Sự biến động và khả năng lây nhiễm của ấu trùng sán lá ruột haplorchis pumilio trên cá rô phi oreochromis niloticus

MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu đánh giá sự biến ựộng và khả năng phát triển của ấu trùng Ờ metacercariae của sán lá ruột Haplorchis pumilio trên cá rô phi Oreochro

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường đại học nông nghiệp hà nội

-*** -

đỗ học dân

Sự biến động và khả năng lây nhiễm

của ấu trùng sán lá ruột Haplorchis pumilio

trên cá rô phi Oreochromis niloticus

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 3 năm 2012

Tác giả

ðỗ Học Dân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành ựối với sự quan tâm giúp ựỡ của Khoa sau ựại học, Ban Giám hiệu trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, và Phòng Thông tin Hợp tác Quốc tế đào tạo, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản

I ựã hướng dẫn và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi ựể tôi hoàn thành tốt khóa học

Với tấm lòng chân thành nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Tiến sỹ Phan Thị Vân, người ựã ựịnh hướng cho tôi, tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Trân trọng cảm ơn ựến Ths Bùi Ngọc Thanh ựã chỉ bảo và truyền ựạt cho tôi những kiến thức chuyên môn, những kinh nghiệm quý báu ựể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ựạo cùng toàn thể anh chị em Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh khu vực Miền Bắc ựã giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất phục

vụ thắ nghiệm, cung cấp các tài liệu cần thiết ựể hoàn thành luận văn theo ựúng tiến ựộ

Sự ựộng viện, giúp ựỡ của bạn bè và ựồng nghiệp ựã khắch lệ tôi rất nhiều, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ quý báu ựó

Cuối cùng con xin ghi nhớ ơn dưỡng dục, sinh thành của bố mẹ và sự ủng hộ của người thân trong gia ựình ựể con có ngày hôm nay

MỤC LỤC

Lời cam ñoan……… i

Lời cảm ơn………ii

Mục lục………iii

Danh mục bảng……….v

Danh mục hình……… v

PHẦN I MỞ ðẦU 1

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 ðặc ñiểm về vòng ñời sán lá truyền lây qua cá 3

2.1.1 ðặc ñiểm hình thái, cấu tạo cơ thể 3

2.1.2 Chu kỳ phát triển của sán lá truyền lây qua cá 4

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

2.3 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 9

2.4 Tình hình nghiên cứu về sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio 14

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 16

3.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 17

3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 17

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 18

3.3.2 Phương pháp áp dụng 20

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 22

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 KẾT QUẢ 23

4.1.1 Cường ñộ nhiễm cercariae trên ốc 23

4.1.2 Biến ñộng metacercariae trên cá sau gây nhiễm 24

4.1.3 Metacercariae trong cơ của cá sau gây nhiễm 27

4.1.4 Khả năng lây nhiễm của ấu trùng 28

4.2 THẢO LUẬN 30

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 34

5.1 Kết luận 34

5.2 ðề xuất nghiên cứu 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Thí nghiệm gây nhiễm trên chuột 20

Bảng 2: Khả năng thải cercariae từ ốc nhiễm 23

DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vòng ñời của Sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophydae 4

Hình 2: Cercariae và metacercariae (Skov và ctc, 2009) 15

Hình 3 ðối tượng nghiên cứu 17

Hình 4: Hình thức gây nhiễm ấu trùng sán cho cá rô phi 19

Hình 5 Pleurolophocercous cercariae (A-B) của H pumilio thu ñược từ ốc M tuberculata (C-D) 24

Hình 6: Biến ñộng tỷ lệ nhiễm metacercariae sau gây nhiễm 25

Hình 7 Biến ñộng cường ñộ nhiễm metacercariae sau gây nhiễm 26

Hình 8: Ấu trùng sán lá ruột H pumilio ở gốc vây ñuôi (ngôi sao) 27

Hình 9 Ấu trùng sán lá ruột H.pumilio ở phần ñầu cá rô phi (ngôi sao) 28

Hình 10: Metacercariae H pumilio [sau gây nhiễm (A-24 giờ, C-7 ngày, D-30 ngày tuổi và B- răng ở giác miệng khi ấu trùng ñã hoàn thiện về hình thái), ấu trùng nhiễm tự nhiên (E), ấu trùng có dấu hiệu chết ở tuần thứ 12 (F)] 29

PHẦN I MỞ ðẦU

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) hiện là một trong những ngành sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất thế giới Các nước Châu Á ñã sản xuất khoảng 90% sản lượng nuôi thủy sản trên toàn thế giới ðây là ngành ñược xem là thế mạnh của nhiều quốc gia có ưu thế về diện tích mặt nước, trong ñó

có Việt Nam Diện tích nuôi trồng thủy sản nước ta hiện nay khoảng 887.700

ha, trong ñó diện tích nuôi thủy sản nước ngọt là 408.700 ha, sản lượng cá nuôi nước ngọt chiếm 60-70% tổng sản lượng thủy sản của cả nước

Sản phẩm từ nuôi trồng thủy sản không chỉ là nguồn cung cấp protein quan trọng cho thị trường nội ñịa mà còn là nguồn nguyên liệu dồi dào cho xuất khẩu Chính vì vậy, vấn ñề an toàn vệ sinh thực phẩm trong nuôi trồng thủy sản rất quan trọng Ký sinh trùng có nguồn gốc từ thủy sản lây sang người gây bệnh sán lá gan và sán là ruột trên người là một trong những tiêu chí ñánh giá chất lượng của sản phẩm thủy sản ðặc biệt ở những nước có truyền thống

