Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc thích hợp trong phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

Các nhà khoa học của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn trong phân lập các bệnh do nấm Phytophthora gây nên vì Phytophthora dễ bị cạnh tranh bởi nhiều loại nấm khác trên mô bệnh và đặc điểm

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chuyên đề 3

Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc thích hợp trong phân lập tác

nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước

Mã số: ĐTĐL.2011- G/63

Chủ trì đề tài: ThS Nguyễn Hồng Tuyên

Hà nội, 2012

1 Đặt vấn đề

1.1 Tính cấp thiết của chuyên đề

Việt nam là một đất nước với hai vùng khí hậu khác biệt, vùng khí hậu cận nhiệt đới thuộc phía Bắc của đèo Hải Vân với 4 mùa khác nhau rõ rệt, trong khi đó vùng khí hậu nhiệt đới ở phía Nam chỉ có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô Những rặng núi ở Miền Trung và Miền Bắc của Việt nam làm tăng thêm sự đa dạng của các vùng khí hậu cho phép nhiều loài cây trồng khác nhau phát triển trên toàn quốc Vùng khí hậu cận nhiệt đới của phía Bắc tiếp giáp với các dãy núi cho phép sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng nhiệt đới và ôn đới ở các vùng lân cận Các vùng khác nhau của Việt Nam cũng đem lại nền khí hậu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài

Phytophthora, nấm Phytophthora là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế lớn cho rất nhiều

loại cây trồng khác nhau trên toàn quốc Bệnh do Phytophthora được báo cáo là nguyên

nhân gây bệnh cháy lá, sùi thân, thối nõn, thối quả và thối rễ trên nhiều loại cây trồng như cây ăn quả, rau, cây lấy gỗ và cây trồng nông nghiệp khác, gây sự giảm lớn về năng suất và thiệt hại kinh tế đáng kể Bệnh sương mai cà chua và khoai tây do nấm

Phytophthora infestans gây ra là bệnh chính của những cây trồng này ở vùng đồng bằng

sông Hồng Tất các giống cà chua bị nhiễm bệnh này đều dẫn đến giảm 30% - 70% năng suất

Các nhà khoa học của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn trong phân lập các bệnh

do nấm Phytophthora gây nên vì Phytophthora dễ bị cạnh tranh bởi nhiều loại nấm khác trên mô bệnh và đặc điểm trên môi trường nhân tạo nấm Phytophthora mọc chậm

hơn so với các loại nấm khác, mà các hoá chất sử dụng cho môi trường chọn lọc khó tìm để mua Việc nghiên cứu sử dụng mồi bẫy và các môi trường thông dụng trong đó

có cho thêm chất kháng sinh, cũng như một số thuốc diệt nấm khác cạnh tranh trên môi

trường phân lập làm tăng khả năng phân lập đối với nấm Phytophthora Tuy nhiên mỗi loài nấm Phytophthora đều có đặc điểm riêng nên ở mỗi loài có phương pháp phân lập

khác nhau Việc phân lập thành công sẽ tạo nguồn gen để nghiên cứu đặc điểm sinh

học, sinh thái và các nghiên cứu cơ bản khác đối với nấm Phytophthora từ đó làm cơ sở

cho nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả Vì vậy, chúng tôi xin được

thực hiện chuyên đề: “Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc

thích hợp trong phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao”.

1.2 Tổng quan tài liệu trong, ngoài nước

1.2.1 Hoá chất chọn lọc được dùng trong môi trường phân lập

Một trong những nguyên lý cơ bản của sự phân lập chọn lọc là sử dụng một hoặc nhiều hoá chất trong môi trường để ngăn cản sự phát triển của cả nấm và vi khuẩn tạp

nhiễm nhưng ít hoặc không ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm Phytophthora.

Trước năm 1960, các loại hoá chất chọn lọc khác nhau dùng trong môi trường phân lập có rất ít để lựa chọn Axít hoá một môi trường PDA có độ pH 4 với 25% axit lactic (khoảng 3 giọt trên một đĩa môi trường) để diệt sự phát triển của vi khuẩn là phương pháp thích hợp cho sự phân lập của nhiều loại nấm nhưng thường không có

hiệu quả để phân lập chọn lọc hầu hết các loại nấm Phytophthora, vì sự nảy mầm của

bào tử thường kém ở giá trị pH thấp Môi trường không có kháng sinh chọn lọc như môi trường nước agar (WA) là môi trường sử dụng có hiệu quả nhất để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Sử dụng một tế bào Van Tiegham, tế bào này buộc sợi nấm

