BÁO CÁO Xác định loài nấm phytophthora tác nhân chính gây bệnh thối đen quả ca cao bằng chỉ thị phân tử

Đặt vấn đề Theo Duncan và Cooke, 2002, trước giai đoạn phát triển của sinh học phân tử, tất cả các loài nấm thật fungi và nấm noãn oomyces, kể cả các loài thuộc chi Phytophthora đều được

Trang 1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT

-*** -CHUYÊN ĐỀ 4

Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân

chính gây bệnh thối đen quả ca cao bằng chỉ

thị phân tử

Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước

Mã số: ĐTĐL.2011- G/63

Chủ trì đề tài: ThS Nguyễn Hồng Tuyên

Trang 2

1 Đặt vấn đề

Theo Duncan và Cooke, 2002, trước giai đoạn phát triển của sinh học phân

tử, tất cả các loài nấm thật (fungi) và nấm noãn (oomyces, kể cả các loài thuộc chi

Phytophthora) đều được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học

Cách xác định truyền thống này nhìn chung khá khó và dễ tạo ra kết quả không

chính xác đối với các loài nấm Phytophthora Các đặc điểm hình thái của nấm

Phytophthora có giá trị chẩn đoán thường không thống nhất, phụ thuộc nhiều vào

isolate và điều kiện nuôi cấy

Hiện nay, việc xác định và phân loại cũng như phân tích quan hệ của các loài

Phytophthora có thể được thực hiện khá dễ dàng dựa trên các kỹ thuật phân tích

phân tử, nhiều vùng gen của Phytophthora đã được lựa chọn làm đối tượng nghiên

cứu như các vùng mã hóa và không mã hóa của DNA ribosome (rDNA), các gen

mã hóa cytochrome oxidase I và II của ty thể

Để xác định chính xác tên loài nấm gây hại, chúng tôi xin thực hiện chuyên

đề: “Xác định loài nấm Phytophthora tác nhân chính gây bệnh thối đen quả ca cao bằng chỉ thị phân tử”

2 Tài liệu tham khảo

Một số phương pháp hiện đã được ứng dụng trong nghiên cứu về nấm

Phytophthora Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Restriction fragment length polymorphism = RFLP) là kỹ thuật được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975

để xác định đa hình DNA nhằm lập bản đồ di truyền một đột biến mẫn cảm nhiệt

độ của các serotype của adenovirus Kỹ thuật dựa trên việc cắt bằng Enzyme cắt giới hạn (RE= Restriction enzyme) toàn bộ bộ gen của vi sinh vật Mặc dù 2 cá thể cùng loài có bộ gen đồng nhất thì chúng vẫn khác nhau một số nucleotide do các nguyên nhân sau: đột biến điểm, thêm/mất, chuyển vị trí, đảo vị trí và lặp (duplication) nucleotide Kết quả là sản phẩm cắt DNA sẽ có số lượng và kích

thước thay đổi Phân tích rDNA-RFLP đã được sử dụng trong xác định nấm P

palmivora MF4 từ các isolate phân lập trên cây ớt

Kong và cộng sự, 2004 đã sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chuỗi đơn PCR - SSCP (Single stranded conformational polymorphism) cho rDNA - ITS để

chẩn đoán nhanh Phytophthora ramorumich Sự khuếch đại DNA và phân tích

SSCP của các sản phẩm PCR được tiến hành ở Mỹ Sử dụng một cặp mồi thích hợp với nấm thuộc Oomycete (Cooke và cộng sự, 2000), mồi xuôi (forward primer) ITS6: 5’-GAA GGT GAA GTC GTA ACA AGG-3’, tại vị trí trong 18S rDNA và mồi ngược (reverse primer) ITS7: 5’- AGC GTT CTT CAT CGA TGT GC-3’, được định vị trên 5-8 S rDNA để khuếch đại

Theo tác giả Ivors và cộng sự, 2004, kỹ thuật dựa trên phân tích đa hình đoạn dài khuyếch đại (amplified fragment length polymorphism = AFLP) cũng

