Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm

Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm

Đặt vấn đề

Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụcho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thựcphẩm, mỹ phẩm Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã được xác định rõ

về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất -lactone làlactone lànhững hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu Các hợp chất này được tìm thấytrong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men

tự nhiên Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng đểtạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực phẩm…Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khókhăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu điềuchế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quátrình chuyển hoá của vi sinh vật Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu làloại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó làacid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp cáclactone

Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sửdụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên

cứu Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm” với các mục tiêu sau:

- Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng

nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm -lactone làdecalactone

- Tách chiết -lactone làdecalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ

định tính, định lượng bằng sắc ký khí

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

1.1 Đại Cương về nấm men

Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm

có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]:nói chung chúng thường ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sản theo cách nảychồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả nănglên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường cónồng độ đường cao và có tính acid

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường cóchứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉđường, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ Là visinh vật thuộc nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồmcó: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân… Kích thước tế bào nấmmen lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 2-lactone là15 m do đó có thể

thấy rõ dưới kính hiển vi quang học Hình thái tế bào nấm men rất đa dạng

và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong, hìnhthoi, hình tam giác, hình thận, hình lưỡi liềm, hình mũ…Nấm men có cả haihình thức sinh sản hữu tính và vô tính Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi,

phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi

ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc

bộ Endomycetales.

Nấm men thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ Chúng chỉ có khảnăng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khícác hợp chất hữu cơ ngoại bào [4] Trong quá trình sinh trưởng và phát triểnnấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon thường là các loạiđường, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng Đồng thời

trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cũng tổng hợp nên các chấthữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụngchúng để phục vụ cho đời sống của mình Rất nhiều loại nấm men được ứngdụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinhkhối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men, các enzym nhưamilase, invertase, lactase, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin,các acid amin như lyzin, cystein, methionin Cũng có rất nhiều loài nấm men

đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành -lactone làdecalactone và

đã được sử dụng để sản xuất -lactone làdecalactone như: Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus,

Rhodotorula glutinus [10]…

1.2 Dầu thầu dầu

1.2.1 Cây thầu dầu [1]

Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ

tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét

Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-lactone là12m.

Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng,phiến lá hình chân vịt từ 5-lactone là9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưakhông đều Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gaimềm Hạt hình trứng hơi dẹt Mặt hạt nhẵn bóng

Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt

Nam, Ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-lactone là5, vớimục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp Ngày nay, cây thầudầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới

1.2.2 Dầu thầu dầu

Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầudầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.

Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi

vị nhạt Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định

rõ ràng Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glyceridchung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein làthành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic).Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau:

C

OH

Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic )

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hoá học của dầu thầu dầu và đã được công bố Theo các tác giả C.Borch-lactone làJensen và G.Lakshininarayana dầu thầu dầu có thành phần hoá học như bảng1

B ng 1: Th nh ph n hoá h c c a d u th u d u[9,14]ảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] ành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] ần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] ọc của dầu thầu dầu[9,14] ủa dầu thầu dầu[9,14] ần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] ần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] ần hoá học của dầu thầu dầu[9,14]

Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có sự khác biệt theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic (chiếm 83-lactone là90,4 %)

OH

OH O

O

O C

T o

ACID

1.3 [R]- -decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng

Các -lactone làlactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó

-lactone làdecalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứunhiều nhất -lactone làDecalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trongquả đào và một số loại hoa quả khác -lactone làDecalactone là một ester nội phân tửcủa acid 4-lactone làhydroxy-lactone làdecanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-lactone là5 và nhiệt độ70-lactone là100 0 C sẽ đóng vòng để tạo -lactone làdecalactone [7]

Ở điều kiện thường -lactone làdecalactone là một chất lỏng trong suốt khôngmàu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu

Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etylacetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]:

+ Công thức phân tử: C10H18O2 (M=170)

+ Công thức cấu tạo:

