PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG NGUYÊN BÀO SỢI NGƯỜI TỪ BÁNH NHAU

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG NGUYÊN BÀO SỢI NGƯỜI TỪ BÁNH NHAU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y-DƯỢC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS.BS.TRẦN CÔNG TOẠI

BS NHAN NGỌC HIỀN

THÀNH PHỐ H`Ồ CHÍ MINH – NĂM 2004

PHẦN I : GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI

I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 5

II.1 MỤC TIÊU TỔNG QUÁT 5

II.2 MỤC TIÊU CỤ THỂ 5

PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU I SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NHAU 6

I.1 VỊ TRÍ LÀM TỔ CỦA PHÔI 6

I.2 CÁC THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA NHAU 6

I.2.1 BÁNH NHAU 6

I.2.2 MÀNG ỐI 7

I.2.3 MÀNG ĐỆM 7

I.2.4 HỒ MÁU HAY KHOẢNG GIAN GAI NHAU 7

I.2.5 VÁCH NHAU 7

I.2.6 MÚI NHAU 7

I.2.7 ĐĨA ĐÁY 8

I.2.8 VÒNG VIỀN HAY BỜ GIỚI HẠN NGOẠI VI 8

I.2.9 DÂY RỐN 8

I.2.10 MÀNG NHAU 8

I.3 SỰ TẠO NHAU 9

I.3.1 SỰ TẠO NHAU TỪ PHÍA CON 10

I.3.1.1 SỰ TẠO TÚI ĐỆM 10

I.3.1.2 SỰ TẠO CÂY GAI NHAU (SỰ TẠO ĐĨA ĐỆM) 10

I.3.2 SỰ TẠO NHAU TỪ PHÍA MẸ 12

I.3.2.1 CẤU TRÚC MÔ HỌC NỘI MẠC TỬ CUNG 12

I.3.2.2 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG THÀNH 12

I.3.2.3 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG BAO 13

I.3.2.4 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG ĐÁY 13

I.4 CHỨC NĂNG CỦA NHAU 14

I.4.1 CHỨC NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT 14

I.4.2 CHỨC NĂNG BÀI TIẾT HORMONE 15

I.4.3 CHỨC NĂNG MIỄN DỊCH 15

II ĐẠI CƯƠNG VỀ NGUYÊN BÀO SỢI 16

II.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG 16

II.2 TẾ BÀO SỢI (FIBROCYTE) 18

II.2.1 NGUỒN GỐC 18

II.2.2 HÌNH DẠNG 19

II.2.3 CHỨC NĂNG 21

II.3 NGUYÊN BÀO SỢI (FIBROBLAST) 21

II.3.1 NGUỒN GỐC 21

II.3.2 HÌNH DẠNG 22

II.3.3 CHỨC NĂNG 23

II.3.4 KHOẢNG ĐỜI 25

III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VIỆC NUÔI TẾ BÀO 25

III.1 GIÁ THỂ 25

III.2 PHA KHÍ 26

III.2.1 OXYGEN 26

III.2.2 CO 2 27

III.3 MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC YẾU TỐ BỔ SUNG 27

III.4 ĐẶC TÍNH VẬT LÝ 29

III.4.1 P H 29

III.4.2 DUNG DỊCH ĐỆM 29

III.4.3 ÁP SUẤT THẨM THẤU 30

III.4.4 NHIỆT ĐỘ 30

III.4.5 TÍNH NHỚT 30

III.4.6 ÁP LỰC SỨC CĂNG BỀ MẶT VÀ SỰ TẠO BỌT 30

IV KHÁI QUÁT VỀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 31

IV.1 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG 31

IV.1.1 DUNG DỊCH MUỐI ĐỆM 31

IV.1.2 AMINO ACID 32

IV.1.3 VITAMINE 32

IV.1.4 MUỐI 32

IV.1.5 GLUCOSE 33

IV.1.6 HUYẾT THANH 33

IV.2 MỘT VÀI LOẠI MÔI TRƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ MÔ ĐỘNG VẬT 35

IV.2.1 MÔI TRƯỜNG BM 35

IV.2.2 MÔI TRƯỜNG EMEM 35

IV.2.3 MÔI TRƯỜNG DMEM 35

IV.2.4 MÔI TRƯỜNG F10, F12 35

IV.2.5 MÔI TRƯỜNG ISCOVE 35

IV.2.6 MÔI TRƯỜNG 5A 36

IV.2.7 MÔI TRƯỜNG RPMI – 1640 36

IV.2.8 MÔI TRƯỜNG 199 36

IV.3 ĐẶC ĐIỂM BA LOẠI MÔI TRƯỜNG EMEM, DMEM VÀ AMNIOMAX ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NUÔI NGUYÊN BÀO SỢI TRONG ĐỀ TÀI NÀY IV.3.1 MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (MEM) 36

IV.3.1.1 MÔ TẢ SẢN PHẨM 36

IV.3.1.2 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG EMEM 37

IV.3.1.3 ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN 39

IV.3.1.4 CÁCH THỨC SỬ DỤNG 39

IV.3.2 DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM 39

IV.3.2.1 MÔ TẢ SẢN PHẨM 40

IV.3.2.2 THÀNH PHẦN CỦA DMEM 40

IV.3.2.3 ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN 42

IV.3.2.4 ĐẶC TÍNH MÔI TRƯỜNG 42

IV.3.3 SẢN PHẨM AMNIOMAX™-C100 43

IV.3.3.1 MÔ TẢ SẢN PHẨM 43

IV.3.3.2 CÔNG THỨC MÔI TRƯỜNG 43

IV.3.3.3 ĐIỀU KIỆN GIỮ 44

IV.3.3.4 CÁCH THỨC SỬ DỤNG 44

V ỨNG DỤNG CỦA VIỆC NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI 44

V.1 ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC Y HỌC 44

V.2 ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC KHOA 44

V.3 ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SINH HỌC 44

V.4 ỨNG DỤNG TRONG CHỌN GIỐNG VẬT NUÔI 45

PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP III.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 46

III.1 CÁC MỤC TIÊU CẦN ĐƯỢC KHẢO SÁT 46

III.2 TRÌNH TỰ THÍ NGHIỆM 47

III.3 CÁC QUY TRÌNH CHÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM 48

III.3.1 VÔ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 48

III.3.2 VÔ TRÙNG NƠI TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 48

III.3.3 CÁC QUY TRÌNH SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM 49

III.3.3.1 THU NHẬN VÀ XỬ LÝ MẪU 49

III.3.3.2 PHÂN LẬP VÀ TÁCH KHỐI MÔ 49

III.3.3.3 CÁC QUY TRÌNH NUÔI TẾ BÀO 50

III.3.3.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO BẰNG PHỒNG ĐẾM NEUBAUER 51 III.3.3.5 PHƯƠNG PHÁP THAY MÔI TRƯỜNG 52

III.3.3.6 CẤY CHUYỀN TẾ BÀO 53

III.3.3.7 CÁCH ĐẾM TẾ BÀO TRÊN QUANG TRƯỜNG 20X 53

III.3.4 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 54

III.3.4.1 DỤNG CỤ 54

III.3.4.2 THIẾT BỊ 54

III.3.4.3 HÓA CHẤT 56

III.3.4.4 MÔI TRƯỜNG 56

PHẦN IV: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN

IV.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA NGUYÊN BÀO SỢI TỪ MÔ NHAU.57

IV.1.1 KẾT QỦA QUAN SÁT MẪU MÔ NHAU THU NHẬN TỪ MỔ NỌI SOI Ở TAY VÒI

57

IV.1.2 KẾT QỦA QUAN SÁT MẪU MÔ NHAU THU NHẬN QUA ĐƯỜNG SANH MỔ Ở NHAU ĐỦ THÁNG 57

IV.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI THU NHẬN TỪ MẪU MÔ NHAU SỔ TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU 60

IV.2.1 KẾT QUẢ 61

IV.2.1.1 NGÀY THỨ NHẤT 61

IV.2.1.2 NGÀY THỨ HAI 63

IV.2.1.3 NGÀY THỨ BA 65

IV.2.1.4 NGÀY THỨ TƯ 67

IV.2.1.5 NGÀY THỨ NĂM 69

PHẦN V: BÀN LUẬN 72

PHẦN VI : KẾT LUẬN 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC 85

PHẦN I : GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI

II ĐẶT VẤN ĐỀ

Vào những năm đầu của thập niên 1960, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm và chú ý đến dòng nguyên bào sợi, là những tế bào non chưa trưởng thành do chúng có những đặc tính đặc biệt như :

Khả năng phân chia in vitro dài (50 – 70 lần), có khả năng biệt hóa in vitro thành các dạng tế bào xương, tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào mô cơ trơn, nguyên bào cơ và một số dạng sơ cấp khác [30] ( một số người cho rằng chúng có khả năng biệt hoá thành tế bào thần kinh ) dưới những điều kiện biệt hóa thích hợp Chúng có khả năng tăng trưởng mạnh và là loại tế bào chiếm ưu thế trong các mô liên kết của cơ thể, giữ vai trò quan trọng trong việc thành lập khung của các mô liên kết

