Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn streptomyces sp gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu thập từ miền bắc việt nam

Trên thế giới, Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây đã được phân loại dựa trên mô tả đặc điểm hình thái các chủng phân lập từ mô bị bệnh kết hợp với kiểm tra sự có mặt của các gen gây

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp hà nội

-

Nguyễn thị thủy

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN

Streptomyces sp GÂY BỆNH GHẺ CỦ KHOAI TÂY

THU THẬP TỪ MIỀN BẮC VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ công trình nào

Hà Nội, ngày 16 tháng 4 năm 2012

Học Viên

Nguyễn Thị Thủy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được

sự giúp đỡ tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài trường

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo

TS Nguyễn Thị Phương Thảo, giảng viên Bộ môn CNSHTV, Khoa Công nghệ sinh học- Trường Đại học nông nghiệp Hà Nội là người đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo; cán bộ nghiên cứu của bộ môn CNSH Thực Vật, trường

ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Hà Viết Cường- Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, các cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp, GS Wanner- Trung tâm khoa học cây trồng Mỹ đã phối hợp, tư vấn, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 4 năm 2012

Học Viên

Nguyễn Thị Thủy

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích: 2

1.2.2 Yêu cầu: 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học: 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: 3

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về bệnh ghẻ thường khoai tây 4

2.1.1 Triệu chứng 4

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh 4

2.1.3 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh 5

2.1.4 Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và kí chủ 6

2.1.5 Biện pháp phòng trừ 6

2.2 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh và đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây 8

2.2.1 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh 8

2.2.2 Đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây 11

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Vật liệu 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Phương pháp phân lập - làm thuần (Loria, 1988) 17

3.2.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hoá: được tiến hành theo phương pháp của Wanner (2006), Loria và Davis 1988 17

3.2.3 Phương pháp đánh giá độc tính gây hại (Wanner, 2006) 19

3.2.4 Phương pháp chiết tách DNA (Miniprep of bacteria genomic DNA (molecular Cell Physiology, 2002) 20

3.2.5 Phương pháp xác định các gen liên quan đến quá trình gây bệnh, định loài các isolate và giải trình tự 16s rRNA 21

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Streptomyces từ củ khoai tây bị bệnh ghẻ thường 25

4.2 Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập 25

4.3 Đặc điểm nuôi cấy của các isolate phân lập 30

4.4 Khả năng tiết sắc tố của các isolate phân lập được khi nuôi trên môi trường ISP6 35 4.5 Kết quả phân nhóm các isolate phân lập được 38

4.6 Đặc trưng phân tử của các isolate phân lập được 42

4.6.1 Định loài một số chủng phân lập được 43

4.6.2 Kết quả giải trình tự 16s rRNA của các chủng phân lập được 46

4.6.3 Kiểm tra sự có mặt của các gen liên quan đến quá trình lây bệnh ở các isolate phân lập được 51

4.7 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 55

IV KẾT LUẬN 59

V ĐỀ NGHỊ 61

Tài liệu tham khảo 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR cho kiểm tra các gen gây bệnh và định loài các isolate phân lập 21

Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR cho nhân dòng gen 16s rRNA 23

Bảng 3 Trình tự các cặp mồi đặc trưng các gen trên PAI và các đoạn trên rRNA 23

Bảng 4: Đặc điểm hình thái, hệ khuẩn ty của các isolate trên môi trường ISP2 26

Bảng 5: Đặc điểm hình thái các isolates trên môi trường ISP3 31

Bảng 6: Đặc điểm hình thái các isolate trên môi trường ISP4 33

Bảng 7: Khả năng tiết sắc tố của các isolate trên môi trường ISP6 35

Bảng 8: Đặc điểm hình thái của các nhóm khi nuôi cấy trên môi trường ISP2 39

Bảng 9: Kết quả định loài và kết quả kiểm tra các gen thuộc đảo gây bệnh của

12 isolate phân lập được 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình thái khuẩn lạc và hệ khuẩn ty của Streptomyces spp 6

Hình 2: Sơ đồ các gen thuộc đảo gây bệnh của S turgidiscabies 10

Hình 3: Các vùng biến động trên trình tự 16s rRNA của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây (Wanner, 2006) 14

Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Streptomyces trên môi trường thạch nước 25

Hình 4: Khả năng tiết sắc tố của các isolate phân lập được khi nuôi trên môi trường ISP6 37

Hình 5: Hình thái, bào tử của các nhóm phân lập được khi nuôi trên 42

môi trường ISP2 42

Hình 7: Kết quả nhân gen 16s RNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1 46

Hình 8: Kết quả nhân dòng 16s rRNA với cặp mồi 16sF1 và 16sR1 47

Hình 9: Kết quả kiểm tra sự có mặt gen TomA ở các isolate phân lập được, sử dụng cặp mồi Tom3, Tom4 54

Hình 10: Kết quả kiểm tra gen sự có mặt gen TxtAB ở các isolate phân lập được, sử dụng cặp mồi (TxtABF1, TxtABR1) 55

Hình 11: Kết quả kiểm tra sự có mặt gen Nec1 ở các isolate phân lập được, sử dụng cặp mồi (Nf, Nr) 55

Hình 12: Triệu trứng biểu hiện bệnh trên củ khoai tây sau 4 tháng lây nhiễm 58

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

ĐC (đối chứng)

ISP (international scab project): dự án nghiên cứu bệnh ghẻ quốc tế

Lad (ladder): Thang chuẩn

NST: nhiễm sắc thể

PAI (pathogenicity island): đảo gây bệnh

PYI (pepton yeast extract iron): môi trường pepton iron

WA (water agar): môi trường thạch nước

YME (yeast malt extract): môi trường cao mạch và cao nấm men

I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh ghẻ thường khoai tây do vi khuẩn gram dương sống trong đất thuộc

chi Streptomyces gây nên, là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở

tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á, Châu Phi (Wanner, 2006) Ở Mỹ, bệnh ghẻ là bệnh hại nghiêm trọng thứ 4 trên cây khoai tây (Hao và cộng sự, 2009) Bệnh cũng ảnh hưởng đến các cây trồng

có củ khác bao gồm, củ cải, cà rốt và khoai lang (Hill và Lazarovits, 2005)

