phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng trong lên men rượu vang quách

Kết quả tuyển chọn cho thấy dòng nấm men B2 là dòng nấm men có hoạt lực lên men cao nhất kết thúc chiều cao cột khí CO2 trong thời gian ngắn nhất sau 7 giờ lên men và đạt độ cồn 14,07%

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỰ NHIÊN ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RƢỢU VANG

QUÁCH

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: LT11609

Năm 2013

Luận văn đính kèm theo đây với tựa đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỰ NHIÊN ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG QUÁCH” do Nguyễn Hữu Phước thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013

Chủ tịch hội đồng

Xin chân thành ghi ơn tất cả Thầy, Cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt cho tôi nhưng kiến thức vô cùng quí báo để tôi vận dụng và hoàn thành tốt bài luận văn tốt nghiệp

Xin thành thật biết ơn Thầy Trần Vũ Phương VCNSH, chị Nguyễn Thị Loan học viên cao học khóa 18 CNTP, đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong xuốt thời gian qua

Xin cảm ơn các tất cả các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm liên thông K37, các anh, chị và các bạn ở VCNSH đã động viên nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã không ngại khó khăn luôn giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành tốt khóa học và luận văn tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

NGUYỄN HỮU PHƯỚC

7 dòng nấm men ở tỉnh Vĩnh Long Hầu hết các dòng nấm men là hình elip

Thử hoạt tính lên men của 19 dòng nấm men phân lập và so sánh với hai dòng

Saccharomyces cerevisiae của Úc và Mỹ Kết quả tuyển chọn cho thấy dòng nấm

men B2 là dòng nấm men có hoạt lực lên men cao nhất (kết thúc chiều cao cột khí

CO2 trong thời gian ngắn nhất sau 7 giờ lên men và đạt độ cồn 14,07% v/v sau 10 ngày lên men) so với các dòng nấm men phân lập còn lại và hai dòng

Saccharomyces cerevisiae của Úc và Mỹ

Tìm các thông số tối ưu cho quá trình lên men từ các điều kiện ban đầu: pH (4,0; 4,4; 4,8), Brix (20; 23; 26), tỉ lệ pha loãng nguyên liệu : nước (1:1,5; 1:2; 1:2,5), cố định mật số nấm men 108

tb/ml Thông số tốt nhất cho lên men rượu vang Quách:

độ Brix 23, pH 4,4, tỉ lệ pha loãng nguyên liệu nguyên liệu:nước là 1:2, mật số nấm men 108 tb/ml, sau 10 ngày lên men cho độ cồn cao 14,06 % v/v Ngoài ra, khi giải phương trình hồi qui tìm được các thông số tối ưu: độ Brix 23, pH 4,69, tỉ lệ pha loãng nguyên liệu 1:1,79 và kết quả độ cồn tính toán được là 13,08% v/v

Chọn các thông số tối ưu pH=4,69; Brix=23; tỉ lệ pha loãng nguyên liệu 1: 1,79 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo tìm các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất rượu vang quách có chất lượng tốt nhất

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ii

LỜI CAM ĐOAN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH viii

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY QUÁCH 2

2.1.1 Tên gọi, phân bố và đặc điểm sinh học 2

2.1.2 Công dụng 2

2.1.3 Thành phần dinh dưỡng 4

2.2 GIỚI THIỆU VỀ RƯỢU VANG 4

2.2.1 Lịch sử rượu vang 4

2.2.2 Các loại rượu vang 4

2.3 NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 5

2.3.1 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men 5

2.3.2 Cấu tạo tế bào nấm men 5

2.3.3 Các hình thức hô hấp của nấm men 5

2.3.4 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men 6

2.3.5 Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men 6

2.3.6 Quá trình sinh trưởng và phát triển 7

2.3.7 Nấm men thường sử dụng trong lên men rượu vang 8

2.4 PHÂN LẬP NẤM MEN 9

2.5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG 10

2.5.1 Cơ chế của quá trình lên men 10

2.5.2 Động học của quá trình lên men 11

2.5.3 Biến đổi sinh hóa trong quá trình lên men .12

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 12

2.6 CÁC VI KHUẨN GÂY HẠI TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 15

2.6.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic 15

2.6.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic 15

2.7 CÁC SẢN PHẨM PHỤ VÀ TRUNG GIAN CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN .15

2.7.1 Sự tạo thành acid 15

2.7.2 Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác 16

2.8 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 16

2.8.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

2.8.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.1.2 Nguyên vật liệu 19

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 19

3.1.4 Hóa chất và môi trường sử dụng 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm .20

3.2.2 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch quả quách lên men .20