Nguyên bào sợi là loại tế bào chịu trách nhiệm chính trong việc chế tiết ra các loại sợi như : sợi collagen, sợi elastin và các loại proteoglycans, glycoprotein, glycosaminoglycan v.v… trong cơ thể và chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm lành vết thương

Với những đặc tính nổi bật của mình, nguyên bào sợi đã được nuôi cấy và ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau, các nhà khoa học và các Viện nghiên cứu đã đi vào nuôi cấy tế bào này và có những kết quả thành công rất khả quan, cụ thể như :

Theo Hayflick và Moorhead (1961), dòng nguyên bào sợi WI-38 lấy từ mô phổi của thai người sẩy khoảng ba tháng tuổi, là một dòng tế bào xác định và dòng tế bào đầu tiên được thiết lập dùng để nghiên cứu sự lão hóa ở mức độ tế bào Khoảng đời in vitro của dòng tế bào này là 50 thế hệ [31]

Dòng tế bào IMR-90 (nữ) và IMR-91 (nam), dòng nguyên bào sợi phổi lấy từ thai người đã được thiết lập bởi Viện NIA Aging Cell Respository ngày 7/7/1975 Khoảng

đời in vitro không được xác định nhưng số lượng tế bào tối đa đạt được là khoảng 58 –

73 lần phân chia và được sử dụng để nghiên cứu sự lão hóa của tế bào

Tiếp theo sau những công bố nói trên, dòng tế bào TIG-1 đã được thiết lập ở Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology ngày 28/7/1976, đã sử dụng mô phổi từ thai sẩy năm tháng tuổi Những tế bào được tách rời bằng hoạt tính của enzyme trypsin Khoảng đời in vitro đạt được là khoảng 67 thế hệ, dùng để nghiên cứu sự lão hóa của tế bào Ngoài việc lấy mẫu từ phôi, thai sẩy, người ta cũng có thể lấy mẫu từ cá thể trưởng thành

Nguyên bào sợi phổi người (HLF) được lấy từ phần trung mô của mô phổi người bình thường Chúng được bảo quản lạnh ở lần cấy chuyền đầu tiên, có thể được nuôi và tăng sinh ít nhất 10 lần nhân đôi thế hệ Nghiên cứu cho thấy rằng HLF đặc biệt quan trọng trong việc nghiên cứu để tạo ra một dạng thuốc mới để chữa trị bệnh hen suyễn [36] Những thử nghiệm dựa trên cơ sở của nguyên bào sợi đã được ứng dụng để chế tạo một loại thuốc kháng sinh mới [43] Nghiên cứu cũng đã phát hiện dịch chiết thuốc lá thêm vào môi trường nuôi sẽ ảnh hưởng ức chế sự tăng trưởng của HLF

Nguyên bào sợi tim người (Human Cardiac Fibroblasts (HCF)] được lấy từ mô tim bình thường ở người Chúng được giữ lạnh ở lần cấy chuyền thứ hai và có thể được nuôi tăng sinh ít nhất 6 lần nhân đôi thế hệ

Hình 1: Nguyên bào sợi phổi người lấy từ phần trung

mô ở người bình thường

HCF đã được sử dụng dùng để nghiên cứu sự ảnh hưởng của TNF-α và Angiotensin (Ang) II trên chức năng của nguyên bào sợi [37] Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sự biểu hiện của MyoD có thể ảnh hưởng đến sự hình thành sợi cơ của nguyên bào sợi tim [26]

Nguyên bào sợi da người - Human Dermal Fibroblasts (HDF) - lấy từ phần hạ bì ở bao quy đầu của trẻ bình thường mới sinh, được bảo quản lạnh ở lần nuôi cấy sơ cấp cuối cùng, có thể được nuôi tăng sinh ít nhất là 16 lần nhân đôi thế hệ

Năm 1993, hai loại nguyên bào sợi từ dây chằng bao xung quanh răng đã được nuôi cấy theo phương pháp nuôi nguyên phát từ các mảnh mô ban đầu bởi Hou và Yaeger [35]

Đếnnăm 1998, Chiu_Po CHAN và cộng sự đã lặp lại thí nghiệm trên Mẫu mô bao

Hình 2: Nguyên bào sợi tim người (Human Cardiac Fibroblasts

(HCF)] được lấy từ mô tim bình thường ở người

Hình 3: Nguyên bào sợi cơ người [Human Dermal Fibroblasts (HDF)]

lấy từ phần hạ bì ở bao quy đầu của trẻ mới sinh ở người bình thường

một thìa nạo Mô được nuôi trên đĩa 100mm bằng phương pháp nuôi mô nguyên phát trong môi trường DMEM chứa 10%FCS, 100U/ml penicilline và 100µg/ml streptomycine Sau 7 – 10 ngày nuôi, nguyên bào sợi có thể di chuyển ra ngoài từ những mảnh mô nuôi ban đầu Tác giả đã sử dụng dòng nguyên bào sợi này để nghiên cứu sự ảnh hưởng của Thrombin trên sự tăng trưởng, tổng hợp protein, sự bám dính, khả năng tạo cụm tế bào và hoạt động của enzyme Alkaline phosphatase [21]

Năm 2003, nguyên bào sợi được tách từ phần trung bì của mẫu sinh thiết da (phần

da lành lấy gần phần mô bị bỏng) ở người trưởng thành [5] nhưng chưa được đưa vào nuôi cấy do khả năng nhiễm còn quá cao trong thời gian tách dài (bằng quy trình tách trypsin lạnh) và có thể do tế bào bị chết nếu lấy quá gần phần mô bỏng

Ngoài ra, nguyên bào sợi còn được nuôi từ các động vật thí nghiệm như : Dòng tế bào Vero – Dòng Nguyên bào sợi lấy từ thận Khỉ ở cá thể trưởng thành [34]; Dòng tế bào 3T3 A31 - Dòng nguyên bào sợi lấy từ phôi Chuột[15]; Dòng tế bào NRK49F - Dòng nguyên bào sợi lấy từ thận Chuột ở cá thể trưởng thành[22] v.v… Tất cả các dòng nguyên bào sợi trên đều đã được nuôi thành công và được dùng để nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm về các vấn đề như nghiên cứu quá trình lão hoá của tế bào, sự tương tác của tế bào, sự tổng hợp các chất, sự di chuyển của tế bào v.v…

Với những thành công trên, việc nuôi nguyên bào sợi đã được phát triển ngày một không ngừng ở các phòng thí nghiệm trên thế giới và có những ứng dụng thực tế to lớn Tuy nhiên trong điều kiện Việt Nam, đây là một lĩnh vực còn khá mới mẻ Với mong muốn tìm hiểu về lĩnh vực nuôi cấy tế bào mà cụ thể là nguyên bào sợi, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài này

II MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

II.1 MỤC TIÊU TỔNG QUÁT

Xây dựng một phương pháp nuôi cấy tối ưu đối với nguyên bào sợi từ mô gai nhau

II.2 MỤC TIÊU CỤ THỂ

− Đánh giá hiệu quả của các phương pháp nuôi cấy khác nhau đối với dòng nguyên bào sợi lấy từ mẫu mô gai nhau

− Xác định phương pháp nuôi tối ưu đối với nguyên bào sợi từ mô gai nhau

So sánh khả tănng trưởng của nguyên bào sợi trên các loại môi trường nuôi khác nhau : AMNIOMAX, DMEM, EMEM, AMNIOMAX + EMEM

PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NHAU

I.1 VỊ TRÍ LÀM TỔ CỦA PHÔI

Phôi nang thường làm tổ ở mặt trước phần đáy của tử cung Nếu phôi làm tổ ở phần

thấp phía dưới thì khi bánh nhau phát triển dễ dẫn đến nhau tiền đạo, tuỳ theo mức độ che lấp phần trong cổ tử cung mà người ta gọi là nhau bám mép, nhau tiền đạo một phần hay toàn phần

Phôi có thể làm tổ ở ngoài tử cung, trong trường hợp này gọi là thai lạc chổ hay thai

ngoài tử cung Khoảng 90% thai ngoài tử cung xảy ra ở vòi trứng, ít hơn là các vị trí nơi buồng trứng cắm vào buồng tử cung, buồng trứng, phúc mạc, cổ tử cung Nguyên nhân

Hình 4 : đường đi của trứng và sự làm tổ bình thường

thường là do có sự cản trở đường di chuyển của phôi nang từ vòi trứng vào buồng tử cung (viêm nhiễm vùng chậu)

I.2 CÁC THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA NHAU

I.2.1 BÁNH NHAU (PLANCENTA)