Mức độ gây hại của bệnh ghẻ trên củ khoai tây biến động theo từng vùng, từng năm do kết quả tác động giữa môi trường, kiểu gen và tác nhân gây bệnh (Wanner, 2006) Trên củ khoai tây, các triệu chứng ghẻ thường biến động từ đốm nâu nổi trên vỏ củ đến hố đen tối kéo dài vài milimet vào thịt củ khoai tây Các tổn thương có thể nhỏ và rời rạc, hoặc có thể kết lại phủ rộng trên bề mặt của củ Do đó bệnh phá hủy hình dạng, chất lượng và giá trị thương mại của củ khoai tây, ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế (Hao và cộng sự, 2009)

Trên thế giới, Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây đã được phân loại

dựa trên mô tả đặc điểm hình thái các chủng phân lập từ mô bị bệnh kết hợp với kiểm tra sự có mặt của các gen gây bệnh và giải trình tự 16s rRNA Có 4 nhóm

loài gây bệnh lớn ở bắc Mỹ: S scabies, S acidiscabies, S europaeiscabiei, và

S stelliscabiei (Bouchek và cộng sự (2000); Healy và cộng sự (1991), Lambert

và Loria (1989) Nghiên cứu bệnh ghẻ trên khoai tây Pasco và cộng sự (2005)

cho rằng, có ít nhất 3 loài gây bệnh ghẻ củ khoai tây ở châu Âu: S scabies, S

europaeiscabies và S stelliscabies

Trong khi đó, ở Việt Nam, bệnh ghẻ khoai tây xảy ra ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên cả nước Các nghiên cứu về bệnh ghẻ khoai tây chủ yếu tập trung vào đánh giá tính mẫn cảm đối với bệnh, nguyên nhân phát sinh bệnh trên đồng ruộng (Dang Thi Dung và cộng sự, 2003) mà chưa có một công trình

nghiên cứu nào về thành phần loài gây bệnh cũng như các đặc trưng hình thái, hóa sinh, phân tử của các chủng gây bệnh này Vậy thành phần loài gây bệnh ghẻ củ khoai tây ở các vùng nghiên cứu của Việt Nam có đặc trưng như thế nào? Nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu về các đặc trưng hình thái, hóa sinh và phân tử của

các vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây ở Việt Nam cũng

như độc tính gây hại của chúng trên khoai tây chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh

giá đa dạng di truyền vi khuẩn Streptomyces sp gây bệnh ghẻ củ khoai tây

thu thập từ miền Bắc Việt Nam”

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích:

- Phân loại phân tử các vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu

thập từ miền Bắc Việt Nam

- Đánh giá đa dạng di truyền của chúng về hình thái, hóa sinh và phân tử (các gen gây bệnh)

1.2.2 Yêu cầu:

- Phân lập được vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ từ củ khoai tây bị bệnh

- Phân loại các mẫu phân lập được dựa trên đặc điểm hình thái, hóa sinh và giải trình tự 16s rRNA

- Kiểm tra sự có mặt của các gen liên quan đến khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu

- Đánh giá tính gây bệnh của các mẫu phân lập bằng lây nhiễm nhân tạo

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học:

Đề tài đã tạo ra được cơ sở dữ liệu tin cậy về các điểm hình thái, hóa sinh

và phân tử của vi khuẩn Streptomyces sp gây bệnh ghẻ thường trên khoai tây ở

Việt nam Đây là một công trình nghiên cứu có hệ thống, sử dụng các phương

pháp nghiên cứu hiện đại về phân loại, đánh giá di truyền vi khuẩn Streptomyces

sp và là công trình lần đầu tiên được tiến hành ở nước ta

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn:

Cơ sở dữ liệu gồm các thông tin có tính hệ thống và chính xác ở mức phân tử mà đề tài đã tạo ra sẽ là cơ sở để nghiên cứu và đề xuất các biện pháp

phòng chống và quản lý bệnh ghẻ thường khoai tây do vi khuẩn Streptomyces sp một

cách hiệu quả hơn

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về bệnh ghẻ thường khoai tây

Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới Hiện nay, bệnh đã trở thành vấn đề toàn cầu thách thức nỗ lực để giảm tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh Tuy không làm giảm năng suất nhưng bệnh ảnh hưởng lớn đến mẫu mã cũng như chất lượng của củ Do đó, bệnh làm giảm hiệu quả kinh tế của các vùng sản xuất khoai tây

2.1.1 Triệu chứng

Bệnh ghẻ thường gây nên rất nhiều triệu chứng khác nhau trên củ khoai tây Khi bệnh nhẹ, bệnh biểu hiện thành dạng lưới trên bề mặt củ Nghiêm trọng hơn bệnh gây ra những đám mô nổi, thô ráp Vết bệnh cũng có thể sẽ hõm sâu vài centimet Tổn thương cũng khác nhau về kích thước và hình dạng: rải rác hoặc bao trùm hầu hết bề mặt củ Khi củ tăng kích thước, tổn thương do bệnh ghẻ mở rộng và tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh (Reiette Gouws, 2006) Nhìn chung, tổn thương do ghẻ trên củ khoai tây có thể được phân thành 3 loại: một lớp bần trên bề mặt – ghẻ nâu đỏ; ghẻ lồi với những vết lồi khoảng 1-2 mm; ghẻ sao với những vết bệnh sâu đến 7mm (Hooker, 1981)

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh

Bệnh ghẻ thường củ khoai tây do vi khuẩn gram dương sống trong đất

thuộc chi Streptomyces gây nên Tác nhân sinh học chủ yếu là Streptomyces

scabies Tuy nhiên, có một số loài Streptomyces khác cũng gây ra bệnh ghẻ

thường trên những củ đang sinh trưởng và các cây trồng rễ cọc, bao gồm

S.turgidiscabies (Miyajima và cộng sự, 1998), S acidiscabies (Lambert và

Loria, 1989) và S europaeiscabiei và S stelliscabiei (Bouchek và cộng sự,

2000)

Streptomyces scabies tồn tại trên các tàn dư cây bệnh trong đất và gây hại

ở các bộ phận của cây nằm dưới mặt đất Chúng còn có thể sống sót qua bộ máy tiêu hoá của động vật và tồn tại trong phân động vật Bệnh lan truyền qua củ giống và qua nước tưới Tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của bệnh ghẻ củ khoai tây thay đổi từ năm này sang năm khác và từ vùng này đến vùng khác Bệnh gây hại mạnh ở những ruộng trồng khoai tây độc canh nhiều vụ liên tiếp

