NGHIÊN CỨU CHẾBIẾN VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM KOJI NẾP THAN

NGHIÊN CỨU CHẾBIẾN VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM KOJI NẾP THAN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHẠM THẾ DƯƠNG THANH THẢO

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN CHẾ

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn thầy cô trường đại học Cần Thơ, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng và bộ môn Công nghệ thực phẩm đã trang bị cho tôi những kiến thức chuyên môn cần thiết để tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà và cô Lâm Thị Việt Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Chân thành cảm ơn quí thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và bộ môn Chăn nuôi - thú y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất các thí nghiệm

Và sau cùng tôi gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp Công nghệ thực phẩm khóa 28 về tất cả những gì các bạn đã dành cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Với mục tiêu tìm ra qui trình chế biến chế phẩm enzyme thô trên môi trường nếp

than từ nấm mốc Aspergillus oryzae, hướng tới sản xuất rượu nếp than Đề tài

được thực hiện gồm 2 thí nghiệm:

- Khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy tối

thích Aspergillus oryzae sinh sản và phát triển, có khả năng tổng hợp enzyme

amylase mạnh nhất

- Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm chết nấm mốc và giảm hoạt tính của enzyme amylase

Qua quá trình thí nghiệm đã cho các kết quả như sau:

- Độ ẩm nếp than nuôi cấy: 60%

- Nhiệt độ môi trường nuôi cấy tối ưu: 300C

- Thời gian thu nhận chế phẩm koji thích hợp: 2 ngày

- Nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than sau nuôi cấy: 500C,16 - 18h

Trong quá trình chế biến chế phẩm koji nếp than cần quan tâm đến những nhân tố trên Giữa chúng có sự tương tác qua lại và mỗi nhân tố có ảnh hưởng nhất định đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae cũng như khả năng tổng hợp enzyme amylase

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách bảng v

Danh sách hình vi

Chương1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji 2

2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than 2

2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae 4

2.4 Hệ enzyme 5

2.4.1 Enzyme amylase 5

2.4.2 Enzyme protease 6

2.5 Phương pháp nuôi cấy 7

2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 7

2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm 8

2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme amylase 9

2.7 Sấy 10

2.7.1 Đặc điểm của quá trình sấy 11

2.7.2 Độ ẩm cân bằng 12

2.8 Các công trình nghiên cứu 13

2.8.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 13

2.8.2 Các công trình nghiên cứu nước ngoài 13

2.9 Các vấn đề cần nghiên cứu và giải quyết trong đề tài 14

2.9.1 Qui trình 15

2.9.2 Giải thích qui trình 15

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 16

3.1 Phương tiện thí nghiệm 16

3.1.1 Địa điểm, thời gian 16

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.3 Thiết bị, hoá chất 16

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Phương pháp phân tích 17

3.2.2 Phương pháp thí nghiệm 17

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 17

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ ẩm môi trường, nhiệt độ môi

trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae 17

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than 19 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau 22

4.2 Hoạt tính enzyme amylase trong quá trình sấy chân không ở những nhiệt độ khác nhau 27

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

Tài liệu tham khảo 34

Phụ lục vii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc 4

Bảng 2: Thành phần hóa học của nếp than 9

Bảng 3: Hoạt tính của enzyme amylase 22

Bảng 4: Biến đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ môi trường,

độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy 25

Bảng 5:Thay đổi trạng thái ẩm của sản phẩm koji trong quá trình sấy 27

Bảng 6: Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy ở những

nhiệt độ sấy khác nhau 30

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Nếp than 3

Hình 2: Aspergillus oryzae 4

Hình 3: Chế phẩm koji gạo 13

Hình 4: Quá trình chế biến koji 15

Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 19

Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 21

Hình 7: Hoạt tính enzyme amylase 22

Hình 8: Chế phẩm koji nếp than sau 2 ngày nuôi cấy 26

Hình 9: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 300C, 60% ẩm, 2ngày) 26

Hình 10: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 270C, 70% ẩm, 3 ngày) 26