Phytophthora mọc dưới bề mặt của agar, hướng tới giải phóng sợi nấm khỏi vi khuẩn

bởi vì vi khuẩn không thể phát triển nhanh khi chìm ngập sâu

Trước năm 1960, phương pháp phân lập nấm Phytophthora bằng sử dụng vật

liệu bẫy (Các mô cây dễ nhiễm bệnh) để bẫy nấm từ mô cây bệnh hoặc từ đất trên môi trường nước agar (WA) hoặc môi trường agar yếu còn hạn chế Những sáng kiến mới đem lại khi Eckert, J.W đã thực hiện thử nghiệm liên tục hợp nhất nhiều loại hoá chất chống lại nhiều hoặc một vài loại nấm khác Ông ấy đã ghi nhận trên môi trường cho

những kháng sinh hiện có thì những loài Phytophthora và Pythium mọc tốt, ngược lại

một vài loại nấm đất khác không mọc

1.2.1.1 Pimaricin

Việc khám phá ra những kháng sinh đặc hiệu có thể kháng được nhiều loại nấm

khác như: pimaricin, nystatin đã làm thay đổi trong phương pháp phân lập nấm

Phytophthora và khuyến khích nghiên cứu trên toàn thế giới về những môi trường chọn

lọc để phân lập nấm Phytophthora loại bỏ sự phát triển của vi khuẩn và các loại nấm

khác Môi trường của Eckert và Tsao sử dụng là những môi trường nghèo dinh dưỡng như: bột ngô agar (cornmeal agar) kết hợp với pimaricin (chất kháng nấm ) lượng (100µg/ ml) và penicillin lượng (50µg/ml) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram dương và polymyxin lượng (50µg/ml) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram âm Thông thường được gọi là môi trường 3P nhưng chỉ phân lập được đối với các mô bệnh mới nhiễm, còn không phân lập được nấm từ đất và mô bệnh đã cũ Còn có một vài tài liệu cho rằng môi trường 3P không phải là môi trường chọn lọc vì với lượng pimaricin (100µg/ ml) ức chế sự nảy mầm của bào tử

Haas, 1964 đã phát hiện đầu tiên sử dụng môi trường với liều lượng pimaricin

thấp (2µg/ ml) có thể phân lập được nấm P sojae (P megasperma var sojae) từ đất.

Tiếp theo báo cáo của Tsao, 1983 đã chỉ ra pimaricin 10 µg/ ml cho phép bào tử của

một vài loại nấm Phytophthora từ mẫu đất nảy mầm, ngược lại dùng với lượng

pimaricin cao 100 µg/ml sẽ ngăn cản bào tử nảy mầm Theo Larkin et al., 1995 tỷ lệ

nảy mầm hậu bào tử của nấm P parasitica và bào tử nang của P palmivora trên môi

trường bột ngô agar kết hợp với pimaricin với các liều lượng 1,5 ; 3; 6 và 12 µg/ml thì

cao hơn trên môi trường bột ngô agar không kết hợp với pimaricin Ở liều lượng 25 , 50

và 600 µg/ml giảm tỷ lệ nảy mầm 20 – 30% so với đối chứng Trong điều kiện các mô cây bệnh còn rất mới, ở liều lượng pimaricin lớn hơn 10µg/ ml sợi nấm không bị ức chế phát triển Các mô cây bệnh đã cũ hoặc nguồn từ đất, các nguồn này chủ yếu tồn tại dưới dạng bào tử nang, bào tử hậu, du động bào tử, liều lượng pimaricin dùng để phân lập phải thấp hơn hoặc bằng 10 µg/ml Nhiều báo cáo cho rằng ở liều lượng 5 µg/ml thì hiệu quả hơn 10 µg/ml

1.2.1.2 Nystatin

Mặc dù pimaricin là kháng sinh chọn lọc, nystatin cũng là một kháng sinh đặc

hiệu, có hoạt động tương tự pimaricin nhưng kém hiệu quả hơn và có phạm vi hoạt động hẹp (Tsao, 1983) Nystatin được sử dụng thay thế pimaricin trên một vài môi trường, đặc biệt một vài khu vực trên thế giới nơi mà pimaricin không có sẵn Cả hai loại kháng sinh pimaricin và nystatin không hoạt động dưới ánh sáng vì vậy đĩa môi trường phải được đặt trong điều kiện tối (Ploetz and Parrado, 1988)

1.2.1.3 PCNB (100 µg/ ml)

PCNB là một thuốc trừ nấm đất với độ tan trong nước thấp, được kết hợp với môi trường của Tsao (Tsao và Ocana, 1969) vì nó là thuốc diệt được nhiều loại nấm

nhưng không diệt Phytophthora và Pythium Đặc biệt PCNB được dùng để sử lý hạt chống lại Rhizoctonia và như là môi trường chọn lọc để phân lập nấm Fusarium (Kerr,