2.1.3 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh

Khuẩn lạc của Streptomyces rắn chắc, khô, dạng vôi, dạng nhung tơ Bề

mặt của khuẩn lạc có thể nhẵn, có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi như vỏ cam sành Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loại xạ khuẩn và tùy điều kiện nuôi cấy

Đường kính khuẩn lạc trung bình từ 0,5 – 2mm Khuẩn lạc của Streptomyces có

nhiều màu sắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, hồng, lam, nâu, tím… Màu sắc

của Streptomyces cũng là một tiêu chuẩn quan trọng để xác định tên của các loài

Streptomyces

Streptomyces có hệ khuẩn ti phát triển tốt, không có vách ngăn và không

tự đứt đoạn, bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha

bào, không có lông và giáp mô Streptomyces là vi khuẩn đa hình thái như: Dạng

hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ti hay phân nhánh thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ti thể (Mycelium) Đường kính của khuẩn ti

từ 0,2 – 2,5µm Kích thước và khối lượng của khuẩn ti thể thường không ổn định,

chúng phụ thuộc vào từng loài Streptomyces và từng điều kiện nuôi cấy

Ở đa số các loài Streptomyces, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình

phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Khuẩn ty cơ chất có thể cắm sâu vào môi trường từ 1 – 3 mm, chúng mọc thành một vòng nhỏ xung quanh khuẩn lạc, khuẩn ty cơ chất có thể ví như bộ rễ của thực vật, chúng hút chất dinh dưỡng để cung cấp cho toàn bộ cơ thể

Hình 1: Hình thái khuẩn lạc và hệ khuẩn ty của Streptomyces spp

2.1.4 Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và kí chủ

Không giống như hầu hết các vi khuẩn khác, Streptomyces gây bệnh có thể xâm nhập trực tiếp vào bên trong tế bào thực vật S scabies nhiễm trên củ trưởng

thành thông qua khí khổng hoặc trực tiếp qua biểu bì và sinh trưởng bên trong lớp

tế bào S.scabies cũng sử dụng một cấu trúc phân nhánh ngắn, được hình thành từ

sợi chính, vuông góc với sợi này để xâm nhiễm vào trong tế bào Điều này chứng

tỏ rằng, cấu trúc thứ cấp được hình thành từ sợi chính là những cấu trúc đặc thù cho sự xâm nhiễm Chính khả năng xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào thực vật có

thể giải thích một phần tại sao Streptomyces gây bệnh thành công trên cây có củ và các

cấu trúc dưới mặt đất khác mà các vi khuẩn khác không thể thực hiện được (Loria và cộng sự, 2003)

2.1.5 Biện pháp phòng trừ

Bệnh ghẻ thường củ khoai tây gây tác hại lớn về kinh tế cho các vùng sản xuất khoai tây Vì thế, nhiều biện pháp phòng chống đã được áp dụng nhằm làm giảm thiểu tác hại do bệnh gây ra: sử dụng vật liệu giống không mang mầm bệnh, kiểm soát lý tính đất, sử dụng thuốc hóa học, sử dụng biện pháp sinh học

và tác động đến quá trình tổng hợp thaxtomin… Các biện pháp này nếu được sử dụng phối hợp một cách thích hợp thì cũng có thể mang lại hiệu quả đáng kể

Trong các biện pháp phòng trừ sâu bệnh nói chung, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến hơn cả do thuốc hóa học rẻ tiền, khả năng tác động nhanh và phổ tiêu diệt rộng của nó Đối với bệnh ghẻ thường củ khoai tây thuốc hóa học được sử dụng để phòng chống bệnh ghẻ bằng cách xử lý củ và xử lý đất Việc xử lý thuốc hóa học trên củ ít có tác dụng, do đó thường không được khuyến cáo sử dụng Trong khi đó, xử lý đất thường được sử dụng hơn: Boocdo dùng với lượng 85kg/ha giảm được tác hại do bệnh ghẻ (Mader 1937; Dozokein, 1955), MnSO4 làm giảm ảnh hưởng của bệnh từ 70% còn 20% khi sử dụng 6kg/ha (Spatcz, 1955) Như vậy, có thể thấy thuốc hóa học có tác động hiệu quả trong phòng chống bệnh ghẻ củ khoai tây Tuy nhiên, biện pháp hóa học không phải là hoàn hảo vì bên cạnh ưu điểm trên thì thuốc gây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái do tiêu diệt cả các sinh vật có ích và điều nguy hiểm hơn

cả là gây ra hiện tượng kháng thuốc làm cho nhiều chủng gây bệnh mới xuất hiện với độc tính cao hơn

pH đất và độ ẩm đất là những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến khả năng gây hại do bệnh ghẻ thường gây ra trên củ khoai tây Bệnh hại nặng trong điều kiện nhiệt độ ấm áp, đất khô, pH trong khoảng 5.2- 8 Vì thế, việc kiểm soát độ ẩm đất, duy trì pH đất trong khoảng từ 5.0- 5.2 sẽ giảm được mức độ gây hại do bệnh ghẻ thường gây ra (Roger Osborn và Knoxfield, 1995)

Bên cạnh đó, biện pháp sinh học- một biện pháp được coi là bền vững và an toàn đối với môi trường sinh thái bằng cách sử dụng các vi sinh vật đối kháng cũng

đã được áp dụng Liu và cộng sự (1996); Ryan và cộng sự (1997), sử dụng các vi

khuẩn Streptomyces đối kháng để điều khiển bệnh ghẻ thường củ khoai tây nhờ sự

tổng hợp các kháng sinh ức chế sự sinh trưởng của tác nhân gây bệnh của các chủng

vi khuẩn này

Các biện pháp kiểm soát bệnh ghẻ củ khoai tây bằng phương pháp hóa học, điều khiển lý tính của đất, biện pháp sinh học đã mang lại những hiệu quả

nhất định trong việc làm giảm thiểu tác hại do bệnh ghẻ gây ra trên củ khoai tây Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn tồn tại những nhược điểm dẫn đến hiệu quả phòng trừ không triệt để Một hướng giải quyết có hiệu quả bền vững là sử dụng giống kháng bệnh Hướng này đã và đang được nghiên cứu phát triển Kobayashi và cộng sự, 2002 đã sử dụng những dòng khoai tây chỉ biểu hiện những vết ghẻ lồi nhỏ trên bề mặt để phát triển chương trình lai giống và đã chọn tạo được một giống được cho là có khả năng kháng bệnh cao, phẩm chất nông sinh học tốt Wilson và cộng sự (2009) đã sử dụng phương pháp chọn lọc

tế bào, dùng thaxtomin A như là yếu tố chọn lọc để chọn ra các dòng mang tính kháng cao Các cây tái sinh đều biểu hiện tính kháng đối với bệnh ghẻ cao hơn

rõ rệt so với cây không được chọn lọc Tuy cơ sở di truyền về tính kháng vẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng tạo giống kháng bệnh vẫn là một hướng đi mang tính chiến lược trong việc làm giảm thiểu tác động của bệnh ghẻ cho các vùng trồng khoai tây