Hình 11:Thay đổi độ ẩm của chế phẩm theo thời gian sấy 27

Hình 12: Chế phẩm koji nếp than trước khi sấy 29

Hình 13: Chế phẩm koji nếp than sau khi sấy 29

Hình 14: Chế phẩm koji nếp than sau khi nghiền 29

Hình 15: Thay đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ sấy 30

Hình 16: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 400C 31

Hình 17: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 500C 31

Hình 18: Quá trình chế biến koji nếp than đề xuất 33

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề

Các loại sản phẩm lên men truyền thống là một trong các sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới Đó là một loại sản phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc, được truyền từ đời này sang đời khác Theo thời gian các sản phẩm lên men truyền thống càng được

mở rộng cả về chủng loại lẫn về phương pháp chế biến Hầu như mỗi dân tộc trên thế giới đều có riêng những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống của mình Sản phẩm này có thể là một bộ phận không thể tách rời trong đời sống hàng ngày của dân tộc

Bộ môn Công nghệ thực phẩm trường đại học Cần Thơ nghiên cứu rượu nếp than nhằm phát triển thành sản phẩm truyền thống của đất nước Bên cạnh qui trình công nghệ sản xuất rượu thì vấn đề được quan tâm nhiều nhất là nguồn vi sinh vật hay những chế phẩm enzyme dùng trong lên men nếp than Do đó enzyme được lấy từ nhiều nguồn: enzyme thương mại, enzyme được trích ly từ hạt ngũ cốc nảy mầm hay enzyme của vi sinh vật, chúng được so sánh và chọn ra nguồn thích hợp cho rượu nếp than có chất lượng tốt nhất Chỉ tiêu để đánh giá chất lượng của enzyme, cụ hể là hệ enzyme amylase dùng trong sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa nhiều tinh bột như nếp than là khả năng thủy phân tinh bột thành đường đơn, cung cấp chất dinh dưỡng cho quá trình lên men tiếp theo

Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ đạo Tùy theo mục đích sử dụng người ta thường sản xuất các loại chế phẩm: chế phẩm enzyme thô, chế phẩm enzyme bán tinh khiết, chế phẩm enzyme tinh khiết, chế phẩm vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme mạnh Ba dạng chế phẩm đầu, người ta quan tâm đến hoạt tính xúc tác và độ tinh sạch của enzyme Dạng sau cùng, được quan tâm cả đến hoạt tính sinh học và khả năng sinh sản, phát triển của vi sinh vật tạo ra enzyme đó (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Chế phẩm koji nếp than thuộc dạng chế phẩm enzyme thô với nấm mốc

Aspergillus oryzae trong môi trường nuôi cấy là nếp than

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường nếp than, khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae sinh sản và phát

triển, có khả năng tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất

Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm giảm hoạt tính của enzyme amylase

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji

Thuật ngữ “Koji” có nghĩa là hạt ngũ cốc lên mốc, nó còn có tên khác như: “shui”

ở Trung Quốc, “ku” ở Hàn Quốc và “koji” ở Nhật Chế phẩm koji được xem như

là một bước tiến quan trọng trong quá trình lên men từ các nguồn thực phẩm đa dạng ở Đông Á Cơ bản đó là quá trình nuôi cấy mốc trên môi trường dinh dưỡng rắn để tạo ra những enzyme thủy phân từ hạt đậu nành hay những hạt ngũ cốc khác Vì vậy koji được xem là một nguồn đa dạng các enzyme xúc tác sự thủy phân nguyên liệu thô rắn để hoà tan các chất có trong nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn phát triển ở giai đoạn lên men tiếp theo Ngoài những enzyme chính có trong nguyên liệu thì còn nhiều chất quan trọng khác, cần thiết cho giai đoạn lên men thứ hai hoặc tạo mùi thơm cho sản phẩm Phương pháp làm koji được truyền đến Nhật vào thế kỷ XIV bởi những tăng ni đạo Phật Mặc dù nó bắt nguồn từ Trung Quốc nhưng việc nghiên cứu và phát triển hướng tới cải tiến phương pháp này lại được thực hiện ở Nhật Kết quả là hiện nay việc làm koji ở Nhật có sự khác biệt so với cách trước đây và dây chuyền này trở nên nổi tiếng khắp thế giới bởi người Nhật với thuật ngữ “koji”

