ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

PHẠM THỊ LAN HƯƠNG

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) TRONG MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI

ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ

KHĨA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

ThS BS ĐỖ QUANG MINH

I.2 Sự phát triển và trưởng thành của trứng 2

I.4 Sự thụ tinh 3

I.5 Sự phát triển của phôi chuột giai đoạn sau làm tổ 3

I.6 Các giai đoạn phát triển chính của phôi chuột 5

II QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY … 6

II.1.1 Sự thụ tinh trong cơ thể (in vivo) 7 II.1.2 Sự thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro) 7 II.2 Kích thích buồng trứng (superovulation) 8

II.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kích thích … 8

II.3.1 Ảnh hưởng của tuổi và trọng lượng 8

II.4.1 Block (sự kiềm hãm) ở giai đoạn 2 tế bào 10

III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY PHÔI GIAI ĐOẠN TRƯỚC … 11

III.2 Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú 12

III.3 Các thành phần chính trong môi trường nuôi cấy phôi chuột 13

III.3.1 Nước 13 III.3.2 Ion 13 III.3.3 Carbohydrate 13

III.3.5 Chất bắt giữ kim loại nặng 15

VI.4.2 Khả năng đông đặc của BSA 20

VI.5 Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong … 21

Vật liệu – Phương pháp

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

IV.1 Ổn định chuột – kích thích buồng trứng – phối 29 IV.2 Mổ chuột – thu nhận phôi 2 tế bào 31 IV.3 Theo dõi sự phát triển của phôi và ghi nhện kết quả 36

Kết quả – Biện luận

I.2 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BSA … 42

I.3 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của số lượng phôi/ 50µl … 43

I.4 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng trong kích thích buồng trứng 45

I.5 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nguồn chuột và … 45

I.6 Kết quả thí nghiệm kiểm tra vai trò của nút nhầy âm đạo … 45

Kết luận – Đề nghị

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiên cứu về nuôi cấy phôi là bước khởi đầu cho rất nhiều lĩnh vực: chuyển gen, công nghệ hỗ trợ sinh sản, công nghệ cloning, tế bào mầm, bảo tồn nguồn gen….Trên thế giới từ năm 1956, Wesley Whitten đã công bố thành công trong nuôi cấy phôi chuột giai đoạn 8 tế bào và một số phôi chuột 4 tế bào thành phôi nang, và cũng Whitten vào năm 1957, đã thành công trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào phát triển thành phôi nang Cho tới ngày nay, việc nuôi cấy phôi chuột đã trở nên phổ biến, và nó chỉ còn là bước khởi đầu cho những nghiên cứu sâu hơn về gen, vi thao tác, tế bào mầm …

Đối với Việt Nam, mặc dù là một nước có nền nghiên cứu khoa học chỉ mới phát triển với phương châm đi trước đón đầu, việc nghiên cứu tạo ra một quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh phù hợp với điều kiện trong nước vẫn là một bước khởi đầu cơ bản cho những thí nghiệm tiếp theo sau trong các lĩnh vực nghiên cứu trên

Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, một trong những trung tâm đào tạo và nghiên cứu hàng đầu trong nước, năm 2003 với đề tài nghiên cứu của Phạm Ngọc Thụy

Vi, đã bước đầu thành công trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào lên phôi nang tuy nhiên kết quả vẫn còn thấp và chưa ổn đị 1nh Kết quả này có thể do rất nhiều nguyên nhân: điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, chủng chuột …

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng không có môi trường nuôi cấy tối ưu chung và những phòng thí nghiệm khác nhau có những công thức môi trường khác nhau để có thể đạt được kết quả nuôi cấy gần với sự phát triển trong cơ thể Vì vậy với khảo sát đánh giá trên những thí nghiệm vừa qua cho thấy yếu tố có khả năng ảnh hưởng cao nhất tới kết quả nuôi cấy là môi trường không phù hợp

Vì vậy đề tài này được tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ BSA tối ưu trong môi trường nuôi cấy phôi chuột từ giai đoạn 2 tế bào lên phôi nang

Bên cạnh đó, trong thí nghiệm này còn tiến hành khảo sát ảnh hưởng của số lượng phôi chuột trong một thể tích môi trường nuôi cấy cố định lên khả năng phát triển của phôi chuột 2 tế bào thành phôi nang, và khảo sát điều kiện ổn định chuột, nguồn chuột cũng như vai trò của việc kiểm tra nút nhầy âm đạo trong đánh giá kết quả thụ tinh

III SINH SẢN TRÊN CHUỘT

III.1 Nội tiết sinh sản

Hormone kích thích nang trứng phát triển FSH (follicle stimulating hormone) do tuyến yên tiết ra kích thích nhóm nang trứng tiếp tục tăng trưởng

Hormone kích thích rụng trứng LH (Luteinizing hormone) được tuyến yên tiết

ra, phá vỡ sự kiềm hãm phân bào giảm nhiễm, bắt đầu sự phân bào giảm nhiễm đầu tiên tạo ra thể cực thứ I, sau đó trứng trưởng thành và được phóng thích

Mặc dù về cơ chế sự rụng trứng vẫn chưa được hiểu rõ, việc trứng được phóng thích ra khỏi nang trứng là nhờ vào sự tăng kích thích của LH

III.2. Sự phát triển và trưởng thành của trứng [5]

Ở chuột cái 5 ngày tuổi, tất cả trứng ở giai đoạn diplotene (DNA đã nhân đôi) trong tiền kì của lần phân bào giảm nhiễm thứ nhất Mỗi trứng chứa trong nang trứng và được bao bọc bởi lớp tế bào hạt Hơn một nửa những nang noãn nguyên thuỷ hiện diện trong buồng trứng lúc sinh ra sẽ thoái hóa trước 3 – 5 tuần tuổi, nguyên nhân của điều này vẫn chưa biết rõ Chuột cái thành thục về giới tính vào khoảng 6 tuần đến 4 tháng tuổi, tuỳ thuộc vào chủng chuột và điều kiện môi trường Khi chuột cái trưởng thành mỗi buồng trứng chứa khoảng 104 trứng ở những giai đoạn phát triển khác nhau

III.3 Sự rụng trứng

Chu kì rụng trứng bình thường xảy ra 4 ngày một lần Tuy nhiên, thời gian chu

kì rụng trứng có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố và có thể được điều khiển bởi kích thích bằng hormone (kích thích buồng trứng) Trứng tăng trưởng về kích thước và dần bước vào giai đoạn cuối của giảm phân khi đáp ứng với sự kích thích của hormone