1963) PCNB khử được sự phát triển của nhiều loại nấm nhưng không diệt

Phytophthora và Pythium Ví dụ PCNB có hiệu quả cao trong phân lập nấm P parasitica var nicotianae và P cinnamomi từ đất (Jeffers và Martin, 1986)

1.2.1.4 Benomyl là một thuốc trừ nấm (Tên thương phẩm như là Benlat) có khả năng

thấm sâu và di chuyển lên trên cây, thường được sử dụng thay thế hoặc bổ sung cho pimaricin, ở liều lượng 10 - 25 µg/ml (Follin, 1971; Schmitthenner, 1973; Papavizas et al., 1981; George và Miholland, 1986b) Nó có thể khử được nhiều loại nấm đất (nhưng

không diệt Phytophthora) Nó có phổ hẹp hơn so với pimaricin Ở liều lượng benomyl 10µg/ml bị ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm P fragariae nhưng bị ức chế

mạnh ở liều lượng 100 µg/ml Môi trường nước quả V8 kết hợp với benomyl có thể

phân lập được nấm P cactorum nhờ ngăn cản các vi sinh vật khác (Harris và Bielenin,

1986) Benomyl là thuốc trừ nấm chọn lọc có khả năng diệt được nhiều loại nấm nhưng

không diệt được các loại nấm thuộc zygomycetes (Ví dụ như: Mortierella, Mucor,

Rhizopus) hoặc những loại của họ Porosporae thuộc nấm bất toàn như: Alternaria, Bipolaris, Drechslera, Stemphylium hoặc một số loại khác (Bollen và Fuchs, 1970;

Edgington et al., 1971) Nó thì không kháng khuẩn Benomyl ít hòa tan trong nước, nó

có thuận lợi không bị phân huỷ hoặc mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, vì vậy

có thể cho cùng vào môi trường để hấp dưới dạng bột thấm nước hoặc trong dung dịch bột thấm nước(Masago et al., 1977)

1.2.1.5 Iprodione là thuốc trừ nấm – ergosterol (C28H440), ở liều lượng 100 và 400 µg/

ml có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Pythium proliferum, nấm này không nhạy cảm với chất hymexazol, một thuốc trừ nấm tương đối độc với các loài Pythium nhưng

ít độc với các loài Phytophthora Ví dụ: khi môi trường P10VPH hoặc P10 ARPH (H là hymexazol liều lượng 50 µg/ml , R là rifampicin liều lượng 10 µg/ml và A là ampicillin

liều lượng 250 µg/ml) được cộng với iprodione sẽ làm tăng tỷ lệ phân lập nấm P.

cinnamomi từ cây bơ con bị bệnh (Solel và Pinká, 1984) Tuy nhiên ipodione sử dụng

không hiệu quả để phân lập một số loại nấm Phytophthora khác.

1.2.1.6 Vancomycin là môi trường chọn lọc (P10VP) của Tsao và Ocana, 1969 được thay thế cho polymyxin và penicillin vì phổ hoạt động của nó rộng có thể chống lại được cả hai loại vi khuẩn nhuộm gram dương và gram âm Môi trường đã được khử trùng và làm nguội ở nhiệt độ 45 – 480C trước khi hoà lẫn hoá chất vào trong và đổ ra đĩa sạch, vì nhiều loại kháng sinh bị hỏng khi hấp ở nhiệt độ 1210C

1.2.1.7 Axít Gallic (425µg/ml) làm giảm kích thước khuẩn lạc của những nấm không

thuộc Pythiaceous mọc nhanh trên môi trường và được sử dụng để phân lập

Phytophthora (Flowers và Hendrix, 1969) Axít Gallic không ức chế sự nảy mầm của

du động bào tử nấm P fragariae (George và Milholland, 1986b) Tuy nhiên axit Gallic

không được sử dụng rộng rãi và lâu dài (Tsao, 1983) khi mà trên thị trường có sẵn

P10VP (Tsao và Ocana, 1969) và P10 ARP (Kannwischer and Mitchell, 1978)

