Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nền kinh tế chủ yếu vẫn là sản xuất nông nghiệp

Phần 1 MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nền kinh tế chủ yếuvẫn là sản xuất nông nghiệp Khí hậu nóng ẩm rất phù hợp cho sự sinh trưởng vàphát triển của cây trồng, đồng thời cũng là điều kiện tốt cho sâu bệnh phát triển.Theo thống kê của tổ chức Lương- Nông thế giới, hiện nay các loại cây trồngtrên đồng ruộng phải chống đỡ với 100000 loài sâu hại khác nhau, 10000 loàinấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh Hàngnăm, khoảng 20 % sản lượng lương thực, thực phẩm trên thế giới bị mất trắng [1]

Do đó việc sử dụng thuốc trừ sâu là vô cùng cần thiết để đảm bảo an ninh lươngthực cho loài người Theo TS Marcus Theurig (2002), nếu không sử dụng thuốcBVTV thì loài người phải cần đến 3 lần diện tích trồng cấy như hiện nay [3]

Bên cạnh những lợi ích lớn lao của thuốc trừ sâu hóa học thì nó cũng gây

ra các hậu quả không nhỏ Thuốc trừ sâu hóa học tồn tại lâu trên nông sản ảnhhưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng, đồng thời một lượng lớn thuốc trừ sâukhi phun cho cây đã phát tán vào môi trường đất, nước gây ô nhiễm nghiêmtrọng Ô nhiễm do thuốc trừ sâu kết hợp với các loại ô nhiễm khác đã làm chomôi trường của chúng ta đang ở trong tình trạng đáng báo động

Trước tình hình này, việc sử dụng phương pháp đấu tranh sinh học trongtrồng trọt để bảo vệ mùa màng đang được áp dụng mạnh mẽ Trong số nhữngbệnh côn trùng, bệnh gây ra do vi sinh vật chiếm 80- 90%, nên vi sinh vật là đốitượng lý tưởng để lợi dụng đấu tranh sinh học trong bảo vệ cây trồng

Xuất phát từ những lý do trên, tôi quyết định tìm hiểu đề tài:

“Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu”

Phần 2 NỘI DUNG

I Thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn

1.1 Một số vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại [2]

1.1.1 Vi khuẩn sinh bào tử điển hình

Clotridium brevifaciens

Clotridium malacosomae

Baciluss cereus

Baciluss thuringiensis

Baciluss var entomocidus

Baciluss var galleriae Baciluss var isralensis (Bti) Baciluss sphaericus (Bs) Baciluss popilliae

1.1.2 Vi khuẩn không sinh bào tử điển hình

Nhiều loài của chi Aerobacter

Nhiều loài của chi Cloaca

Trong số những vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại, Baciluss thuringiensis

(Bt) là tác nhân sinh học đầu tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu

vi sinh trên thế giới

* Một số loài sâu bị Bac Thuringiensis gây chết [1]

Có khoảng hơn 200 loài côn trùng có thể bị vi khuẩn Bt gây chết trong đó

đa số là sâu hại cây trồng và cây rừng Con số này không ngừng gia tăng do cácnhà khoa học không ngừng tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng diệt côntrùng và thử nghiệm trên các loài sâu khác nhau

Sâu xanh hại bông (Heliothis armigera)

Sâu xám hại rau (Agrotis upsilon)

Ngài đêm hại su hào, bắp cải (Barathra brassicae)

Sâu xanh hại ớt (Heliothis assulta)

Bọ lá khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) (H.1-Phụ lục)

Bọ xít rùa (Eurygaster integriceps)

Sâu cắn lá ngô (Leucania separate Walker)

Mọt lúa mì (Sitophilus granaries Linne)

Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimoschema opereulella Zeller)

Sâu đục thân bắp (Pyrausta nubilalis Hiibner) (H.3-Phụ lục)

1.2 Chế phẩm thuốc trừ sâu Bt

1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bt [2]

- Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, nhuộm gramdương, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ vàxếp thành từng chuỗi

- Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Bt không cao, chất dinh dưỡng chủyếu là protein động thực vật Bt có thể phát triển bình thường trong nhiều nguồnnitơ, cacbon và muối vô cơ