Trong một chu kì rụng trứng tự nhiên chỉ có một số nang noãn đáp ứng với sự tăng FSH do tuyến yên sản xuất Sự rụng trứng xảy ra khi có sự tăng LH được tuyến yên sản xuất Dưới sự kích thích của LH, nhân mất đi màng, nhiễm sắc thể tập trung trên sợi nhiễm sắc và chia đôi, cuối cùng diễn ra sự phân bào giảm nhiễm thứ nhất và tạo thể cực thứ I Trứng được phóng thích khỏi nang noãn.Trứng rụng vào ống dẫn trứng, vào lúc này đầu ngoại biên của ống dẫn trứng trở nên ứ máu và trương phòng lên thành đoạn bóng nơi sự thụ tinh sẽ diễn ra Trong sự rụng trứng tự nhiên, 8 – 12 trứng được phóng thích (tuỳ thuộc vào chủng chuột) nhưng tiến trình này không đồng bộ và xảy ra trong khoảng thời gian 2- 3 giờ

III.4 Sự thụ tinh

Khoảng 58x106 tinh trùng được phóng vào ống dẫn trứng trong mỗi lần phóng tinh Vài tinh trùng tới được đoạn bóng trong khoảng 5 phút và sự thụ tinh xảy ra trong khoảng 1 giờ

Sự thụ tinh khởi động quá trình phân bào giảm nhiễm thứ 2 và tạo thể cực thứ 2

III.5 Sự phát triển của phôi chuột giai đoạn sau làm tổ [13]

Hình 1: Sơ đồ sự phát triển ban đầu của phôi

Thụ tinh: là sự kết hợp của giao tử đực và giao tử cái tạo thành hợp tử và cũng

là mốc bắt đầu sự phát triển của hợp tử

Sự phân chia: là chuỗi phân bào nguyên nhiễm nhờ đó một tế bào ban đầu

(hợp tử) phân chia thành nhiều tế bào (phôi bào- blastomeres)

Các đặc điểm của sự phát triển phôi ban đầu ở động vật có vú:

− Sự thụ tinh và phân chia sớm xảy ra ở 2 nhánh vòi trứng

− Sự phân chia xảy ra chậm từ 12 – 24 giờ

− Sự phân chia ban đầu không đồng bộ

− Bộ gen được hoạt hóa khi hợp tử bắt đầu phân chia

Trứng

Thụ tinh

Hợp tử Phân chia Phôi bào Tinh trùng

Hình 2: Sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh A: trứng đã thụ tinh B: phôi 2 tế bào

C: phôi dâu -phôi 8 tế bào D: phôi 16 tế bào E: phôi nang

Khó khăn của việc nghiên cứu ở những loài động vật có vú:

Thể cực

Tiền nhân đực và cái Màng pellucida

Trứng đã được thụ tinh

Phôi 2 tế bào

Khoang phôi Ngoại phôi bì

Khối tế bào

− Trứng của chúng nhỏ nhất trong giới động vật (hợp tử của người có kích thước là 120µm, của chuột khoảng 80µm)

− Số lượng trứng của động vật có vú được tạo ra ít

− Phôi của động vật có vú phát triển bên trong thay vì bên ngoài cơ thể

III.6 Các giai đoạn phát triển chính của phôi chuột [5,8,9]

Giai đoạn tế bào rời (Cleavage): số lượng tế bào trong phôi có thể đếm được dễ

dàng cho tới lúc xảy ra sự kết khối ở giai đoạn 8 tế bào, làm hình dạng tế bào trở nên mờ nhạt

Giai đoạn kết khối (Compaction): xảy ra vào 3,5 – 7,5 giờ sau khi bắt đầu chu

kì tế bào thứ 4, tức ở giai đoạn phôi 8 tế bào

Phân chia tới giai đoạn 16 tế bào: kết thúc chu kì tế bào thứ 4 và bắt đầu chu kì

tế bào thứ 5, diễn ra sự phân bào nguyên nhiễm sau tách khối và kết khối trở lại sau khi phân bào nguyên nhiễm kết thúc

Hình thành khoang phôi (Blastocoel): chu kì tế bào thứ 6, biểu thị sớm nhất của

sự chuyên chở chất dịch xảy ra khi phôi tiến gần tới số lượng 32 tế bào và hình thành không bào chứa đầy dịch lỏng (hoặc 2 không bào phồng to ra và sau đó hợp nhất lại)

IV QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TRONG ỐNG NGHIỆM

IV.1 Quy trình giao phối tự nhiên

Chuột cái được ổn định theo chu kì sáng tối thường rụng trứng theo chu kì 3-4 ngày, 3-4 giờ sau khi bắt đầu chu kì tối Chuột đực được ổn định trong cùng điều kiện sẽ giao phối với con cái vào chu kì động dục khoảng giữa chu kì tối

Hình 3: A: phôi giai đoạn 8 tế bào chưa kết khối; B: phôi đã kết khối-không

nhìn thấy rõ tế bào

Có thể xác định chuột cái vào chu kì động dục bằng cách xác định màu sắc, độ nhầy, và sự sưng đỏ của âm đạo

Giai đoạn của chu kì động dục Hình thái của âm đạo

Không động dục Âm đạo có độ mở nhỏ, phần mô

không đỏ và rất nhầy

Tiền động dục Âm đạo hở, mô đỏ hồng và nhầy,

có nhiều nếp gấp theo chiều dọc hoặc những nếp nhăn rõ ràng trên cả mép lưng và mép bụng

dục, nhưng mô hồng sáng hơn và ít nhầy, và những nếp nhăn rõ ràng hơn Sau động dục 1 Mô âm đạo tái nhạt đi và khô;

mép lưng không phù như trong thời gian động dục

Sau động dục 2 Tương tự như sau động dục 1

nhưng môi ít nhợt nhạt hơn và lùi lại; những mảnh vụn tế bào hơi trắng có thể làm đầy thành trong hoặc lấp đầy âm đạo)

Bảng 1: Cách xác định giai đoạn của chu kì động dục chuột cái dựa vào hình thái của âm đạo

Chuột cái (từ 6 tuần đến 4 tháng tuổi) được kiểm tra và cho tiếp xúc với chuột đực (1 hoặc 2 chuột cái trong một chuồng với 1 chuột đực)

Con đực trưởng thành từ 6-8 tuần tuổi (tuỳ thuộc vào chủng chuột), nên nhốt trong chuồng riêng

Buổi sáng sau khi giao phối chuột cái được kiểm tra sự xuất hiện nút giao phối- tức nút nhầy âm đạo Nút nhầy gồm protein bị đông lại từ dịch tinh trùng của con đực và có thể được nhìn thấy dễ dàng trong hầu hết các chủng chuột Nút nhầy âm đạo thường tan rã khoảng 12-14 giờ sau khi xảy ra sự giao phối Thông thường, 50% chuột cái được chọn sẽ phối