được áp dụng để nghiên cứu nấm Phytophthora Vos et al., 1995 là người đầu tiên

Trang 3

sử dụng kỹ thuật đa hình đoạn dài khuyếch đại và hiện nay kỹ thuật này được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu đa dạng thực vật, nấm và vi khuẩn AFLP là một trong các kỹ thuật hiệu quả nhất khi nghiên cứu DNA fingerprinting và kỹ thuật này kết hợp ưu điểm của RFLP (RE trên toàn bộ bộ gen) và PCR Đặc điểm quan trọng nhất của AFLP là khả năng đánh giá mức độ đa hình trên toàn bộ bộ gen hay nói cách khác là kiểm tra đồng thời một cách ngẫu nhiên các sản phẩm từ nhiều locus trên

Theo tác giả Blair, 2008, các phân tích phân tử nhằm xác định cũng như

đánh giá mối quan hệ của các loài nấm Phytophthora chủ yếu dựa vào các vùng

liên gen ITS (internally transcribed spacers) của cụm gen rDNA Các rDNA của

nấm Phytophthora cũng như của các sinh vật nhân thật (Eukaryote) được tổ chức

thành các đơn vị phiên mã Mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần trên

bộ genome Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã Một đơn vị phiên mã gồm

các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS

ký hiệu là ITS1 (ở đầu 5’) và ITS2 (ở đầu 3’) (Hình 1)

Hình 1 Sơ đồ minh họa các cụm gen rDNA của sinh vật nhân thật Vùng ITS1

và ITS2 được chỉ bằng mũi tên.

Theo Duncan & Cooke, 2002, các vùng ITS do có tốc độ đột biến tương ứng với tốc độ biến hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới

mức loài, như đã được chứng minh đối với các loài nấm Phytophthora

Nguyễn Văn Viết, 2002, sử dụng kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý (Random amplified polymorphic DNA= RAPD), xác định sự khác nhau giữa các

kiểu gen của nấm Phytophthora colocasiae từ 5 mẫu phân lập trên cây khoai sọ ở

Việt Nam

Trang 4

Theo Phạm Ngọc Dung và Hà Viết Cường, 2010, tác nhân gây bệnh chết

nhanh hồ tiêu ở Đăk Nông do nấm Phytophthora tropicalis gây nên dựa vào

phương pháp ITS , sử dụng mồi ITS5 và ITS4

3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung

- Chạy PCR để nhân dòng

- Dòng hoá sản phẩm PCR

- Giải trình tự sản phẩm PCR

- Phân tích cây phân loại

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị nguồn nấm

Các mẫu Phytophthora được phân lập từ quả ca cao bị thối đen thu thập tại

tỉnh Đăk Lăk, Bình Phước và Đăk Nông Tác nhân gây bệnh được phân lập trên

môi trường chọn lọc Phytopthora PSM (Phytophthora selective medium) là V8

agar chứa rifarmpicin, hymexazol và pimaricin và sau đó được cấy truyền sang môi trường PDA (potato dextrose agar) hoặc V8 agar

3.2.2 Tách chiết ADN

ADN được chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 250C 3 - 7 ngày Khoảng 100 mg sợi nấm được chuyển sang ống effpendorf 1,5 mL và được rửa với 1 ml nước cất Sợi nấm được nghiền trong ống effpendorf với 500 µl đệm chiết (2 M NaCl, 25 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, 2

% polyvinyl pyrrolidone và 2 % CTAB) dùng chày nhựa nhỏ Dịch nghiền được chiết 2 lần với chlorophorm:isoamyl alcohol (24:1) Cặn ADN được rửa 2 lần bằng ethanol 70 %, làm khô trong không khí 30 phút và được hòa trong 50 µl đệm TE Dịch ADN được giữ ở -20 OC

3.2.3 Chạy phản ứng PCR

Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ

vùng ITS của nấm Phytophthora Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0,5

ml với tổng thể tích phản ứng 25 µl chứa 2,5 µl đệm DreamTaq PCR X10 (Fermantas), 0,5 µl dNTPS (10 mM môi loại A, T, G, C, Roche), 0,5 µl mỗi loại mồi (đều đươc chuẩn bị ở nồng độ 20 μM), 0,25 μL DreamTaq polymerase (5U/µl, Fermentas) và 0,5 µl DNA Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94OC trong 5 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR (biến tính ở 94 OC trong 40 giây, gắn mồi ở 50OC trong

Trang 5

45 giây và tổng hợp sợi ở 72OC trong 1 phút) Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở

72OC

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 phút Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp bằng máy ảnh số