+ Nguồn cacbon: tinh bột, maltose, glucose

+ Nguồn nitơ: nitơ hữu cơ: cao thịt bò, peptone, bột men, bột bánh lạc,bột cá v.v

+ Muối vô cơ: K2HPO, MgSO4, CaCO3

- Biên độ nhiệt sinh trưởng của Bt là 120C – 400C, nhiệt độ thích hợp là

270C- 320C, ở 350C- 400C sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hóa, nhiệt độ thấpsinh trưởng rất chậm

- Bt thích hợp với điều kiện kiềm, pH thích hợp là 7,5; ở pH 8,5 vẫn cóthể hình thành bào tử; pH= 5 không hình thành bào tử

- Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt:

+ có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết ngựa agar

+ có thể mọc trên môi trường muối xianat, khử muối nitrat thành nitrit,không khử muối sulphat, sản sinh ra enzyme phospholypase

Quá trình sống có thể chia làm 3 giai đoạn: Thể sinh dưỡng, nang bào tử,bào tử và tinh thể

1.2.1.1 Thể sinh dưỡng

Dạng que, hai đầu tù, kích thước 1,2- 1,8 μm x 3- 5 μm, bắt màu gramm x 3- 5 μm x 3- 5 μm, bắt màu gramm, bắt màu gramdương Lông mọc xung quanh, hơi động hoặc không động Thường tồn tại 1hoặc 2 cá thể liền nhau Thể sinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang.Trong thời kì sinh sản, thường có 2,4,8,v.v thể sinh dưỡng liền nhau thành mộtchuỗi Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất mạnh, dễ nuôi cấy trênmôi trường

1.2.1.2 Nang bào tử

Khi các thể vi khuẩn già, một đầu sẽ hình thành bào tử hình bầu dục, đầukia hình thành tinh thể hình thoi Đây là giai đoạn nang bào tử, nang bào tử hìnhtrứng dài, to hơn thể sinh dưỡng

1.2.1.3 Bào tử và tinh thể (H.1)

Nang bào tử phát triển nứt ra giải phóng bào tử và tinh thể Bào tử ở dạngngủ có thể chống chịu với môi trường bất lợi, do đó chế phẩm bào tử thườngđược bảo quản ở dạng bào tử

Tinh thể thường có dạng hình thoi, tùy theo loài và môi trường tinh thể cóthể có dạng tròn hoặc bầu dục Tinh thể có bản chất protein, là chất diệt sâu cóhiệu quả

Hình 1: Nang bào tử của Bacillus thuringiensis [8]

1.2.2 Độc tính và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bt

+ Các chất độc tinh thể (Cry) được mã hóa bởi các gene cry khác nhau.+ Các chất độc phân giải tế bào (Cyt), loại chất độc này tác động riêng rẽhoặc cùng với Cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc.

* Nhóm chất độc phân giải tế bào (Cyt)

Gồm các ngoại độc tố do vi khuẩn tiết ra

- Ngoại độc tố α (alpha- exotoxin): là enzim phospholipase được tiết ratrước khi bào tử và tinh thể độc được hình thành gây phân hủy mô trong cơ thểcôn trùng bị tác động

- Ngoại độc tố β (beta- exotoxin): là loại ngoại độc tố của Bt được nghiêncứu kỹ nhất Độc tố này có tính bền nhiệt, được tạo ra trước khi tinh thể độchình thành Vi khuẩn Bt có một số type huyết thanh là H1, H4a, H4c, H5, H8, H9 và

H10 có khả năng sinh ngoại độc tố β [1]

Ngoại độc tố này có cấu trúc tương tự ATP, có tác dụng cạnh tranh vớiATP  ức chế hoạt động của ARNpolymerase

Cùng với tinh thể độc ngoại độc tố β xâm nhập vào huyết tương của côntrùng, đến các cơ quan làm tăng tính độc của vi khuẩn Hiệu quả của ngoại độc

tố β thể hiện rõ nhất trên tế bào sâu non của côn trùng chịu tác động  ngăn cảnquá trình lột xác, hoặc gây dị thường trong phát triển