II.1.1 Sự thụ tinh trong cơ thể (in vivo)

Để sự thụ tinh và sự phát triển tiếp theo sau được đồng bộ, thời gian tiêm hormone cần đảm bảo cho sự thụ tinh xảy ra trước khi rụng trứng- nghĩa là trứng vừa

rụng được thụ tinh ngay lập tức, không trùng lấp với thời gian LH nội sinh Nếu có sự khác nhau trong tuổi phát triển của phôi là do sự lệch chế độ tiêm thuốc làm kéo dài thời gian rụng trứng và thời gian giao phối dẫn đến sự không đồng bộ ở phôi thu nhận Trứng đã thụ tinh có thể phân biệt với trứng chưa thụ tinh bằng cách quan sát sự xuất hiện thể cực thứ 2

Nên tránh sự thụ tinh với trứng đã rụng quá 12 giờ vì sẽ làm tăng hiện tượng tự phát hoạt tính sinh sản đơn tính của trứng (tức trứng sẽ phân chia giả và sẽ thoái hóa dần sau đó) Chuột giao phối hiệu quả nếu sử dụng cân đối và không quá thường xuyên

II.1.2 Sự thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro)

Phương pháp này có 2 lợi điểm:

Đồng bộ hơn sự thụ tinh trong cơ thể do sự thụ tinh có thể được thiết lập thời gian chính xác

Tiến trình có thể tách khỏi chu kì ngày đêm thông thường, vì vậy cho phép sự thụ tinh của trứng diễn ra theo thời gian thí nghiệm cho phép

IV.2 Kích thích buồng trứng (superovulation)

Đối với những thí nghiệm cần nhiều phôi giai đoạn trước làm tổ thì phải tiêm kích dục tố cho chuột cái trước khi cho phối để tăng số lượng trứng rụng

Hormone kích thích nang trứng phát triển - FSH được thay thế bằng kích dục tố thu từ huyết thanh ngựa cái mang thai - PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)

Hormone kích thích rụng trứng - LH được thay bằng kích dục tố màng đệm ở người - hCG (human chorionic gonadotropin)

Hiệu quả của việc sử dụng kích dục tố gây kích thích buồng trứng ở chuột tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: tuổi, trọng lượng chuột, liều kích dục tố, thời gian tiêm kích dục tố và chủng chuột Số lượng trứng rụng được thụ tinh tuỳ thuộc vào khả năng sản xuất tinh trùng của chuột đực

IV.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kích thích buồng trứng

II.3.1 Ảnh hưởng của tuổi và trọng lượng

Sự trưởng thành của con cái là yếu tố ảnh hưởng tới số lượng của trứng được kích thích Tuổi tốt nhất cho sự kích thích buồng trứng thay đổi tuỳ thuộc vào chủng chuột Vào giai đoạn phát triển tốt nhất, sự chín nang noãn tăng đột ngột làm tăng số

lượng nang noãn có khả năng phản ứng với FSH tối đa

Tuy nhiên, tình trạng dinh dưỡng và sức khoẻ của chuột cái cũng có thể ảnh hưởng đến sự chín của nang noãn Những con vật thiếu trọng lượng và bệnh dẫn đến sự chậm phát triển và giảm số lượng trứng trong việc gây kích thích buồng trứng

II.3.2 Liều kích dục tố

Hai loại kích dục tố được sử dụng gây kích thích buồng trứng: PMSG và hCG Liều tiêm cho chuột từ 5 - 10UI Thuốc được tiêm vào khoang bụng chuột cái

Thuốc khi đã pha có thể trữ ở -200C trong khoảng 1 tháng Thường pha thuốc sao cho lượng tiêm 1ml có chứa đủ liều cần tiêm

PMSG là hormone đầu tiên tiêm cho chuột, có tác dụng kích thích sự phát triển của nang noãn

hCG là hormone kích dục tố thứ 2 được tiêm cho chuột trong quy trình gây siêu rụng trứng, có tác dụng làm trứng thoát khỏi nang noãn

III.4 Thu nhận phôi

Sự phát triển của phôi từ giai đoạn 2 tế bào lên 8 tế bào và 16 tế bào xảy

ra ở vòi trứng trong khoảng thời gian 47 giờ Chu kì tế bào thứ 2 cũng giống với chu kì đầu kéo dài khoảng 20 giờ nhưng trái lại chu kì thứ 3 và những chu kì sau lại giống với chu kì của tế bào sinh dưỡng 12 giờ Vì vậy, phôi ở từng giai đoạn nên được thu nhận từ vòi trứng trong thời gian có thể đoán trước sau khi tiêm hCG hoặc thời gian được phỏng đoán của sự thụ tinh trong cơ thể

Hình 4: Sự phát triển và di chuyển của phôi trong vòi trứng

III.4.1 Block (sự kìm hãm) ở giai đoạn 2 tế bào

Đối với phần lớn các chủng chuột, trứng và phôi khi nuôi cấy ở bất cứ giai đoạn nào trước giai đoạn 2 tế bào thường bị kiềm hãm sự phát triển ở pha G2 của chu kì tế bào thứ 2 – điều này được cho là sự block ở giai đoạn phôi 2 tế bào Dù vậy, vẫn có một vài chủng chuột có trứng và phôi không bị block ở giai đoạn 2 tế bào (Trong thí nghiệm so sánh giữa chủng chuột bị block và không bị block cho thấy khả năng phôi ngừng phát triển ở giai đoạn 2 tế bào được xác định chỉ bởi kiểu gen của giao tử cái và không liên quan đến kiểu gen của giao tử đực.)

Nếu việc thu nhận phôi từ vòi trứng được trì hoãn cho tới giai đoạn phôi 2 tế bào muộn (khoảng 48 giờ sau khi tiêm hCG) thì sự phát triển trong ống nghiệm với môi trường thí nghiệm không bị cản trở Việc thu nhận phôi ở giai đoạn 2 tế bào muộn rất quan trọng để có thể có được sự phát triển bình thường của chúng lên phôi nang trong nuôi cấy Điều này có thể thực hiện bằng cách thu nhận phôi từ 36 – 40 giờ sau khi tiêm hCG