Khi việc nuôi cấy mốc trên hạt ngũ cốc được quan tâm thì hàng loạt các sản phẩm lên men được sản xuất ở các nước trong đó có sản phẩm rượu gạo Trung Quốc được coi là cái nôi của chế phẩm này nhưng ở các nước khác lại cho đó là phương pháp cổ truyền của cha ông họ, được truyền qua nhiều thế hệ Trong các sản phẩm lên men thì rượu Saké (rượu gạo) của Nhật là bằng chứng tốt ở cả hai khía cạnh lịch sử và kỹ thuật

Do đặc tính có ích, dễ làm của koji đồng thời dây chuyền sản xuất koji ngày càng hiện đại đã thúc đẩy quá trình sản xuất tạo nhiều loại sản phẩm phi thực phẩm (enzyme công nghiệp, chất độc, thuốc chống vi sinh vật)

Tóm lại koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cần thiết cho quá trình lên men tiếp theo

2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than

Nếp than là một đặc sản của Việt Nam và được trồng nhiều ở các tỉnh Hòa Bình, Bắc Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái và ở vùng Nam Bộ Việc mở rộng hơn nữa diện tích trồng lúa nếp than ở các tỉnh trên và một số tỉnh khác là hoàn toàn có thể được khi nhu cầu chế biến nếp than tăng cao

Ở Nam Bộ, nếp than được chia ra thành bốn loại:

Nếp cẩm Đức Hoà

Nếp đen Khánh Vinh

Nếp than Long Đất

Lúa lứa nếp cẩm

Các loại này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha

Hiện nay dân vùng đồng bằng Nam Bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo Theo cách này nếp than được chia thành hai loại:

Nếp than đen tuyền

Nếp than hồng đỏ

Các sắc tố của nếp than dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu mang màu sắc đặc trưng của loại gạo nguyên liệu.Tuy khác nhau về hình thức bên ngoài nhưng các loại nếp than có thành phần hoá học không khác nhau nhiều

Trong những năm gần đây, khi mức thu nhập của người dân tăng nhanh thì nhu cầu sử dụng rượu nếp than cũng tăng nhanh, yêu cầu về chất lượng của sản phẩm cũng đòi hỏi ngày càng phải được nâng cao Điều đó chứng tỏ sản xuất rượu nếp than của Việt Nam là hướng đi phù hợp và cần thiết Tuy nhiên để nếp than trở thành rượu đặc sản thực sự thì cần phải có sự đầu tư thỏa đáng không chỉ khoa học, kỹ thuật, kinh nghiệm cổ truyền mà còn phải có kinh phí dành cho các cơ sở nghiên cứu và sản xuất chuyên ngành, tạo ra một bước “đột phá” về công nghệ, để tạo được một sản phẩm có chất lượng cao

Hình 1: Nếp than

( http://www.recipetips.com/kitchen-tips/t-134-1014/Selecting-Rice.asp.)

2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae

Aspergillus spp hiện diện rất nhiều trong thiên nhiên, không phải loài nào cũng được sử dụng trong thực phẩm Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus spp được tiến hành thử nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α- amylase và maltase với lượng đáng

kể (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Một số loài có khả năng sinh độc tố gây ung thư

Loài vi sinh vật được dùng trong thí nghiệm là Aspergillus oryzae Nấm sợi này có

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào Khi được tổng hợp, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của nó Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: sinh khối vi sinh vật, nước trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào, và cả khối lượng môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô

Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc, mới phát triển có màu trắng, khi già thì khuẩn ty chuyển sang màu vàng nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng

Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc

(Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

85 ÷ 95 %

27 ÷ 30 0C

30 ÷ 36 giờ

2.4 Hệ enzyme

Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus và

một số loài của Neurospora, Mucor sinh tổng hợp mạnh mẽ không những chỉ có

α-amylase mà cả glucoamylase (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường nếp than nên các enzyme được

tổng hợp chủ yếu là: amylase và protease

2.4.1 Enzyme amylase

Enzyme amylase bao gồm nhiều loại: α- amylase,β- amylase, γ - amylase,

glucose isomease, pullulanose và isoamylase Trong đó hoạt lực α-amylase, β

-amylase, γ -amylase tiêu biểu cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường

glucose

• Enzyme α - amylase (1,4-α -glucan 4-glucanhydrolase)