- Ngoại độc tố γ: là một loại phospholipase tác động lên phospholipid, pháhủy mô tế bào

* Tinh thể độc: Nội độc tố δ (delta- endotoxin) (H.3)

Tinh thể độc Cry được tạo ra với một lượng lớn hơn nhiều so với chất độcCyt và là tác nhân có hiệu quả chính trong việc gây độc cho côn trùng

Tinh thể độc không hòa tan trong nước hoặc các chất hữu cơ nhưng có thểhòa tan trong dung dịch kiềm

Có hơn 50 gene mã hóa các protein tinh thể độc, có thể chia protein tinhthể độc thành 15 nhóm dựa trên sự giống nhau trong trình tự gene

1.2.2.2 Cơ chế gây độc của tinh thể độc (H.2)

Hình 2: Cơ chế hoạt động của tinh thể độc tố diệt côn trùng [6]

A: Sâu ăn lá có vi khuẩn  tinh thể độc và bào tử xâm nhập vào cơ thểsâu Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không hòa tan

B Quá trình hòa tan tinh thể và hoạt hóa chất độc: xảy ra ở ruột giữa nơi

có pH kiềm cao (> 9,5), ở pH này tinh thể độc tan ra  tiền độc tố có kích thước135- 140 kDa  protease trong ruột giữa của sâu hoạt hóa thành dạng hoạt động

là độc tố δ (kích thước 60- 66 kDa)

C Độc tố liên kết với thụ thể (receptor) trên biểu bì ruột  đâm quamàng tạo thành lỗ xuyên màng  mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô

 tế bào nội mô bị phân giải  sâu ngừng ăn  chết đói

D Lỗ xuyên màng xuất hiện trên thành ruột  pH trong ruột giảm xuốngbằng pH nội môi trong huyết tương  cho phép bào tử nảy mầm, xâm chiếmvật chủ  gây chết

Nội độc tố δ

tiền độc tố độc tố hoạt động

Độc tố liên kết với receptor trên biểu bì ruột

receptor độc tố

Xuyên thủng màng ruột

D Bào tử nảy

mầm và vi khuẩn sinh sôi

+ Vùng II: chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn khángnguyên của globulin miễn dịch, vùng này có chức năng gắn với thụ thể trên bềmặt tế bào biểu mô ruột.

+ Vùng III: bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa khỏi bị phân hủy bởi proteaseruột

Với cấu trúc và hoạt tính như vậy, tinh thể độc liên kết một cách đặc hiệuvới màng tế bào biểu mô ruột của sâu, do đó phổ tác động của Bt khá hẹp, tùytừng loại tinh thể độc mà các chủng Bt tác động với các sâu của nhóm côn trùngchủ yếu thuộc bộ Lepidoptera

Hình 3: Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis [8]

1.2.3 Phương pháp sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt: [2]

Bt được sản xuất chủ yếu theo hai cách : lên men thường (lên men bề mặt)

và lên men chìm có sục khí Hiện nay người ta sử dụng phương pháp lên menchìm vì mang lại hiệu quả cao

Bước chọn chủng lên men: tùy theo việc phòng trừ loài sâu hại nào mànhà sản xuất chọn chủng vi khuẩn phù hợp để lên men

Bước chọn môi trường lên men: trên cơ sở môi trường cơ bản, tùy thuộcchủng vi khuẩn cần lên men mà thêm các chất phù hợp

Vùng I

Vùng II

Vùng III

Quy trình tổng quát sản xuất chế phẩm Bt

Lên men chìm tiến hành trong các nồi lên men 500l, 1000l, 2000l, ngoàimôi trường dinh dưỡng cần chú ý tới một số thông số khác như: chế độ thổi khí,chế độ nhiệt độ, chế độ luân chuyển giống v.v để hạn chế các thực khuẩn thểphá hủy các bào tử và tinh thể độc

+ Chế độ thổi khí: là chỉ tiêu quan trọng trong quá trình hình thành bào tử

và tinh thể độc Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5- 0,6 m3môi trường / m3 không khí Chế độ thổi khí thấp  bào tử phát triển yếu, mật độthưa Chế độ thổi khí cao  bào tử phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn,tinh thể độc nhỏ  hiệu quả diệt sâu không cao