III.4.2 Phôi dâu

Phôi dâu là sự kết hợp thành khối của phôi bào, điều này chỉ mang tính chất mô tả, có thể bao quát tất cả các giai đoạn trong quá trình phát triển từ khối 8 tế bào tới giai đoạn 16 hoặc 32 tế bào trước khi tiến lên giai đoạn hình thành khoang phôi Bằng cách quan sát sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm suốt thời gian này người ta có thể phân chia giai đoạn phát triển của chúng từ khi thành phần phôi bào bắt đầu kết khối ở giai đoạn phôi 8 tế bào, tách khối suốt sự gián phân đến giai đoạn 16 tế bào và sau đó thì kết khối trở lại Giai đoạn phôi dâu muộn được quan tâm khi phôi 16 tế bào tới 32 tế bào, khi vẫn chưa tạo khoang hổng (khoảng 84 giờ sau khi tiêm hCG) và chúng di chuyển xuống ống tử cung chỗ nối liền vòi trứng với tử cung Khi thu nhận phôi ở giai đoạn này nên thu nhận cả ở vòi trứng và phần đầu tử cung

III.4.3 Phôi nang

Phôi xuống tới tử cung và bắt đầu tạo khoang hổng vào khoảng 94 giờ sau khi tiêm hCG, khi phôi có khoảng 32 tế bào (nghĩa là hầu hết các tế bào tiến tới kết thúc chu kì tế bào thứ 5) Phôi nang sẽ tiếp tục nở phồng ra khi thành phần tế bào của chúng phát triển qua chu kì 2 tế bào tiếp theo Khi chúng chứa khoảng 128 tế bào (khoảng

120 giờ sau khi tiêm hCG) màng zona bắt đầu mỏng dần và phôi nang thoát nang, kết nối với biểu mô tử cung, bắt đầu tiến trình làm tổ

Hình 5: Các giai đoạn phát triển của phôi chuột A-phôi 2 tế bào; B-phôi 4 tế bào; C- phôi

8 tế bào; D-phôi dâu sớm; E-phôi dâu muộn; F-phôi nang

III.5 Môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ

III.5.1 Lịch sử nghiên cứu môi trường

Whitten là người công bố đầu tiên sự phát triển của phôi chuột 8 tế bào thành phôi nang trong nuôi cấy sử dụng môi trường Krebs-Ringer bicarbonate được bổ sung glucose và albumin huyết thanh bò (BSA) vào năm 1956 Cùng lúc đó là các nghiên cứu về những nhân tố ảnh hưởng lên sự làm tổ (implantation) của McLaren và Mitchie năm 1956; năm 1958 McLaren và Biggers đã thành công khi chuyển phôi nang từ nuôi cấy trong ống nghiệm vào tử cung của chuột cái được mang thai giả

Năm 1963, R Brinster đã phát triển phương pháp giọt nuôi cấy và phương pháp này được sử dụng rộng rãi tới ngày nay chủ yếu trên nuôi cấy phôi chuột

Brinster đã nghiên cứu về tính chất của môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của sự thay đổi áp suất thẩm thấu, pH, thành phần amino acid, những nguồn năng lượng và đã thiết lập nền móng sự nuôi cấy phôi chuột giai đoạn trước làm tổ Với những nghiên cứu vào năm 1968 – 1969, ông đã công bố môi trường căn bản đầu tiên nuôi cấy tế bào trứng BMOC2 Một vài môi trường khác dựa trên BMOC2 được phát triển tiếp đó, bao gồm môi trường thay đổi Whitten (do Whitten phát triên năm 1971) và môi trường M1

Vào năm 1982 Quinn đã thay thế thành phần đệm bicarbonate bằng đệm HEPES (hypoxyethyl-1-piperazineenthanesulforic acid) để duy trì pH ổn định cho chọn

phôi và cho những thí nghiệm mà phôi được thao tác trong một thời gian dài bên ngoài tủ CO2

Gần 20 năm phát triển, đã có một vài thay đổi trong điều kiện nuôi cấy phôi chuột, sự phát triển môi trường nuôi cấy phôi chuột thế hệ thứ 2 được tiến hành dựa trên những hiểu biết tốt hơn về yếu tố sinh lý học căn bản, sự trao đổi chất, và cũng đã có nhiều cải tiến trong kĩ thuật nuôi cấy phôi

III.5.2 Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú

Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy phôi động vật có vú thường thuộc 1 trong

Môi trường nuôi cấy mô phức tạp (Ham’s F-10)

Môi trường này có giá trị về mặt thương mại và được thiết kế cho nuôi cấy tế bào sinh dưỡng (somatic cell) Loại môi trường này phức tạp hơn nhiều, có chứa amino acid, vitamin, tiền thân nucleic acid, kim loại chuyển tiếp, thường được bổ sung 5-20% huyết thanh Tuy nhiên cần chú ý: nó không được thiết kế cho mục đích nuôi cấy phôi

Môi trường liên tục

Môi trường này được phát triển gần đây, dựa trên những thay đổi sinh lý của phôi và nhu cầu dinh dưỡng khi phôi phát triển từ giao tử tới phôi nang Ví dụ điển hình của loại môi trường này là G1, G2 được Gardner (1994) và Barners (1995) xây dựng cho nuôi cấy phôi trước và sau khi kết khối

III.5.3 Các thành phần chính trong môi trường nuôi cấy phôi chuột

II.3.1 Nước

Nước luôn là thành phần quan trọng của bất kì môi trường nào, chiếm khoảng 99% thành phần Nguồn gốc và sự tinh sạch của nước được sử dụng trong môi trường là yếu tố quan trọng nhất đảm bảo chất lượng môi trường Khả năng phát triển của phôi trong nuôi cấy có liên quan tuyệt đối với chất lượng của nước Whittingham đã chứng minh rằng sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào tới phôi nang trong nuôi cấy tăng khi môi trường sử dụng nước được chưng cất 3 lần so với môi trường sử dụng nước chưng cất 1 lần hay 2 lần Nước được sử dụng nên được kiểm tra nội độc tố và lượng độc tố phải ít hơn 0,125IUml

II.3.2 Ion

Vai trò của ion trong suốt quá trình phát triển phôi chuột giai đoạn trước làm tổ được biết rất ít Dịch ống dẫn trứng của động vật có vú có nồng độ cao Kali và Clo, và áp suất thẩm thấu toàn diện cao Tuy nhiên khi người ta sử dụng dung dịch muối được cân bằng áp suất thẩm thấu cao và được bổ sung nguồn năng lượng carbohydrate thì lại không thu được mức phát triển cao của phôi

Đối với phôi chuột, lactate có thể được sử dụng như nguồn năng lượng ở giai đoạn 2 tế bào và hoạt động hiệp lực với pyruvate Đã có những nghiên cứu đối lập với nhau về nồng độ tối ưu của lactate trong môi trường nuôi cấy phôi chuột phát triển tới giai đoạn phôi nang Cross và Brinster cho nồng độ tối ưu là 30mM cho sự phát triển từ giao tử tới phôi nang Trong khi có những nghiên cứu khác cho rằng nồng độ tối ưu là 10mM Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy rằng phôi chuột từ giao tử tới giai đoạn 8 tế bào cần nồng độ lactate cao (20mM), nhưng khi thời gian nuôi cấy kéo dài tới phôi dâu thì môi trường tối ưu lại có nồng độ lactate thấp hơn