ăn nhiều món ăn chế biến từ cá bao gồm các món như gỏi, mắm, khô và muối

Sán lá ruột nhỏ Haplorchis spp thuộc họ Heterophyidae thường ký

sinh trong ruột non của người, gia súc và gia cầm Sán lá ruột ký sinh ở niêm mạc ruột và gây rối loạn tiêu hóa Tác hại trực tiếp của loài sán này ñối với người và ñộng vật là không lớn Nhưng khi sán ký sinh, nó tạo các vết loét là cửa ngõ cho các tác nhân gây bệnh khác xâm nhập vào cơ thể, ñặc biệt chúng có thể gây những tổn thương ñến não bộ khi di chuyển tới não và ñẻ trứng ở ñây Hiện có khoảng 40 triệu người trên thế giới ñang bị nhiễm sán lá gan nhỏ

Clonorchis sinensis hay Opisthorchis viverrini và sán lá ruột nhỏ Haplorchis sp., Echinotosma sp, hoặc Metagonimus sp (World Health Organization, 1995)

Cá Rô phi (Oreochromis niloticus) hiện ñang là một trong những ñối

tượng nuôi chủ lực nhằm cung cấp thực phẩm cho nội ñịa cũng như xuất

khẩu Với sản lượng nuôi ngày càng tăng cả về số lượng và diện tắch, việc nghiên cứu sán lá truyền lây qua cá có nghĩa vô cùng quan trọng ựối với an

toàn vệ sinh thực phẩm Vì vậy chúng tôi tiến hành ựề tài nghiên cứu: ỘSự

biến ựộng và khả năng lây nhiễm của ấu trùng sán lá ruột Haplorchis

pumilio trên cá rô phi Oreochromis niloticus Ợ.

MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

đánh giá sự biến ựộng và khả năng phát triển của ấu trùng Ờ

metacercariae của sán lá ruột Haplorchis pumilio trên cá rô phi Oreochromis

niloticus nhằm góp phần ựề xuất các giải pháp ựảm bảo an toàn vệ sinh thực

phẩm (ATVSTP) trong NTTS

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu cường ựộ ấu trùng cercariae do ốc nhả ra

Nghiên cứu sự biến ựộng metacercariae H pumilio nhiễm trên cá rô phi

O niloticus trong ựiều kiện thắ nghiệm

Nghiên cứu mô bệnh học của cá rô phi sau khi gây nhiễm

Nghiên cứu khả năng cảm nhiễm của ấu trùng metarcerariae trên chuột bạch

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ðặc ñiểm về vòng ñời sán lá truyền lây qua cá

2.1.1 ðặc ñiểm hình thái, cấu tạo cơ thể

Theo tài liệu của dự án FIBOZOPA, 2005 sán lá truyền lây qua cá - Fishborne Zoonotic Trematodes (FZT) giai ñoạn trưởng thành cơ thể có hình trứng hoặc hình lá ñối xứng 2 bên hoặc không ñối xứng Với một số loài, cơ thể còn chia làm hai phần trước và sau, một số ít loài mặt lưng hơi cao so với thân Kích thước cơ thể khoảng 0.5 x 2,0mm, cá thể có loài chiều dài lên tới 25mm như sán lá gan nhỏ Cơ thể trong, không màu, cá biệt có cá thể có màu ñỏ do màu máu Bề mặt trơn, một số giống loài trên bề mặt có gai hoặc các mấu lồi Giác miệng nhỏ ở phía trước cơ thể, giác bụng lớn hơn hoặc tương ñương với giác miệng

Lớp ngoài cùng của sán lá là lớp nguyên sinh chất, rải rác có giống loài

có móc là cơ quan bám bổ sung, lớp này ñể chống lại tác dụng dịch tiêu hóa của ký chủ và hấp thụ dinh dưỡng Sau lớp nguyên sinh chất là 3 lớp cơ: cơ vòng, cơ dọc, cơ xiên

Hệ thống tiêu hóa của sán lá truyền qua cá có miệng, hầu, thực quản, ruột ðại bộ phận miệng ở chính giữa giác hút trước Hầu do tế bào cơ và tuyến thể cấu tạo thành Thực quản hẹp ngắn, ruột chia làm hai nhánh ở hai bên cơ thể và bịt kín tận cùng Một số giống của loài có hậu môn

Hệ thống sinh dục lưỡng tính, ñực cái trên cùng một cơ thể Cơ quan sinh dục ñực thường có 1-2 tinh hoàn rồi ñổ ra ống dẫn tinh nhỏ hướng về trước, tập chung thành ống phóng tinh và tận cùng cơ quan giao phối ở trước giác bụng Cơ quan sinh dục cái có một buồng trứng, ống dẫn trứng ñổ vào khoang bé gọi là ootýp, từ khoang ootýp ñi ra là tử cung uốn khúc chạy ñến lỗ sinh dục cái cạnh lỗ sinh dục ñực trong tuyến sinh dục Tuyến noãn hoàng ở hai bên cơ thể ñổ vào hai nhánh nhỏ sau ñó hợp thành bầu rồi dẫn ñến khoang

ootýp ñể làm vỏ, khoang ootýp có túi nhận tinh Thể melit có dạng hình tròn gồm nhiều tế bào quanh ootýp

Tinh trùng từ huyệt sinh dục theo tử cung ngược lên khoang ootýp gặp trứng từ buồng trứng ra tiến hành thụ tinh Trứng ñã thụ tinh ñược tuyến noãn hoàng bao quanh tạo thành lớp trứng Sau ñó, trứng theo tử cung lên lỗ sinh dục rồi ra ngoài

Hệ thống bài tiết là nguyên ñơn thận gồm 1-2 ñôi ống bài tiết chạy dọc hai bên cơ thể Hai ống bài tiết cùng ñổ vào bọng ñái rồi ñổ ra ngoài qua lỗ bài tiết