+ Nhiệt độ: ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử, nhiệt độ quá caohoặc quá thấp sẽ rút ngắn hoặc kéo dài quá trình lên men, nhiệt độ phù hợp là

300C

Chủng Bt thuần khiết

Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1

Thời gian lên men: 48- 72

h, pH = 7, nhiệt độ: 30 0 C

Lên men Lọc và ly tâm Thu sinh khối Hoàn thiện sản phẩm

+ Chế độ luân chuyển giống: nếu sử dụng giống liên tục sẽ xảy ra hiệntượng nhiễm thực khuẩn thể Bình thường chỉ lên men 10- 15 lần giống cũ thìphải thay giống mới để khắc phục hiện tượng phân đốt, hiện tượng tạo ra ít bào

tử và ít tinh thể độc tố

Sau khi lên men, người ta lọc và ly tâm dịch lên men để thu sinh khối.Bước hoàn thiện sản phẩm: sản phẩm được đóng gói và chế thành cácdạng chế phẩm khác nhau

Dạng chế phẩm cũng là một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phòngtrừ sâu bệnh Chế phẩm Bt có các dạng: nước, bột, bột thấm nước, nang keo.1.2.4 Một số chế phẩm Bt trừ sâu

* XENTARI 35 WDG trừ sâu hại cây Rau [4]

Xentari 35 WDG (Bacillus thuringiensis var.aizawai),

là một sản phẩm của Công ty Valent BioSciences-Hoa Kỳ đã

được phép sử dụng trên rau theo Quyết định số

19/2005/QĐ-BNN ngày 24/3/2005 của Bộ Nông nghiệp và PTNT

- Xentari có tính chọn lọc cao, diệt trừ rất hữu hiệu hơn

60 loài sâu hại thuộc bộ cánh phấn đã kháng các loại thuốc hóa

học khác trên 200 loài cây trồng khác nhau

- Thuốc an toàn đối với người sử dụng, phân giải dễ dàng, không ảnhhưởng đến quần thể thiên địch

* Agritol (Hoa Kỳ) : 60- 70 bào tử/g

* Larvatrol (Hoa Kỳ) : 5- 150 bào tử/g

* Thuricide (Hoa Kỳ) : 5- 50 bào tử/g

* Bathurin (Tiệp Khắc) : 3- 300 bào tử/g

* Entobakterin (Nga) : 50- 90 bào tử/g

các nhà khoa học đã sử dụng virus để sản xuất thuốc trừ sâu Có hai nhóm virusđược quan tâm trong công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu:

Baculovirus thuôch họ Baculoviridae

Cytoplasmis polyhedrosis virus (CPV) thuộc họ Reoviridae

* Nhóm Baculovirus được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm nổi trộisau:

- Baculovirus chỉ tấn công động vật không xương sống và có tính đặc hiệucao nên không gây hại cho các côn trùng có ích khác

- Có cấu trúc thể bọc bảo vệ tránh điều kiện bất lợi của môi trường  cókhả năng sống tiềm sinh ngoài cơ thể vật chủ

- Có thể đạt được nồng độ cao trong cơ thể ấu trùng (1010 virus/ ấu trùng)nên thuận lợi trong sản xuất chế phẩm sinh học Chế phẩm có thể giữ hoạt tínhsinh học trong thời gian dài (10-15 năm) ngoài cơ thể vật chủ

2.1.1 Đặc điểm cấu trúc và hệ gene Baculovirus

- Baculovirus có hình que điển hình, đường kính 30- 60 nm, dài 250- 300 nm

- AND vòng, kép Trên khắp hệ gene có nhiều trình tự ngắn lặp lại (vùngtương đồng), tăng cường khả năng phiên mã sớm của gene và có vai trò như cácpromotor Trong hệ gene có nhiều gene gối nhau cho phép mã hóa nhiều genetrong khi kích thước hệ gene nhỏ

* Polyhedra: Các virus tập trung lại trong một thể đa diện (thể bọc), đượcquan sát thấy dưới kính hiển vi quang học Thể bọc được tạo ra ở giai đoạnmuộn trong chu kì lây nhiễm của virus, thể này được bọc trong một lớp giàuprotein, cấu trúc này được gọi là polyhedra, giúp virus lây nhiễm sang tế bàomới và giúp chúng chống chịu được với điều kiện tự nhiên (H.4)