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt lực lên men của các dòng nấm men đã phân lập và so sánh với dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Úc và Mỹ Tuyển chọn ra dòng nấm men có hoạt lực tốt nhất .22

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH, tỉ lệ pha loãng đến quá trình lên men rượu Quách .25

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 PHÂN LẬP VÀ TÁCH RÒNG NẤM MEN TỪ DỊCH QUẢ QUÁCH LÊN MEN 28

4.2 KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH QUẢ QUÁCH CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN VỪA PHÂN LẬP VÀ NẤM MEN CỦA VIỆN NC & PT CNSH .39

4.2.1 Kết quả khảo sát hoạt lực lên men dựa vào chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham 39

4.2.2 Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập và hai dòng nấm men

Saccharomyces serevisiase của Úc và Mỹ .41

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ BRIX, pH, TỈ LỆ PHA LOÃNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU QUÁCH .43

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 KẾT LUẬN .48

5.2 ĐỀ NGHỊ .48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ CHƯƠNG I

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Giá trị dinh dƣỡng trong 100g thịt quả và hạt 4

Bảng 2 Thành phần hóa học của nấm men: 6

Bảng 3: Tổng hợp đặc điểm hình thái của 19 dòng nấm men 38

Bảng 4: Chiều cao cột khí CO2 của 21 dòng nấm men 40

Bảng 5: Kết quả lên men của 21 dòng nấm men 42

Bảng 6: Độ cồn, độ Brix sau lên men của dòng nấm men B2 44

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Trái quách 2

Hình 2 Trái quách lúc chín 3

Hình 3 Quá trình và phát triển của nấm men 8

Hình 4 Saccharomyces cerevisiae 8

Hình 5 Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men 12

Hình 6 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 20

Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 21

Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 23

Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 26

Hình 10: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men A1 28

Hình 11: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men A2 29

Hình12: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men A3 29

Hình 13: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men A4 30

Hình 14: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men AD1 30

Hình 15: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men AD2 31

Hình 16: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men B1 31

Hình 17: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men B2 32

Hình 18: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men BD1 32

Hình 19: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men BD2 33

Hình 20: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men BD3 33

Hình 21: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men BD4 34

Hình 22: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men C1 34

Hình 23: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men C2 35

Hình 24: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men C3 35

Hình 25: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men D1 36

Hình 26: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men D2 36

Hình 27 : Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men DD1 37

Hình 28: Hình dạng tế bào và khuẩn lạc của dòng nấm men DD2 37

Hình 29: Biểu đồ thể hiện thời gian xuất hiện bọt khí của các dòng nấm men 39

Hình 30: Biểu đồ thể hiện thời gian đầy cột khí của các dòng nấm men 41

Hình 31: Độ cồn và độ Brix sau lên men của các dòng nấm men ở thí nghiệm 2 43

Hình 32: Hình dạng tế bào nấm men và khuẩn lạc của dòng B2 43

Hình 33: Độ cồn và độ Brix sau lên men của dòng nấm men B2 ở thí nghiệm 3 45

Hình 34: biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa pH ban đầu và tỉ lệ pha loãng đến quá trình tạo ethanol 46

Hình 35: Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa pH ban đầu và tỉ lệ pha loãng nguyên liệu đến quá trình tạo ethanol 46

Chương 1: GIỚI THIỆU

Tuy nhiên quách ít được biết đến vì quách chỉ trồng được ở vùng đồng bằng khô, hầu như quách chín chỉ sử dụng tươi dùng để pha chế các dạng nước uống, ngoài ra không có sản phẩm nào khác từ quả quách

Rượu vang từ bao ngàn năm qua vẫn được coi là món quà quí giá mà thượng đế ban tặng cho nhân loại Rượu vang trái cây được xem là thức uống tự nhiên có lợi cho sức khỏe Rượu vang đã trở thành thức uống truyền thống từ xa xưa của người Châu

Âu - Mỹ, người Châu Á cũng đã làm quen dần với rượu vang trái cây trong mỗi bữa

ăn

Trên thế giới có hàng trăm loại rượu vang trái cây khác nhau được sản xuất ở qui

mô công nghiệp và hộ gia đình Do đó để làm đa đạng hóa sản phẩm rượu vang trái cây, nâng cao giá trị kinh tế cho quả quách và góp phần giới thiệu trái quách ra bên ngoài thì cần có một sản phẩm mới từ quả quách có đủ sức hấp dẫn người tiêu dùng