1.2.1.8 Một số chất kháng sinh (ampicillin, penicillin, rifampicin)

Sự lựa chọn kháng sinh thích hợp và liều lượng dùng là quan trọng trong sự phân lập có chọn lọc Tsao, 1983 đã đưa ra hầu hết các kháng sinh kháng khuẩn đều phù hợp

cho phân lập các loài Phytophthora như: ampicillin, penicillin, rifampicin (hoạt động

khống chế vi khuẩn gram âm) và vancomycin (hoạt động diệt cả vi khuẩn gram dương

và gram âm) Theo báo cáo đầu tiên của Masago et al., 1977 sử dụng rifampicin (10 µg/ ml) kết hợp ampicillin (500 µg/ml) Kannwischer và Mitchell (1978) thay thế vancomycin trong môi trường của Tsao và Ocana (1969) bằng rifampicin (10µg/ml) và

ampicillin (250µg/ml) cho sự phân lập nấm P parasitica var nicotianae từ đất Jeffers

và Martin, 1986; Pittis và Colhoun, 1984 trích dẫn rifampicin và ampicillin hơn hẳn vancomycin Việc có nên hoặc không nên thay thế vancomycin bằng rifampicin và

ampicillin là tốt nhất để phân lập tất cả Phytophthora từ đất vẫn còn là câu hỏi có nhiều

tranh cãi Trong một vài nguồn từ đất thì vancomycin có hiệu quả hơn (P.H Tsao, unpublished) Rifampicin và ampicillin thì giá rẻ hơn vancomycin (Jeffers và Martin, 1986)

Nghiên cứu tổng hợp của Jeffers và Martin, 1986 về ảnh hưởng của môi trường bột ngô agar bổ sung với các kháng sinh khác nhau cho sự phân lập và phát triển của

một vài loài nấm Phytophthora từ nguồn đất trên đồng ruộng đã chỉ ra giảm liều lượng

pimaricin từ 10 xuống 5 µg/ml, cộng với hymexazol 50µg/ml và thay thế vancomycin bằng ampicillin (250µg/ml ) và rifampicin (10µg/ml) đã tăng số lượng đơn vị khuẩn lạc

(cfu) của P cinnamomi 8 lần và P parasitica var.nicotianae 2,9 lần Sự kết hợp

ampicillin và rifampicin thay thế cho vancomycin (200µg/ml) đã giảm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn tạp nhiễm từ 43 xuống 0 khi phân lập nguồn bệnh từ đất vườn quả

Rifampicin (10µg/ml) giảm khoảng một nửa sự nảy mầm của du động bào tử và

sự phát triển của ống mầm nấm Phytophthora, nhưng là hợp chất ngăn cản hoàn toàn sự

tạp nhiễm của vi khuẩn (George và Milholland, 1986b)

Phân lập nấm P infestans từ mô cây bệnh, đặc biệt là mô bệnh đã cũ luôn luôn gặp khó khăn Hohl (1991a) đã báo cáo có thể phân lập nấm P infestans từ mô cây

bệnh trên môi trường lúa mạch đen (pH 5.5) chứa griseofulvin (20 µg/ml), nystatin (19 µg/ml), benlate (10µg/ml), methoxypurine (5µg/ml), penicillin G (48µg/ml), nalidixic acid (5µg/ml), neomycine (30µg/ml) và 8-azoguanine (40 µg/ml) (Hohl 1991a) Môi

trường nuôi cấy này cho phép tỷ lệ mọc của 6 isolate nấm P.infestans là 42 -56% (So sánh với môi trường lúa mạch đen không có kháng sinh) nhưng không mọc Mucor

mucedo, Trichoderma viridans, Trichoderma alba, Fusarium spp, Acremonium, Byssochlamys nivea và các loài Pythium Drenth et al (1995) sử dụng môi trường lúa

mạch đen chứa ampicillin (200 µg/ml), fenpliclonil (10µg/ml), pimaricin (10 µg/ml) và rifampicin (30 µg/ml)

1.2.1.9 Rose bengal (60µg/ml) được sử dụng trong môi trường phân lập để hạn chế sự

phát triển của vi khuẩn (Hendrix và Kuhlman, 1965) Mặc dù hỗn hợp này là chất

kháng khuẩn, nó cũng gây độc cho sự nảy mầm của bào tử nấm Phytophthora Rose bengal đặc biệt ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Phytophthora khi sử dụng kết hợp

với streptomycin Theo Papavizas et al (1981) độ độc của rose bengal lớn hơn khi sử dụng kết hợp với benomyl hoặc hymexazol Rose bengal có lợi thế sử dụng hơn so với những chất kháng sinh có sẵn như: ampicillin, rifampicin và vancomycin (Donald C.Erwin và Olaf K.Ribeiro, 1996)