Bánh nhau thường có hình đĩa, đường kính từ 18 – 20 cm, bề dày từ 2 – 3 cm (trung tâm dày khoảng 3 cm và mỏng dần ra ngoại vi) Trọng lượng trung bình 470g (bằng 1/6 trọng lượng thai) Bánh nhau thường có hình bầu dục, ngoài ra còn có các dạng khác như bánh nhau phụ, nhau hai thùy, nhau màng, nhau móng ngựa Mặc dù có nhiều dạng song hình dạng bánh nhau không ảnh hưởng đến sự phát triển của thai Trong suốt thời gian mang thai có sự thay đổi về khối lượng và vị trí phần màng đệm có gai nhau

I.2.2 MÀNG ỐI (AMNIOTIC MEMBRANE)

Màng ối bình thường trong veo, bóng, láng Màng ối của bánh nhau dễ bóc, màng ối của màng nhau và dây rốn khó bóc

I.2.3 MÀNG ĐỆM (CHORIONIC MEMBRANE)

Màng đệm nằm ngay dưới màng ối Ở bánh nhau, màng đệm phát triển thành đĩa đệm; các gai nhau không dừng lại ở gai nhau cấp I, gai nhau cấp II, gai nhau cấp III mà tiếp tục phát triển thành cây gai nhau với nhiều loại gai nhau khác nhau về đặc điểm cấu tạo và chức năng

I.2.4 HỒ MÁU HAY KHOẢNG GIAN GAI NHAU (INTERVILLOUS SPACES)

Hồ máu (hay khoảng gian gai nhau) có ở màng rụng đáy, thuộc lớp chức năng của nội mạc tử cung, là những hốc chứa máu sau khi nội mạc tử cung bị lá nuôi hợp bào phá hủy

I.2.5 VÁCH NHAU (PLANCENTAL SEPTA)

Vách nhau có ở bánh nhau, là phần mô còn lại của lớp chức năng của nội mạc tử cung không bị lá nuôi hợp bào phá hủy Bên trong các vách nhau có những mạch máu lớn gọi là các mạch máu tử cung-nhau cong queo mở trực tiếp vào những hồ máu

I.2.6 MÚI NHAU (COTYLEDONS)

Múi nhau hay đơn vị nhau, có thể nhận ra khi quan sát mặt đáy bánh nhau sau sổ nhau: sần sùi, có nhiều rãnh chia thành những múi nhau; các rãnh này ứng với những nơi trước đó có vách nhau bên trong hồ máu Những vách nhau và rãnh là giới hạn của một múi nhau Mỗi múi nhau là một đơn vị cấu tạo, bên trong có một cây gai nhau

I.2.7 ĐĨA ĐÁY (BASAL PLATE)

Là phần màng rụng đáy (decidua basilis) còn lại sau khi hồ máu hình thành, thuộc lớp đáy của nội mạc tử cung, gồm có hai lớp : lớp đặc và lớp xốp Lớp xốp ở bên dưới, tiếp xúc với cơ tử cung và là chổ nhau bong khi sổ nhau

I.2.8 VÒNG VIỀN HAY BỜ GIỚI HẠN NGOẠI VI (PERIPHERAL MARGIN)

Có ở rìa bánh nhau, là nơi mặt ngoài màng đệm dày, đục tạo thành một đường viền

I.2.9 DÂY RỐN (UMBILICAL CORD)

Dây rốn gồm cuống phôi, niệu nang và các mạch máu rốn Dây rốn thường cắm ở gần trung tâm bánh nhau, song cũng có thể cắm ở bất kỳ vị trí nào khác Dây rốn thường có đường kính khoảng 1-2 cm, dài trung bình 55 cm

Bình thường dây rốn có hai động mạch rốn và một tĩnh mạch rốn, xung quanh các mạch là mô chất đông được gọi là chất Wharton

I.2.10 MÀNG NHAU

Có cấu tạo các lớp tương tự như ở bánh nhau, song mức độ phát triển kém hơn (cũng có màng ối, màng đệm và màng rụng)

I.3 SỰ TẠO NHAU

Nhau hình thành từ phía con và từ phía mẹ: phần nhau từ phía con có nguồn gốc từ lá nuôi và trung bì ngoài phôi, phần nhau từ mẹ có nguồn gốc từ nội mạc tử cung

Khởi đầu, túi đệm bao bọc toàn bộ phôi Về sau, vùng túi đệm phát triển sẽ tạo bánh nhau, vùng túi đệm kém phát triển sẽ tạo màng nhau

Bên cạnh khoang tử cung, ban đầu còn có khoang ối, khoang noãn hoàng và khoang ngoài phôi; về sau chỉ còn khoang ối

Hình 6: hình dạng của bánh nhau từ phần mẹ và phần thai

Hình 5 : các thành phần cấu tạo của nhau

I.3.1 SỰ TẠO NHAU TỪ PHÍA CON (SỰ TẠO TÚI ĐỆM VÀ CÂY GAI NHAU)

I.3.1.1 SỰ TẠO TÚI ĐỆM

Túi đệm (chorionic sac) được hình thành qua 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn tiền hốc: khi phôi nang có lá nuôi tế bào và lá nuôi hợp bào Lá nuôi

hợp bào được hình thành do các tế bào lá nuôi tế bào sát nhập lại, bên trong lá nuôi hợp bào không có màng bào tương ngăn cách giữa chúng Lá nuôi hợp bào xuất hiện đầu tiên ở cực phôi rồi sau đó lan rộng dần bao hết toàn bộ phôi Do lá nuôi hợp bào giúp phôi làm tổ và do cực phôi có lá nuôi hợp bào nên cực phôi thường cũng là cực làm tổ

+ Giai đoạn hốc: các hốc nhỏ xuất hiện bên trong lá nuôi hợp bào, sau đó các hốc

nhỏ này sẽ sáp nhập thành hốc lớn Phần lá nuôi hợp bào còn lại giữa các hốc bắt đầu có hình thù của các gai nhau ban đầu

+ Giai đoạn gai nhau ban đầu: các hốc bên trong lá nuôi sáp nhập lại tạo thành hệ

thống gọi là hồ máu hay khoảng gian gai nhau Lúc này lá nuôi tạo nên màng đệm hay túi đệm với hình ảnh bánh nhau ban đầu có dạng túi bao lấy toàn bộ phôi

I.3.1.2 SỰ TẠO CÂY GAI NHAU (SỰ TẠO ĐĨA ĐỆM)

Các gai nhau ban đầu tiếp tục phát triển tạo cây gai nhau (đĩa đệm) với năm loại gai nhau:

+ Gai nhau trung mô (mesenchymal villus) cấu tạo giống các gai nhau cấp III (có

lá nuôi, mô lõi và mao mạch) Có bản chất là chồi, có tính sinh sản và biệt hóa cho ra các loại gai nhau khác Gai nhau trung mô còn được gọi là chồi lá nuôi

+ Gai nhau trung gian chưa trưởng thành (immature intermediate villus) biệt

hóa từ các gai nhau trung mô trong ba tháng đầu thai kỳ và sau đó biệt hóa tiếp thành các gai nhau gốc Gai nhau trung gian chưa trưởng thành có mô lõi dạng lưới, có các

kênh bên trong mô lõi được tạo nên từ các tế bào lưới và bên trong các kênh có các đại thực bào gai nhau gọi là các tế bào Hofbauer

+ Gai nhau gốc (stem villus) có nhiều kích cỡ được gọi tên từ lớn đến bé là thân,

nhánh to, nhánh vừa, nhánh bé Đặc điểm cấu tạo của các gai nhau gốc lá có mô lõi xơ hoá nhiều Loại gai nhau này có thể ví như các đoạn thân nhánh của một cây trồng, chỉ có nhiệm vụ dẫn truyền các chất ở ba tháng cuối thai kỳ (trong ba tháng đầu thai kỳ các gai nhau gốc có trao đổi chất)

+ Gai nhau trung gian trưởng thành ( mature intermediate villus) biệt hóa từ các

gai nhau trung mô trong ba tháng cuối thai kỳ Sau đó, các gai nhau trung gian trưởng thành sẽ sinh ra các gai nhau tận Đặc điểm cấu tạo của các gai nhau trung gian trưởng thành là có kích thước tương đương với nhau gai tận, có nhiều mao mạch nhưng chưa có xoang mao mạch

+ Gai nhau tận (terminal villus) có chứa năng trao đổi chất, đảm bảo nhiệm vụ

của bánh nhau Gai nhau tận được sinh ra từ các gai nhau trung gian trưởng thành và là loại gai nhau có số lượng nhiều nhất ở bánh nhau đủ tháng Đặc điểm cấu tạo của gai nhau tận là có hệ mao mạch phong phú phát triển thành các dạng xoang, được gọi là các xoang mao mạch Bên ngoài các xoang mao mạch, lớp lá nuôi tế bào còn rất mỏng; và như thế xoang mao mạch cùng với lá nuôi hợp bào mỏng tạo thành một cấu trúc đặc trưng của gai nhau tận gọi là tấm biểu mô (epithelial plate)