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng trong lên men rượu vang quách” được nghiên cứu từ thực tế đó

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phân lập nấm men tự nhiên từ dịch quả quách lên men

Thử hoạt tính lên men của các dòng nấm men đã phân lập chọn ra dòng nấm men lên men tốt nhất

Nghiên cứu và thiết lập các thông số pH, độ Brix, tỉ lệ pha loãng nguyên liệu tối ưu cho quá trình lên men rượu vang quách

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tìm ra dòng nấm men có hoạt tính lên men tốt

Sử dụng nấm men phân lập khảo sát tìm các thông số pH, Brix, tỉ lệ pha loãng ban đầu tối ưu cho quá trình lên men rượu vang quách

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY QUÁCH

2.1.1 Tên gọi, phân bố và đặc điểm sinh học

2.1.1.1 Tên gọi

Trái quách có tên khoa học là Limonia acidissima L., thuộc họ Rutaceae Tùy theo

từng vùng, từng quốc gia mà trái quách có tên gọi khác nhau: Tiếng Anh được gọi

là wood-apple, bên cạnh đó quách còn được gọi là táo voi Ở đất nước Malaya có tên là gelinggai, ở Thái Lan có tên gọi ma-khwit, ở Lào gọi là ma-fit (Smith

Albert C, 1985)

Hình 1 Trái quách

http://metinfo.blogspot.com/2007/09/trai quach

2.1.1.2 Phân bố

Cây quách có nguồn gốc phổ biến trong tự nhiên ở vùng đồng bằng khô của Ấn Độ

và Tích Lan, cây phân bố chủ yếu ở các nước châu Á nhiệt đới như: Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Cambodia và Việt Nam Ở Việt Nam, cây mộc chủ yếu ở những vùng đất cát pha, khô cằn của các tỉnh như Trà Vinh, Vĩnh Long, Bến Tre, Sóc Trăng (Smith Albert C, 1985)

2.1.1.3 Đặc điểm sinh học

Đây là loại cây thân gỗ, cao trung bình từ 6-9 m, có thể đạt tới 12 m Cây quách phổ biến ở vùng đồng bằng khô, thích hợp với khí hậu gió mùa với mùa khô rỏ rệt Loài cây có thể sống ở độ cao 450 m Cây quách thường trồng từ hạt giống trong quả

hoặc có thể chiết cành chúng sẽ phát triển mau hơn (Morton J, 1987)

2.1.2 Công dụng

Quả quách non được dùng để chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ, đau họng và các bệnh của nướu răng Quả chín rất hiệu quả đối với người bị một số bệnh liên quan đến cổ

họng Những người bị bệnh viêm loét dạ dày, tiêu thụ quách tươi sẽ giúp giảmđau tức thời và đẩy nhanh quá trình chữa loét, do trong thành phần của quách có chứa tanin Ngoài ra còn có tác dụng lọc máu và chống lại bệnh scorbut gây ra do thiếu vitamin C do trong quách có chứa nhiều vitamin C Tiêu hóa 100g quách mỗi ngày giúp phục hồi thận và ngăn ngừa tự nhiên bệnh sỏi thận Trái quách chứa nhiều caroten được xem là chất dinh dưỡng bắt buộc để duy trì sức khỏe mắt tối ưu Đối với vấn đề hô hấp nó giúp cho mọi người ngăn ngừa hoặc thoát khỏi cảm lạnh lập lại và các bệnh liên quan đến đường hô hấp do thời tiết lạnh (Gupta VC, SJ and Imam Hussain S 1997)

Bột vỏ cây được nghiên cứu bào chế thành mỹ phẩm ở Thái Lan, Anh, Malaysia, Myanma Đặc biệt là mỹ phẩm dùng cho những phụ nữ mang thai chống lại sự tiếp xúc của muỗi gây bệnh sốt xuất huyết và sốt rét khi các loại thuốc thông thường

kháng lại ngày càng nhiều (Dr SW Lindsay.1998)

Nhựa cây được sử dụng trong tranh màu nước, mực in, thuốc nhuộm và sơn

(Morton J, 1987)

Hình 2 Trái quách lúc chín

http://metinfo.blogspot.com/2007/09/trai quach

Đến thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, cây nho xuất hiện ở vùng Địa Trung Hải thuộc Pháp bây giờ Chính những người Pháp đã tìm ra việc lên men rượu vang trong thùng gỗ, làm diện tích trồng nho tăng lên rất nhanh