Điều quan trọng là hầu hết lactate trong môi trường nuôi cấy phôi trộn lẫn 50:50 giữa D- và L-isomer trong dịch sodium lactate Trong đó chỉ có L-lactate có hoạt tính sinh học, vì vậy nồng độ lactate trong môi trường chỉ là ½ lượng được cho vào môi trường Lactate là một acid yếu có thể vào phôi và gây sụt giảm pH nội bào vì vậy sodium lactate được sử dụng trong môi trường nuôi cấy phải tránh sự có mặt của D-isomer, mặc dù nó không có hoạt tính sinh học nhưng nó vẫn có thể gây ra sự sụt giảm

pH và làm ảnh hưởng tới sinh lý tế bào

Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh, glucose hiện diện đồng thời với phosphate trong môi trường nuôi cấy làm chậm hoặc hãm lại sự phát triển, phân chia của phôi ở giai đoạn 4 tế bào muộn và 8 tế bào sớm trong nuôi cấy Tuy nhiên, sự ức chế của glucose có thể được giảm bớt bởi amino acid và vitamin

Tóm lại, phôi trong giai đoạn trước làm tổ trải qua sự thay đổi đột ngột trong việc sử dụng carbohyrate khi phát triển Pyruvate/lactate lúc đầu là những chất dinh dưỡng ưu tiên và việc sử dụng glucose tăng rõ rệt vào giai đoạn sau kết khối

II.3.4 Amino acid

Dịch ống dẫn trứng và tử cung có chứa một lượng đáng kể amino acid tự do được phôi sử dụng và tổng hợp Điều này cho thấy amino acid có vai trò sinh lý trước và trong quá trình làm tổ của phôi động vật có vú

Những nghiên cứu cho thấy, amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang Đối với sự phát triển của phôi chuột, những amino acid không thiết yếu và glutamine trong môi trường nuôi cấy làm tăng tỉ lệ phát triển của giao tử lên phôi nang vượt qua sự block ở giai đoạn phôi 2 tế bào trong nuôi cấy trong ống nghiệm Những amino acid không thiết yếu, glutamine kích thích sự phân chia tế bào, hình thành phôi nang và thoát nang trong nuôi cấy phôi chuột Amino acid trong môi trường nuôi cấy giúp cho sự hình thành phôi nang cùng thời gian với trong cơ thể

Trong khi, việc thêm những amino acid không thiết yếu vào môi trường nuôi cấy làm tăng số lượng tế bào phát triển lên thành phôi nang, được cho chỉ vào giai đoạn từ hợp tử tới giai đoạn 8 tế bào Sau khi kết khối, những amino acid không thiết yếu và glutamine không kích thích sự phân chia nữa mặc dù chúng làm tăng sự hình thành khoang phôi và thoát nang Những amino acid thiết yếu với nồng độ thấp trong vòi trứng làm giảm số lượng giao tử phát triển lên thành phôi nang trong nuôi cấy Việc ức chế sự phát triển này có thể do ảnh hưởng xấu của những amino acid thiết yếu trong suốt sự phát triển của 4 chu kì tế bào đầu tiên Tuy nhiên, sau giai đoạn 8 tế bào, những amino acid thiết yếu lại kích thích sự phân chia và làm tăng sự phát triển của khối tế bào bên trong phôi nang

Ở chuột, phôi được nuôi tới giai đoạn 8 tế bào với môi trường có chứa những amino acid không thiết yếu và chuyển vào con nhận sẽ làm tăng tỉ lệ làm tổ và phát triển sau khi cấy chuyển Trái lại nếu phôi được nuôi cấy tới giai đoạn phôi dâu hay phôi nang rồi chuyển vào con cái thì tỉ lệ phát triển sẽ tăng khi nuôi trong môi trường có chứa tất cả 20 loại amino acid

II.3.5 Chất bắt giữ kim loại nặng

Việc thêm những chất bắt giữ kim loại nạêng vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát triển của phôi trong giai đoạn trước làm tổ Thêm EDTA (Ethylenediamine tetra-acetic acid) vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát triển của giao tử chuột vượt qua được giai đoạn phôi 2 tế bào và tăng sự phát triển lên phôi nang Tuy nhiên, EDTA chỉ có hiệu quả trong khoảng nồng độ giữa 10µM đến 150µM, nồng độ 200µM sẽ ức chế sự phát triển lên phôi nang

Những chất bắt giữ ion kim loại tự do khác như transferrin cũng được chứng minh làm tăng sự phát triển của giao tử chuột lên phôi nang vượt qua được hiện tượng block 2 tế bào Người ta cho rằng transferrin làm tăng sự phát triển của phôi bằng cách bắt giữ những ion sắt, tuy nhiên lại ngăn chặn triệt để oxy tự do trong môi trường nuôi cấy là nguyên nhân gây ra stress oxi hoá đối với phôi

Người ta đã chứng minh với môi trường có chứa EDTA, những amino acid không thiết yếu và glutamine, việc có thêm transferrin không làm tăng sự phát triển

của phôi chuột lên giai đoạn phôi nang Vì vậy, khi môi trường đã có EDTA và amino acid thì transferrin là không cần thiết

II.3.6 Chất chống oxi hóa

Người ta đã chứng minh rằng một trong những nguyên nhân làm chậm lại sự phát triển của phôi ở giai đoạn trước làm tổ trong nuôi cấy so với sự phát triển trong cơ thể là do stress oxi hóa Nguyên nhân do nồng độ oxy cao, sự phơi bày ra ánh sáng và sự có mặt của những kim loại chuyển tiếp trong môi trường nuôi cấy Vì vậy, một vài nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của nhữmg chất chống oxi hóa lên sự phát triển của phôi giai đoạn trước làm tổ, tuy nhiên tới nay vẫn còn rất nhiều tranh cãi

II.3.7 Kháng sinh

Những kháng sinh như penicillin, streptomycin hoặc gentamycin thường có trong môi trường nuôi cấy phôi Khi rửa phôi trong môi trường có chứa kháng sinh có thể tránh được sự nhiễm khuẩn

II.3.8 Các đại phân tử

Đại phân tử được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường là albumin huyết thanh Bổ sung vào môi trường lượng lớn albumin huyết thanh làm tăng tính căng bề mặt, giảm xu hướng trôi lơ lửng hoặc dính chặt vào thuỷ tinh hay plastic, giúp cho việc thao tác với phôi sẽ trở nên dễ dàng hơn

