lượng sinh khối; lượng acid amin khi ly giải tế bào tương

ñương với Chlorella vulgaris, nhưng chứa thành phần methionin cao hơn

Các loại chất thải hay vật liệu rẻ tiền thường ñược tận dụng làm nguyên liệu

ñể nuôi cấy VKQH thu sinh khối, Khi nuôi cấy ñồng thời Rubriviax

delatinosa và Rhodobacter sphaeroides trên bã mì, lượng vi tamin B12 và carotenoid thu ñược là 44 và 230 µg/g chất khô

Sinh khối VKQH giàu vitamin, axit amin thiết yếu và axit amin có lưu huỳnh là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phiêu sinh vật và tôm cá Giá trị ñinh dưỡng của VKQH khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi ñã ñược chứng minh trong thực tiễn Mức ñộ sống sót của cá giống, tốc ñộ sinh trưởng va trọng lượng của chúng ñược gia tăng khi nuôi bằng thức ăn có bổ sung tế bào VKQH Việc bổ sung sinh khối của VKQH vào thức ăn của gà mái ñã giúp cải thiện số lượng, chất lượng trứng gà [23]

2.4.2 Sản xuất ubiquinone

Ubiquinone 10 (Q10) là thành phần quan trọng trong của chuỗi vận chuyển ñiện tử trong hệ quang của VKQH Q10 ñược biết ñến là loại ubiquinone có giá trị về dược liêu, chúng có tác dụng kích thích cơ tim, ñược

sử dụng trong ñiều trị các bệnh về phổi và còn có thể sử dụng như một chất chống oxy hóa trong sản xuất dược phẩm, mỹ phẩm [32] Tế bào VKQH tía

chứa hàm lượng Q10 cao hơn ở các loài vi sinh vật khác Thành phần này ñã

ñược chiết tách, tinh chế từ Rhodopseudomonas sphaeroides,

Rhodopseudomonas sulfidophilus, và Rhodospirillum rubrum

2.4.3 Sản xuất hoocmon thực vật

Người ta ñã phát hiện ra rằng một số hoocmon thực vật cũng có mặt trong tế bào VKQH tía với vai trò ñiều chỉnh quá trình quang hợp Các

hoocmon tách ra từ R.rubrum có hoạt tính sinh lý khá cao và bao gồm ba loại

cytokinin (hàm lượng1mg/g sinh khối tươi) có nguồn gốc adenin Dịch thế

bào R.spharroides ñã nuôi cấy bằng nước thải có chứa kinetin (hàm lượng 4,7

g/l) và zeatin với hàm lượng 2g/l Ngoài ra, người ta cũng tìm thấy một số chất kích thích sinh trưởng khác như auxin, idol – 3 – axetic axit (IAA), indol

– 3 – butiric axit (ABA) trong tế bào chủng R.sphaeroides IFO 12203

2.4.4 Sản xuất các chất kháng sinh

Một trong những ñặc tính của VKQH là có khả năng sinh các chất kháng vi sinh vật bao gồm: các chất kháng sinh, các chất kháng khuẩn và kháng virus [15]

Hoạt chất kháng virus có thể ñược tìm thấy trong khá nhiều chủng

thuộc loài R.rubrum, R.capsulatus C.vinosum Chất này thường tấn công vào

các virus gây bệnh cho cá và các coliphage mà không gây hại cho vật chủ

R.capsulatus có thể loại bỏ ñược 97% coliphage khi sử dụng chúng trong xử

lý nước thải chăn nuôi [24]

2.4.5 Sử dụng vi khuẩn quang hợp tía trong xử lý nước thải

Nước thải chứa hỗn hợp các chất hữu cơ phân tử lượng nhỏ, là nguồn

cơ chất tốt cho vi khuẩn tía ñể tăng trưởng trong ñiều kiện kị yếm khí và vi

thường ñược sử dụng trong xử lý nước thải là: R.Capsulatus, R.sphaeroides,

Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum fulvum…

Hệ thống xử lý nước thải có sự tham gia của VKQH tía có những ưu ñiểm sau:

- Không cần thiết phải khử trùng nước trước khi xử lý

- Sinh khối thu ñược sau quá trình xử lý giàu protein, vitamin, carotenoid và nhiều hoạt chất sinh học khác nên có thể ñược tái sử dụng trong

y học, nông nghiệp và chăn nuôi

- Khi xử lý nước thải ñậm ñặc hữu cơ bằng vi khuẩn quang hợp tía thì không cần phải pha loãng [24]

III VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn quang hợp tía ñược phân lập từ nhiều thủy vực tự nhiên ở Việt Nam ðịa danh khu vực lấy mẫu ñược trình bày trong bảng 4.1

3.2 Hóa chất

3.2.1 Môi trường phân lập, làm thuần và cấy chuyển VKQH tía

ðề tài sử dụng môi trường SA ñặc trưng cho VKQH tía ở nước ngọt và môi trường SSM ñặc trưng cho VKQH tía ở nước mặn