Có khả năng phân cắt các liên kết α -1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu

nhiên và là enzyme nội bào (endoenzyme) α -amylase không chỉ có khả năng

phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn

Sự thủy phân tinh bột của α -amylase trải qua nhiều giai đoạn Trước tiên enzyme

này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử

thấp, sau đó các dextrin này bị phân hủy tiếp tục để tạo ra maltose và glucose Sau

thời gian tác dụng lâu dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13%

glucose và 87% maltose Còn sản phẩm thủy phân amylopectin là 72% maltose,

19% glucose, dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% do α - amylase không thể cắt

được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin

Khả năng dextrin hóa của α -amylase rất cao do đó người ta còn gọi α -amylase là

amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột:

- Giai đoạn dextrin hoá:

- Giai đoạn đường hoá:

Dextrin tetra và trimaltose di- và monosaccharide

Maltose maltosetriose maltotetrose

α -amylase

α-amylase

α -amylase

• Enzyme β-amylase (1,4-α-glucan-maltohydrolase):

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, phân cắt từng tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch Khác với α-amylase,

nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylosepectin thành maltose Quá trình thủy phân amylosepectin được tiến hành

từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Mỗi nhánh ngoài có từ 10-26 gốc glucose nên tạo thành 10-12 phân tử maltose Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế liên kết α-1,6 glucoside thì nó ngừng tác dụng Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside cho màu tím đỏ với iod Độ nhớt của dung dịch giảm chậm Tác dụng của β-amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:

Tinh bột 54-58% maltose + 42-46% dextrin

Nếu cho cả α -amylase và β-amylase cùng tác dụng đồng thời lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%

• Enzyme γ-amylase (glucoamylase, α-1,4-glucan-glucohydrolase)

Glucoamylase là enzyme ngoại phân, thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,6 glucoside thành glucose Tóm lại nó có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột tới glucose

2.4.2 Enzyme protease

Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein hoặc các polypeptid Ngoài ra còn có peptidase Protease phân hủy phân tử protein thành polyleptid và pepton, chúng có đặc tính đặc hiệu tương đối rộng Tiếp theo đó la sự phân hủy các peptid phân tử nhỏ này thành các acid amin tự do dưới tác dụng của peptidase

Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và

vi khuẩn Protease của vi khuẩn hoạt động ở pH = 7 – 8 Còn protease của A

oryzae hoạt động trong khoảng pH = 3.5 – 9, tối thích ở pH = 7 – 8 Dựa vào khoảng pH hoạt động người ta chia protease thành ba loại: loại acid hoạt động ở vùng pH = 2.5 – 3, loại trung tính hoạt động ở pH = 6 – 6.5 và loại kiềm hoạt động trong khoảng pH = 8 – 11 (Lương Đức Phẩm, 1998)

β-amylase

Theo Oresenko (1963) ngoài amylase canh trường bề mặt của Aspergillus- oryzae

còn có protease acid và trung tính (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004), phân hủy protein thành các chuỗi peptid và amino acid

2.5 Phương pháp nuôi cấy

2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX Sau đó, phương pháp nuôi cấy chìm được thay thế vào những năm 50 – 60 của thế kỷ trước Phương pháp nuôi cấy bề mặt là tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên

bề mặt môi trường, phương pháp này lại được phục hồi rất mạnh vào những năm

1970 đến nay

• Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

Dễ thực hiện Qui trình công nghệ thường không phức tạp Thực chất của phương pháp nuôi cấy bề mặt theo qui mô công nghiệp được xuất phát từ các quá trình lên men truyền thống của các nước Ở đó người dân đã biết sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên Người ta chỉ cần nấu (hoặc hấp) các nguyên liệu, để nguội và khi đó vi sinh vật trong không khí sẽ rơi xuống khối nguyên liệu, tự chúng phát triển tuân theo qui luật cạnh tranh trong tự nhiên Những giống vi sinh vật nào đó có khả năng trao đổi chất mạnh, có khả năng phát triển mạnh sẽ lấn át các vi sinh vật khác Và như vậy người ta đã đặt nền móng cho sự ra đời của công nghệ nuôi cấy bề mặt Lượng enzyme tạo thành từ môi trường thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm Đây là đặc điểm rất ưu việt rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại

Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém

Trong trường hợp nhiễm vi sinh vật lạ, dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

• Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phải có diện tích lớn khi thực hiện phương pháp này Trong phương pháp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng và môi trường bán rắn)

nên cần rất nhiều diện tích Trong những năm gần đây, người ta đã cải tiến các thiết bị để vi sinh vật có thể phát triển ở 4 mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt khó cơ giới hoá, tự động hóa

2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Phương pháp nuôi cấy chìm là vi sinh vật phát triển hẳn trong lòng môi trường Chính vì thế người ta thường sử dụng môi trường lỏng

• Phương pháp nuôi cấy chìm có những ưu điểm

Phương pháp nuôi cấy chìm thường chiếm diện tích ít Quá trình nuôi cấy thường được thực hiện trong các thiết bị lên men Các thiết bị lên men thường rất gọn Phương pháp nuôi cấy chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men Ngoài ra, ta có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động

Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng trong môi trường

Enzyme thu được ít lẫn tạp chất

• Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy chìm

Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra sự nhiễm toàn bộ hệ thống trong một thời gian rất ngắn Dung dịch lên men trong thiết bị lên men luôn luôn trong trạng thái nhờ hoạt động của cánh khuấy và hệ thống thổi khí

Do đó, chỉ cần một điểm nào trong môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệ thống bị nhiễm, khi đó ta rất khó kiểm soát và giải quyết hậu quả do sự nhiễm vi sinh vật lạ gây nên

Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hỏi chi phí rất lớn Những chi phí này bao gồm chi phí cho hệ thống lên men, năng lượng cho cánh khuấy, cho quá trình hoạt động của hệ thống cung cấp khí trong suốt quá trình lên men

Nồng độ enzyme trong canh trường thấp nên phải cô đặc, giá thành cao.( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002)

Với những ưu nhược điểm của hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật được trình

bày ở trên Trong thí nghiệm này, nấm mốc Aspergillus oryzae sẽ được nuôi cấy

theo phương pháp bề mặt

2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính amylase

• Thành phần môi trường dinh dưỡng

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh tạo các enzyme khác là tính hoàn thiện Hầu hết vi sinh vật đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…) và oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp nuôi cấy

bề mặt là nếp than

Bảng 2: Thành phần hoá học của nếp than

( Nguyễn Thị Hiền, Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền)

• Độ ẩm của nguyên

Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh tổng hợp enzyme Nếu độ

ẩm môi trường tăng cao quá sẽ làm giảm độ thoáng khí, thấp quá sẽ kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển cũng như tạo enzyme

• Nhiệt độ nuôi

Nhiệt độ luôn thay đổi trong quá trình nuôi do mốc thủy phân tinh bột sinh ra nhiệt, cần phải đảo trộn đuổi bớt nhiệt nhằm duy trì nhiệt độ cần thiết cho mốc phát triển Nếu nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt tính amylase (Nguyễn Đức Lượng

và ctv, 2004)

• Thời gian nuôi

Thời gian nuôi để có lượng enzyme cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt

lực enzyme Đối với đa số nấm mốc Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại

thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

• pH

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm sợi và sự tạo enzyme Đa số nấm mốc phát triển tốt và tạo enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm

ẩm môi trường (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.7 Sấy

Khi Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất, tiến hành sấy

đến độ ẩm khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm thô dạng khô (PGS – TS Đặng Thị Thu và ctv, 2004)

Đối tượng của quá trình sấy là vật liệu ẩm Vật liệu ẩm được chia làm 3 nhóm chính:

- Nhóm 1: Vật keo đặc trưng - vật liệu của nhóm này khí tách ẩm vẫn giữ nguyên kích thước và tính đàn hồi dẻo