+ nhiệt độ sôi: 281 0 C

+ Tỷ trọng : 0,952

+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa

-lactone làDecalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thựcphẩm Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sáchnhững hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ caonhất từ 5 –20 ppm Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụngtrong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-lactone là400ppm[17] Trên thế giới -lactone làdecalactone được sử dụng trong nhiều ngành côngnghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an

toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng Nó được dùng làm chấttạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa,sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]

Trong tự nhiên, -lactone làdecalactone có mặt trong một số loại hoa quả như:mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20mg/kg một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men Trong phân tử

-lactone làdecalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tựnhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là[R]-lactone là-lactone làdecalactone và [S]-lactone là-lactone làdecalactone Tuy nhiên dạng đồng phân quanghọc R được tìm thấy nhiều hơn Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượttrội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5]

1.4 Tổng hợp -decalactone nhờ vi sinh vật [15]

-lactone làDecalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation) Con đường biến đổisinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp

-lactone làdecalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợpsinh học

1.4.1 Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic).

Là con đường tổng hợp -lactone làdecalactone nhờ vi sinh vật trong đó không

sử dụng chất béo hay dầu mỡ Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp

-lactone làdecalactone từ những hợp chất đơn giản Berger là người đầu tiên đã pháthiện ra sự có mặt của -lactone làdecalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi

các chủng Basidomycetes (nấm đảm) Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc

tổng hợp -lactone làdecalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng

-lactone làdecalactone thu được rất thấp Jourdant và cộng sự đã dùng chủng

Sporobolomyces odorus để tổng hợp -lactone làdecalactone nhưng chỉ thu được 1mg/

1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản xuất -lactone làdecalactone nhờ sự hoá đặc acyl-lactone làACP cùng succinyl CoA Tuy nhiên có rất

ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc sinh lýhọc với tổng hợp -lactone làdecalactone

1.4.2 Con đường biến đổi sinh học (biotransformation)

-lactone làDecalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệpbằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ

vi sinh vật Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-lactone làhydroxy-lactone làdecanoic sau đó đóng vòng để tạo ra -lactone làdecalactone

Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo -decalactone ở vi sinh vật.

Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym haykhông cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng Tổng hợp

-lactone làdecalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy

mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11,

12, 13, 16, 18, 19] Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyểnhoá acid ricinoleic thành -lactone làdecalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm

C

O OH OH

C

O O

Vi sinh vËt

Acid 4-lactone làhydroxy decanoic

Acid ricinoleic

Gamma-decalactone

2001 Yarrowia lipolytica

HR 145 (DSM 12397)

Dầu thầu dầu

-decalactone

1.4.3 Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành -decalactone ở vi sinh vật.

Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất làqúa trình -lactone làoxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase(Aox) Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-lactone làCoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế

bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2].Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-lactone làhydroxy decanoic, như đãbiết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra -lactone làdecalactone Yves Wache[21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5)được mã hoá bởi các gen Pox1-lactone là>Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica cóliên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone Trong đó gen Pox3 mã hoáenzym Aox3 (chuỗi ngắn-lactone làshort chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổnghợp -lactone làdecalactone Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng

-lactone làdecalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/llên đến 220mg/l sau 24 h) Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-lactone làhydroxy-lactone là-lactone làdecalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng

ở chủng hoang dã quá trình -lactone làoxy hoá chịu sự tác động của 3-lactone làhydroxy-lactone làAcyl-lactone làCoenzym A Hydrogenase

Con đường -oxy hoá biến đổi methyl ricinoleate ở nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [22]:

Sản phẩm -oxy hoá khác

+ Sản phẩm tạo thành:

1: Dec-lactone là3-lactone làen-lactone là4-lactone làOlide

2: -lactone làDecalactone

3: Dec-lactone là2-lactone làen-lactone là4-lactone làOlide

4: 3-lactone làhydroxy-lactone là-lactone làDecalactone

5: 3-lactone làketo-lactone là-lactone làDecalactone

+Hệ enzym:

Aox: Acyl CoezymA oxidase Ahy: Acyl Co A Hydratase Hdh: 3-lactone làhydroxy-lactone là-lactone làDecalactone Thi : 3keto acyl Co A thiolase.

PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1 Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị

 Dầu thầu dầu : Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công

nghiệp Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng

ở Bắc Ninh

 Acid ricinoleic : Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp

 Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện

CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu,

chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica ), chủng PDT7.

 Lá cây, đ ất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa

được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viênPasteur, Công viên Lê-lactone lànin, Hoài Đức Hà Tây…

 Hoá chất :

+ Etyl acetat (Trung Quốc)

+ Agar

+ Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco)

+ Dịch chiết Malt-lactone làglu 20 0 Bx

+ (NH4)2SO4

+ n-lactone làHecxan ( Trung Quốc)

+ -lactone làDecalactone chuẩn

+ HCL 37%

 Thiết bị và dụng cụ:

+ Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp )

+ Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật )

+ Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật )

+ Máy lắc bình tam giác Lab-lactone làline ( Mỹ )

+ Máy ly tâm Universal 16 Hettich

+ Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật )

+ Máy sắc ký khí Aligent 6890 A(USA)

+ Đĩa petri, ống eppendorf, ống nghiệm có nắp vặn, ống falcon, pipet,bình tam giác…

2.1.2 Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu

(*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit)

MnSO4.4H2O : 400 g

Na2MoO4.2H2O : 200 g

ZnSO4.7H2O : 400 g

 Môi tr ư ờng 2: môi tr ư ờng yeast-nitrogen 10%

+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g

+ Nước cất vừa đủ 100 ml

Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difcogồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự pháttriển của nấm men

Hấp ở 120 0C/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80 0C bổ xung 0,1 % acidlactic và đổ thạch đĩa

Môi tr ư ờng 5: môi tr ư ờng làm sạch lần 2

Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acidlactic

Môi tr ư ờng 6: môi tr ư ờng phân lập và giữ giống

Thành phần như môi trường làm sạch lần 2

2.1.3 Phương pháp thực nghiệm

+ Nguyên tắc:

Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi

sử dụng môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic Nếu nấmmen mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá được acid ricinoleic Những chủng cókhả năng chuyển hoá acid ricinoleic được kiểm tra khả năng tạo mùi thôngqua đánh giá cảm quan

+ Chuẩn bị môi tr ư ờng : Pha môi trường 1 đong vào các ống nghiệm

loại 10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml Bổ xung 30 l acid ricinoleic / ống.Hấp thanh trùng ở 120 0C / 20 phút

-lactone là Lắc mạnh trong 1-lactone là2 phút

-lactone là Để lắng trong vài chục giây, sau đó hút 1 ml dung dịch vào ốngeppendorf

-lactone là Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút

-lactone là Hút bỏ 900 l phần dịch trong, trộn đều phần còn lại và nhỏ toàn bộvào ống chứa môi trường chọn lọc

+ Nuôi cấy :

Nuôi cấy lắc trên giá ống nghiệm, chỉnh tốc độ lắc sao cho toàn bộ phầndịch bị khuấy trộn Sau 1-lactone là2 tuần, tuỳ theo mức độ phát triển có thể tiến hànhphân lập nấm men

+ Phân lập :

Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường 5

-lactone là Lắc đều dịch nuôi cấy

-lactone là Nhúng que cấy vào canh trường và cấy lên mặt thạch vài lần

-lactone là Di que cấy theo hướng từ vị trí ban đầu ra các phía để tách từng khuẩnlạc riêng rẽ

Sau 3-lactone là 5 ngày ta chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy lên đĩathạch chứa môi trường làm sạch lần 1 Khi VSV đã mọc ta chọn một khuẩnlạc riêng rẽ cấy lên môi trường làm sạch lần 2 Qua 2 lần làm sạch ta có thểchọn được các giống thuần chủng và các chủng này được giữ trong ốngeppendrof ở 5 0 C

+ Thử hoạt lực của các chủng phân lập đư ợc :