Albumin huyết thanh có thể hoạt động như chất bắt giữ làm bất hoạt các kim loại nặng và những độc tố khác

Albumin huyết thanh là chất đệm làm giảm tối thiểu sự thay đổi pH khi môi trường được đưa ra khỏi tủ CO2

Tuy nhiên, các đại phân tử xuất phát từ huyết thanh cũng là các nguyên nhân dẫn đến nhiễm khuẩn và trong mỗi lô sản xuất đều có sự thay đổi đáng kể thành phần albumin Vì vậy, cần kiểm tra trước khi sử dụng đối với mỗi lô môi trường albumin huyết thanh

Polyvinyl pyrrolidone và polyvinyl alcohol được nghiên cứu cho khả năng trở thành nguồn cung cấp đại phân tử phi sinh học thay cho albumin huyết thanh bò (BSA) có nguy cơ gây nhiễm khuẩn Nhưng những đại phân tử này không có chức năng như BSA trong việc giảm sức căng bề mặt hoặc bắt giữ độc tố

Một đại phân tử khác hiện diện trong ống sinh sản con cái là hyaluronan, khối cao phân tử polysaccharide Ở chuột, lượng hyaluronan tăng trong thời gian làm tổ Người ta đã chứng minh rằng không chỉ hyaluronan có thể thay thế albumin trong hệ thống nuôi cấy phôi chuột và bò, mà còn làm tăng kết quả đáng kể trong việc chuyển phôi Tương tự với những kết quả của albumin tái tổ hợp, sự có mặt của hyaluronan trong môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng tồn tại trong điều kiện đông lạnh phôi nang Người ta thấy albumin và hyaluronan cho kết quả hiệp lực với nhau đối với việc nuôi cấy phôi

II.3.9 Ammonium

Người ta đã chứng minh khi ủ ở 370C, amino acid tự khử gốc amin phóng thích ammonium vào môi trường nuôi cấy Ngoài ra, phôi cũng khử gốc amin của các amino acid khi chuyển hoá và cũng tạo ra ammonium

Ammonium không chỉ làm chậm sự phát triển của phôi trong nuôi cấy, mà còn có thể khiến bào thai chậm phát triển và khiếm khuyết hệ thần kinh ở chuột Vì vậy phải thay môi trường sau 48 giờ đến 72 giờ để không bị ảnh hưởng bởi độc tố của ammonium Thủ phạm chính liên quan tới sự khử gốc amin và phóng thích ammonium là glutamine Tuy nhiên, amino acid có thể được thay thế bằng ananylglutamine dipeptide, nó ổn định ở 370C và giảm rõ rệt sự phóng thích ammonium vào môi trường nuôi

III.6 Thể tích ủ

Toàn bộ hệ thống nuôi cấy với mọi yếu tố: không khí, thể tích nuôi cấy, số lượng phôi, việc bổ sung các đại phân tử … đều tác động lẫn nhau và tác động lên sự phát triển của phôi

Việc nuôi cấy phôi động vật có vú trong thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong nhóm làm tăng rõ rệt sự phát triển lên phôi nang Hơn thế, đã có những nghiên cứu chứng minh rằng nuôi cấy phôi trong thể tích nhỏ làm tăng khả năng tồn tại và phát triển tiếp tục sau khi chuyển Người ta cho rằng việc tăng sự phát triển của phôi trong nuôi cấy với một thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong nhóm là do phôi tạo ra những nhân tố actocrine/paracrine đặc biệt sẽ kích thích sự phát triển Nuôi cấy phôi trong một thể tích lớn sẽ gây ra sự pha loãng làm giảm các nhân tố trên dẫn đến không đem lại kết quả mong muốn

80µl môi trường

Hình 6: Sự pha loãng trong nuôi cấy phôi đơn lẻ với một thể tích lớn môi

trường

III.7 Không khí

Nồng độ oxy trong lumen của vòi fallope thỏ là 2-6%, và 8% trong vòi trứng của chuột đồng, nồng độ oxy trong tử cung thấp hơn so với trong vòi trứng Các nghiên cứu trên những loài động vật có vú khác nhau đã chứng minh rằng nuôi cấy trong nồng độ oxy thấp (đặc biệt là phôi của loài nhai lại), làm tăng cao sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm Một vài nghiên cứu cho thấy nồng độ oxy thấp (giữa 5-8%) làm tăng cao sự phát triển lên giai đoạn phôi nang ở chuột

Nồng độ CO2 trong hệ thống nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp lên pH môi trường Mặc dù hầu hết môi trường hoạt động trên một dãy rộng pH (7,2-7,4), nhưng tốt hơn là đảm bảo để pH không vượt quá 7,4 Vì vậy, thích hợp nhất là sử dụng nồng độ CO2 trong khoảng 5-8%

VIII ALBUMIN HUYẾT THANH BÒ – BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN)

VIII.1 BSA

Albumin huyết thanh là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi nhất và là protein phong phú nhất trong huyết thanh với nồng độ 5g/100ml Trọng lượng phân tử: 68000Da (583 amino acid) pH: 7,0 +/- 0,2

Autocrine

Paracrine

20-50µl môi trường được phủ dầu

Hình 7: Sự hỗ trợ lẫn nhau khi nuôi cấy nhómphôi trong thể tích môi trường

nhỏ được phủ dầu

VIII.2 BSA và sự tổng hợp BSA trong cơ thể động vật có vú

Albumin được quan tâm chính là albumin huyết thanh Từ albumin được sử dụng để mô tả protein hoặc nhóm protein được xác định tính chất bởi tính tan trong nước Albumin là protein phổ biến nhất trong hệ tuần hoàn và chiếm 80% áp suất keo của máu Người ta đã chứng minh rằng albumin huyết thanh chịu trách nhiệm chính cho việc duy trì pH máu

Albumin của động vật có vú được gan tổng hợp ban đầu ở dạng preproalbumin Sau khi loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu thành proalbumin và tiếp tục loại bỏ 6 propeptide còn lại để trở thành albumin

Hình 8: Sự tổng hợp bovine serum albumin (BSA)

VIII.3 Thành phần amino acid trong BSA

Albumin được cấu tạo bởi lượng thấp tryptophan và methionine; lượng lớn cystine và những amino acid tích điện, aspartic và glutamic acid, lysine, và arginine Glycine và isoleucine trong BSA thấp hơn trong protein chuẩn bình thường

VIII.4 Đặc tính chức năng của BSA

VIII.4.1 Tạo bọt

Bảng 2: Các thành phần amino acid trong BSA

Preproalbumin H2N-M-K-W-V-T-F-L-L-L-L-F-I-S-G-S-A-F-S-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E-