2.2.2 Các loại rượu vang

Theo giới tiêu dùng thì rượu vang được phân làm 4 loại:

Vang bàn: Là vang đỏ, vang trắng và vang hồng có hàm lượng cồn từ 9-14% thường dùng trong các bữa ăn

Vang sủi tăm: Còn gọi là champagne, có nồng độ cồn từ 8-12%, thường dùng vào những dịp liên quan và các bữa ăn sang trọng Vang sủi tăm là do có thêm co2 Loại nổi tiếng được sản xuất từ các giống nho vùng champagne nước Pháp

Vang nặng: Là loại vang có thêm rượu mạnh Brandy để tăng độ cồn, thường là 22% cồn

17-Vang mùi: Có hàm lượng cồn từ 15-20% là vang được cường hóa và thêm mùi

2.3 NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

2.3.1 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dục Hình dạng nấm men thường không ổn định, thường phụ thuộc vào tuổi nấm men và điều kiện nuôi cấy Chiều dài 8-10µm và chiều rộng 2-7µm Kích thước này cũng thay đổi, sự không đồng đều thấy ở các loài khác nhau, lứa tuổi

khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.3.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Thành tế bào: Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó đáng kể nhất là: Glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin

Màng nguyên sinh chất: Gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid, enzyme permase

Nhân: Tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình bầu dục hay hình cầu Nhân nấm men có chứa protein và nucleic

Những thành phần khác như: Không bào, volutin, ty lạp thể, riboxom (Lương Đức

Phẩm, 2005)

2.3.3 Các hình thức hô hấp của nấm men

Ở nấm men quá trình hô hấp là quá trình khá phức tạp, nó xảy ra theo hai chiều hướng khác nhau Vì thế người ta phân ra làm hai loại hô hấp: Hô hấp yếm khí và

hô hấp kỵ khí

Hô hấp hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 674cal

Hô hấp kỵ khí: C6H12O6 C2H5OH + CO2 + 33cal

(Lương Đức Phẩm, 2005)

2.3.4 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men

Bảng 2 Thành phần hóa học của nấm men:

(Nguyễn Đức Lượng-công nghệ vi sinh vật 1996)

Về giá trị dinh dưỡng thì protid nấm men tương đương protid động vật nhưng giá trị hơn protid thực vật Ở nhiệt độ cao và bình thường, dưới tác dụng của protease có sẳn trong nấm men, protid sẽ biến thành pepton, peptid và acid amin

Glucid của nấm men chủ yếu là glycogen (C6H10O5)n, đây là chất dự trữ của tế bào, theo thành phần cấu tạo thì glycogen giống như amylopectin nhưng khác là khối lượng phân tử lớn hơn Hàm lượng của nó trong tế bào nấm men tùy thuộc trước hết vào môi trường dinh dưỡng

Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất béo như lexitin và sterin Trong số

đó quan trọng hơn cả là ugosterin, chất này dễ biến thành vitamin dưới tác dụng của

ánh sáng mặt trời và còn gọi là vitamin D (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)

2.3.5 Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men

Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng

mà chúng sử dụng chủ yếu vận chuyển qua thành tế bào theo 2 con đường cơ bản sau:

Con đường thứ nhất là thẩm thấu bị động: Trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ nhỏ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào tế bào

từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu Ngược lại, chất thải trong quá trình trao đổi chất cũng được thải qua những lỗ này

Con đường thứ 2 là hấp thu thức ăn một cách chủ động: Các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào thì lập tức có hệ permease hoạt hóa Permease là một protid hoạt động, chất này sẽ liên kết với chất dinh dưỡng thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào vào trong, tại đây chúng tách ra và permease lại tiếp tục làm công việc vận chuyển

2.3.6 Quá trình sinh trưởng và phát triển

Sự sinh trưởng: Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều

Sự phát triển: Các nấm men sinh sản bằng cách nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên, đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách

đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian

Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian, hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp điểm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch

Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 4 giai đoạn, thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 3 Quá trình và phát triển của nấm men

2.3.7 Nấm men thường sử dụng trong lên men rượu vang

là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin

Đa số các tế bào loại này hình ovan, có kích thước từ (3 – 8) x (5 – 12) µm Sinh

sản theo kiểu nảy chồi và tạo bào tử Saccharomyces vini sinh ra enzyme invectase

có khả năng khử đường saccarose thành glucose và fructose Vì vậy, trong lên men

ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và nồng độ rượu vẫn tăng lên bình thường Chủng này lên men chỉ đạt 8 – 10% hàm lượng rượu theo thể tích Ở