* Virus nảy chồi: gặp khi virus lây nhiễm vào cơ thể côn trùng hoặc đượcnuôi cấy trong điều kiện thích hợp Virus nảy chồi chỉ mang duy nhất mộtnucleocapsid được bao bọc bởi lớp vỏ có nguồn gốc từ màng sinh chất của vậtchủ Các protein trên lớp vỏ này như protein GP64 có vai trò quan trọng trongviệc giúp virus lây nhiễm [H.4]

Hình 4: Cấu tạo các dạng tồn tại của virus [7]

2.1.2 Chu trình sống và cơ chế lây nhiễm gây độc của nucleopolyhedrovirus(NPV) (H.5)

Hình 5: Sự lây nhiễm NPV vào vật chủ là côn trùng [7]

Baculovirus có chu trình phân chia hai pha Hai dạng tồn tại, một dạnggiúp cho virus này lây nhiếm trong môi trường tự nhiên từ vật chủ này sang vậtchủ khác (Polyhedra) và một dạng là virus nảy chồi liên quan đến sự lan truyềncủa virus giữa các tế bào trong chính cơ thể vật chủ

Polyhedra vỡ  virion phá hủy thành ruột

Các tế bào ruột giữa Thành ruột

AND virus

thể vùi

vỏ bọc virion

vỏ của polyhedra (calyx)

Virus trong cấu trúc polyhedra

- Khi vật chủ ăn thức ăn có chứa virus thể bọc, virus sẽ theo đường tiêuhóa đi vào ruột giữa.

- Môi trường kiềm tại ruột giữa sẽ phá tan thể bọc, giải phóng các virion.Virion xâm nhập qua tế bào thành ruột vào trong tế bào Tại đây chúng sử dụng

bộ máy tế bào chủ thực hiện các quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã tạo racác virion mới

- Virion mới nảy chồi, thoát ra khỏi tế bào thành ruột trở thành dạng virusnảy chồi Do lớp bọc ngoài là từ màng tế bào thành ruột nên các virus này có thểxâm nhập tiếp vào các tế bào thuộc các mô khác của côn trùng

- Virus tấn công vào tất cả các loại tế bào khác nhau trong cơ thể vật chủ,

ở mỗi tế bào chu trình trên lại được tiếp tục Tuy nhiên, thay vì tạo ra các virionnảy chồi, các virus mới tạo ra tập hợp lại, được bao bởi các protein polyhedrinđặc biệt tạo ra cấu trúc thể bọc gây tan tế bào Vật chủ bị tiêu diệt giải phónghàng loạt thể bọc Các thể bọc này lại tiếp tục tấn công vào cơ thể mới

2.2 Nguyên tắc sản xuất thuốc trừ sâu virus

Nuôi sâu làm vật chủ để nhân bản virus vì virus chỉ nhiễm vào tế bào sống.Sâu kí sinh được nuôi trong buồng nuôi bằng thức ăn nhân tạo, đến giaiđoạn ấu trùng thì dịch huyền phù virus được cây vào thức ăn để lây nhiễm chosâu Sau 7- 9 ngày, ấu trùng chết sẽ được thu , sấy nhẹ ở 33-350C đến khô.Xácsâu mang nhiều virus được nghiền thành bột, thêm dịch sinh lý, trộn đều rồi lọc.Sản phẩm lọc được ly tâm lấy cặn chứa virus, thêm nước cất tạo thành dịchhuyền phù, glycogen vô trùng được thêm vào để bảo quản

III Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ nấm sợi

3.1 Một số đại diện nấm sợi có khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng

Sâu hại phát triển nhanh nhưng số lượng luôn được giới hạn bởi hiệntượng khống chế sinh học thông qua các thiên địch Nấm sợi là một trong nhữngthiên địch phổ biến, có nhiều loài thuộc các lớp nấm khác nhau có khả năng diệtcôn trùng, tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài được nghiên cứu dùng trong nôngnghiệp [2]