Hệ thống thần kinh gồm một ñôi hạch não nằm trên hầu, 3 ñôi dây thần kinh, dây thần kinh lưng, dây thần kinh hầu (FIBOZOPA Laboratory manual, 2005)

2.1.2 Chu kỳ phát triển của sán lá truyền lây qua cá

Sán lá truyền lây qua cá tiến hành giao phối trên cùng một cơ thể, ñẻ trứng, trứng có kích thước rất nhỏ nhưng số lượng trứng lớn Từ trứng ñể phát triển thành cơ thể trưởng thành phải trải qua một quá trình phát dục phức tạp

ở nhiều ký chủ với nhiều giai ñoạn phát triển cụ thể:

Hình 1: Vòng ñời của Sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophydae

Giai ñoạn ấu trùng miracidium

Trứng sau khi rơi vào nước nở ra ấu trùng miracidium có lông tơ và

ñiểm mắt Phần trước cơ thể có tuyến ñầu, ñoạn sau cơ thể có một ñám tế bào mầm có ống tiêu hóa ñơn giản Hệ thần kinh và bài tiết không phát triển Miracidium sống tự do trong nước, dinh dưỡng nhờ glycogen dự trữ nên chỉ bơi một thời gian rồi nhờ tuyến ñầu tiết men phân giải lớp biểu mô chui vào

tổ chức gan của cơ thể ký chủ trung gian 1 (ốc) Ở trong cơ thể ốc, ấu trùng miracidium mất lông tơ, mất ñiểm mắt và ruột biến thành bào nang sporocyte

Giai ñoạn ấu trùng bào nang sporocyte

Bào nang hình tròn hay hình túi, bề mặt có khả năng thẩm thấu dinh dưỡng Bào nang có thể xoang lớn, nó tiến hành sinh sản ñơn tính (vô tính) cho nhiều ấu trùng redia

Giai ñoạn ấu trùng redia

Ấu trùng hình túi có thể di ñộng, cấu tạo cơ thể có hầu và ruột dạng hình túi ngắn Ấu trùng redia lớn lên, phá nang của bào nang ñể ra khỏi gan rồi vào cơ quan tiêu hóa của ốc Cơ thể ấu trùng redia dài ra, hầu và ruột phát triển, có hai ống bài tiết Phía sau cơ thể có một ñám tế bào mầm tiến hành sinh sản ñơn tính cho nhiều ấu trùng cercariae, một số loài sán song chủ không qua giai ñoạn ấu trùng redia mà phát triển trực tiếp từ sporocyte qua

cercariae

Giai ñoạn ấu trùng cercariae

Cơ thể chia thành hai phần riêng biệt: phần thân và phần ñuôi, bề mặt

có gai, có từ 1-2 giác hút Cơ quan tiêu hóa có miệng, hầu, thực quản và ruột Chúng có hệ thống bài tiết và ñốt thần kinh Ấu trùng sống trong cơ thể ốc một thời gian, sau ñó chúng thoát ra ngoài bơi lội tự do trong môi trường nước Hầu hết các các loài sán lấy cá là ký chủ trung gian thứ hai Chúng chủ ñộng xâm nhập vào cơ thể cá, kết bào nang ở trong da, mang, thịt của cá và hình thành ấu trùng metacercariae

Giai ñoạn ấu trùng metacercariae

Do cơ thể nằm trong bào nang nên không vận ñộng Cấu tạo cơ thể phát triển gần giống với sán trưởng thành Bề mặt cơ thể có móc, có giác miệng, giác bụng, lỗ miệng và lỗ bài tiết, bên trong có cơ quan tiêu hóa, cơ quan bài tiết, thần kinh và cơ quan sinh dục Hệ thống sinh dục của một số giống loài phát triển còn ñơn giản nhưng cũng có giống loài cơ quan sinh dục ñực cái ñã hoàn chỉnh, thậm chí ñã có lúc trong cơ quan sinh dục cái ñã có trứng xuất hiện

Giai ñoạn sán trưởng thành

Khi người và một số ñộng vật (chó, mèo, vịt, lợn, chim, …) ăn cá sống hoặc cá chưa ñược nấu chín kỹ thì bị nhiễm ấu trùng metacercariae Như vậy, người và một số ñộng vật là ký chủ cuối cùng Metacercariae sẽ vào các ống tiêu hóa, do tác dụng của dịch tiêu hóa vỏ bọc bị vỡ, metacercariae thoát ra ngoài di chuyển ñến cơ quan thích hợp của ký chủ ñể phát triển thành sán trưởng thành Sán trưởng thành ký sinh trong mật, ruột, gan của ký chủ và tiếp tục ñẻ trứng Trứng sẽ theo phân của các ký chủ cuối cùng ra ngoài, gặp môi trường nước tiếp tục nở ra ấu trùng ñể hoàn thiện vòng ñời (FIBOZOPA Laboratory manual, 2005)

Như vậy, quá trình phát triển của sán lá song chủ yếu cần các ký chủ trung gian Ký chủ trung gian thứ nhất là ốc, ký chủ trung gian thứ hai là cá,

ký chủ cuối cùng là người và một số gia súc gia cầm

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Quá trình nghiên cứu ấu trùng metacercariae của sán lá song chủ ở cá nước ngọt lây truyền qua người trên thế giới bắt ñầu từ rất sớm ñặc biệt ở một

số quốc gia thuộc khu vực châu Á

Tại Nhật Bản, việc nghiên cứu về sán lá C sinensis ñược bắt ñầu từ

những năm 1900 Vào tháng 5 năm 1910, Harujiro Kobayashi lần ñầu phát

hiện ra ký chủ trung gian 2 của C sinensis là một số loài cá nước ngọt Ông

ñã tách C sinensis từ cá Pseodorasbora parva ở Okayama Sau ñó ông ñã

làm thực nghiệm lấy cá có nhiễm C sinensis cho 3 con mèo ăn cá sống vào 3

ựợt thắ nghiệm khác nhau Kết quả ở cả 3 con mèo ựều phát hiện bị nhiễm sán

C sinensis ở giai ựoạn trưởng thành, (Komiya, K, 1965)