- Nhóm 2: Vật mao dẫn xốp - vật liệu của nhóm này khi tách ẩm trở nên dòn (ví dụ: thạch cao, gốm, sứ,…)

- Nhóm 3: Vật keo mao dẫn xốp - vật liệu của nhóm này có thành mao dẫn dẻo và đàn hồi, khi thấm nước thì trương nở (ví dụ: gỗ và các loại ngũ cốc,…) Vật keo mao dẫn xốp có tính chất tổng hợp của 2 nhóm kia Trong thực tế, hầu hết các vật liệu ẩm đều thuộc nhóm này

Quá trình sấy là quá trình làm khô các vật thể, các vật liệu, các sản phẩm,… bằng phương pháp bay hơi Như vậy muốn sấy khô một vật ta phải tiến hành các biện pháp kỹ thuật sau:

- Gia nhiệt cho vật để đưa nó đến nhiệt độ bão hoà ứng với áp suất trên bề mặt vật

- Cấp nhiệt để làm bay hơi ẩm trong vật thể

- Vận chuyển hơi ẩm đã thoát ra khỏi bề mặt vật thể vào môi trường

Có nhiều cách gia nhiệt vật thể và cũng có nhiều cách vận chuyển hơi ẩm từ bề mặt vật thể vào môi trường Tương ứng với chúng có nhiều phương pháp sấy khác nhau

Từ những điểm đã nêu ở trên ta thấy trong quá trình sấy xảy ra các quá trình trao đổi nhiệt và trao đổi chất cụ thể là: quá trình truyền nhiệt từ chất tải nhiệt cho vật

truyền ẩm từ bề mặt vật sấy vào môi trường Các quá trình truyền nhiệt, truyền chất trên xảy ra đồng thời trên vật liệu sấy, chúng có ảnh hưởng quá lại với nhau

2.7.1 Đặc điểm của quá trình sấy

Nếu chế độ sấy tương đối dịu, tức là nhiệt độ và tốc độ chuyển động của không khí không lớn, đồng thời vật có độ ẩm tương đối cao, thì quá trình sấy sẽ xảy ra 3 giai đoạn: giai đoạn làm nóng vật, giai đoạn sấy tốc độ không đổi và giai đoạn sấy tốc

độ giảm dần

• Giai đoạn làm nóng vật

Giai đoạn này bắt đầu từ khi đưa vật vào buồng sấy tiếp xúc với không khí nóng cho đến khi nhiệt độ vật đạt đến bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt Trong quá trình này toàn bộ vật liệu vật liệu sấy được gia nhiệt Ẩm lỏng trong vật cũng được gia nhiệt cho đến khi đạt được nhiệt độ sôi ứng với áp suất hơi nước trong môi trường không khí trong buồng sấy Do được làm nóng nên độ ẩm của vật liệu có giảm chút ít do bay hơi ẩm còn nhiệt độ của vật thì tăng dần từ nhiệt độ ban đầu cho đến khi bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt Tuy vậy sự tăng nhiệt độ xảy ra không đồng đều ở phần ngoài và phần bên trong vật Vùng trong vật đạt tới nhiệt độ bầu ướt chậm hơn Đối với những vật dễ sấy thì giai đoạn làm nóng vật xảy ra rất nhanh

• Giai đoạn tốc độ sấy không đổi

Kết thúc giai đoạn gia nhiệt, nhiệt độ vật bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt Tiếp tục cung cấp nhiệt, ẩm trong vật sẽ hoá hơi còn nhiệt độ của vật giữ không đổi nên nhiệt lượng cung cấp chỉ làm hoá hơi nước Ẩm sẽ hoá hơi ở lớp vật liệu sát bề mặt vật,