2.2 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh và đa dạng di truyền của các chủng

Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây

2.2.1 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh

Khả năng gây bệnh ghẻ củ khoai tây của các loài thuộc chi Streptomyces

có liên quan đến một nhóm gen gây bệnh thuộc đảo gây bệnh PAI (pathogenic

island) PAI của Streptomyces được mô tả từ S turgidiscabies Đó là một vùng

trình tự giới hạn 425kb chứa các gen tổng hợp protein gây bệnh được tìm thấy

trên vùng NST liền kề của S acidiscabies và S scabies Các gen này bao gồm:

TxtAB, txtC, nos, txtR (Joshi và cộng sự, 2007b) Chúng lần lượt mã hóa cho sự tổng hợp thaxtomin A, cytochrom P450 monooxygenase và nitric oxide Vùng này cũng bao gồm các gen: TomA mã hóa cho enzyme Tomatinase thuộc họ enzyme saponinase có vai trò ức chế phản ứng phòng thủ của cây (Vanetten và cộng sự, 1994) và Nec1 có liên quan tới việc tạo ra kiểu hình chết hoại trên bề mặt củ khoai tây (Xinshun và cộng sự, 2008) Bản chất sản phẩm của các gen

này là các phytoxin có vai trò chủ chốt trong quá trình phát triển bệnh thông qua việc làm tổn thương cấu trúc thành tế bào sơ cấp của thực vật Bên cạnh đó, các gen liên quan đến quá trình tương tác của tác nhân gây bệnh với kí chủ (gen

esterase….), đặc biệt là sự hình thành các enzyme ngoại bào và các toxin (Lawrence và cộng sự, 1990; Healy và cộng sự, 1991 ) cũng đã được tìm thấy

Các nghiên cứu của Bukhalid và cộng sự (1998); Lawrence và cộng sự (1990) chỉ ra một mối tương quan chặt giữa tính gây bệnh và việc sản sinh

thaxtomin Đột biến của S scabies với việc giảm hoặc không nhận thấy được

mức độ tổng hợp thaxtomin đều là các chủng không gây bệnh hoặc tính độc bị giảm (Bukhalid và cộng sự, 1998; Lawrence và cộng sự, 1990; Loria và cộng sự, 1997)

Trong khi đó, kết quả kiểm tra gen TxtAB- tổng hợp thaxtomin có vai trò

chủ chốt trong quá trình gây bệnh của Streptomyces phân lập từ 6 bang nước Mỹ

cho thấy, tất cả các chủng có TxtAB đều là các chủng gây bệnh và không có

chủng nào gây bệnh nếu không có TxtAB (Wanner, 2006) S scabies được phân

lập từ Nam Phi có gen TxtA- tổng hợp thaxtomin A nhưng không có gen Nec1

(Bukhalid và cộng sự, 1998) Trong khi đó, S luridiscabiei và S puniscabiei là

các chủng gây bệnh nhưng không tạo thaxtomin (Park và cộng sự, 2003)

Phân tích sự sản sinh thaxtomin A, Reinette Gouws (2006) cũng cho rằng

có một sự liên quan chặt chẽ giữa khả năng gây bệnh của các isolate phân lập

được và khả năng sản sinh thaxtominA Tuy nhiên, nghiên cứu này cũng chỉ ra

rằng 14% các chủng gây bệnh không tổng hợp thaxtomin A, trong khi có 6% số

chủng không gây bệnh được kiểm tra tạo toxin Park và cộng sự (2003) tìm ra 2 loài gây bệnh ở Hàn Quốc là S luridiscabiei và S puniscabiei nhưng không tạo

thaxtomin

Gen Nec1 mã hóa cho một protein gây chết hoại (Joshi và cộng sự, 2007)

và có tính bảo thủ cả về cấu trúc và chức năng giữa các chủng Streptomyces spp gây bệnh (Park và cộng sự, 2003) Các chủng gây bệnh S scabies, S

acidiscabies, S turggidiscabies có thể có cả gen tổng hợp Nec1 và thaxtominA

nhưng Nec1 không cần thiết cho sự tổng hợp thaxtomin A (Bukhalid và cộng sự

1997, 1998) Joshi và cộng sự (2007) cho rằng, Nec1 cần thiết cho tính gây bệnh nhưng một vài nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng Nec1 có vai trò phụ trong tính

gây bệnh vì một số chủng Streptomyces gây bệnh khác không có mặt của Nec1

bảo thủ về trình tự của TomA trên đảo gây bệnh của S.cabies, S acidiscabies, S

turgidiscabies cho thấy TomA có một vai trò trong quá trình tương tác giữa tác

nhân gây bệnh và cây trồng (Ryan và cộng sự, 2008)

Mặt khác, Schottel và cộng sự (1992) đã tìm thấy sự xuất hiện của hoạt tính esterase trong dịch chiết nuôi cấy của một số chủng S scabies gây bệnh

Điều này chứng tỏ rằng, esterase có thể có vai trò trong việc phá vỡ lớp bảo vệ của bề mặt củ khoai tây (suberin, cutin) tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh (Beauséjour và cộng sự, 1999)

Như vậy, có rất nhiều sản phẩm của gen tham gia vào quá trình tương tác

gây bệnh của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây

Hình 2: Sơ đồ các gen thuộc đảo gây bệnh của S turgidiscabies

(Kerset và cộng sự, 2005 )