Vào năm 1911, Masatomo và Kobayashi ựã phát hiện ký chủ trung gian 1

của sán lá gan Clonorchis sinensis là ốc nước ngọt Parafossarulus manchouricus

(loài ốc này ựã ựược tìm thấy ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, đài Loan),

Melina hongkongensis, Bithynia fuchsiana và B Longicorni, (Muto M, 1918)

Kobayashi ựã ựưa ra khuyến cáo rằng, không nên ăn gỏi cá nước ngọt, trong khi ựó, ở Nhật Bản và một số quốc gia khu vực đông Nam Á gỏi cá ựược xem là món ăn truyền thống, do ựó cần phải nỗ lực giáo dục cho người

dân về việc người bị nhiễm sán C sinensis là do ăn gỏi cá, cá nấu chưa chắn

kỹ, cá sấy hoặc cá muối (Komiya, K, 1965)

Một thời gian sau ựó, ở châu Á ựã có báo cáo cho thấy, có hơn 80 loài

cá nước ngọt là ký chủ trung gian thứ 2 của C Sinensis (Komiya Y, Suzuki N

O, 1963)

Tại Hàn Quốc, các nhà khoa học ựã xác ựịnh 80 loài cá thuộc 9 họ là ký

chủ trung gian 2 của C sinensis Trong ựó có 71 loài thuộc họ cá chép, chúng

phân bố ở nhiều vùng và nhiều loại hình thủy vực Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm ấu trùng metacercariae giữa các sông và các tháng trong năm có sự khác nhau

Tỷ lệ nhiễm ấu trùng metacercariae tương ựối cao vào tháng 9, thấp nhất từ tháng 12 ựến tháng 1 năm sau (Shin DS, 1964)

Khi nghiên cứu về một số giống loài sán lá ruột, theo Jong - Yil Chai

và ctv cho biết tại Hàn Quốc, các ký chủ trung gian của sán lá họ Galactosomidae và Heterophyidae là ốc, ký chủ trung gian thứ 2 là cá Các ký chủ cuối cùng là ựộng vật có vú như chó, mèo, chuột, người Trên cá nước

ngọt, sán ở giai ựoạn metacercariae chủ yếu là các loài: Metagonimus

yokogawai, M takahashii, M Miyatai, C formosanus và C armatus (Chai

JY, Lee SH, 1990, Chai JY, Lee SH, Parasitol Int 2002; 51: 129 - 154)

Ở Trung Quốc, theo Xu BK và ctv (1979), sự lây nhiễm của sán

Clonorchis sinensis vào các ký chủ trung gian chịu sự tác ựộng của nhiệt ựộ

Bởi vì, khi nhiệt ựộ thấp hơn 10oC thì ấu trùng cercariae không thể xâm nhập vào giai ựoạn cá hương của cá trắm cỏ, khoảng nhiệt ựộ thắch hợp cho sự lây nhiễm sán vào cá là từ 20 - 30oC và thắch hợp nhất là 25oC

Bằng thực nghiệm ở các ngưỡng nhiệt ựộ khác nhau, các tác giả ựã cho thấy: Ấu trùng cercariae khi nhiễm vào cá hương của trắm cỏ ở nhiệt ựộ nhỏ hơn 25oC thì có 51,6% ấu trùng metacercariae phát triển trong cá sau 10 ngày, 84,6% metacercariae phát triển trong cá sau 20 ngày, 98,3% metacercariae phát triển trong cá sau 30 ngày, 99,4% metacercariae phát triển sau 40 ngày Còn khi ở nhiệt ựộ thấp hơn 15oC có 75,6% metacercariae phát triển nhưng thời gian phải kéo dài ựến 50 ngày và phải mất ựến 60 ngày ựể 99,7% ấu trùng metacercariae có thể phát triển trong cá (Xu BK và ctv, 1979)

Năm 1950, một số nghiên cứu về sán lá ruột của Chen XT khi ông tiến

hành ựiều tra trên các giống Haplorchis sp., Procerovum sp., Stellantchamus

sp ựã ựược báo cáo Vòng ựời của sán cần có ốc làm ký chủ trung gian thứ nhất và cá (ếch) làm ký chủ trung gian thứ 2 Chim và một số ựộng vật có vú trong ựó có con người làm ký chủ cuối cùng của sán (Yu Sen - Hai and Xu Long Qi, 2004)

Sán lá ruột thường gặp là Heterophyes heterophyes phân bố ở Quảng đông, Hồ Bắc, đài Loan; Metagonimus yokogawai có ký chủ trung gian 1 là

ốc họ Melania, ký chủ trung gian 2 là một số loài cá nước ngọt và ký chủ trung gian cuối cùng thường là người, chó, mèo Sán phân bố nhiều ở đài Loan, Quảng đông, An Huy, Hồ Bắc, Chiết Giang (Yu Sen - Hai and Xu Long Qi, 2004)

Thái Lan là một trong số các quốc gia đông Nam Á có tập tắnh ăn sản phẩm thủy sản sống và có tỷ lệ người nhiễm sán lá cao, ựây là một trong những vấn ựề về sức khỏe cộng ựồng ở vùng đông Bắc Thái Lan Hầu hết số

người nhiễm ấu trùng sán khi họ ăn các món chế biến từ cá chưa ñược nấu kỹ Các tác giả ñã phân tích ấu trùng giai ñoạn metacercariae ở 79 cá nước ngọt

họ cá chép thu từ hồ chứa Huay Thalaeng, tỉnh Nakornrat Chasrima ñã phát hiện có 16 con nhiễm metacercariae chiếm 20,2% (V Wiwanitkit và ctv, 2001)