I.3.2 SỰ TẠO NHAU TỪ PHÍA MẸ (sự biến nội mạc tử cung thành hồ máu, đĩa đáy với lớp đặc và lớp xốp)

I.3.2.1 CẤU TRÚC MÔ HỌC NỘI MẠC TỬ CUNG

Khi phôi làm tổ, hoàng thể tiết ra progesteron làm nội mạc tử cung có những thay đổi quan trọng gọi là phản ứng màng rụng (decidual reaction) Nội mạc tử cung lúc này

được gọi là màng rụng (decidua) vì khi đẻ một phần màng này sẽ bị rụng và bong ra ngoài

Tuỳ theo vị trí, có ba loại màng rụng: (1) màng rụng bao là phần nội mạc tử cung bọc ngoài phôi hướng vào trong lòng khoang tử cung, (2) màng rụng thành là phần nôi mạc tử cung còn lại trong khoang tử cung không phủ bề mặt phôi, ở phía đối diện với màng rụng bao, và (3) màng rụng đáy là phần nội mạc tử cung nằm giữa phôi và cơ tử cung Màng rụng đáy sẽ tạo nên phần bánh nhau của mẹ

I.3.2.2 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG THÀNH

Màng rụng thành (decidua parietalis) có những thay đổi kéo dài đến tháng thứ ba,

lớp trên mặt phát triển khác hẳn với lớp sâu Lớp trên mặt sẽ thành lớp đặc còn lớp sâu thành lớp xốp Ở màng rụng thành không có sự tạo hồ máu

Từ tháng thứ tư đến cuối thai kỳ, màng rụng thành mỏng dần đi do phôi ngày càng lớn, khoang tử cung ngày càng rộng và màng rụng thành ngày càng bị kéo căng ra Phôi càng lớn, màng rụng thành càng tiến dần đến màng rụng bao Biểu mô của hai màng rụng này dán vào nhau, thoái hoá rồi biến mất Khoang tử cung giữa hai màng rụng này sáp nhập vào nhau chúng còn một vết nối

Đến cuối thai kỳ, dọc theo bề mặt lớp xốp, các tuyến tử cung dãn rộng và bị ép lại Biểu mô tuyến dẹt dần rồi biến mất, mô liên kết giữa các tuyến chứa đầy các tế bào rụng Đây là vùng giữa lớp xốp, là nơi mà khi đẻ ra màng nhau bong ra và lớp đặc bị bóc ra ngoài

I.3.2.3 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG BAO

Màng rụng bao (decidua capsularis) là phần nội mạc tử cung phủ trên bề mặt phôi

trong vào khoang tử cung, mỏng hơn màng rụng thành Màng rụng bao được tái tạo sau khi trứng lọt hẳn vào trong nội mạc tử cung (lành sẹo) Trong khi phát triển, trứng cùng với màng rụng bao lồi vào bên trong khoang tử cung Màng rụng bao đến sát màng

rụng thành rồi dán vào lấp đi khoang tử cung bị Sau đó, màng rụng bao thoái hóa, lớp biểu mô cùng với mô liên kết bên dưới tiêu đi và hầu như không để lại một vết tích gì

I.3.2.4 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MÀNG RỤNG ĐÁY

Màng rụng đáy (decidua basilis) là phần mô chính của mẹ tham gia tạo bánh nhau;

lớp chứa năng biệt hoá thành hồ máu còn lớp đáy biệt hóa thành lớp đặc và lớp xốp Trong khi phát triển, lá nuôi hợp bào tăng sinh, tạo nên những gai nhau ăn sâu vào bên trong màng rụng đáy Hệ thống cây gai nhau được thành lập, phá huỷ màng rụng đáy giúp cho phôi phát triển Màng rụng đáy bị phá hủy để lại một vùng mô gồm những chất còn lại của màng rụng đáy như tuyến, mô liên kết, thành của các mạch máu, thành của các tuyến tử cung và các chất tiết của tuyến tử cung bị phân hủy thành chất dinh dưỡng cho phôi Phôi càng lớn, vùng mô bị phá hủy càng rộng Lá nuôi hợp bào tiếp tục phá hủy lớp chức năng nội mạc tử cung tạo nên những hốc chứa đầy máu gọi là hồ máu Những hốc này được ngăn bởi các vách nhau (là phần mô của lớp chức năng chưa bị lá nuôi hợp bào phá hủy hết) [1,2]

I.4 CHỨC NĂNG CỦA NHAU

Nhau là cơ quan đảm nhiệm chức năng trao đổi chất giữa cơ thể mẹ và thai Sự trao đổi chất ấy bao gồm sự lọt các chất dinh dưỡng, nước, oxy, kháng thể và hormone từ cơ thể mẹ sang thai và sự lọt theo hướng ngược lại những chất dị hoá, nước, khí carbonic và hormone Sự trao đổi qua hàng rào nhau là một hiện tượng lý hoá học phức tạp vì cấu trúc của hàng rào nhau không phải là cấu trúc của một hàng rào bán thấm đơn giản mà nó được tiến hành theo nhiều cơ chế khác nhau

Nhau còn là cơ quan bài tiết hormone

I.4.1 CHỨC NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT

Sự trao đổi chất qua hàng rào nhau tiến hành theo nhiều cơ chế khác nhau:

™ Khuyếch tán đơn giản Nhiều chất lọt qua hàng rào nhau nhờ cơ chế khuyếch

tán đơn giản Đó là các muối Na, K, Ca, Mg, các acid amin, acid uric, urea, ammoniac, creatinin, creatin, các chất khí như oxy, carbonic, các chất gây mê và một số hợp chất hoà tan trong mỡ v.v… Sự trao đổi khí là do áp lực khí trong máu mẹ và trong máu thai khác nhau

™ Khuyếch tán thuận lợi Một số monosaccharid lọt qua hàng rào nhau nhờ cơ chế

khuyếch tán thuận lợi Nhờ cơ chế ấy, glucose trong máu mẹ lọt qua hàng rào nhau

sang máu thai và được tích trữ trong gan phôi thai dưới dạng glycogen

™ Vận chuyển tích cực Những chất khác, thí dụ các ion sắt, các acid amni chủ yếu

lọt qua hàng rào nhau bằng cơ chế vận chuyển tích cực Do đó cần chú ý sự khác nhau về cơ chế trao đổi chất giữa các acid amin chủ yếu và không chủ yếu Những acid amin không chủ yếu lọt qua hàng rào nhau bằng cơ chế khuyếch tán đơn giản như đã nói ở trên Khả năng của các loại protein lọt qua hàng rào nhau thì khác nhau Thí dụ: immunoglobulin A không lọt qua hàng rào nhau, trong khi đó immunoglobulin G có cùng phân tử lượng với nó lại lọt qua được Sự lọt hay không của các kháng thể qua hàng rào nhau quyết định mức độ miễn dịch thụ động mà đứa trẻ có thể biểu lộ sau khi

ra đời Những chất như insulin, thyroxin, curare, heparin không lọt qua nhau

I.4.2 CHỨC NĂNG BÀI TIẾT HORMONE

Những hormone bài tiết bởi nhau gồm những hormone hướng sinh dục, hormone hướng thân, estrogen, progesterone Những hormpne ấy được gọi chung là hormone màng đệm Chúng do hợp bào lá nuôi tiết ra Hormone hướng sinh dục là một glycoprotein duy trì sự hoạt động của hoàng thể cho đến khi nhau bài tiết ra estrogen và progesterone

Sự chế tiết estrogen và progesteron bởi nhau được đảm nhiệm bởi lá nuôi hợp bào và tăng dần trong thời gian có thai Sự tăng nồng độ estrogen tiết ra bởi nhau vào máu

mẹ làm tăng sự nhạy cảm của cơ tử cung đối với tác dụng của ocytocin tiết ra bởi thuỳ sau tuyến yên Ocytocin kích thích sự co bóp của cơ tử cung để tống thai ra ngoài

I.4.3 CHỨC NĂNG MIỄN DỊCH

Khả năng miễn dịch thụ động của thai là do immunoglobulin G từ máu mẹ lọt qua hàng rào nhau sang thai Nhờ đó thai có tính miễn dịch tạm thời đối với một số bệnh như thuỷ đậu, sởi và bạch hầu, nhưng không có tính miễn dịch đối với một số bệnh khác như ho gà

Mặc dù có sự ngăn cách giữa máu mẹ và máu thai bởi hàng rào nhau, thường thường một lượng nhỏ máu thai có thể lọt sang máu mẹ Trong trường hợp này, nếu máu thai có Rh+ và máu mẹ có Rh- thì những kháng thể kháng huyết cầu Rh+ sẽ phát sinh trong máu thai Vì những kháng thể này đi qua nhau sẽ phá huỷ mạnh hồng cầu của thai, gây nên bệnh vàng da hoại huyết cho thai Sự truyền máu sớm cho thai và sự sử dụng những kháng thể chứa những immunoglobulin kháng Rh là những biện pháp điều trị được dùng để chữa và phòng bệnh này [4]