Pha tiềm phát

Cân bằng

Suy vong

giai đoạn cuối lên men, Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong dịch

rượu Các chủng giống này có đặc tính riêng về khả năng chịu cồn, chịu sulfit, tạo thành các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp làm cho rượu vang có mùi vị đặc

trưng riêng biệt (Trần Minh Tâm, 2000)

2.4 PHÂN LẬP NẤM MEN

Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn) Muốn nghiên cứu những đặc tính sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng nấm men trong lên men rượu vang thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết thông qua quá trình phân lập nấm men

Phân lập là quá trình tách riêng từng vi sinh vật đó từ mẫu hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống ở dạng thuần chủng Sau đó các giống này được khảo sát các đặc tính thuần khiết Phân lập nấm men có thể sử dụng phương pháp: Tách giống thuần chủng từ một khuẩn lạc riêng biệt Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết dựa trên kỹ thuật pha loãng, thường bao gồm các bước sau:

Chuẩn bị tăng sinh mẫu và pha loãng mẫu: Nếu mẫu chứa ít số tế bào vi sinh vật cần phân lập thì cần thiết sử dụng đến môi trường tăng sinh Pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý hay nước cất hoặc dung dịch đệm, ở nồng độ khác nhau (thường theo tỉ lệ 1:10, 1:100, 1:1000…) nhằm tránh hiện tượng không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau trên mặt thạch sẽ khó khăn trong hoạt động phân lập

Cấy và ủ mẫu: Môi trường phân lập thường không giống nhau đối với việc phân lập các vi sinh vật khác nhau Hơn nữa các vi sinh vật khác nhau nhưng có quan hệ gần nhau thì có thể phát triển thành những khuẩn lạc có đặc điểm tương tự nhau

Chính vì vậy, việc chọn môi trường phân lập đóng vai trò quan trọng quyết định đến hiệu quả phân lập Thông thường các môi trường chuyên biệt được sử dụng để phân lập các vi sinh vật này

Phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trưng: Thông thường các vi sinh vật khác nhau có khuẩn lạc mang những đặc điểm khác nhau trên môi trường phân lập, cần nuôi cấy trong môi trường dịch thể thích hợp, ủ và kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật: Có nhiều phương pháp kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật như kiểm tra vết cấy, kiểm tra dưới kính hiển vi tính đồng nhất

về hình thái các tế bào nấm men, kiểm tra bằng phương pháp cấy trang, cấy ria

(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2003)

*Yêu cầu đối với chọn nấm men thuần chủng

Những nấm men được phân lập và sử dụng cho sản xuất cần đạt một số yêu cầu sau:

- Có hoạt lực lên men cao đối với nước quả sử dụng đường cho lên men gần hoàn toàn

- Khả năng kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh

- Chịu được độ cồn cao và độ acid của môi trường cũng như các chất xác trùng

- Tạo được rượu thơm ngon thanh khiết (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG

2.5.1 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men lượng tế bào nấm men phải đạt được >100 triệu tế bào trong 1ml dịch lên men Do diện tích bề mặt tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng rất mạnh Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào môi trường,

CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800 mmHg, nhiệt độ 25-300C là 0,855 – 0,857 lít CO2 trong một lít nước Vì thế, CO2sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt trạng thái bảo hòa Khi bảo hòa, CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần thành túi lớn, đến lúc nào đó sẽ xảy ra sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường với tế bào nấm men chúng sẽ nổi lên trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căn bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài Lúc này khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng bị chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trang thái tĩnh sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc của

tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn Khi đó làm tăng nhanh quá trình lên men

Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lững khác hiện diện trong dịch lên men khi lên men đều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2006)

2.5.2 Động học của quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi

hàm lượng đường trong dịch lên men, quan sát bằng cách theo dõi sự thay đổi độ

rượu và CO2 tạo thành cũng như thay đổi trị số của nồng độ dịch lên men

Quá trình lên men được chia làm 3 thời kỳ chính:

- Thời kỳ đầu: Khoảng 60 giờ kể từ khi nấm men tiếp xúc với dịch lên men, sự lên

men diễn ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

- Thời kỳ 2: Đây là thời kỳ lên men chính, chiếm 60 – 120 giờ sau thời kỳ đầu Sự

phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng lên đáng kể và đạt đến trị số

cực đại

- Thời kỳ cuối: Đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ

ổn định tạo mùi thơm cho sản phẩm Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm

mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được

Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên

men Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men Trong giai đoạn này,

trong điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men

sẽ giảm đi khoảng 1 độ (0Brix, Balling, %) tùy theo loại sản phẩm, dây chuyền sản

xuất

Sự tồn tại của thời kỳ lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch

đường hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2006)