Chuẩn bị môi trường 1 và đong vào các ống nghiệm 10 ml có nắpkhoảng 3 ml/ống Bổ xung 30l acid ricinoleic/ống Hấp thanh trùng ở 1atm/20 phút Các chủng đã phân lập được cấy vào các ống nghiệm có chứamôi trường trên Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí nhiệt độ 25 0C, lắc 320vòng /phút Theo dõi mùi tạo ra hàng ngày trong thời gian 2 tuần để chọnchủng có khả năng tạo hương thơm

ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện:

Các chủng giống được giữ trong ống eppendorf trong tủ lạnh được cấytruyền sang môi trường 6 trên thạch nghiêng để hoạt hoá chủng

Pha môi trường 2 đong vào các ống nghiệm 2ml/ống Bổ xung 20lacid ricinoleic /ống nuôi cấy ở điều kiện như trên v à theo dõi mùi tạo ra

phân lập và tuyển chọn

Từ các chủng tạo hương được phân lập và tuyển chọn chúng tôi tiếnhành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và khả năng tạomùi thơm của các chủng

tuyển chọn

Các chủng nấm men được cấy truyền từ ống giữ giống sang thạchnghiêng, nuôi cấy ở 25 0C trong 3-lactone là5 ngày và quan sát hinh thái Các hìnhảnh qua kính hiển vi quang học Eclipse 600 được truyền bằng camera JVC

và lưu giữ trên máy vi tính Hình ảnh đã số hoá được sử lý bằng phầnmềm đồ hoạ Adobe Photoshop 5.0 Kết quả thu được sẽ được tham chiếuvới những khoá phân loại nấm men để sơ bộ định tên các chủng giống

các chủng tạo hương

+ Chuẩn bị chủng giống: chủng giống được cấy truyền từ ống

eppendorf sang thạch nghiêng, sau 2-lactone là3 ngày có thể sử dụng cho lên men

+Lên men và tách chiết: chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml môi

trường 2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam dầu thầu dầu Tween 80 đượccho vào ở đây nhằm làm tăng khả năng nhũ hoá của dầu thầu dầu giúp cho

vi sinh vật có thể sử dụng tốt hơn Môi trường được hấp thanh trùng ở 120

0C /20 phút Cấy khoảng một vòng que cấy chủng vào môi trường nuôi cấy,lắc đều Đặt các bình nuôi cấy chủng trong điều kiện rung lắc ở 200vòng/phút, nhiệt độ 25 0C, trong quá trình lên men theo dõi pH môi trường

và giữ ở 6,5-lactone là7 Sau 7 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5bằng dung dịch acid HCl Đun nóng ở 100 0C trong 10 phút để thực hiệnphản ứng đóng vòng lactone Sau khi làm lạnh chiết bằng dung môi n-lactone làhecxan Ly tâm dịch chiết để loại bỏ cặn Hút lấy dịch trong vào ống Falcon,dịch chiết được sử dụng cho việc định tính và định lượng chất thơm tạo rabằng sắc ký khí.

nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau(*):

Nuôi cấy chủng KFP 346 theo các cách sau:

+ Cách 1: Pha 100ml môi trường 1 trong bình tam giác Hấp thanh

trùng ở 1atm/20 phút Cấy khoảng 1 vòng que cấy chủng Sau thời gian nuôicấy 7 ngày ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, 250C Sau cùng chiết bằng 50 mldung môi etylacetat Ly tâm loại cặn

+ Cách 2: khác cách 1 ở điểm: sau 7 ngày nuôi cấy thực hiện phản ứng

đóng vòng lacton bằng cách acid hoá môi trường bằng dung d ịch HCl đến

pH 1,5 Đun nóng ở 100 0 C trong 10 phút Làm lạnh và chiết bằng 25 mldung môi n-lactone làhecxan Sau cùng ly tâm loại cặn

+ Cách 3: chuẩn bị 100 ml môi trường 3 vào bình tam giác Hấp thanh

trùng ở 1atm/20 phút Cấy khoảng một vòng que cấy chủng Nuôi cấy trong