Mặc dù các chất kháng sinh streptomycin, chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline, neomycin và chloramphenicol thông thường được sử dụng trong nhiều môi trường chọn lọc để phân lập nhiều loại nấm, chúng lại thường kìm hãm sự phát triển

của nhiều loại nấm Phytophthora hơn nhiều so với các loại nấm thích hợp nhất được đề

cập ở trên (Dhingra và Sinclair, 1985)

1.2.1.10 Streptomycin là kháng sinh phổ rộng kìm hãm sự phát triển của cả vi khuẩn

nhuộm gram âm và gram dương, nhưng nó gây độc hầu hết các loại nấm Phytophthora

(Tsao, 1983), vì vậy nó không là sự lựa chọn tốt cho môi trường chọn lọc Streptomycin

kìm hãm phát triển của nấm P trophthora và P heveae nhưng chỉ kìm hãm một chút đối với nấm P capsici, P cinnamomi và P parasitica (Eckert và Tsao, 1962) Streptomycin kìm hãm hoàn toàn sự phát triển của nấm P infestans (Ersek, 1975) và một vài loài nấm Phytophthora khác (Cohen và Perl, 1973) Streptomycin ở liều lượng

10 – 50 µg/ml trong môi trường dung dịch hạt lúa mì, hoàn toàn ức chế sự phát triển

của nấm P infestans, tuy nhiên môi trường đó để sau 4 ngày mới sử dụng, sự mọc chỉ

giảm một nửa Khi streptomycin được cộng vào để lây nhiễm bào tử nang hoặc du động bào tử, nó sẽ ngăn cản sự hình thành vết bệnh trên lá khoai tây nhưng không tác động sau khi đã xuất hiện sự nhiễm bệnh

Streptomycin sẽ được sử dụng với sự thận trọng trong môi trường phân lập

(Cohen và Perl, 1973) Sợi nấm Phytophthora và nhiều thành viên khác của Oomycetes

bắt giữ streptomycin nhanh hơn các loại nấm khác Sự hấp thu lớn hơn 2 - 9 lần ở

những loài nấm Phytophthora và Pythium hơn các thành viên của Mucorales,

Cuninghamella echinulata Điều này là kết quả của hoạt động hấp thu của vách tế bào

không kitin trong Phytophthora (Voros, 1965)

1.2.1.11 Chloramphenicol

Mặc dù Chloramphenicol được báo cáo có hiệu quả trong một số môi trường,

nhưng có thể gây độc cho sự phát triển sợi của nhiều loài nấm Phytophthora (Tsao,

1983) Vì vậy, nó không là lựa chọn thích hợp cho môi trường chọn lọc Chloramphenicol ở liều lượng 1µg/ml trong môi trường nhân tạo làm giảm sự phát

triển của 28 isolate của nấm P cinnamomi 11 – 75% so với đối chứng không có

chloramphenicol Sự phát triển tia của 4 isolate đã bị ức chế hoàn toàn ở liều lượng 25 µg/ml và bị ức chế 70 – 80% ở 5 µg/ml (Leary et al 1982) Tuy nhiên, một số báo cáo lại cho thấy chloramphenical ở 10 µg/ml (Shew và Benson, 1982) hoặc ở 30 µg/ml (Sneh và Katz, 1988) có chức năng như là môi trường chọn lọc có hiệu quả Hollomon

(1965) sử dụng chloroamphenicol (50 µg/ml ) để phân lập nấm P infestans từ lá khoai tây Rahimian và Mitchell (1988) đã sử dụng chloramphenicol để phân lập P cactorum

từ đất Theo báo cáo của Ersek (1975), chloramphenicol ở 100, 200 và 400 µg/ml làm tăng độc tính đối với sự phát triển của sợi nấm nhưng không độc với sự nảy mầm của

bào tử nang hoặc du động bào tử của nấm P infestans trên cả hai môi trường và lát

mỏng khoai tây

1.2.1.12 Hymexazol ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm Pythium, những loài nấm

này tồn tại trong đất và vùng xung quanh rễ của hầu hết các cây Chúng thường hạn chế

sự nảy mầm và gây chết cây con, trong một vài trường hợp gây chết cây trưởng thành Hợp chất kháng nấm pimaricin hoặc benomyl sử dụng trong môi trường phân lập nấm

Phytophthora đều không có khả năng ức chế được nấm Pythium, trong khi đó nấm Pythium cũng là trở ngại lớn trong quá trình phân lập Phytophthora do khả năng mọc

của chúng trên môi trường nhanh hơn các loài Phytophthora Kết quả, các khuẩn lạc

Phytophthora có thể bị mọc chùm lên và mờ bởi Pythium Năm 1977, thuốc trừ nấm

hymexazol được thương mại hoá ở Tachigaren, được xác định có nhiều độc tính đối với

nhiều loài Pythium hơn một vài loài Phytophthora (Masago et al.1977)