II ĐẠI CƯƠNG VỀ NGUYÊN BÀO SỢI

II.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG

Mô liên kết là mô tạo ra và giữ cho cơ thể có hình dạng nhất định, đồng thời mô liên kết giữ nhiều vai trò quan trọng và đa dạng đối với cơ thể : trao đổi chất, bảo vệ và tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học Khác với các mô khác (mô cơ, thần kinh, biểu mô), mô liên kết có khoảng gian bào rộng chứa chất căn bản và các sợi liên kết Vùi trong chất gian bào đó là nhiều loại tế bào khác nhau [3]

Nhiều tế bào đã biệt hóa trong cơ thể trưởng thành có thể tạo thành nhóm trong một họ mà các thành viên có quan hệ gần gũi với nhau ở những vùng mô hoặc bởi những đặc tính có liên quan với nhau Một ví dụ quan trọng là họ tế bào của mô liên kết,

thành viên của chúng không chỉ có liên quan với nhau mà còn có một khả năng đáng chú ý là sự chuyển hóa qua lại

Họ tế bào này bao gồm : nguyên bào sợi, tế bào sụn và tế bào xương, tất cả chúng có một chức năng đặc biệt đối với việc tiết ra chất nền ngoại bào collagen và hoạt động cùng nhau trong một kiểu cấu trúc thống nhất của cơ thể, cũng như là các tế bào mỡ và tế bào mô cơ trơn, mà chúng thường được tìm thấy trong những vùng cùng với các tế bào trên Những kiểu tế bào này có thể xảy ra sự chuyển hóa qua lại giữa chúng Tế bào của mô liên kết đóng một vai trò trung tâm trong việc nâng đỡ và sữa chửa cho hầu hết các mô hoặc cơ quan bị hủy hoại, đặc điểm biệt hóa là một nét đặc trưng quan trọng của chúng trong sự đáp ứng đối với nhiều kiểu tác động và sự hủy hoại [8]

Mô liên kết gồm 3 loại chính : mô liên kết chính thức, mô sụn và mô xương Tất cả các loại mô liên kết đều có nguồn gốc từ trung bì phôi, trừ một số mô liên kết ở vùng đầu có thể bắt nguồn từ ngoại bì Mô liên kết là mô chứa nhiều mạch máu để nuôi bản thân mô liên kết và các mô khác

Mô liên kết thưa có nguồn gốc từ trung mô Trong trung mô, các sợi ngày càng tăng lên rồi dần dần các sợi đó họp với nhau, tạo thành những bó sợi lớn hơn và có những tính chất giống chất tạo keo Những tế bào trung mô dần dần thay đổi đặc tính, kéo dài dọc theo bề mặt các bó sợi rồi chuyển thành những tế bào sợi, loại tế bào chính của mô liên kết

Mô liên kết có thành phần tế bào rất đa dạng : tế bào sợi, đại thực bào, tương bào, masto bào, tế bào mỡ, tế bào nội mô, chu bào, tế bào sắc tố, các loại tế bào bạch cầu từ máu đến [3]

Một vài tế bào của mô liên kết như là nguyên bào sợi và tế bào mỡ được tạo thành và duy trì cục bộ trong khi những tề bào khác như là tế bào máu tạo thành từ những vùng khác và có thể được tạm thời cư trú trong mô liên kết

Sự tương tác của những tế bào của mô liên kết, tạo thành một cơ chế phức tạp giúp bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật [13]

Chất nền ngoại bào có lẽ ảnh hưởng lên trạng thái biệt hóa tế bào của mô liên kết thông qua các yếu tố sinh lý cũng như các yếu tố hóa học Điều này đã được chỉ ra rằng trong nghiên cứu trên nuôi cấy tế bào sụn Dưới điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào sụn sẽ tăng trưởng để tổng hợp lượng lớn chất nền sụn khác nhau sẽ bao xung quanh chính bản thân chúng và duy trì những đặc tính biệt hoá của mình khi có các nhân tố kích thích thích hợp Tuy nhiên, dưới những điều kiện nơi mà những tế bào được giữ cùng nhau ở mật độ thấp và được duy trì như là một lớp đơn trên chai nuôi, một sự biến đổi xảy ra : những tế bào mất đi hình dạng phát triển đầy đủ tiêu biểu của tế bào sụn, hình phẳng nằm trên thể nền, và dừng lại việc tạo ra chất nền của sụn, trong những trường hợp đặc biệt, chúng dừng lại việc tạo ra collagen kiểu II - kiểu đặc trưng của tế bào sụn – và thay vào đó là tổng hợp collagen kiểu I – kiểu đặc trưng của nguyên bào sợi

Hình 7 : Các loại tế bào của mô liên kết

Đối với hầu hết các kiểu tế bào, đặc biệt đối với tế bào của mô liên kết, khả năng được giữ lại và bám dính tùy thuộc vào chất nền xung quanh chúng Một tế bào có thể tạo ra một môi trường xung quanh cho chính bản thân chúng Sau đó môi trường sẽ tác động trở lại trên tế bào này để tạo ra một khả năng biệt hóa Do đó, chất nền ngoại bào mà một tế bào tiết ra tạo thành một phần của môi trường đối với các tế bào bên cạnh cũng như đối với chính chúng và hướng đến việc tạo ra sự biệt hóa của các tế bào bên cạnh trong cùng một cách tương tự [8]

II.2 TẾ BÀO SỢI (FIBROCYTE)

II.2.1 NGUỒN GỐC

Tế bào sợi có nhiều trong gân, cơ, màng bao xơ của nhiều cơ quan, là cơ sở cấu tạo

của vết sẹo Tế bào sợi chế tiết những tiền chất của những thành phần sợi của mô liên kết, những phần tử chất tạo keo Tế bào sợi được sinh ra từ tế bào trung mô (ở phôi thai), từ những tế bào kém biệt hoá ở mô liên kết, hoặc do sự sinh sản của các tế bào sợi (khả năng sinh sản của tế bào sợi rất mạnh)

II.2.2 HÌNH DẠNG

Tế bào sợi khá lớn, đường kính thân tế bào có thể đạt tới 20 micron, có hình sao hay hình thoi, có nhánh để tiếp xúc với những nhánh của các tế bào bên cạnh Vì vậy tế bào sợi được xếp vào loại tế bào bất động của mô liên kết Bào tương tế bào sợi thường ưa màu acid (eosin) giống như chất tạo keo trong chất căn bản nằm cạnh Do đó rất khó phân biệt ranh giới tế bào Tuy nhiên, có thể dễ dàng nhìn rõ sau khi nhuộm bằng phương pháp hematoxylin sắt

Nhân tế bào có hình trứng, sáng màu khi tế bào còn non (nguyên bào sợi), hoặc hình thoi dẹt, sẫm màu khi tế bào trưởng thành, có 1-2 nhân Chất nhiễm sắc là những hạt nhỏ, nằm rải rác trong nhân Màng nhân thường phẳng, đôi khi cũng có thể khúc khuỷu

Trong bào tương có: một cặp tiểu thể trung tâm, một bộ Golgi nằm gần nhân, những

ty thể dài, mảnh, chủ yếu thấy ở thân tế bào, nhưng cũng có thể gặp ở các nhánh Lưới nội bào có hạt, các Ribosome nằm rải rác trong bào tương

Khi có sự kích thích (trong quá trình tạo sẹo vết thương), khi tế bào sợi chuẩn bị phân chia, khi tế bào tích cực hoạt động tổng hợp những thành phần ngoài tế bào, các tế bào sợi lớn lên về kích thước và bào tương của chúng trở nên ưa base Dưới kính hiển vi quang học, những tế bào sợi không hoạt động có bộ Golgi ít phát triển, một ít

Hình 8 : hình dạng thân và nhân của tế bào sợi

Hình 9 : thành phần tế bào chất của tế bào sợi

mạng lưới nội bào có hạt Nhưng trong mô liên kết đang phát triển, đang hoạt động mạnh thì bộ Golgi phát triển: nhiều túi dẹt, túi nhỏ, nhưng không bào lớn, lưới nội bào có hạt cũng tăng lên

Bình thường, tế bào sợi không hấp thu chất lạ, nhưng khi bị kích thích mạnh, trong thời gian dài (như trong trường hợp tiêm thuốc nhuộm sống dạng keo như xanh trypan) tế bào có thể hấp thu thuốc nhuộm đó

Phần lớn các nhà nghiên cứu mô học cho rằng tế bào sợi là loại tế bào đã biệt hoá, thường không phải là nguồn gốc của các loại tế bào khác của mô liên kết Nhưng lại có những dẫn chứng nêu ra rằng: trong điều kiện bệnh lý hoặc trong một số thực nghiệm xác định, tế bào sợi có thể chuyển thành tế bào xương Có quan điểm được công nhận một cách rộng rãi cho rằng tế bào sợi tích luỹ mỡ hoặc có thể nói một cách chắc chắn rằng có thực là tế bào sợi đã chuyển thành tế bào xương, tế bào mỡ hay chính những tế bào tiền thân của chúng (những tế bào trung mô chưa biệt hoá) đã thực hiện sự chuyển biến nói trên