ẩm lỏng ở bên trong vật sẽ truyền ra ngoài bề mặt vật để hóa hơi Do nhiệt độ không khí nóng không đổi, nhiệt độ vật cũng không đổi nên chênh lệch nhiệt độ giữa vật và môi trường không đổi Do vậy tốc độ bay hơi ẩm của vật cũng không đổi Do vậy tốc độ bay hơi ẩm của vật cũng không đổi Trong giai đoạn sấy tốc độ không đổi biến thiên của độ chứa ẩm theo thời gian là tuyến tính Ẩm được thoát ra trong giai đoạn này là ẩm tự do Chấm dứt giai đoạn thoát ẩm tự do chuyển sang giai đoạn sấy tốc độ giảm

• Giai đoạn sấy tốc độ giảm dần

Kết thúc giai đoạn sấy tốc độ không đổi ẩm tự do đã bay hơi hết, còn lại trong vật

là ẩm liên kết lớn hơn so với ẩm tự do Do đó tốc độ bay hơi ẩm trong giai đoạn này nhỏ hơn giai đoạn sấy tốc độ không đổi nghĩa là tốc độ sấy trong giai đoạn này nhỏ hơn và càng giảm đi theo thời gian sấy Quá trình sấy càng tiếp diễn, độ ẩm của vật càng giảm, tốc độ sấy cũng giảm cho đến khi độ ẩm của vật giảm đến bằng

độ ẩm cân bằng ứng với điều kiện môi trường không khí ẩm trong buồng sấy thì quá trình thoát ẩm của vật ngừng lại có nghĩa là tốc độ sấy bằng không Trong giai

đoạn sấy tốc độ giảm nhiệt độ ở các lớp bên ngoài bề mặt tăng nhanh hơn, còn càng sâu vào bên trong vật liệu nhiệt độ tăng chậm do đó hình thành gradient nhiệt

độ trong vật sấy Khi độ ẩm của vật đã đến độ ẩm cân bằng thì lúc này giữa vật sấy

và môi trường có sự cân bằng nhiệt và ẩm Có nghĩa không có sự trao đổi nhiệt và chất giữa vật và môi trường (nhiệt độ của vật bằng nhiệt độ môi trường, còn độ ẩm của vật là độ ẩm cân bằng)

Ở cuối quá trình sấy do tốc độ sấy nhỏ nên thời gian sấy kéo dài Về lý thuyết để cho độ ẩm giảm đến độ ẩm cân bằng thì thời gian sấy τ → ∞ tức là đường cong

u = f(τ ) tiệm cận với đường thẳng ucb = const Tuy vậy trong thực tế người ta sấy đến độ ẩm cuối lớn hơn độ ẩm cân bằng

Trong ba giai đoạn sấy trên, giai đoạn thứ nhất thường xảy ra rất nhanh so với hai giai đoạn tiếp theo Vì vậy trong nhiều trường hợp người ta chia quá trình sấy thành hai giai đoạn: giai đoạn sấy tốc độ không đổi (bao gồm cả giai đoạn gia nhiệt) hay giai đoạn đẳng nhiệt và giai đoạn sấy tốc độ giảm hay giai đoạn nhiệt độ tăng (Hoàng Văn Chước, 2004)

2.7.2 Độ ẩm cân bằng

Độ ẩm cân bằng là độ ẩm của vật khi ở trạng thái cân bằng với môi trường xung quanh vật đó Ở trạng thái này độ chứa ẩm trong vật là đồng đều và áp suất hơi nước trên bề mặt vật ẩm bằng áp suất hơi nước trong không khí ẩm Lúc này không tồn tại sự trao đổi chất ẩm giữa vật và môi trường Như vậy độ ẩm cân bằng phụ thuộc vào trạng thái môi trường bao quanh vật Trong kỹ thuật sấy độ ẩm cân bằng có ý nghĩa rất lớn, nó xác định giới hạn quá trình sấy Một vật có độ ẩm ϖ1

đặt trong môi trường không khí ẩm có trạng thái nhất định t1, ϖcb1 Nếu độ ẩm của vật lớn hơn độ ẩm cân bằng tương ứng với trạng thái không khí thì vật ẩm sẽ thoát

ẩm cho tới khi đạt đến trị số độ ẩm cân bằngϖcb1.Ngược lại nếu ϖ1<ϖcb1 thì vật sẽ hấp thu ẩm để cho độ ẩm của nó tăng lên cho tới khi đạt trị số cân bằng