Mặc dù hymexazol là hoá chất chọn lọc có hiệu quả cho sự phân lập của một số

loài Phytophthora, nó vẫn có độc tính cao với một số loài Phytophthora nhất định và

ngược lại không kìm hãm tất cả các loài Pythium Ví dụ, hymexazol không ức chế được

sự phát triển của nấm Pythium proliferum (Solel và Pinkas, 1984) hoặc Pythium vexans (Tsao và Guy, 1977) Chỉ có 6 trong 12 loại Pythium phân lập từ đất cây rừng là bị kìm

hãm bởi hymexazol (E.M.Hansen et al., 1979) E.M.Hansen et al., 1979 tiếp tục nghiên cứu sử dụng hymexazol để phân lập từ đất rừng, kết quả cho thấy nó cũng kìm hãm sự

phát triển của nấm Phytophthora lateralis và Phytophthora cactorum và một số nấm khác không phải là Phytophthora

Hymexazol kìm hãm rất mạnh đối với sự phát triển của nấm P infestans, P.

phaseoli, P porri, P syringae, làm chậm sự phát triển của nấm P hibernalis và P lateralis, nhưng nhẹ đối với sự mọc của P fragariae và P ilicis và kìm hãm không

nhiều đối với nấm P cactorum và P pseudotsugae (Ho, 1987)

1.2.2 Một số môi trường đặc hiệu để phân lập nấm Phytophthora

1.2.2.1 Môi trường 3-P Medium

Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) được hấp ở 1210C và để nguội khoảng 450C

bổ sung với pimaricin (100ppm), penicillin (50ppm) và polymyxin (50 ppm) Đĩa được bảo quản lạnh trong điều kiện tối vì pimaricin rất nhậy cảm với ánh sáng Đây là môi trường chọn lọc đầu tiên sử dụng pimaricin kháng nấm và có hiệu quả trong phân lập

mô cây bệnh còn mới chứa các loài Phytophthora tồn tại ở dạng sợi nấm, nhưng không

từ mẫu đất bệnh mới chứa nấm Phytophthora tồn tại ở dạng bào tử Sử dụng pimaricin

(100ppm) ở liều lượng cao ức chế bào tử nảy mầm (Tsao, 1983)

1.2.2.2 Môi trường P 10 VP (Tsao và Ocana, 1969)

Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) được hấp ở 1210C và để nguội khoảng 450C

bổ sung với liều lượng thấp pimaricin (10ppm), vancomycin (200ppm) và pentacholoronitrobenzene (100ppm) đĩa được giữ trong tối vì Pimaricin nhậy cảm với ánh sáng Môi trường này có hiệu quả phân lập mô bệnh từ đất và mô cây vì giảm liều lượng pimaricin không ức chế sự nảy mầm của bào tử Hymexazol (25-50mg/lit) được cho vào sau khi hấp để diệt một vài loài Pythium (Masago et al.,1977; Tsao và Guy, 1977)

1.2.2.3 Môi trường sử dụng Hymexazol để phân lập Phytophthora loại bỏ Pythium

(Masago et al.,1977)

Môi trường PDA (1%agar) được cộng thêm benomyl (10ppm), pentachloronitrobenzene (25ppm), nystatin (25ppm), ampicillin (500ppm), rifampicin (10ppm), hymexazol (25-50 ppm) Hymexazol khử nhiều loài những không phải tất cả

các loài Pythium Nhiều loài Pythium có khả năng kháng, nhưng một vài loài rất nhậy

cảm khi phân lập trên môt trường chứa hymexazol Môi trường bột ngô hoặc V8 thì tốt hơn môi trường PDA

1.2.2.4 Môi trường P 10 ARP (Kannwischer và Mitchell, 1978) và P 5 ARP (Papavizas

et al., 1981; Jeffers và Martin, 1986)

Môi trường bột ngô sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ hạ xuống 450C được cộng thêm với pimaricin (10ppm), ampicillin (250ppm), rifampicin (10ppm) và pentachloronitrobenzene (100ppm) Jeffers và Martin (1986) đã sử đổi Môi trường

P10ARP bằng giảm pimaricin từ 10 ppm xuống 5 ppm để phân lập P cactorum

(P5ARP) Thêm rifampicin để khử vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn lọc

P10ARP và P5ARP để phân lập hầu hết các loài Phytophthora Hymexazol có thể được cộng 25 – 50 ppm sau khi hấp khử trùng để khử một vài loài Pythium (Masago et al.,1977; Tsao và Guy, 1977) mà không ảnh hưởng đến các loài Phytophthora mục tiêu.