Ở Mehico, Laborotori (1999) có nghiên cứu sâu về sán C formosanus

và ñã ñưa ra cảnh báo về sự nhiễm loài sán này trên cá nuôi Ký chủ trung

gian của sán là ốc Melanoides tuberculata ñã ñược phát hiện vào năm 1979

Cho ñến năm 1985 khi nhập cá chép hương từ Trung Quốc về ñã phát hiện có

nhiễm sán C formosanus, từ ñó sán ñã nhanh chóng lây nhiễm sang các loài

cá khác ở Mehico Qua các nghiên cứu thực nghiệm ông ñã phát hiện ấu trùng

C formosanus ký sinh ở mang của 39 loài cá, trong ñó nhiều nhất ở họ cá

chép (Laborotori, 1999)

Cũng nghiên cứu về C formosanus, Andrew Mitchell ñã khẳng ñịnh ñây

là sán lá song chủ ngoại lai ñã nhiễm vào Hoa Kỳ qua con ñường nhập khẩu (Andrew Mitchell, Andrew Goodwin, Thomas Brandt, Melissa Salmon, 2002)

ðến tháng 12 năm 1985, C formosanus ñã ñược phát hiện trên các loài cá tự

nhiên tại hồ nhỏ ở Pasco, bang Florida ðến năm 1990, chúng lại ñược tìm thấy trên cá tự nhiên ở sông San Antonio Tháng 12 năm 1996, ấu trùng

C.formosanus ñược phát hiện ký sinh ở mang một số loài cá tự nhiên ở nước

chảy từ sông Cormal, Texas Hai năm sau tại sông này người ta ñã phát hiện có

ñến 15 loài cá nhiễm C.formosanus (Andrew Mitchell, 2005)

2.3 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Việt Nam, do ñiều kiện khí hậu thời tiết nắng nóng nên có tập tính sinh hoạt lâu ñời là ăn gỏi cá và các món ăn từ cá chưa ñược nấu chín ðiều ñó ñã tạo ñiều kiện cho sự lây nhiễm sán vào cơ thể Sán thường ký sinh ở các cơ quan như mang, cơ thịt, vây cá Các loài sán gây bệnh ñều ký sinh ở gan hoặc ruột các ký chủ cuối cùng (người và ñộng vật), trong ñó chủ yếu là các họ

Opisthorchidae, Galactosomidae và Heterophyidae Như vậy, việc nghiên

cứu về ấu trùng sán lá song chủ nhằm ñề xuất biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát vấn ñề an toàn vệ sinh thực phẩm trong NTTS, góp phần bảo vệ, chăm sóc sức khỏe con người

Từ những năm 1960, tiến sĩ Hà Ký ñã bắt ñầu các nghiên cứu về bệnh sán nói chung và sán lá song chủ nói riêng Trong 120 loài ký sinh trùng ñã tìm gặp, ông phát hiện 8 loài thuộc lớp sán lá song chủ ký sinh trên cá nước ngọt ở miền Bắc, Việt Nam (Hà Ký, 1968)

Bùi Quang Tề và ctv (1984 - 1996) ñã ñiều tra nghiên cứu khu hệ cá nước ngọt ở ñồng bằng sông Cửu Long Qua nghiên cứu các tác giả ñã phân loại ñược 157 loài ký sinh trùng trong ñó có 14 loài là ấu trùng metacercariae thuộc sán lá song chủ (Bùi Quang Tề, 2001)

Cũng trong nghiên cứu của Bùi Quang Tề và ctv (1996) ñã phát hiện ấu

trùng metacercariae của loài sán lá gan Clonorchis sinensis ký sinh trong cơ

cá mè trắng ở Kim Sơn (Ninh Bình), Nghĩa Hưng (Nam ðịnh) với tỷ lệ nhiễm metacercariae từ 40 - 60% (Bùi Quang Tề, 2006)

Nguyễn Văn ðề, Nguyễn Thị Hợp và ctv (2007) khi xét nghiệm 4 loài cá chủ yếu (cá mè, cá chép, cá trắm, cá rô phi) nuôi tại hồ Thanh Trì (Hà Nội) và

hồ Vị Xuyên (Nam ðịnh) cho thấy, vào thời ñiểm lúc mới nuôi, cả 2 hồ ñều chỉ tìm thấy cá chép nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ với tỷ lệ thấp Ấu trùng ở cả 2

ñiểm ñều ñược xác ñịnh là Haplorchis pumilio Vào thời ñiểm thu hoạch (sau 7

tháng) cả 4 loài cá nuôi chủ yếu trên ñều ñược xét nghiệm ñều nhiễm ấu trùng

sán lá ruột nhỏ Thành phần loài của ấu trùng thu ñược là Haplorchis pumilio và

Centrocestus formosanus ở hồ Thanh Trì; Haplorchis pumilio và Haplorchis taichui ở hồ Vị Xuyên (Nguyễn Văn ðề, Nguyễn Thị Hợp và ctv, 2007)