Vì vậy khi cần bảo quản một sản phẩm có độ ẩm nhỏ hơn độ ẩm cân bằng ứng với không khí trong phòng ta không thể để sản phẩm trong điều kiện không khí trong phòng vì như vậy sản phẩm sẽ hấp thu ẩm làm cho độ ẩm của nó tăng lên dẫn đến giảm đáng kể thời gian bảo quản an toàn, sản phẩm mau hỏng Ta thường dùng bao gói hoặc nhà kho mà độ ẩm tương đối của không khí nhỏ hơn so với môi trường bên ngoài Tức là làm sao cho độ ẩm cân bằng của sản phẩm tương ứng với điều kiện môi trường trong kho bảo quản phải nhỏ hơn hay bằng độ ẩm của vật cần bảo quản Có như vậy khi sản phẩm đạt đến trạng thái cân bằng với môi trường trong kho thì độ ẩm của nó không vượt quá trị số độ ẩm cho phép (Hoàng Văn

2.8 Các công trình nghiên cứu

Koji được biết đến hầu hết ở các quốc gia trên thế giới dưới những tên gọi địa phương khác nhau Chúng được làm từ đậu nành, đậu phộng, gạo lức, gạo đỏ, chúng được xem là chế phẩm trung gian làm nước tương, rượu gạo, tạo màu cho sản phẩm và còn được dùng trong y học

2.8.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

Các công trình nghiên cứu trong nước chủ yếu trên môi trường cám nhằm thu nguồn enzyme phục vụ cho các quá trình chế biến thực phẩm và rượu các loại Đặc biệt chế phẩm nuôi cấy trên đậu nành dùng trong sản xuất nước tương được sử dụng rộng rãi trong nước

2.8.2 Các công trình nghiên cứu ngoài nước

Koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cho quá trình lên men tiếp theo Chúng đựơc dùng sản xuất các sản phẩm truyền thống của các quốc gia Châu Á như: rượu sake và nước tương

Có những báo cáo về những lợi ích vượt trội trong việc dùng thiết bị tự đông làm koji so với phương pháp thủ công, dùng trong chế biến nước tương giúp tăng năng suất từ 65% lên đến 95% Và cũng có báo cáo cho rằng nước tương được sản xuất

từ dây chuyền tự động cho hương vị ưu việt, ngăn ngừa sự lây nhiễm của các vi sinh vật không mong muốn vào koji

2.9 Các vấn đề cần nghiên cứu và giải quyết trong đề tài

Nhìn chung các nghiên cứu về koji trên thế giới khá nhiều, mốc Aspergillus oryzae

được nuôi cấy trên nhiều môi trường khác nhau tương ứng với những sản phẩm nhất định Ở đây, nhằm phát triển rượu nếp than thành sản phẩm truyền thống của

Việt Nam với chất lượng cao thì việc nuôi mốc Aspergillus oryzae là một trong

hàng loạt những nghiên cứu liên quan đến rượu nếp than

Thông qua đề tài, cần xác định một qui trình chế biến koji với các thông số về nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp

2.9.1 Qui trình sản xuất koji nếp than

Hình 4: Quy trình chế biến koji

2.9.2 Giải thích qui trình

Nếp than được rửa và ngâm trong nước khoảng một giờ, giúp giai đoạn nấu được nhanh hơn và hạt nở to hơn Nếp sau khi chín được đem đi xác định độ ẩm nhằm chỉnh ẩm theo yêu cầu, rồi đem thanh trùng để tiêu diệt những vi sinh vật từ không khí hay dụng cụ nhiễm vào, đồng thời tạo điều kiện cho nếp hút phần nước bổ sung vào khi chỉnh ẩm hay là khi nếp có độ ẩm sau khi nấu vượt quá mức yêu cầu thì thanh trùng sẽ làm giảm đi một phần ẩm nào đó Sau thanh trùng để nguội và cấy mốc giống vào với tỷ lệ 0.2% và đem đi ủ Khi đã xác định được các thông số tốt nhất để mốc có hoạt tính cao nhất thì tiến hành sấy để bảo quản

Giống Làm nguội