1.2.2.5 Môi trường sử dụng Benomyl (Sneh và Katz, 1988)

Benomyl diệt được nhiều loại nấm (Sneh, 1972a; McIntosh, 1975) Bổ sung thành môi trường chọn lọc tổng hợp gồm: benomyl (25ppm), pentachloronitrobenzene (30ppm), penicillin (60ppm), chloramphenicol (30ppm), penicillin (60ppm), polymyxin

(50ppm) và hymexazol (25ppm) để phân lập P nicotianae và P citrophthora từ đất cây

có múi Chloramphenicol và polymyxin không là kháng sinh thích hợp

George và Milholland (1986b), bổ sung vào môi trường đậu hà lan gồm benomyl (10ppm), pimaricin (10ppm), rifampicin (10ppm) và hymexazol (50ppm) để phân lập

P fragariae từ mô cây.

Papavizas et al (1981), bổ sung vào môi trường bột ngô (Chuẩn pH 4.0) gồm benomyl (25ppm), pimaricin (5ppm), vancomycin (200ppm), penicillin (100ppm),

pentachloronitrobenzene (100ppm) và hymexazol (20ppm) để phân lập P capsici từ

đất

1.2.2.6 Môi trường sử dụng Chloramphenicol

PBNC (Rahimian và Mitchell, 1988), môi trường nước quả V8 yếu (40ml/lít) được đệm với CaCO3 (0,6g/lít) và bổ sung với yeast extract (0,2 g/lít), Sucrose (1,0 g/lít), cholesterol (0,01 trong 2 ml) N, N-dimethylformamide và agar (20g/lít) cộng thêm benlate (50% benomyl) (20µg/ml), pentachloronitrobenzene (27µg/ml), neomycin sulfate (100µg/ml) và chloramphenicol (10µg/ml) được dùng để phân lập một vài loài

Phytophthora Chloramphenicol và neomycin có thể độc với một số loài Phytophthora,

còn có hiệu quả để phân lập hầu hết các loài Phytophthora.

Môi trường PCH (Shew và Benson, 1982), là một môi trường tổng hợp gồm (g/lít) KH2PO4 (1,0g/lít), MgSO4 .7H2O (0,5g/lít), KCl (0,5g/lít), CaCl2 .H2O (0,01g/lít), FeSO4 H2O (0,02g/lít), thiamine-HCl (0,001g/lít), yeast extract (0,3g/lít), NaNO3 (1,0g/ lít), glucose (15,0g/lít), pentachloronitrobenzene (35,0g/lít), chloramphenicol (0,01

trong 2 ml của ethanol) và hymexazol (50,0g/lít), sử dụng để phân lập P cinnamomi.

1.2.3 Một số phương pháp phân lập sử dụng mồi bẫy nấm Phytophthora bằng sử

dụng các loại mồi bẫy khác nhau: lá cây ký chủ, vỏ quả…

Hầu hết các loài Phytophthora thường khó phân lập từ các mô đã bị thối rữa

hoặc từ đất, vì thế phương pháp bẫy được sử dụng trong gần nửa thế kỷ để hỗ trợ cho việc phân lập

Về nguyên tắc phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài

Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi

trường chọn lọc, vết bệnh do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên môi trường nhân tạo chọn lọc Đặc điểm vết bệnh trên quả táo do nấm Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium và vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn Một số cây ký chủ được sử dụng để bẫy nấm Phytophthora:

quả táo, quả ca cao xanh, quả lê, quả bơ, quả chanh, cánh hoa cẩm chướng, lá thông, mẩu lá đậu tương, cây đậu lupin

Kỹ thuật bẫy lợi dụng sự gây bệnh của những loài nấm Phytophthora trên cây ký

chủ hoặc mô cây ký chủ, sự sản sinh nhanh bào tử nang hoặc du động bào tử trong đất hoặc trong mô cây bệnh, các du động bào tử sẽ bơi hướng tới nguồn dinh dưỡng như là

rễ hoặc mô cây Du động bào tử sẽ di chuyển bám dính vào một vị trí hấp dẫn hoặc vị trí đặc biệt trước khi chúng bọc bào nang Khả năng bám dính lên trên bề mặt là đặc

điểm đặc trưng của nấm Phytophthora Nấm Phytophthora phát triển nhanh trên mồi

bẫy và giúp tăng hiệu quả phân lập (Erwin, D.C and Riberrio O.K,1996)