2.5.3 Biến đổi sinh hóa trong quá trình lên men

Glucose Hexokinaza Glucose – 6 phosphat Phosphoglucoseza isomeraza

Fructose – 6- phosphat phosphaFructokinaza

Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza Glyceraldehyd – 3 phosphat Dihydro aceton phosphat Glyceraldehyd phosphatdehydrogennaza

Hình 5 Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men

2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men

2.5.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng bậc nhất đối với nấm men nói chung và lên men rượu vang nói riêng Lên men rượu vang thường thực hiện ở khoảng nhiệt độ 15 – 320

C

Chúng ta cũng xác định được rằng, ở nhiệt độ cao lên men bắt đầu sớm, xảy ra mạnh mẽ nhưng lại dễ ngưng lại giữa chừng và kết thúc lên men khi đường còn xót lại nhiều trong dịch lên men, độ cồn có thể thấp và hương vị của sản phẩm có khi không tốt, với đường này dễ bị vi khuẩn lactic sử dụng Do vậy, trong rượu vang có nhiều acid lactic và acid acetic Ngoài ra, trong dịch quả có sẵn fructose tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic sử dụng và tạo thành rượu Những chất này với đường sót làm cho rượu vang bị chua – ngọt khó chịu Nhiệt độ càng cao, càng tạo điều kiện

kỵ khí cho lên men, nhưng lại gây khó khăn cho lên men thứ cấp (lên men phụ) từ các đường sót, đặc biệt là tiến hành lên men trong điều kiện không có oxy của không khí, với hàm lượng lên men ban đầu tương đối cao (Lương Đức Phẩm, 2005) Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với nấm

men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 – 320C Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men cao và sẽ kéo dài hơn Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1÷450C Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch lên men tới 18–220C sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn Ở nhiệt độ này thì tốc độ lên men sẽ không nhanh nhưng chất lượng sản phẩm lên men tốt do hạn chế được sự sinh ra các sản phẩm phụ như: Methanol, glycerin và các rượu bậc cao Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh, nhưng chủ yếu là trong điều kiện nhiệt độ này, dịch lên men tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic và nấm

men dại phát triển (Vũ Công Hậu, 1983)

2.5.4.2 Ảnh hưởng của số lượng tế bào nấm men

Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn Nếu lượng nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi lạ, vị lạ đồng thời phí đi một lượng đáng kể men có ích (Vũ Công Hậu, 1983)

2.5.4.3 pH môi trường

Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon Đối với dịch quả thường có pH từ 2,8-3,8 Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2÷8 nhưng thích hợp nhất là 4÷4,2, vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn chỉ có nấm men phát triển Vì vậy, trong lên men rượu, để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người

ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8÷4,2 Tuy nhiên trong thực tế có những vi khuẩn do quen dần (thuần hóa) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh

pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH = 3,8÷4,1 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường lên men bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh mẽ đến trung tâm hoạt động của nấm men Nếu nâng cao độ chua của môi trường lên nửa nấm men sẽ thay đổi hình thái: Tế bào nhỏ hơn, dạng cầu vượt trội,

trong tế bào chất tích tụ chất béo (Vũ Công Hậu, 1983)

2.5.4.4 Hàm lượng đường

Trong nước quả có hàm lượng đường không đều, do vậy người ta thường bổ sung thêm đường saccaroza Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường <20% Có một số chủng hoạt động ở môi trường đường cao hơn Khi

nhân giống thường dùng môi trường có độ đường thấp <10% (Vũ Công Hậu, 1983)

Nồng độ dịch lên men quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không chỉ tạp khuẩn mà ức chế cả nấm men Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men Khi nồng độ đường 30 – 35% sự lên men gần như đình chỉ Ngược lại nếu nồng độ dịch đường lên men thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng lực lên men Thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch lên men rượu vang quả khoảng 220

Bx (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.5.4.5 Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng là yếu tố kìm hãm hoạt động của nấm men Đặc biệt, các tia cực tím trong ánh sáng sẽ giết chết tế bào nấm men Vì vậy, quá trình lên men phụ thuộc vào thời tiết của từng mùa Tuy nhiên, nếu sản phẩm rượu (hoặc dịch lên men) tiếp xúc với ánh sáng thì sẽ dẫn đến việc oxy hóa các loại vitamin của dịch lên men, làm giảm