3.2.4 Dòng hóa và giải trình tự

Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM

Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose Sản phẩm PCR tinh chiết được nối vào vector pTZ57R/T của kít dòng hóa InsTA Clone (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được biến nạp vào tế bào vi khuẩn

Escherichia coli dòng XL1-Blue Plasmid được tinh chiết dùng kít tinh chiết

plasmid (Bionier) Các dòng vi khuẩn tái tổng hợp được kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp đúng bằng PCR dùng mồi ITS Plasmid tái tổ hợp được giải trình

tự cả 2 chiều dùng kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR Sản phẩm giải trình tự được tinh chiết, làm khô và gửi đọc tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)

3.2.5 Phân tích trình tự chuỗi ADN

Đầu tiên, các chuỗi mẫu được xác đinh danh tính khi so sánh với các chuỗi

đã công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện với các phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX1.83 và MEGA 4.0

4 Kết quả nghiên cứu

4.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại

và giám định Tất cả 20 mẫu nấm đã được kích thích sinh bào tử nhằm quan sát đặc điểm hình thái của bào tử nang (sporangium), cành bào tử nang (sporangiophore), bào tử hậu (chlamydospore) (Bảng 1) Các quan sát hinhfthias cho thấy:

• Bào tử nang (sporangium) của tất cả các mẫu nấm đều có núm, một số mẫu nấm có bào tử nang 2 núm Hình dạng bào tử nang rất biến động: hình cầu, hình trứng tới hình ellip (hình 1)

Trang 6

• Bào tử nang hình thành trên cành bào tử nang (sporangiophore) dạng sym (Hình 2)

• Hầu hết các mẫu đều hình thành bào tử hậu (chlamydospore) ở mức độ khác nhau Bào tử hậu có thể hình thành ở đỉnh hoặc giữa sợi nấm (Hình 3)

Hình 1 Đặc điểm của bào tử nang: hình cầu, trứng, ellip, bất qui tắc, bào tử nang

có hai núm (minh họa từ trái sang phải, CCĐL 3.6, CCĐL 15.1, CCĐL 13,

CCĐL 5.1, CCĐL11.4)

Trang 7

Hình 2: Bào tử nang hình thành trên cành bào tử mọc dạng sym (minh họa mẫu

CĐL1.3)

Hình 3: Bào tử hậu hình thành ở đỉnh sợi (mẫuCBP 10.1)

và ở giữa sợi (mẫu CCBP 5)

Các đặc điểm hình thái của các mẫu nấm Phytophthora trên caccao nhìn chung

giống với các nấm đã công bố trên cacao như P capsici (nhóm 2), P palmivora,

P megakarya (nhóm 4).

Thiếu các đặc điểm liên quan tới sinh sản hữu tính như hình thái bao đực (antheridium), bao trứng (oogonium), bào tử trứng (oospore) và cách giao phối dẫn tới không thể định danh loài các mẫu Phytophthora trên cacao

Trang 8

Bảng 1 Đặc điểm hình thái các mẫu Phytophthora phân lập từ cacao

Stt Mẫu Bào tử hậu (Đường kính (µm)/

vị trí hình thành

Cành bào

Hình dạng Dài (µm) Rộng (µm) Núm Lỗ thoát động

bào tử (µm)

1 CCĐL 1.3 19 ( mọc ở đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip, bất qui tắc 23-65 16-27 1 núm 5

3 CCĐL 2.4 25 - 40 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 22-50 20-32 1 - 3 núm 5

4 CCĐL 3.6 25 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng 22-55 20-42 1 núm 5

5 CCĐL 4.2 20 - 30 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 22-45 17-35 1 núm 5

6 CCĐL 5.1 17 - 25 (mọc ở đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip, bất quy tắc 25-47 20-40 1 núm 5

7 CCĐL 11.4 25 -27 (mọc ở đầu, mọc nhiều ở giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng 22-57 17-52 1 - 2 núm 5