Cũng vào thời gian ñó, qua nghiên cứu tại Ninh Bình trên 3 loài cá nuôi

là cá mè trắng, cá trắm cỏ, cá rôhu, Nguyễn Thị Thanh (2007) ñã phát hiện 5

loài metacercariae, trong ñó có 4 loài sán lá ruột là Haplorchis pumilio, Haplorchis

taichui, Centrocestus formosanus, Procerovum sp và một loài sán lá gan là Clonorchis sinensis Ở cá hương và cá giống của cả 3 loài nghiên cứu ñều

nhiễm nhiều nhất là H pumilio ký sinh ở cơ và C formosanus ký sinh ở mang cá; ở vây cá mức ñộ nhiễm 2 loài sán này thấp hơn Các loài sán khác như H

taichui, Procerovum sp chỉ tìm thấy ở cơ cá trắm cỏ Còn sán lá gan chỉ phát

hiện ở cơ cá trắm cỏ với mức ñộ nhiễm không cao (Nguyễn Thị Thanh, 2007)

Tại Nam ðịnh, từ tháng 3 năm 2006 ñến tháng 6 năm 2007 (Phan Thị Vân và ctv, 2011) ñã tiến hành nghiên cứu về FZP trên các ñối tượng cá nước ngọt Mẫu cá ñược thu từ kênh, ao ương giống và ao nuôi thương phẩm tại 2

xã Nghĩa Phú và Nghĩa Lạc (huyện Nghĩa Hưng, Nam ðịnh) Việc phân tích

714 mẫu cá thu một lần từ kênh, 1.761 mẫu từ ao ương và 4.715 mẫu cá ñược thu từ ao nuôi trương phẩm với tần suất 2 tháng 1 lần trong suốt 1 năm, ñã phát hiện ñược 5 loài ký sinh trùng có nguồn gốc từ cá ký sinh trên cá nước ngọt, bao

gồm: Clonorchis sinensis, Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Centrocestus

formosanus, Procerovum sp Loài sán lá ruột Haplorchis pumilio ñã ñược tìm thấy

nhiều nhất trong nghiên cứu này, trong khi ñó ấu trùng sán lá gan Clonorchis

sinensis lại rất ít khi tìm thấy (Phan Thị Vân và ctv, 2011)

Tại Thừa Thiên Huế, Trương Thị Hoa và Nguyễn Ngọc Phước (2009)

ñã nghiên cứu mức ñộ nhiễm ấu trùng metacercariae trên cá chép và cá trắm

cỏ giai ñoạn cá giống Qua phân tích, kiểm tra metacercaria trên 500 mẫu cá chép và cá trắm cỏ ở giai ñoạn cá giống, các tác giả ñã xác ñịnh ñược 3 loài

metacercariae trên cá chép và cá trắm cỏ, ñó là Centrocestus formosanus,

Clonorchis sinensis và Haplorchis taichui (Trương Thị Hoa và Nguyễn Ngọc

Phước, 2009)

Tại An Giang, tỷ lệ nhiễm metacercariae trên cá tra, rô ñồng và cá lóc nói chung lần lượt là 1,2%; 1,46% và 0,79%; thành phần loài bao gồm

Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Procerovum sp., Metagonimus sp và

sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini (Fibozopa, 2005) Mặc dù tỷ lệ nhiễm

thấp nhưng ñối với An Giang, một vùng chuyên sản xuất cá tra xuất khẩu lớn nhất trong cả nước thì ñây cũng là vấn ñề ñáng báo ñộng ñối với khía cạnh an toàn thực phẩm

Tại Nghệ An, ñiều tra trên các ñối tượng gồm trắm cỏ, chép, mè trắng, trôi, rô phi và các loài cá tạp trong ao thu ñược ngẫu nhiên từ quá trình ñánh bắt những loài cá trên thì kết quả thu ñược về tỷ lệ nhiễm lần lượt là 54%, 45%, 43%, 36%, 11%, 45% các loại metacercariae của sán lá ruột, với số lượng cao nhất là 3.163 metacercariae/1 cá thể Thành phần các loài

metacercariae ñược tìm thấy bao gồm: Haplorchis pumilio, Haplorchis

taichui, Haplorchis yokogawai, Centrocestus fomosanus và Echinostoma japonicus, trong ñó tỷ lệ nhiễm metacercariae của H pumilio cao nhất, lên tới

42,06% (Fibozopa, 2005)

Nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Hùng và ctv (2009) nhằm xác ñịnh mối liên hệ giữa sự nhiễm ấu trùng sán lá ruột ở trong ốc và cá ở các ao cá giống

ñã cho thấy: Cá bột không bị nhiễm FZT Không có quan hệ rõ ràng giữa mật

ñộ của các loài ốc nhiễm ấu trùng sán lá ruột và tỷ lệ hay cường ñộ nhiễm ấu trùng metacercariae ở cá Mặc dù tỷ lệ và cường ñộ nhiễm ở cá cao hơn ốc nhiễm trong ao, không thu ñược ốc có nhiễm ấu trùng trong ao, nhưng rõ ràng

sự lây nhiễm vẫn rất cao khi không tìm thấy ốc bị nhiễm ấu trùng Có thể sẽ cần những nỗ lực nghiêm khắc hơn ñể kiểm tra ấu trùng có trong ốc tại những

ao này hoặc xác ñịnh tại sao một lượng lớn ấu trùng cercariae vào ñược ao

Có thể nguồn gốc của ấu trùng và những công việc liên quan ñến vấn ñề kiểm soát sẽ ñược bàn luận (Nguyễn Mạnh Hùng và ctv, 2009)