Cắt chuỗi peptide tín hiệu

Cắt bỏ chuỗi propeptide

Tạo bọt được định nghĩa là sự tạo và giữ ổn định bọt khí trong dung dịch Protein được khuyếch tán vào mặt phân cách giữa không khí và nước và làm giảm sức căng bề mặt Tại mặt phân cách chúng hiện diện và kết hợp để tạo ra màng dính kết đàn hồi giữa các phân tử Việc tạo bọt và ổn định được cải thiện khi BSA phản ứng với những protein như lysozyme và clupeine nhờ vào liên kết chéo giữa BSA và lysozyme tại bề mặt phân cách BSA tiến tới điểm đẳng điện khi lực đẩy tĩnh điện ở mức tối thiểu Khi nó tương tác với lysozyme, sự giản nở và ổn định lớn nhất ở pH 8 và 9, giữa điểm đẳng điện của BSA (4,7) và lysozyme (10,7) khi các protein mang điện trái nhau Clupeine với pH 12 có ảnh hưởng nhiều hơn lysozyme

Lipid ức chế sự tạo bọt bằng cách chiếm chỗ của các phân tử protein tại bề mặt phân cách và phá vỡ màng protein Sự ức chế này của lipid được trung hoà khi BSA phản ứng với clupeine tại bề mặt phân cách

VIII.4.2 Khả năng đông đặc của BSA

BSA bị đun nóng tạo thành khối hoà tan thông qua cầu nối disulphide và liên kết không đồng hóa trị

Alpha-lactalbumin không tạo thành khối hoà tan nhưng phản ứng với BSA qua cầu nối disulphide tạo nên khối hoà tan Khối hoà tan những phân tử polyme hoá được hình thành trong suốt giai đoạn ban đầu của sự đông protein được đun nóng, và sự polyme hóa tiếp theo sau dẫn đến sự hình thành mạng lưới gel rắn Việc thêm alpha-lactalbumin vào BSA làm giảm khả năng tạo gel của BSA vì bị giới hạn bởi phức hợp đàn hồi

Sự đông đặc bao gồm 2 bước: bước khởi đầu gồm sự phơi bày hoặc sự phân ly những phân tử protein, sau đó là bước kết khối tức xảy ra các phản ứng liên kết Cuối cùng là hình thành gel dưới điều kiện thích hợp Để hình thành được gel với những tiêu chuẩn cao, bước kết khối cần diễn ra chậm hơn với bước phân ly Nhiệt độ làm biến tính của BSA ở 620C và 640C Nhiệt độ làm biến tính BSA tăng khi kết hợp với acid béo nhưng giảm khi nó phản ứng với clupeine Vì vậy, những phản ứng của một polymer sinh học như acid béo với BSA dẫn đến làm ổn định phân tử BSA, trong khi những phân tử khác như clupeine làm khởi động bước phân ly của BSA

VIII.4.3 Phối tử kết nối

Khả năng quan trọng nhất của albumin là khả năng kết nối thuận nghịch với nhiều phối tử BSA là chất vận chuyển những acid béo không tan trong huyết thanh Nó cũng thực hiện nhiều chức năng khác như cô lập các gốc oxygen tự do và bất hoạt các độc tố như bilirubin Albumin hút mạnh với các acid béo, hematin, bilirubin và thu hút chính với những hợp chất thơm nhỏ mang điện tích âm Nó hình thành các nối đồng hoá trị với pyridoxyl phosphat, cysteine, glutathione, và nhiều kim loại khác nhau như

Cu (II), Ni (II), Hg (II), Ag (II), và Au (I) Như một protein vận chuyển đa chức năng, albumin là chất vận chuyển chính hoặc nguồn cung cấp oxid nitric

VIII.5 Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong môi trường nuôi cấy phôi chuột

Trong thành phần hóa học môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ, huyết thanh hoặc protein có những chức năng vẫn chưa được xác định Mặc dù, BSA thường có mặt trong tất cả môi trường nuôi cấy phôi chuột giai đoạn trước làm tổ

Năm 1949, Hammond đã có những nghiên cứu ban đầu về vai trò của các đại phân tử trong môi trường nuôi cấy, thấy rằng phôi chuột 8 tế bào phát triển lên thành phôi nang cần sự kết hợp của lòng trắng trứng trong môi trường Những nghiên cứu tiếp theo sau của Whitten (năm 1956), cho là những thành phần thiết yếu trong lòng trắng trứng không thể phân tích được Vì thế năm 1956 Whitten đã thay thế lòng trắng trứng bằng BSA kết tinh, từ lúc đó việc sử dụng lòng trắng trứng trong môi trường nuôi cấy đã giảm xuống thay vào đó là BSA

BSA có thể có chức năng dinh dưỡng, như nguồn nitrogen hỗn hợp trong môi trường nuôi cấy phôi Một chức năng khác là cung cấp amino acid tự do khi thuỷ phân protein

Trong lịch sử nghiên cứu, việc thay thế BSA bằng các đại phân tử không phải là protein đã xuất hiện đầu tiên khi Brinster (năm 1965) thiết kế những thí nghiệm để chứng minh nhu cầu của những amino acid ngoại sinh trong sự phát triển của phôi chuột giai đoạn trước làm tổ Trong những nghiên cứu về những chất tổng hợp thay thế cho BSA, Brinster (năm 1965) đã tìm ra một số chất thay thế cho BSA nhưng vẫn không chứng minh được vai trò dinh dưỡng của BSA trong sự phát triển của phôi chuột

2 tế bào thành phôi nang Ông cho rằng “một số ảnh hưởng có lợi của BSA và những amino acid nào đó có thể nhờ vào hoạt động của chúng như những tác nhân bắt giữ, điều hoà quá trình oxi hóa, chất bảo vệ bề mặt tế bào, hoặc chất bảo vệ enzym”

Những nghiên cứu tiếp sau đó đã chứng minh rằng BSA là một sản phẩm rất hay thay đổi về mặt hóa học, thành phần của chúng tùy thuộc vào sự khác biệt của các phối tử kết hợp với các đại phân tử

Những thí nghiệm với môi trường thay thế BSA đã thu được những kết quả không phùø hợp Từ những thí nghiệm sử dụng PVP150 (polyvinylpyrrolidone – mol.trọng lượng phân tử 150 000) thay thế BSA, năm 1965 của Brinster đã tìm ra rằng phôi chuột 2 tế bào F1 lai xa đòi hỏi nguồn nitrogen hỗn hợp để có thể phát triển lên phôi nang Nguồn nitrogen này là BSA, hỗn hợp amino acid là thành phần của BSA bị thuỷ phân do Brinster chứng minh vào năm 1965, hoặc glutathionine do Brinster chứng minh vào năm 1968