2.2.2 Đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây

Nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây được mô tả lần đầu tiên vào cuối thế kỉ 19 ở Bắc Mỹ (Thaxter, 1892) Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, bệnh này xảy ra ở khắp các vùng trồng khoai tây trên thế giới, trong đó tác

nhân gây bệnh chủ yếu là S.scabies Các loài gây bệnh thuộc chi này có khả

năng tiết sắc tố melanin trên môi trường nuôi cấy, tạo ra dạng bào tử xoắn với sợi khí sinh màu xám tro Cơ sở hình thái, hóa sinh và khả năng sử dụng các nguồn cabon cũng như sự có mặt của các gen gây bệnh, đặc điểm trình tự 16s

RNA của các loài thuộc chi Streptomyces đã được sử dụng để phân loại các loài thuộc chi này Ngoài ra, các chủng Streptomyces khác cũng được tìm thấy là

nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường (Beaulieu, 2008)

Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng Streptomyces phân lập được

từ mẫu củ khoai tây bị bệnh từ 6 bang của nước Mỹ trên môi trường YME và

PYI cho thấy, nhiều isolates có đặc điểm hình thái tương tự S scabies Trên môi

trường YME, bào tử có màu xám, sợi cơ chất có màu nâu vàng đến nâu vàng nhạt và tiết sắc tố màu nâu cam Chủng gây bệnh có màu sắc sợi cơ chất biến động từ màu kem đến màu vàng sáng và màu nâu caramel, bào tử từ màu trắng đến màu xám sáng đến xám tối hoặc gần như màu đen Màu sắc của sợi khí sinh

và sắc tố tiết ra trên môi trường YME biến động giữa các chủng không gây bệnh

(Wanner, 2006) S scabies gây bệnh có khả năng sinh sắc tố màu nâu, chuỗi bào

tử màu xám, bào tử nhẵn, dạng xoắn (Thaxter, 1890) Cũng nghiên cứu về các

chủng S scabies gây bệnh ghẻ thường ở Bắc Mỹ, Canada và Hungary, Lambert

và cộng sự, 1989 đã mô tả rất cụ thể về đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng này Trên môi trường aga cơ bản, sợi khí sinh phân nhánh từ gốc, chuỗi bào tử xoắn rời nhau, bào tử màu xám, nhẵn và có dạng gai Thành tế bào của một số chủng có chứa LL- diaminopimenlyc acid isomer Tất cả đều có khả năng tiết melanin trên môi trường tyrosine agar và sắc tố màu đen trên môi

trường peptone yeast extract aga (PYI) Một loài khác S acidiscabies cũng gây

bệnh ghẻ thường củ khoai tây, có khả năng chịu được acid, gây ra các triệu

chứng bệnh tương tự như triệu chứng do S scabies tuy nhiên loài này có sự khác biệt với S scabies về hình thái, sinh hóa S acidiscabies sinh chuỗi bào tử gấp

khúc, bào tử màu trắng đến hồng, sinh sắc tố màu đỏ đến vàng Một số chủng

Streptomyces gây bệnh khác được tìm thấy ở Nhật Bản có khả năng sử dụng tất

cả các loại đường trên môi trường ISP, sinh chuỗi bào tử nhẵn, xám, gấp khúc

(Loria và cộng sự, 1997) Các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ

khoai tây ở Algeria có đặc điểm: khuẩn lạc lồi, nhẵn màu kem trên môi trường YME, sợi khí sinh sau đó chuyển sang màu nâu, có khả năng đồng hóa L- arabinose, D- fructose và rhamnose Đồng thời, chúng có khả năng phân giải xylose và tinh bột và tạo melanin trên môi trường PYI (Bencheikh và cộng sự, 2007) Nghiên cứu bệnh ghẻ thường khoai tây ở Nam Phi, Reinette Gouws (2006) đã phân lập được 145 isolates từ củ khoai tây biểu hiện các triệu chứng: vết bệnh sâu, nổi và trên bề mặt Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh hóa, 145 isolates này đã được phân làm 6 nhóm với các đặc điểm: Nhóm 1 (52% tổng số)

có dạng khuẩn lạc màu nâu, chuỗi bào tử dạng xoắn, bào tử màu xám, sinh sắc

tố trên môi trường PYI và TY; sử dụng 9 loại đường ISP 12% thuộc nhóm 2 có các đặc điểm giống nhóm 1 nhưng điểm khác biệt là không sinh sắc tố Nhóm 3 (6%) và nhóm 4 (10%) có khuẩn lạc màu nâu, bào tử xám, chuỗi bào tử gấp khúc Các isolates thuộc nhóm 3 có khả năng tạo sắc tố trên môi trường PYI trong khi nhóm 4 không có khả năng này Khuẩn lạc thuộc nhóm 5 (12%) màu nâu vàng, bào tử màu xanh xám trong chuỗi bào tử xoắn hoặc gấp khúc, sử dụng tất cả các nguồn đường nhưng không tạo sắc tố Nhóm 6 (8%) bao gồm các isolates với dạng bào tử màu đen, chuỗi bào tử gấp khúc, sử dụng tất cả các

nguồn đường nhưng không tạo sắc tố Streptomyces DS3024 có những khác biệt

về hình thái, sinh lý so với các chủng gây bệnh đã được mô tả: chuỗi bào tử gấp khúc, bào tử hình trụ, ráp; sợi khí sinh biến động từ màu trắng đến màu đen trên

các loại môi trường khác nhau; sợi cơ chất màu vàng đến màu nâu; có khả năng tiết sắc tố melanin trên môi trường ISP6 Chủng này có thể tồn tại ở pH 4.5 (Hao

và cộng sự, 2009)

Như vậy có thể thấy, đặc điểm hình thái, sinh hóa là các tiêu chí quan

trọng trong việc phân loại các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ

khoai tây Tuy nhiên, công cụ phân tử gần đây đã đóng một vai trò quan trọng

trong việc nhận diện và phân loại các chủng Streptomyces gây bệnh Bằng việc phân tích trình tự 16s rRNA và đã thành công trong việc nhận diện các chủng

Streptomyces ở mức độ loài

Trong khi đó, từ mẫu củ khoai tây bị bệnh thu thập từ 6 bang của nước

Mỹ, Wanner (2006) đã phân lập và xếp các chủng Streptomyces phân lập được thành 4 nhóm: S scabies, S europaeiscabiei, S stelliscabiei hoặc nhóm mới X