9 CCĐL 15.1 22 - 25 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 25-52 20-37 1 - 2 núm 2.5 – 5

11 CCĐN 3 19 - 23 (mọc ở đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 27-57 17-30 1 núm 5

12 CCĐN 4 15 - 17 (mọc ở đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 22-45 15-30 1 núm 5

17 CCBP 5 21 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Hình thành ít bào tửCầu, trứng 27-50 22-40 1 núm 5

18 CCBP 10.1 30 - 40(mọc ở đầu sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 23-60 17-40 1 núm 5

19 CCBP 10.2 17 - 32 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 20-40 12 40 1 núm 5

20 CCBP 10.3 17 - 30 (mọc ở đầu, giữa sợi) Dạng sym Cầu, trứng, ellip 27-47 17-38 1 núm 5

Trang 9

PCR và giải trình tự vùng ITS

Tất cả 20 mẫu nấm được chiết DNA, thực hiện PCR (Hình 4) và giải trình

tự Sau khi lắp ráp, tất cả 20 mẫu đều có kích thước đoạn đọc được từ 729 – 782, tương ứng với sản phẩm PCR (Bảng 2, Phụ lục 1) Đoạn đọc được của tất cả 20 mẫu đều chứa vùng ITS 4 và ITS 5 cần cho phân tích

Hình 4 PCR nhân vùng ITS bằng cặp mồi ITS4 và ITS5 của các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao M là thang DNA 1 kb (GeneRuler 1 kb, Fermentas) với băng tham khảo 750 bp được chỉ bằng mũi tên Các giếng: 1 (CCBP3), 2 (DL3.6), 3 (DL11.4), 4 (DL4.2), 5 (CCDN4), 6 (CCBP2), 7 (DL15.1), 8 (CCBP10.1), 9 (CCBP5), 10 (CCDN7), 11 (CCDN3), 12 (CCDN8), 13 (DL5.1), 14 (DL16.1), 15 (DL2.4), 16 (DL2.3), 17 (CCBP10.3).

Trang 10

Bảng 2 Kết quả giải trình tự các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao

trình tự Chất lượng

Sản phẩm cuối (bp)

1 CCBP10.1 CCBP10-1_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

781

2 CCBP10.1 13COZAA003 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

3 CCBP10.2 13D1ZAB010 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

782

4 CCBP10.2 13D1ZAB011 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

5 CCBP10.3 CCBP10-3_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải 750

6 CCBP10.3 13COZAA004 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

8 CCBP2 13COZAA000 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

11 CCBP5 CCBP5_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

756

13 CCDN3 CCDN3_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

757

14 CCDN3 13COZAA005 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

15 CCDN4 13D1ZAB008 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

776

16 CCDN4 13D1ZAB009 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

792

748

21 DL1.3 13D1ZAB004 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

783

22 DL1.3 13D1ZAB005 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

23 DL11.4 DL11-4_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải

710

24 DL11.4 13COZAA013 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

26 DL13.2 13D1ZAB007 ITS5 Tốt 3/4 bên trái

27 DL15.1 DL15-1_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải 736

29 DL16.1 DL16-1_ITS4 ITS4 Tốt 1/4 bên phải 764

782

779

761

773

751

Chúng tôi cũng nhận thấy đối với tất cả 20 mẫu được giải trình tự đều có đặc điểm giống nhau như sau:

Trang 11

• Tất cả 20 mẫu được giải trình tự với mồi ITS5 đều có khoảng 650 nucleotide phía bên trái có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng rất xấu (nhiễu)

• Tất cả 20 mẫu được giải trình tự với mồi ITS4, trái lại, đều có khoảng 100 nucleotide phía bên phải có chất lượng rất tốt, phần còn lại có chất lượng rất xấu (nhiễu)

• Đối với tất cả 20 sản phẩm PCR, vị trí phân chia 2 vùng có trình tự chất lượng tốt – xấu của mỗi cặp giải trình đều giống nhau như minh họa đối với mẫu Cacao-BB5 ở Hình 4

Hiện tượng này xuất hiện khi giải trình tự trực tiếp một sản phẩm PCR mà trên sản phẩm này chứa vị trí có trình tự không đồng nhất Hậu quả, DNA polymerase sẽ không thể đọc đúng trình tự tính từ phái hạ lưu của vị trí không đồng nhất

Không giống như nấm túi, nấm noãn oomyces như Phytophthora có bộ gen lưỡng bội Vị trí không đồng nhất có thể được xem là một locus dị hợp tử, hậu quả của sinh sản hữu tính của một loài Phytophthora nhóm dị tản (Heterothalic)

> Cacao-PB5

Định dạng
Số trang	16
Dung lượng	847,5 KB