Tại 4 tỉnh ðồng bằng sông Mêkông, nghiên cứu của ðinh Thị Thủy và ctv (2009) ñã ghi nhận sự xuất hiện của 4 loài sán lá có khả năng lây nhiễm cho người ở cá tra Tổng số 1.127 mẫu cá ñược thu từ các ao nuôi bao gồm

hệ nuôi nông hộ (Farm House System - FHS) (279) và hệ thống nuôi trang trại (Farm House Hold Systems - FHHS) (848) ñược kiểm tra bằng các

phương pháp cổ ñiển và sinh học phân tử Các loại ấu trùng sán Haplorchis

pumilio, H taichui, Centrocestus formosanus và Procerovum sp ñược phát hiện

và phân tích trong mối quan hệ với mùa vụ, phương thức quản lý, kích cỡ vật

chủ, vị trí nhiễm Nói chung, tỷ lệ nhiễm ở cá cao hơn vào mùa mưa từ tháng

4 ñến 10 so với mùa khô Tỷ lệ nhiễm và cường ñộ nhiễm thấp hơn với cá

nuôi trong hệ thống FHHS so với FHS Cá ở các ñộ tuổi từ 60 ñến 90 ngày có

tỷ lệ nhiễm cao nhất, phản ánh sự có mặt của mối nguy lây nhiễm luôn luôn

thường trực trong ao cá sau khi thả giống Ký sinh trùng ñược phát hiện ở

phần cơ, ñầu và vây; ñặc biệt là các gốc vây Tầm quan trọng của cá tra hiện

nay ñang gia tăng cả ở thị trường trong nước, quốc tế và các phương pháp

quản lý trong trang trại nuôi và công nghệ chế biến có thể giảm thiểu mức ñộ

rủi ro từ ñó cải thiện ñược tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm cá

tra (ðinh Thị Thủy và ctv, 2009) Phạm Cử Thiện và ctv ñã ñiều tra khảo sát về sự lây nhiễm sán lá gây

bệnh ở người có nguồn gốc thủy sản (Fishborne Zoonotic Trematode - FZT)

trên cá trê lai và cá tai tượng ñã ñược thực hiện ở ñồng bằng sông Cửu Long,

tập trung vào các hệ thống nuôi ghép và nuôi kết hợp trong hệ thống vườn -

ao - chuồng (VAC), trong ñó có phân tích hiện trạng sử dụng phân chuồng

làm thức ăn cho cá Các mẫu cá ñã ñược thu trong cả mùa mưa và mùa khô Kết

quả cho thấy metacercariae FZT không có trong cá trê lai nuôi ñơn, tuy vậy lại rất

phổ biến ở cá nuôi thuộc hệ thống VAC Metacercariae sán lá thuộc họ

Heterophyidae: Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Centrocestus formosanus

và Stellantchasmus falcatus, với tỷ lệ nhiễm như sau: 1,7% ở cá tai tượng nuôi

ñơn; 6,6% trong cá chép nuôi ghép và 3,0% trong nuôi hệ thống VAC

Haplorchis pumilio là loài sán phổ biến nhất, chiếm trên 58,0% ấu trùng

metacercariae phát hiện ñược ở cá Cường ñộ nhiễm mạnh nhất là ở cá chép

nuôi ghép, ñặc biệt trong mùa mưa lũ Kết quả cho thấy một số hệ thống nuôi

cá ñang tồn tại những rủi ro về FZT (Phạm Cử Thiện và ctv, 2007)

Theo Jakob Skov (2009) việc khảo sát sán lá song chủ gây bệnh ở người nhiễm trên ốc và cá trong các hệ thống nuôi cá nước ngọt miền Bắc Việt Nam ñã cho thấy sự xuất hiện của ba loại ấu trùng cercariae parapleurolophocercous trên

ký chủ ốc Melanoides tuberculata và sự hiện diện của nang kén giống sán lá ruột nhỏ (thuộc hai loài H pumilio và H taichui) cũng như Procerovum sp trên mô cá

nuôi (cá mè trắng, cá trôi Ấn và cá rô ñồng) Các ñặc ñiểm hình thái không ñủ ñể chứng minh mối liên hệ giữa ấu trùng cercariae với nang kén Việc áp dụng

kỹ thuật phân tử bằng phản ứng PCR và giải mã trình tự hệ gen sử dụng thu nhận gen ITS 2 (DNA ribosome) ñối với ấu trùng cercariae và nang kén ñã

làm rõ ñược quan hệ giữa một loại ấu trùng cercariae ñối với nang kén H

pumilio ñược phân lập Ngoài ra, sử dụng hệ gen ITS của H pumilio trưởng

thành ñã cho thấy sự tương ñồng 100% ở vùng này Tuy không loại cercariae

nào có sự tương ñồng về trật tự hệ gen ñối với H taichui, nhưng giữa một loại cercariae với nang kén Procerovum sp ñã phát hiện thấy mức ñộ tương ñồng tới

99% ðiều này cho thấy rằng sán lá ký sinh trên cá nuôi có thể vào ao từ nguồn bên ngoài và có thể xâm nhập tự do khi nguồn nước ao ñược trao ñổi với nước sông Kết quả nghiên cứu này ñã làm nảy sinh nhu cầu áp dụng kỹ thuật phân tử nhằm hỗ trợ cho các nghiên cứu sinh thái học ñối với nang kén

ở các hệ sinh thái phức tạp Các loài ký sinh trùng ñã phát hiện tại các ao cá không chỉ ảnh hưởng tới sức khỏe cá nuôi mà còn tiềm ẩn nguy cơ gây bệnh nguy hiểm cho con người khi ăn cá chưa chín (Jakob Skov, 2009)

2.4 Tình hình nghiên cứu về sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio

H pumilio thuộc giống Haplorchis, Loose 1899 trong giống này có 3

loài bao gồm H taichui, H yokogawai và H pumilio H pumilio là một trong

31 loài thuộc họ Heterophyidae và nằm trong số 70 loài sán lá ruột có khả

năng lây nhiễm cho con người (Chai và ctv, 2005)