Phân tích trình tự 16s rRNA, ba vùng trình tự biến động trong gen 16s rDNA đã

được nhận diện hữu ích cho việc mô tả các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ

thường củ khoai tây Đó là các vùng α, γ và 1435 (Wanner, 2006) Để đánh giá

đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces phân lập từ 6 bang nước Mỹ, PCR được sử dụng để khuếch đại đặc trưng của các chủng S scabies, S

europaeiscabiei, S stelliscabiei, S acidiscabies, S bottropensis, S.turgidiscabies và S aureofaciens Các cặp mồi được thiết kế dựa trên sự khác

nhau của vùng biến động 16s rDNA để xác định các chủng gây bệnh được phân

lập là thuộc chi Streptomyces Các nhà nghiên cứu đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho S.aureofacient và S.turgidiscabies cũng như là cặp mồi dùng để nhân một sản phẩm từ S.scabies Cặp mồi này (scabI và scabII) được cải biến cho vùng

biến động γ tương đồng hoàn toàn với vùng trình tự 16s rDNA và mồi tương

đồng cho vùng biến động 1435 có chứa một nucleotid đơn trong trình tự của S

scabies và S europaeiscabiei nhưng không có mặt trong mồi gốc scabII Các

cặp mồi đặc hiệu cho bảy chủng Streptomyces và ba marker cho PAI được sử

dụng để mô tả đặc điểm của các chủng phân lập được ở Mỹ Dựa trên trình tự

rDNA có 49 chủng thuộc S scabies và S europaeiscabiei được tìm thấy ở cả 6

bang và ở Ohio, Mchigan, Wisconsin và Marin là các chủng chiếm ưu thế Để

xác định có hay không cả S scabies và S.europaeiscabiei ở Mỹ, gen 16s rRNA

đã được nhân dòng và giải trình tự trên 9 chủng gây bệnh và một chủng không

gây bệnh S.scabies hoặc S europaeiscabiei Hai chủng này có cùng vùng trình

tự 1435 và α nhưng khác nhau bởi G hoặc A ở vị trí 172 trong vùng biến động γ

Bảy isolates thuộc S scabies và ba thuộc S europaeiscabiei

Hình 3: Các vùng biến động trên trình tự 16s rRNA của các chủng

Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây (Wanner, 2006)

Kết quả nghiên cứu tác nhân gây bệnh ghẻ thường trên khoai tây của các tác giả Lambert (1989); Healy (1991); Bouchek (2000); Bukhalid (2002) đã tìm

ra ít nhất 4 loài gây bệnh thuộc Bắc Mỹ, trong đó có 3 loài có đặc điểm tương tự

như S scabies là: S scabies, S europaeiscabiei, S stelliscabiei và một loài

khác là S acidiscabies

Cũng nghiên cứu bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây, Bouchek và cộng sự

(2000) cho rằng, có ít nhất 13 chủng Streptomyces spp khác nhau đã được tìm

thấy là nguyên nhân gây ra bệnh ghẻ thường ở khắp các vùng trồng khoai tây

trên thế giới Trong đó, có 4 nhóm loài gây bệnh lớn ở Bắc Mỹ là: S scabies, S

acidiscabies, S europaeiscabie, và S stelliscabiei (Bouchek và cộng sự, 2000;

Lambert and Loria, 1989) Tác nhân gây bệnh phổ biến nhất là Streptomyces

scabies phân bố khắp thế giới Hai loài tiếp theo có một số đặc điểm hình thái

giống với S.scabies nhưng khác biệt về di truyền là S europaeiscabiei và S

Stelliscabiei Chúng được tìm thấy ở Pháp, Đông Mỹ và Canada

(Bouchek-Mechiche và cộng sự, 2000; Bukhalid và cộng sự, 2002) Một loài thứ tư cũng

có các đặc điểm hình thái giống với các loài trên là S bottropensis được phát

hiện ở Ai Cập (Bukhalid và cộng sự, 2002)

Ngoài ra, các loài Streptomyces khác là nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường

củ khoai tây cũng đã được tìm thấy S caviscabies gây bệnh ghẻ thường ở Quebec, Canada (Goyer và cộng sự., 1996), S aureofaciens, S griseus, S

europaeiscabiei, S reticuliscabiei và S stelliscabiei ở Pháp (Corbaz, 1964;

Bouchek-Mechiche và cộng sự., 2000), S cinereus, S collinus và S

longisporoflavus được tìm thấy ở Ấn Độ (Dey & Singh, 1983), S exofoliatus, S rochei và S violaceus gây bệnh ở Israel (Doering-Saad và cộng sự., 1992)

Trong khi đó S flaveolus ở Bắc Mỹ (Millard & Burr, 1926) Các loài gây bệnh ở Washington là: S atrolivaceus, S cinerochromogenes, S corchorussi, S

diastatochromogenes, S lidicus và S resistomycificus (Archuleta & Easton,

1981) S turgidiscabies được mô tả ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Phần Lan và Thụy

Điển (Kreuze và cộng sự 1999; Lehtonen và cộng sự 1998; Park và cộng sự

2003); S aureofaciens tìm thấy ở Phần Lan (Kreuze và cộng sự 1999); ba loài mới được phát hiện ở Hàn Quốc là Streptomyces luridiscabiei sp nov.,

Streptomyces puniciscabiei sp nov và Streptomyces niveiscabiei sp nov (Park

và cộng sự, 2003); S reticuliscabiei gây ra bệnh ghẻ lưới được tìm thấy ở châu

Âu (Bouchek-Mechiche, 2000); S reticuliscabiei và S aureofaciens phát hiện

gây ra bệnh ghẻ lưới và ghẻ nâu đỏ ở Canada và Phần Lan (Faucher, 1992; Kreuze,1999)

Số lượng các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây có thể tăng

lên do sự chuyển gen ngang Do sự tương đồng giữa các gen gây bệnh ở các loài khác nhau cho thấy, có một cơ chế chuyển gen ngang giữa các loài gây bệnh

sang các loài không gây bệnh để hình thành nên một loài mới (Bukhalid và cộng

sự, 2002) Phân tích di truyền chỉ ra rằng: sự chuyển gen ngang độc lập từ

S.scabies sang các chủng hoại sinh đã tạo ra S.acidiscabes và S.turgdiscabies

(Wanner, 2006)