Sự phong phú của các bào quan trong tế bào sợi chứng tỏ tế bào có hoạt động chuyển hoá thường xuyên

II.2.3 CHỨC NĂNG

Hình 10 : tế bào sợi hấp thu với thuốc nhuộm xanh trypan

Tế bào sợi đảm nhiệm nhiều chức năng:

− Tạo ra chất căn bản của mô liên kết

− Tạo ra các tơ tạo keo nguyên phát

− Chế tiết mucopolysaccharide và những enzyme có khả năng làm cho các tơ tạo keo nguyên phát trở thành các sợi liên kết

− Tham gia vào việc tạo ra sẹo, làm lành vết thương Một số khối u của mô liên kết sinh ra do sự phát triển của tế bào sợi ( ví dụ những fibrosarcoma)

II.3 NGUYÊN BÀO SỢI (FIBROBLAST)

II.3.1 NGUỒN GỐC

Nguyên bào sợi là loại tế bào thường gặp nhất trong các mô liên kết, có nguồn gốc từ những tế bào trung mô trong phôi thai và những tế bào nguyên bào sợi phân chia trong cơ thể trưởng thành Ngoài ra, nguyên bào sợi cũng có thể xuất phát từ những tế bào trung mô tiền thân được duy trì trong các mô liên kết của cơ thể trưởng thành Nguyên bào sợi được cho rằng chúng là kiểu tế bào đơn nhưng thực tế cũng chưa chắc chắn được rằng có bao nhiêu loại nguyên bào sợi tồn tại trong cơ thể và có hay không tiềm năng biệt hóa của các kiểu nguyên bào sợi khác nhau có thể bị hạn chế trong nhiều cách khác nhau

II.3.2 HÌNH DẠNG

Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những tế bào non, ít biệt hoá Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh ngắn, kích thước không quá 20–25 micromet, nhân bầu dục hoặc hình cầu có một hoặc vài hạt nhân Nhân của nguyên bào sợi cô đặc được kéo dài theo trục dọc tế bào Bào tương ưa base nhạt, lưới nội bào, ti thể phát triển và có ranh giới với chất nền ngoại bào không rõ rệt Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu nhờ siêu sợi actin và myosin ở ngoại vi bào tương Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi

Hình dạng của tế bào có thể bị thay đổi do các yếu tố vật lý bề mặt nơi mà chúng gắn bám Ngoài ra, đây là loại tế bào có khả năng di động nhờ các chân giả là thành phần của tế bào chất tạo ra

II.3.3 CHỨC NĂNG

Nguyên bào sợi hiện diện như là kiểu tế bào đặc biệt nhất của mô liên kết Chúng phân tán khắp nơi trong mô liên kết của cơ thể, nơi chúng tiết ra chất nền ngoại bào một cách linh động giàu collagen kiểu I và/hoặc kiểu III Khi mô liên kết bị hủy hoại, nguyên bào sợi gần như di chuyển vào bên trong vết thương, tăng trưởng và tạo ra một lượng lớn chất nền collagen giúp cho việc cô lập và sửa chữa mô bị hư Khả năng của chúng phát triển nhanh trong bề mặt của mô bị thương, đi cùng với lối sống cô độc của chúng, có lẽ giải thích tại sao nguyên bào sợi là loại tế bào dễ phát triển nhất trong điều kiện nuôi cấy – một nét đặc trưng mà tạo cho chúng một niềm đam mê đối với việc ngiên cứu sinh học tế bào

Nguyên bào sợi là loại tế bào linh hoạt nhất của mô liên kết, khả năng đáng chú ý nhất là sự biệt hóa tạo thành các thành viên khác trong mô liên kết Đây là một bằng chứng rất tốt cho rằng nguyên bào sợi ở các bộ phận khác nhau của cơ thể thực tế là khác xa nhau và xa hơn nữa là nguyên bào sợi trong cùng một vùng của cơ thể là khác

Hình 11 : Những các hình dạng khác nhau của một nguyên

nhau Mô liên kết có lẽ chứa một sự hỗn tạp của các dòng nguyên bào sợi khác biệt, một vài trong số chúng có khả năng biến đổi tạo ra tế bào sụn, một vài cái khác có khả năng biến đổi tạo ra tế bào mỡ và nhiều hơn thế nữa là một kiểu nguyên bào sợi với nhiều khả năng phát triển và biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác của mô liên kết Cũng có thể cho rằng nguyên bào sợi chưa trưởng thành (thường gọi là tế bào trung mô) mà có thể phát triển thành các kiểu tế bào trưởng thành khác nhau

Quan sát kính hiển vi quanh học chỉ ra rằng tế bào sợi có ít mạng lưới nội chất nhám phát triển và thể Golgi hơn nguyên bào sợi Khi nhận đủ kích thích, tế bào sợi có lẽ quay trở lại trạng thái của nguyên bào sợi, và hoạt động tổng hợp được tái hoạt động trở lại Điều đó có thể xảy ra trong suốt quá rtrình làm lành vết thương, và trong trường hợp tế bào đảm nhận việc tạo ra và thay thế sự hiện diện của của nguyên bào sợi

Chức năng của nguyên bào sợi đã được nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi quang học phóng xạ tự ghi Tế bào ở đây tổng hợp collagen, lưới và sợi elastic và glycosaminoglycan và glycoprotein của chất nền nội bào vô định hình

Kỹ thuật ảnh phóng xạ tự ghi quan sát việc tổng hợp collagen bởi mạng lưới nội sinh chất hạt được tích lũy trong các vật chứa trong các cấu trúc, thường tìm thấy trong thể Golgi và sau đó được chuyển ra ngoài tế bào thông qua những lổ nhỏ Do đó, collagen được tổng hợp theo cùng cách tương tự như trong trường sinh tổng hợp protein

Sự tổng hợp glycosaminoglycan đã được nghiên cứu chủ yếu bằng ảnh phóng xạ tự

glycosaminoglycan mô liên kết đều có sulfate

Nguyên bào sợi đồng thời tổng hợp collagen và glycosaminoglycan, nhưng một vài nhà nghiên cứu cho rằng khi một tế bào tạo ra collagen trong chất nền thì số lượng glycosaminoglycan được tạo ra ít và riêng rẻ hơn [9,12,13,14]

Khả năng thực bào của nguyên bào sợi rất thấp

Không phải tất cả các tế bào có khả năng tạo sợi đều tạo thành từ những nguyên bào sợi tồn tại từ trước [42] Dưới những điều kiện xác định, tế bào trung mô, tế bào Schwann và nguyên bào mỡ có thể ngẫu nhiên trở thành nguyên bào sợi và tạo ra collagen Đặc biệt là tế bào Schwann có nhiều tiềm năng và thêm vào khả năng tạo collagen, thỉnh thoảng có thể tạo sụn, dạng xương, mô cơ xương, mô mỡ và thậm chí tuyến, tạo thành với chất nhầy trung tính Tế bào Schwann cũng có thể trở thành tế bào thực bào giống như mô bào

II.3.4 KHOẢNG ĐỜI

Tế bào bình thường ở người được nuôi cấy in vitro biểu hiện một khả năng tăng trưởng giới hạn

Khoảng đời tăng trưởng tối đa khác nhau một cách đáng kể khi so sánh những tế bào đang tăng trưởng trên hai loại môi trường thương phẩm thông thường dùng để nuôi chúng Khoảng đời tăng trưởng có thể đảo ngược lại liên quan tới áp lực oxygen xung quanh và một cách chính xác liên quan đến mật độ nuôi trong tất cả các dòng thí nghiệm [16]

Nguyên bào sợi khác nhau ở mô liên kết thưa, ở giác mạc, ở gân, ở mô dạng lưới của tủy xương và ở các vùng khác nhau của cơ thể Cho nên khoảng đời tăng trưởng của các dòng nguyên bào sợi từ các vùng khác nhau của cơ thể thì khác xa nhau

Nguyên bào sợi tồn tại 6 -7 tháng trong quá trình nghiên cứu in vitro Dòng nguyên bào sợi từ phôi người có khả năng duy trì cấu trúc nhiễm sắc thể lưỡng bội bình thường đến nửa năm nhưng sau đó mất dần khả năng này rồi chết [6]

Trong cơ thể trưởng thành, nguyên bào sợi trong mô liên kết hiếm khi trãi qua quá trình phân chia Nguyên phân chỉ được quan sát khi cơ quan cần thêm nguyên bào sợi,

ví dụ, khi mô liên kết bị hủy hoại [13]