Theo tài liệu phân loại của dự án FIBOZOPA, nhóm Haplorchis sp có

giác bụng lớn, giác miệng không phát triển và có răng xung quanh, số lượng

và hình dạng răng bám trên giác bụng khác nhau là ñặc ñiểm ñể phân loại

giữa chúng H pumilio có 30-36 răng thường xếp thành 2 hàng, H taichui có

từ 11-18 răng lớn, trong khi H yokogawai có số lượng răng lớn hơn khoảng

70 răng nhỏ (Sổ tay phòng thí nghiệm dự án FIBOZOPA, 2005) Bào nang ấu

trùng metacercariae của loài H pumilio có hình elip, kích cỡ (0,16-0,19) x

(0,14-0,16) mm, thành nang dày, giác bụng nhỏ hơn giác miệng, giác bụng có thể biến ñổi và phát triển thành các gai (răng), sán có từ 36-42 răng nhỏ xếp thành 1-2 hàng quanh ống sinh dục bụng hoàn chỉnh, ấu trùng không có gonotyl, tuyến bài tiết hình chữ O và chiếm phần lớn cơ thể phía sau (FIBOZOPA Laboratory manual, 2005)

Hình 2: Cercariae và metacercariae (Skov và ctc, 2009)

PHẦN III đỐI TƯỢNG,

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Sán lá ruột nhỏ H pumilio giai ựoạn ấu trùng cercariae - pleurolophocercous ựược lấy từ ốc Melanoides tuberculata thu từ xã Nghĩa

Lạc, huyện Nghĩa Hưng, Nam định - vùng dịch tễ của sán lá truyền lây qua

cá, ựặc biệt là sán lá ruột H Pumilio

Cá rô phi Oreochromis niloticus giai ựoạn cá hương lấy từ Viện nghiên

cứu NTTS1, đình Bảng Từ Sơn, Bắc Ninh ựược kiểm tra ựầu vào không nhiễm ấu trùng sán Sau ựó cá ựược nuôi thuần dưỡng trong vòng 1 tuần trước khi tiến hành thắ nghiệm

Chuột bạch Mus musculus, 4 tuần tuổi, có trọng lượng 20-30g ựược mua từ Phòng ựộng vật thắ nghiệm, Viện vệ sinh dịch tễ TW, Hà Nội

Hình 3 ðối tượng nghiên cứu 3.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

• Kính hiển vi soi nổi 3X

• Kính hiển vi quang học, với các vật kính 4X, 20X, 60X, 100X

3.2.2 Hóa chất thắ nghiệm

Ớ Pepsin, axit Clohydric (HCl), NaCl dùng ựể tiêu cơ cá

Ớ Dãy nồng ựộ cồn (50 - 100%), Xylen, Bomsal Canada

Ớ Dung dịch Eosin và Hematoxyline ựể nhuộm tiêu bản mô

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Bố trắ thắ nghiệm

∗ Xác ựịnh cường ựộ nhiễm cercariae trên ốc

Thắ nghiệm ựược bố trắ ựể xác ựịnh cường ựộ thải ấu trùng cercariae

của ốc M tuberculata sau 1 và 4 giờ ựược tiến hành như sau;

- đặt riêng từng cá thể ốc vào trong lọ nhựa tròn (2.5 x 3cm), màu trong suốt có chứa 0.5cm nước sạch

- Sau 1 giờ, chuyển ốc sang lọ nhựa khác có kắch thước giống nhau chứa 0.5cm nước sạch thêm 4 giờ sau ựó loại bỏ ốc ra khỏi cốc

- Sử dụng pipette ựể hút ấu trùng cercariae ra ựĩa petri, soi và ựếm số lượng cercariae thải ra trong mỗi cốc nhựa ở thời ựiểm 1 và 4 giờ

Thắ nghiệm ựược lặp lại với 10 cá thể ốc nhiễm khác nhau ựược thu cùng một thời ựiểm

∗ đánh giá sự biến ựộng metacercariae trên cá

Nghiệm thức 1: 500 cá rô phi O niloticus ựược gây nhiễm với n= 40 cá thể ốc M tuberculata có nhiễm ấu trùng cercariae trong thùng xốp

(40x50x30cm) chứa nước sạch có ựộ sâu là 10 cm

Nghiệm thức 2: cũng với các ựiều kiện tương tự nhưng chỉ ựược gây

nhiễm với liệu thấp một nửa so với nghiệm thức 1(1/2 n= 20 ốc M

tuberculata) nhiễm ấu trùng cercariae

Sau 2 giờ phơi nhiễm trong nước, cá ở các Nghiệm thức 1 và 2 ựược chuyển sang 2 bể kắnh tương ứng có kắch thước giống nhau (50 x 90 x 50cm)

Cá ựược nuôi trong ựiều kiện thắ nghiệm trong vòng 15 tuần, sử dụng cho ăn

thức ăn công nghiệp (cargill) phù hợp với kắch cỡ cá, và có chế ựộ thay nước sạch (giếng khoan) hàng ngày

Mỗi nghiệm thức, 15 cá thể ựược thu vào các tuần thứ 2, 3, 6, 8, 10, 11,

12, 13, 14 và 15 sau gây nhiễm ựể kiểm tra ấu trùng nhiễm trên cá nhằm ựánh giá sự biến ựộng về tỷ lệ và cường ựộ nhiễm

Mỗi nghiệm thức, 2-5 cá thể ựược thu vào các ngày 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 sau gây nhiễm, cố ựịnh trong formalin 10% ựể nghiên cứu sự phát triển của metacercaria trong cá

Hình 4: Hình thức gây nhiễm ấu trùng sán cho cá rô phi

∗ đánh giá sự phát triển của ấu trùng

Thắ nghiệm ựược bố trắ với 500 cá rô phi O niloticus (0.1 g) nhiễm với

60 cá thể M tuberculata có nhiễm pleurolophocercous trong 5 giờ

Metacercariae sẽ ựược ựịnh kỳ thu bằng cách tiêu cơ và phân lập từ 30, 30,