Trái lại, năm 1970 Cholewa và Whitten cũng sử dụng PVP thay thế cho BSA đã không thể chứng minh được sự cần thiết của nguồn nitrogen hỗn hợp trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào lai F1 Brinster và Thomson vào năm 1966 đã chứng minh phôi chuột 8 tế bào lai xa không đòi hỏi nguồn nitrogen hỗn hợp để phát triển lên thành phôi nang

Kết quả thí nghiệm của Biggers, Summers, và Ginnis vào năm 1997 cho thấy: hợp tử CF1 lai xa phát triển thành phôi nang trong môi trường KSOM được thay thế

BSA bằng PVA (polyvinyl alcohol), dưới điều kiện này nguồn nitrogen chỉ là glutamine Kết quả này khác với kết luận của Brinster năm 1965 cho rằng có sự phân chia của phôi giai đoạn 2 tế bào nhưng không có sự hình thành phôi nang khi glutamine được bổ sung vào môi trường với PVP thay thế cho BSA Liệu sự khác biệt này là do sự khác nhau trong thành phần của 2 loại môi trường vẫn chưa được kết luận

Kết quả thu được từ thí nghiệm này cũng cho thấy rằng năng suất của phôi nang nuôi cấy trong môi trường KSOM với PVA thay thế cho BSA thấp hơn rõ ràng so với môi trường KSOM với BSA Như thế BSA được bổ sung vào môi trường KSOM làm tăng sự tác động hình thành phôi nang KSOM với PVA thay thế cho BSA được bổ sung amino acid cũng làm tăng sự hình thành phôi nang

Fissore vào năm 1989 đã chứng minh rằng có thể loại BSA ra khỏi môi trường nuôi cấy thay vào đó là EDTA Lý do BSA làm tăng sự phát triển phôi vẫn không được biết rõ ràng, có thể có ít nhất 3 khả năng:

(1) BSA làm tăng amino acid được bổ sung

(2) BSA cung cấp những phân tử không phải amino acid được kết hợp kích thích sự phát triển

(3) BSA cung cấp những chức năng bắt giữ

Năm 1992, Kiernan và Bavister đã chứng minh một số lô BSA kích thích sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào trong nuôi cấy, trong khi một số lô khác lại ức chế

Những nghiên cứu của Evecen, Alkan năm 2002 thấy rằng trong nuôi cấy phôi chuột từ phôi chuột 2 tế bào: với môi trường M16 và môi trường Whitten nồng độ BSA được bổ sung là 1mg/ml và 3 mg/ml là tối ưu cho sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào lên phôi nang và khi nồng độ BSA vượt quá 10 mg/ml ức chế sự phát triển của phôi chuột

VII ỨNG DỤNG THỰC TIỄN

Đây là nghiên cứu với mục đích cuối cùng là tạo được một quy trình nuôi cấy phôi tối ưu với điều kiện thực tiến hiên tại Nghiên cứu này ngoài ý nghĩa khoa học đơn thuần còn có một số ứng dụng thực tế trong Nhân giống động vật, sinh sản vô tính, bảo tồn nguồn gen …

Nhân giống động vật

Một quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh là tiêu chuẩn cần hoàn thiện đầu tiên trong công nghệ nhân giống động vật với các mục đích thương mại hay bảo tồn giống loài với các kĩ thuật tiên tiến hơn như vi thao tác, đông lạnh …

Có được môt quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh ứng dụng trong nhân giống gia súc đối với nền chăn nuôi Việt Nam sẽ mang đến một nguồn lợi kinh tế to lớn, chấm dứt đượ c vấn đề lệ thuộc nguồn giống nước ngoài, cũng như tạo được nguồn giống gia súc dồi dào trong nước, chủ động chọn lựa được những đặc tính tối ưu của những giống gia súc nội địa Cũng như bảo tồn được nguồn giống trong nước

Khai thác tế bào mầm

Ngày nay, ứng dụng tế bào mầm là vô cùng to lớn, tất cả các nước trên thế giới

đã và đang ngày càng đẩy mạnh lợi ích trong lĩnh vực này Việc tạo nguồn tế mầm từ

phôi được nuôi cấy là một lĩnh vực rất khả quan và nằm trong tầm tay nếu có được một

quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh

Chuyển gen ở động vật

Để nâng cao chất lượng gia súc thì lĩnh vực chuyển gen chiếm ưu thế rất mạnh

khi kết hợp với kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm và nuôi cấy phôi Đồng thời lĩnh vực

này cũng có ý nghĩa to lớn trong y học và tạo ra các sản phẩm thay thế trong cấy ghép

nội tạng cho người

Mô hình thực tập - giảng dạy về phôi học

Có được một quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh để ứng dụng vào việc giảng

dạy thực tập sẽ giúp cho học sinh – sinh viên tiếp cận với công nghệ trên phôi học dễ

dàng hơn, sẽ tạo được một nền tảng cơ bản cho thế hệ các nhà khoa học quan tâm tới

lĩnh vực này có thể tiến xa hơn

VI ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Gồm 599 phôi chuột giai đoạn 2 tế bào được thu nhận từ chuột nhắt trắng (Mus

musculus var Albino) khoảng 2-3 tháng tuổi, nặng khoảng 20-30g Chuột được mua tại

viện Pasteur theo tiêu chuẩn trong lượng, ổn định theo điều kiện thí nghiệm một tuần

trước khi tiêm thuốc kích dục tố, và chuột được mua từ viện Pasteur ở dạng chuột ổ (1

- 2 tuần tuổi), ổn định theo điều kiện thí nghiệm tới độ tuổi yêu cầu

VII PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm mô tả: chuột được ổn định theo chu kì

sáng – tối, sau đó tiêm kích dục tố, cho phối và thu nhận phôi 2 tế bào, tiến hành nuôi

phôi với các điều kiện thí nghiệm ở 3 nồng độ BSA 0,4%, 0,8%, 1,2% và nuôi phôi với

số lượng phôi khác nhau: 10 phôi và 6 phôi trong 50µl môi trường IVF Quan sát và ghi

nhận kết quả

Phương pháp thống kê: Ghi nhận tỉ lệ % sự phát triển lên các giai đoạn phôi 4

tế bào, phôi dâu, phôi nang so với phôi 2 tế bào thu nhận ban đầu Dùng phần mềm

thống kê Statgraf để xác định độ khác biệt ý nghĩa và các số trung bình khác

VIII DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT

IV.1 Dụng cụ

1 Ống tiêm 1ml Vinahankook Medical Supplies Việt Nam