2.6 CÁC VI KHUẨN GÂY HẠI TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

2.6.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic

Rượu vang để tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài ngày bị một màng trắng bao phủ, đó là màng giấm Vi khuẩn giấm biến rượu etylic thành acid acetic, do đó rượu vang có mùi giấm Một phần nhỏ acid acetic lại hợp với rượu etylic thành một ester, etyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm

Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi etyl acetate để đánh giá rượu có bị chua giấm hay không

Phản ứng tạo thành giấm: C2H5OH + O2 = CH3COOH + H2O Tuy nhiên, mùi chua giấm là do etyl acetate, một ester được hình thành bởi vi khuẩn acetic

Phản ứng tạo thành este: C2H5OH + CH3COOH = CH3COOC2H5 + H2O (Nguyễn Đình Thưởng, 2007)

2.6.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic

Loại vi khuẩn này có thể hiện diện ở bất cứ nơi đâu như trên nguyên liệu, trong xưởng rượu, trên các dụng cụ chế rượu cũng có Không phải tất cả các vi khuẩn này đều có thể tồn tại Do một số không thể sinh sản được vì pH quá thấp, có độ cồn tăng lên dần thì vi khuẩn bị ức chế, cuối cùng chỉ có một tỷ lệ rất thấp các vi khuẩn

có mặt ở quả lúc đầu sống sót và sau này gây lên men malolactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng được dần dần với điều kiện môi trường có cồn, chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh

2.7 CÁC SẢN PHẨM PHỤ VÀ TRUNG GIAN CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN

2.7.1 Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các aid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid lactic Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hóa khử giữa hai aldehyde acetic trong đó một phân tử bị oxy hóa, phân tử thứ 2 bị khử:

2CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH

Acid lactic được tạo bởi pyruvat dehydronase theo phản ứng:

CH3COO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD

Hoặc

CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4

Acid citric được tạo từ aldehyde acetic, phản ứng được biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O =(CH2COOH)2(OH)2COOH + 6CH3CH2OH

Acid succinic được tạo thành có thể theo 2 con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic:

2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH

2.7.2 Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác

* Sự tạo thành ester

Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những este tương ứng Phương trình tổng quát:

2.8 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.8.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vấn đề sản xuất rượu vang ở Việt Nam vẫn còn tồn tại nhiều khó khăn, rượu vang vẫn chưa được nhiều người tiêu dung quan tâm Trước đây, phần lớn là sản xuất ở quy mô gia đình, ngày nay đã phát triển ở quy mô công nghiệp Một số nhà máy lớn

đã sử dụng dịch mơ, dâu, táo,… để sản xuất như: Rượu vang Thăng Long, vang Gia Lâm, vang Đà Lạt Ngoài ra, một số địa phương như Vĩnh Phú tận dụng nguồn quả

tự nhiên như: Chuối, dứa, mận, mơ,… sản xuất vang đạt tiêu chuẩn chất lượng cao Tuy nhiên, thực tế cho thấy chưa có nhiều nghiên cứu về quá trình phân lập và tuyển chọn nấm men cho quá trình sản xuất rượu vang trong nước

Ngô Thị Phương Dung et al., (2011) đã thực hiện quá trình phân lập, tuyển chọn,

phân lập được 6 dòng nấm men thuần và xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lên men rượu vang dưa hấu Kết quả của nhóm tác giả cho thấy rượu đạt độ cồn cao (12,830) khi lên men với nấm men phân lập (Saccharomyces cerevisiae) với tỷ lệ

107 tế bào/ml, dịch lên men được bổ sung đường 30oBrix sau 10 ngày lên men ở nhiệt độ 250C

Nguyễn Minh Thủy và cộng sự (2012) đã phân lập và tuyển chọn nấm men từ nước thốt nốt, kết quả đã phân lập được 39 dòng, trong đó có 2 dòng thể hiện hoạt lực lên men tốt nhất, với các ưu điểm vượt trội, như thời gian kết thúc cột CO2 sớm nhất (2 giờ), hàm lượng ethanol cao nhất (13,67%) v/v) và hàm lượng đường sót thấp (2,5%)

Huỳnh Ngọc Thanh Tâm et al., (2009) đã phân lập và tuyển chọn 5 dòng nấm men

từ quá trình chế biến vang mận Điều kiện để sản xuất rượu vang mận là: Nồng độ đường ban đầu là 250