Phân tích nấm Phytophthora từ đất bệnh bằng cách pha loãng trong bình thuỷ

tinh hoặc cốc nhựa, sử dụng mồi bẫy là cây ký chủ, các loại quả được lát mỏng như tờ giấy thả lên trên mặt nước Tỷ lệ nước pha loãng đất lớn gấp 4 lần, mục đích để pha loãng các tạp chất có trong đất như: phân bón, thuốc sinh học…những chất này có thể

gây độc cho nấm Phytophthora Sử dụng 1/3 – 1/2 mồi bẫy được thả nổi trên mặt nước

vì đặc điểm của du động bào tử là bơi lên và cư trú trên bề mặt nước (Carlile, 1983) Sau khi lưu giữ vài ngày, mồi bẫy thả nổi trên mặt nước thường biến màu nâu Khử trùng bề mặt mồi bẫy bằng chất tẩy hypochlorite natri hoặc 70% ethanol, cắt rìa mô bị bệnh đặt trên môi trường chọn lọc hoặc nếu không có sẵn môi trường chọn lọc thì đặt trên môi trường WA Mặc dù phương pháp sử dụng mồi bẫy bằng mẩu quả hoặc lá cây

ký chủ đã được sử dụng rộng rãi, những báo cáo gần đây chỉ ra rằng sử dụng mồi bẫy

nấm P.parasitica bằng những cây con hoặc lá mầm cây táo thì có hiệu quả cao hơn so

với quả táo và quả lê (Jeffers và Aldwinckle, 1987)

Mặc dù nước tự do thích hợp cho sự hình thành bào tử nang, nhưng thiếu sự thông khí trong nước làm hạn chế sự hình thành bào tử nang (Duniway, 1975)

Duniway đã đề xuất sự phân lập nấm Phytophthora từ dung dịch đất bệnh bằng sử dụng

mồi bẫy là các mô cây phải được thả nổi trên mặt nước, vì nếu mồi bẫy bị ngập trong nước sẽ hạn chế sự hình thành bào tử nang và du động bào tử, mẫu đất có độ ẩm cao hơn mức trung bình trước khi cho ngập nước trong cốc có thể làm tăng sự phân lập nấm

Phytophthora bằng phương pháp bẫy

P.sojae sản sinh bào tử nang và du động bào tử sau khi đất thu về hong khô

trong không khí, được làm ẩm trở lại và đặt ở nhiệt độ phòng 1 – 2 tuần, cuối cùng đổ ngập nước ít nhất 1 giờ Phương pháp này làm tăng sự sản sinh các bào tử nang trong đất ẩm và sau đó phân lập mẩu lá đậu tương được thả bẫy trong dung dịch đất Khi mẩu

lá được thả nổi trên dung dịch đất trong khoảng thời gian ngắn (Khoảng 1 giờ) thì tỷ lệ

phân lập được nấm P.Sojae thường xuyên hơn so với loài Pythium, những nếu thả mồi bẫy (mẩu lá đậu) lâu hơn trong dung dịch đất thì các loài Pythium cũng được tìm thấy

trên lá mồi bẫy (Canaday và Schmitthenner, 1982) Hầu hết các báo cáo khác đều khuyến cáo đặt mẩu lá trong nước trong khoảng thời gian dài hơn (24 đến 48 giờ) trước khi chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu Miếng lá cây bạch đàn được đặt trong dung dịch đất 24 giờ trước khi chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu để phân lập

P.cinnamomi (Erwin, D.C and Riberrio O.K, 1996).

1.2.4 Phân lập nấm Phytophthora từ mô cây

Chuẩn bị cẩn thận giúp cho việc phân lập nấm Phytophthora từ mô cây bị bệnh

thành công Tuy vậy nếu sử dụng môi trường chọn lọc thì việc khử trùng bề mặt có thể không cần thiết Đặt rễ, thân hoặc lá đã rửa sạch (Không khử trùng bề mặt) vào trong một hố nông chứa nước ao, dung dịch muối khoáng, nước triết đất hoặc nước đã khử

trùng để xác định rõ hoặc phát hiện nấm Phytophthora Nếu bào tử nang xuất hiện sau

24 – 48 giờ, chuyển lên môi trường đặc hiệu Mặc dù triệu chứng không luôn luôn đáng tin cậy, hầu hết tất cả các mô bệnh trên quả, vỏ cây hoặc lá có màu nâu, nâu tía hoặc đen, phụ thuộc vào độ rộng của sắc tố trên mô cây chủ Mô bị nhiễm bệnh thường

rắn và không mềm Mô bệnh mềm thường bị gây hại bởi các loài vi khuẩn, Rhizopus hoặc Pythium.