III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VIỆC NUÔI TẾ BÀO

III.1 GIÁ THỂ

Phần lớn tế bào động vật có xương sống được nuôi in vitro tăng trưởng như một lớp đơn trên bề mặt nhân tạo Từ những cố gắng sớm nhất, thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nó, nhưng do tế bào cần dàn trãi lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sự tăng trưởng [27,28,40] để khắc phục tình trạng này sau đó người ta đã dùng nhựa plastic do chúng có đặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được bề mặt tăng trưởng tốt và có thể tái sử dụng trong nuôi cấy

Hiện nay đa số người ta thích dùng polystyrene Ngoài ra còn có các loại giá thề bán thấm, các loại vi giá thể và giá thể nhân tạo khác

Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào:

− Khả năng sinh sản của tế bào

Hình 12 : sự phân chia của nguyên bào sợi

− Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn

− Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín

− Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay không

− Giá cả có hợp lý

III.2 PHA KHÍ

III.2.1 OXYGEN

Phần quan trọng trong cấu tạo của pha khí là Oxy và CO2 Áp lực Oxy phù hợp với hầu hết các loại tế bào nuôi, đặc biệt là giai đoạn muộn của phôi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành cần đến 95% Oxy trong pha khí

Chiều sâu của môi trường nuôi có thể ảnh hưởng đến tỉ lệ khuyếch tán Oxy hoà tan của tế bào, thích hợp nhất nên giữ độ sâu của môi trường trong khoảng 2-5mm

III.2.2 CO 2

CO2 có nhiều vai trò quan trọng như : ảnh hưởng đến nồng độ CO2 hoà tan, pH và nồng độ HCO3- Rất khó khăn để xác định chính xác áp lực CO2 không khí để kiểm soát nồng độ CO2 hoà tan

Đây là một phản ứng thuận nghịch diễn ra:

Kết quả của việc gia tăng CO2 không khí là làm giảm pH Vì thế, hiệu quả của việc gia tăng áp lực CO2 được trung hoà bởi sự gia tăng nồng độ bicarbonate

Sự gia tăng HCO3- làm cân bằng (1) cho đến khi có sự cân bằng pH ở 7.4

NaOH + H2CO3 ⇔ NaHCO3 + H2O ⇔ Na+ + HCO3- + H2O (3) Hầu hết việc nuôi cấy trong điều kiện in vitro, áp lực CO2 được nhiều nhà nghiên cứu chấp nhận là 5% CO2 trong 95% không khí

III.3 MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC YẾU TỐ BỔ SUNG

Aûnh hưởng của môi trường trên nuôi cấy tế bào biểu hiện qua 4 con đường :

1 Tính tự nhiên của giá thể hoặc các phương pháp nuôi cấy khác nhau

2 Sự cấu thành của các yếu tố lý hoá và sinh lý của môi trường

3 Thiết lập về giai đoạn pha khí

4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

Sự lựa chọn một môi trường dinh dưỡng bị ảnh hưởng lớn bởi:

1 Kiểu tế bào

2 Kiểu nuôi (lớp đơn, dịch treo, tạo dòng)

3 Tuỳ thuộc vào lượng hóa chất xác định cần thiết

Sự hư hỏng của môi trường bột có lẽ được nhận diện bởi một vài hoặc tất cả các yếu tố sau:

1 Sự thay đổi màu sắc

2 Sự tạo hột/ kết thành cục

3 Sự không hòa tan được

Sự hư hỏng của môi trường lỏng có lẽ được nhận diện bởi một vài hoặc tất cả các yếu tố sau :

1 Sự thay đổi pH

2 Có chất kết tủa hoặc có vật gì đặc biệt có mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường

3 Sự xuất hiện của màu đục

4 Sự thay đổi màu sắc

Việc nuôi tế bào bắt đầu từ nuôi nguyên phát với các mảnh mô có thể tăng sinh in vitro và được cấy chuyền dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều loại môi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng của dòng tế bào liên tục và thay thế môi trường tự nhiên như : dịch chiết phôi, dịch thuỷ phân protein, lymph v.v

Sự tiếp cận để phát triển một môi trường mới thường bắt đầu với một môi trường giàu chất dinh dưỡng như :

Ham’s F12 hoặc môi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao của huyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng độ của các thành phần cấu tạo của môi trường và thêm vào các yếu tố mới

III.4 ĐẶC TÍNH VẬT LÝ

III.4.1 P H

Hầu hết các dòng tế bào đều tăng trưởng tốt ở pH 7.4 Mặc dù điều kiện thuận lợi về pH đối với sự phát triển của tế bào sẽ thay đổi liên quan đến các kiểu tế bào khác nhau Dòng nguyên bào sợi bình thường ở Người thích hợp nhất ở pH 7.4 – 7.7

Phenol Red thường được sử dụng như là một chất chỉ thị Nó có màu đỏ ở pH 7.4, trở nên hồng ở pH 7.0, màu chanh ở pH 6.5, vàng chanh pH dưới 6.5, hơi hồng pH ở 7.6 và tím ở pH 7.8

III.4.2 DUNG DỊCH ĐỆM

Môi trường nuôi phải được đệm với do hai điều kiện :

1) Đĩa mở, nơi tạo ra CO2 do pH gia tăng

2) Sự sản sinh quá nhiều CO2 và acid lactic trong một dòng tế bào khi tế bào gia tăng mật độ cao khi đó pH sẽ giảm xuống

Một loại dung dịch đệm phải được sử dụng để kết hợp chặt chẽ trong môi trường để giữ pH không thay đổi nhưng trong phản ứng (1) sản phẩm CO2 ngoại sinh có lẽ cần cho vài dòng tế bào, đặc biệt ở nồng độ tế bào thấp, và ngăn chặn tổng lượng

CO2 hoà tan mất đi và Bicarbonate từ môi trường

Dung dịch đệm Bicarbonate được sử dụng thường xuyên hơn các dung dịch đệm khác do chúng có khả năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra ít độc tố, giá thấp và có giá trị dinh dưỡng cho việc nuôi tế bào

HEPES là một loại dung dịch đệm mạnh, có khả năng đệm ở pH khoảng 7.2 – 7.6 và được sử dụng ở 10 hoặc 20 mM Khi HEPES được sử dụng với CO2 ngoại sinh, khi đó nồng độ của dung dịch HEPES cần được dùng với lượng nhiều hơn hoặc gấp đôi của lượng Bicarbonate tương ứng

III.4.3 ÁP SUẤT THẨM THẤU

Hầu hết tế bào được nuôi có một giới hạn chịu đựng khá rộng về áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của huyết tương người là 290mOsm/kg và người ta cho đây là áp suất tối ưu cho những trường hợp nuôi tế bào người trong điều kiện in vitro, mặc dù có sự khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau

Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260mOsm/kg và 320 mOsm/kg được khá chấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên có một sự chọn lựa và nên giữ ở mức ± 10 mOsm/kg

III.4.4 NHIỆT ĐỘ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nó làm ảnh hưởng đến

pH do sự gia tăng của các CO2 hoà tan ở nhiệt độ thấp và do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm pH nên được điều chỉnh thấp hơn 0.2 đơn vị ở nhiệt độ phòng hơn là ở 36.50C là điều liện tốt nhất để tạo ra môi trường hoàn toàn với huyết thanh nếu được sử dụng và ủ mẫu qua đêm ở 36.50C

III.4.5 TÍNH NHỚT

Tính nhớt của môi trường bị ảnh hưởng bởi các thành phần của huyết thanh và trong một số trường hợp ảnh hưởng một ít lên sự tăng trưởng tế bào Tính nhớt trở nên đặt biệt quan trọng khi mà nuôi dịch treo được lắc hoặc khi dịch nuôi được khuấy hoặc khi tế bào được tách ra sau khi trypsin hoá Nếu tế bào bị huỷ hoại bởi những điều kiện này có lẽ nó sẽ giảm bớt bởi sự tạo ra tính nhớt của môi trương

III.4.6 ÁP LỰC SỨC CĂNG BỀ MẶT VÀ SỰ TẠO BỌT

Áp lực sức căng bề mặt được sử dụng để kiểm soát sự bám dính của mảnh mô được cấy nguyên phát với giá thể Trong nuôi cấy dịch treo với 5% CO2 trong không khí thì bọt được tạo ra trong môi trường chứa huyết thanh Sự thêm vào của một Silicone kháng bọt (Dow chemical) hoặc Pluronic F68 (Wyandotte) giúp cải thiện điều này bởi làm giảm áp lực sức căng bề mặt

Ảnh hưởng của sự tạo bọt chưa được xác định rỏ ràng như là tỉ lệ của sự biến tính protein khi gia tăng và nguy cơ của việc nhiễm gia tăng nếu sự tạo bọt gia tăng đến cổ của lọ nuôi, tốt nhất là nên tránh

IV KHÁI QUÁT VỀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

IV.1 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi

trường nuôi cấy vi sinh vật và tế bào thực vật Trong các công trình đầu tiên về nuôi cấy tế bào động vật, người ta dùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi gà làm môi trường nuôi cấy Do thành phần huyết thanh và chiết phầm phôi gà rất phức tạp, khó ổn định nên người ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo ra các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trường và ổn định môi trường trong những lần nuôi cấy khác

Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã được thiết lập với môi trường tổng hợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổ sung 5 –

10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh)

IV.1.1 DUNG DỊCH MUỐI ĐỆM

Dung dịch đệm có thể dùng cho các công việc sau:

+ Dùng để ủ, không cần dinh dưỡng

+ Rửa, loại bỏ môi trường

+ Rửa, xử lý mô cấy

+ Dùng cho cấy dịch treo

Một số dung dịch đệm thường dùng :

HBSS, EBSS và PBS liên quan đến tính đệm yếu của phosphate, chúng là những dung dịch đệm không ảnh hưởng xấu ở pH sinh lý

HEPES (10 – 20mM) hiện tại là dung dịch đệm hiệu quả nhất trong khoảng pH 7.2 – 7.8 và TRICINE trong khoảng pH 7.4 – 8.0

IV.1.2 AMINO ACID

Amino acid cần thiết cần phải được bổ sung cho việc nuôi tế bào với sự thêm vào của cystein và tyrosine, mặc dù nhu cầu riêng đối với các amino acid sẽ thay đổi từ tế bào này đến tế bào khác Nồng độ của amino acid giới hạn mật độ tối đa của tế bào có thể đạt đến và sự cân bằng có lẽ ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào và tỉ lệ tăng trưởng

Glutamine cần được thêm vào bởi hầu hết các dòng tế bào mặc dù vài dòng tế bào sẽ dùng glutamate Nhưng glutamine được sử dụng bởi những tế bào nuôi như một nguồn năng lượng và Cacbon [38]

IV.1.3 VITAMINE

Môi trường Eagles’s MEM chỉ chứa vitamine nhóm B những chất bổ sung khác sẽ lất từ huyết thanh Sự giới hạn vitamine được biểu hiện trong khoảng thời gian tồn tại của tế bào và tỉ lệ tăng trưởng hơn là mật độ tối đa của môi trường

IV.1.4 MUỐI

Muối chủ yếu là những muối của Na+, K+,Mg+,Ca+,Cl-,SO42-,PO43- và HCO3- và những thành phần lớn khác tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trường

Calcium làm giảm việc tách tế bào và sự bám dính đối với nuôi dịch treo Nồng độ sodium bicarbonate được xác định bởi nồng độ CO2 trong pha khí, có vai trò dinh dưỡng và khả năng đệm

IV.1.5 GLUCOSE

Glucose có mặt hầu hết trong các môi trường như là một nguồn năng lượng Chúng được chuyển hoá bởi quá trình đường phân tạo ra pyruvate và tham gia vào chu trình acid citric để tạo ra CO2 Trong môi trường nếu có tích luỹ acid lactic chứng tỏ chu trình acid citric không hoàn toàn như trong cơ thể

Ngoài ra còn có một số cơ chất phụ hữu cơ có mặt trong môi trường như : protein, peptides, nucleosides, các chất trung gian của chu trình acid citric, pyruvate và lipids … Ngoài ra, thành phần phụ của môi trường có ý nghĩa quan trọng đó là huyết thanh

IV.1.6 HUYẾT THANH

Huyết thanh được sử dụng hầu hết trong nuôi mô là huyết thanh lấy từ bê con, thai bò, ngựa và người Huyết thanh bêø được sử dụng rộng rãi nhất, tiếp theo là huyết thanh bò có thai (Fetal Bovine Serum) Chúng được sử dụng cho các dòng tế bào có nhu cầu huyết thanh cao và đối với việc tạo dòng Thỉnh thoảng huyết thanh người cũng được sử dụng cho một số nghiên cứu tế bào trên người và ngoài ra cũng dùng huyết thanh ngựa

do chúng có độ đồng nhất giữa các lô cao

Tuy nhiên, có những dòng tế bào tăng trưởng không cần đến sự có mặt của huyết thanh như một số dòng tế bào ung thư : dòng tế bào ung thư L929 và dòng tế bào ung thư Hela lần đầu tiên được nuôi không cần huyết thanh [18,25,33] Kết quả từ phòng thí nghiệm của Ham [29]; Sato [17]; Carney [20] và những người khác đã chứng minh rằng huyết thanh có thể được giảm bớt hay loại bỏ nếu dòng tế bào nghiên cứu thích hợp với một môi trường nuôi với chất dinh dưỡng và hormone thay thế có trong môi trường phù hợp với chúng

Những yếu tố cần thiết trong huyết thanh được chú ý bao gồm:

1 Nhân tố bám dính như là fibronectin

2 Những peptide điều khiển sự tăng trưởng và biệt hóa như là: insulin, PDGF và TGF - β

3 Chất dinh dưỡng cần thiết như là chất khoáng, vitamin, acid béo và chất chuyển hóa trung gian

4 Hormone kiểm soát sự vận chuyển qua màng, kiểu hình cơ thể và cấu tạo bề mặt tế bào như là insulin, hydrocortisone, estrogen và triiodotyrosine

Tuy nhiên, trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh vì nó có những vai trò quan trọng như sau:

− Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…

− Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

− Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thương cho tế bào

− Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

− Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

− Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy

Huyết thanh rất cần cho nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy) Ngoài ra, huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không

chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy) Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trường nuôi cấy tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lượng thấp

IV.2 MỘT VÀI LOẠI MÔI TRƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ MÔ ĐỘNG VẬT

IV.2.1 Môi trường BM (Basal Medium ): đây là môi trường cơ bản do H Eagle

thiết lập, khi dùng phải bổ sung 5 – 10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lượng tùy loại tế bào Thường sử dụng nuôi cấy tế bào HeLa, tế bào L

IV.2.2 Môi trường EMEM (Eagle Minimal Essential Medium): còn gọi là môi

trường tối thiểu, do H Eagle thiết lập Đây là môi trường BM có chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào

IV.2.3 Môi trường DMEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium): là môi trường

EMEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và một số vitamin cao gấp bốn lần so với số môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

IV.2.4 Môi trường F10, F12: do R Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong

môi trường này huyết thanh được thay bằng 20µg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10-7M acid linoleic

IV.2.5 Môi trường Iscove: do N.N Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến môi

trường DMEM

IV.2.6 Môi trường 5A: do T.A Mc.Coy thiết lập, thường được dùng cho tế bào

bệnh bạch huyết

IV.2.7 Môi trường RPMI – 1640: được G.E Moore thiết lập tại Viện nghiên cứu

Roswell Part Memorial, được dùng để nuôi tế bào và mô bạch huyết

IV.2.8 Môi trường 199: do R.C Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô cơ phôi

gà trong sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt [6]

IV.3 ĐẶC ĐIỂM BA LOẠI MÔI TRƯỜNG EMEM, DMEM VÀ AMNIOMAX ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NUÔI NGUYÊN BÀO SỢI TRONG ĐỀ TÀI NÀY

IV.3.1 MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (MEM) (1X) LIQUID IV.3.1.1 MÔ TẢ SẢN PHẨM

Chứa dung dịch muối Hank và L-glutamine

Minimum Essential Medium (MEM), còn gọi là môi trường tối thiểu, được thiết lập bởi Harry Eagle, là một trong những môi trường tổng hợp dùng để nuôi tế bào được sử dụng rộng rãi nhất Những thử nghiệm sớm nhất dùng để nuôi nguyên bào sợi của động vật hữu nhủ và dùng để cấy chuyền dòng tế bào HeLa cần những nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt mà chúng ta không thể gặp trong Eagle's Basal Medium (BME) Đây là môi trường cơ bản có chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào MEM gồm có một nồng độ cao của các amino acid để tạo ra một môi trường gần giống với thành phần protein của tế bào động vật hữu nhủ MEM đã được sử dụng cho nuôi cấy đối với số lớn các loại tế bào tăng trưởng tạo ra lớp đơn

Sự lựa chọn thành phần bổ sung của các amino acid không cần thiết để tạo ra công thức môi trường có sự kết hợp của dung dịch muối Hank hoặc Eagle (Hanks' or Eagles' salts) tạo ra một cách sử dụng rộng rãi loại môi trường này Công thức đã được cải biến

xa hơn là đã loại bỏ Calcium cho phép tế bào tăng trưởng được trong nuôi dịch treo

Công thức môi trường gốc của MEM chứa muối Earle và nhóm amino acid thông thường được đề cập như là các amino acid cần thiết Chúng được cần thiết quan tâm đến bởi vì tế bào sẽ không tăng trưởng trên môi trường mà nếu không có sự hiện diện của chúng Mười hai amino acid cần thiết là L-arginine; L-cystine; L-glutamine; L-

histidine; isoleucine; leucine; methionine; phenylalanine; threonine; tryptophan; L-tyrosine và L-valine [24,47]

IV.3.1.2 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG EMEM (Catalog Number: 21575 -

022 )

Weight

Concentration (mg/L)

Molarity (mM) Amino Acids