Mặt khác, Streptomyces gây bệnh ghẻ thường đa dạng về loại hình triệu

chứng bệnh gây ra trên bề mặt củ khoai tây Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng

có nhiều nhóm hoặc loài Streptomyces khác nhau trong việc tạo ra các triệu

chứng bệnh ghẻ như: vết hõm (pitted), đốm nổi (raised) hoặc dạng lưới (netted)

(Bouchek-Mechiche và cộng sự, 2000) S.scabies gây ra các triệu chứng bệnh

điển hình như: vết bệnh hõm sâu trên bề mặt và một số các triệu chứng khác

Trong khi đó S.turgidiscabies tạo ra các vết bệnh hóa bần, S.reticuliscabies là

nguyên nhân gây các vết ghẻ lưới Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh ghẻ có thể được tìm thấy trên cùng một cánh đồng, cùng một giống khoai tây, cùng một củ và thậm chí là trên cùng một vết bệnh (Lehtonen và cộng sự, 2004)

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu

- Các mẫu khoai tây bị bệnh ghẻ củ được thu thập từ các địa phương trồng khoai tây ở miền Bắc Việt Nam

Tràng Định- Lạng Sơn

- DNA chủng đối chứng ATCC49173 (Wanner, trung tâm khoa học cây trồng Mỹ)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân lập - làm thuần (Loria, 1988)

- Củ khoai tây bị bệnh được khử trùng bề mặt bằng 1.5% NaOCl, rửa lại bằng nước cất vô trùng

- Lấy lớp mô ngay dưới vết bệnh, nghiền trong 5ml nước vô trùng hoặc hỗn hợp phenol: nước (1:140) thành dung dịch đồng nhất, sau đó để yên trong vòng 10 phút Một giọt của huyền phù này được cấy trải trên môi trường water agar

- Nuôi ở 280 trong 10- 14 ngày để thu được khuẩn lạc riêng rẽ

- Mỗi khuẩn lạc đơn sẽ được cấy chuyển sang môi trường YME

3.2.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hoá: được tiến hành

theo phương pháp của Wanner (2006), Loria và Davis 1988

- Nuôi cấy các isolates trên môi trường ISP2, ISP3, ISP4, ISP6 ở 280C, trong điều kiện tối (3 tuần theo dõi)

- quan sát chuỗi bào tử (Kính hiển vi điện tử, 100x) trên môi trường ISP2, màu sắc mặt trước; mặt sau của khuẩn lạc, màu sắc sượi khí sinh; sợi dinh dưỡng (ISP2, ISP3, ISP4) và khả năng sinh sắc tố trên môi trường ISP6

* Thành phần các loại môi trường

3.2.3 Phương pháp đánh giá độc tính gây hại (Wanner, 2006)

3.2.3.1 Chuẩn bị dịch khuẩn lây nhiễm

- Nuôi các vi khuẩn Streptomyces trên môi trường YME agar trong 2- 3 tuần

- Tạo dịch khuẩn với mật độ tế bào 4* 106 CFU/ml trong 50ml YME ở

3.2.3.3 Kiểm tra mật độ tế bào dịch lây nhiễm:

- Lấy 1 cm3 hỗn hợp lây nhiễm trên lắc với 10ml nước

- Cấy trải 10 µl ở các nồng độ pha loãng 2, 3, 4, 5 trên môi trường YME,

ủ trong 2 ngày ở 280 C để khuẩn lạc mọc riêng rẽ Mỗi nồng độ lặp lại 4 lần

3.2.3.4 Lây nhiễm

- Cho 600 cm3 hỗn hợp cát: đất vô trùng (tỷ lệ 1:1) vào chậu có kích thước 15

cm

- Trộn 2700 cm3 hỗn hợp cát: đất vô trùng (tỷ lệ 1:1) với 300 cm3 hỗn hợp lây nhiễm với vermiculite (1 đến 10*1010 CFU/ml)

- Lấy 200 cm3 hỗn hợp trên phủ trên chậu

- Củ khoai tây được khử trùng bề mặt trong 5 phút với 0.5% NaOCl chất tẩy bề mặt, rửa lại với nước cất vô trùng trước khi trồng củ trực tiếp trên giá thể nuôi cấy

Khoai tây được thu hoạch và đánh giá cấp bệnh sau 16 tuần Mỗi chủng làm 3 lần lặp lại

3.2.3.5 Chỉ số gây bệnh

Chỉ số gây bệnh (Index: I) dựa trên mức độ nghiêm trọng và % thương tổn trên củ khoai tây Chỉ số này được tính trên tất cả các củ khoai tây có đường kính> 0.5 cm (Wanner, 2006)

+ I=1:nếu các tổn thương bề mặt có đường kính <10mm

+ I=2: nếu các tổn thương bề mặt có đường kính >10mm

+ I= 3: nều các tổn thương nổi lên có đường kính < 10mm

+ I=4: nều các tổn thương nổi lên có đường kính >10mm

+ I=5: nếu các tổn thương hõm sâu vào thịt củ

3.2.4 Phương pháp chiết tách DNA (Miniprep of bacteria genomic DNA

(molecular Cell Physiology, 2002)

- Nuôi lắc qua đêm 5ml dịch khuẩn trong môi trường YME

- Ly tâm 1,5ml dịch khuẩn trong 2 phút để thu cặn khuẩn

- Hòa tan cặn khuẩn trong 567 µl đệm TE Bổ sung 30µl SDS 10% và 3µl proteinaise K (20mg/ml) Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 37°C trong 1h

- Bổ sung 100µl NaCl 5M và trộn đều

- Tiếp tục bổ sung thêm 80µl CTAB/NaCl Trộn đều và ủ trong 10 phút

- Bổ sung một thể tích tương đương (0.7ml-0.8ml) hỗn hợp Phenol/Cloroform/Isoamyl-alcohol (25:24:1) (đảo nhẹ nhàng), sau đó ly tâm 5 phút

- Hút lấy dịch nổi ở trên sang một ống mới Tiếp tục rửa lại bằng một thể tích tương đương Cloroform/Isoamyl- alcohol Đảo ngược ống nhẹ nhàng và ly

tâm trong 5 phút (có thể lặp lại cho đến khi không nhìn thấy lớp phân tách ở giữa)

- Thu lấy dịch nổi ở phía trên và chuyển sang ống mới Bổ sung 0.6 thể tích isopropanol để kết tủa DNA Đảo ống và ủ ở -20°C trong 30 phút Sau đó đem ly tâm nhanh để thu DNA

- Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70% và ly tâm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch nổi phía trên và để khô

- Hòa tan lại DNA trong 100µl đệm TE và bảo quản trong tủ -200C

3.2.5 Phương pháp xác định các gen liên quan đến quá trình gây bệnh, định loài các isolate và giải trình tự 16s rRNA

- Để phát hiện sự có mặt của các gen đặc trưng trên đảo gây bệnh và định

loài của các vi khuẩn Streptomyces được phân lập từ củ khoai tây bị bệnh, tiến

hành chạy PCR với các mồi nhân các gen TxtAB, gen TomA và gen Nec1 đồng thời giải trình tự 16s rRNA

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR cho kiểm tra các gen gây bệnh và định

loài các isolate phân lập

Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR cho nhân dòng gen 16s rRNA

Kích thước sản phẩm (bp)

Tài liệu tham khảo

TxtABR2: TTCAACAACAGGGACAGCA cứu này

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Streptomyces từ củ khoai tây bị bệnh ghẻ

thường

Trên môi trường thạch nước (water agar) (Loria, 1988), 58 isolates khác nhau đã được phân lập, làm thuần độc lập từ các mẫu củ khoai tây bị bệnh của bốn địa phương: Lạng Sơn, Văn Chấn-Yên Bái, Yên Phong- Bắc Ninh, Tiên Lãng- Hải Phòng Trên môi trường này, các mẫu phân lập phân biệt nhau bởi: màu sắc của khuẩn lạc (màu kem, màu vàng kem, màu gạch non…); hình thái khuẩn lạc (hình tròn, mép nhẵn hay phóng xạ…) Sự khác nhau về đặc điểm hình thái ban đầu trên môi trường thạch nước là cơ sở cho việc đánh giá các đặc điểm hình thái, sinh lý sử dụng các loại môi trường đặc trưng

Hình 3: Khuẩn lạc vi khuẩn Streptomyces trên môi trường thạch nước (water agar)

4.2 Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập

Đặc điểm hình thái là tiêu chí quan trọng trong việc phân loại các chủng

Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây Nghiên cứu bệnh ghẻ

thường trên củ khoai tây, Wanner 2006 đã sử dụng môi trường YME để mô tả

đặc điểm hình thái của các chủng phân lập được Các chủng Streptomyces phát triển rất mạnh trên môi trường ISP2 Việc nuôi cấy các chủng Streptomyces trên

môi trường giàu cao nấm men (yeast extract) và cao mạch (malt extract) làm cho khuẩn ty thể phát triển rất mạnh và có thể nhận biết rõ sự khác nhau giữa các giữa các isolates Trên môi trường này, bào tử hình thành có màu xám, sợi cơ

chất có màu nâu vàng đến nâu vàng nhạt và tiết sắc tố màu nâu cam (Wanner, 2006) Chính vì vậy, 58 isolates được nuôi trên môi trường ISP2 (YME) để tiến hành mô tả các đặc điểm hình thái, bào tử Kết quả thể hiện trên bảng 4

Bảng 4: Đặc điểm hình thái, hệ khuẩn ty của các isolate trên môi trường

ISP2 (sau 3 tuần theo dõi)

Isolates Mặt sau Mặt trước Sắc tố Khuẩn ty

trắng, chia múi -

nhánh

Trắng vàng trắng nhạt

nhánh

HLLS7 Viền nâu sáng- trong màu nâu

đen trắng nhánh

Xanh, lồi xung quanh rỗ, giữa nhẵn

nhánh

Phóng xạ trắng, trắng xám, xám trắng

Viền trắng- nâu xám, nâu đen, chia múi

DLS7 Nâu đen Nâu đen Nâu đen Thẳng, phân

Trên môi trường ISP2, sau 21 ngày nuôi cấy, 58 isolates biểu hiện sự khác biệt nhau rõ ràng về mặt hình thái với các dạng khuẩn lạc tròn, mép trơn, (YB45, DLS3…) hoặc phóng xạ (TLHP7, TLHP8,…), có thể tiết sắc tố màu nâu

đỏ (YB27, DLS19 ), vàng nâu (DLS13, DLS9…) hoặc không tiết sắc tố trên

môi trường (YP11, YP9….) Màu sắc bào tử, sợi khí sinh biến động từ màu trắng- xám trắng- xám tro- xanh xám-xám đen đến đen Mặt sau khuẩn lạc, màu sắc thay đổi từ màu vàng nâu nhạt tới màu nâu đen Cũng trên môi trường này,

hệ khuẩn ty của các mẫu phân lập biểu hiện hai dạng cơ bản là: dạng xoắn (YB1, YB21, YB41, YB42, YB43, YB44… ) và khuẩn ty dạng thẳng phân nhánh (HLLS1, TLHP7,YP5….)

Nhiều nghiên cứu về đặc điểm hình thái của các chủng Streptomyces trên

thế giới đã dựa vào màu sắc của bào tử, màu sắc sợi khí sinh trên môi trường dinh dưỡng nhất định, ở một chế độ ánh sáng phù hợp Theo đó, có 5 dạng màu

sắc cơ bản sử dụng trong hệ thống phân loại Streptomyces: màu trắng, xanh,

hồng, vàng nâu nhạt và xám (Tresner và Backus, 1963) Mặt khác, các loài

thuộc chi Streptomyces có dạng khuẩn ty dạng xoắn, dạng thẳng phân nhánh,

dạng gấp khúc Như vậy, mặc dù sự biểu hiện về mặt hình thái của các mẫu phân lập rất đa dạng nhưng các mẫu này đều mang đặc điểm của các chủng

Streptomyces được mô tả trước đó

4.3 Đặc điểm nuôi cấy của các isolate phân lập

Sử dụng môi trường ISP2, ISP3, ISP4 để mô tả đặc điểm nuôi cấy của các isolate phân lập được Kết quả bảng 5, 6, 7 cho thấy: Toàn bộ các isolate đều sinh trưởng được trên ba loại môi trường trên Khuẩn lạc của các chủng phân lập hình thành lúc đầu có màu sáng, trắng sau đó chuyển thành màu trắng, màu xanh xám, màu vàng nâu và màu xám Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP3 và ISP4 tương tự như trên môi trường ISP2 nhưng điểm khác biệt cơ bản nhất là không một isolate nào sinh sắc tố trên môi trường ISP4