Brix, nồng độ nấm men 20ml men giống (mật số nấm men khoảng 4.108 tế bào/ml)/100 ml dịch quả, nhiệt độ 250C thích hơp cho lên men rượu vang mận với độ rượu sau lên men đạt 14% v/v

2.8.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, nhất là ở các nước Châu Âu, rượu vang đã có từ lâu đời và được dùng rất phổ biến Một số loại rượu vang nổi tiếng trên thế giới như:

Vùng Alasce, nổi tiếng về rượu vang trắng Sản lượng rượu vang trắng chiếm 30% tổng sản lượng rượu vang trắng của Pháp Rượu vang trắng ở đây có tên gọi duy nhất là vang Alasce

Vùng Bordeaux, sản xuất rượu vang nổi tiếng: Meldoc, Haut Meldoc, Graves Barsac, Sauternes, St Emillion, Pomerol, Ce1rons, Loupiac, Fronsac, Bourg

Vùng Burgundy nằm ở miền Trung nước Pháp có diện tích 47.700 ha Ở đây không

có các vườn nho cỡ lớn mà chỉ vườn nho thuộc diện gia đình, diện tích chỉ khoảng

50 ha nhưng lại có đến 56 ông chủ vườn Phần đông các chủ vườn đều bán cho các tiệm rượu để họ pha chế và bán ra thị trường

Vùng champagne, sản xuất loại rượu vang rất nổi tiếng trên thế giới Nhờ vào giống nho, điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nhất là kỹ thuật sản xuất và kinh nghiệm nên nước Pháp đã sản loại rượu vang đặc biệt này Phần lớn, rượu champagne được sản xuất từ hỗn hợp giống nho đỏ thẫm Pinot Noir có chất đường, nước trắng nên độ rượu mạnh và giống như Chordonnay có màu vàng kim, đem lại vị thanh cao và

hương thơm ( http://huaf.edu.vn/diendan/viewtopic.php?f=116&t=8390 )

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về quá trình phân lập và tuyển chọn nấm men cho quá trình sản xuất rượu vang, khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu vang như:

R Sidari và A Cardi (2009) nghiên cứu khả năng sống sót của chủng nấm men rượu sau quá trình bảo quản lạnh sâu ở -20o

C có chất bảo quản là glycerol cho thấy rằng: Khi tính khả năng sống sót bằng log (CFU/ml) của chủng F15, với số lượng tế bào ban đầu là 109

Sau 3 tháng bảo quản, số lượng tế bào là 105

Matapathi et al., (2004) phân lập được 10 dòng nấm men với khả năng lên men

được đường glucose Hiệu quả lên men được kiểm tra các đặc điểm lên men của các dòng nấm men nay, như tốc độ tăng trưởng của nấm men, khả năng chịu được cồn, khả năng lên men, khả năng đồng hóa nguồn carbon, sử dụng đường và khả năng tạo độ rượu Khảo sát khả năng chịu được cồn và hàm lượng đường của nấm men phân lập được từ trái đào lộn hột được thực hiện bởi Osho (2005) Tổng cộng 17 dòng nấm men thuộc loài Saccharomyces đã thu được từ nghiên cứu của tác giả, trong đó có 2 dòng cho hiệu suất lên men vượt trội

Patil (2005) đã thực hiện quá trình phân lập và tuyển chọn nấm men dại trong các phần của trái khóm Kết quả cho thấy có khả năng phân lập được dòng nấm men

Saccharomyces ellipsoideus với hiệu quả lên men tốt sau 24 hoặc 48 giờ

Kurkarni et al (2011) phân lập được 14 dòng nấm men và định danh 7 giống từ trái

đu đủ bằng phương pháp vi sinh chuẩn Khả năng lên men tạo rượu của các dòng nấm men này được xác định

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng 304 thí nghiệm Sinh Hóa Thực Phẩm - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian từ tháng 01/2013 đến tháng 05/2013

3.1.2 Nguyên vật liệu

Quách được lấy mẫu tại hai xã của huyện Huyện Càng Long: Bình Phú, Huyền Hội

và hai xã của huyện Trà Ôn: Hựu Thành, Trà Côn

Đường cát tinh luyện, khoai tây, Agar mua trên thị trường/chợ

Nấm men Saccharomyces cerevisiae dòng của Úc và Mỹ đã được phân lập của Viện

NC & PT CNSH – ĐH Cần Thơ

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Nồi thanh trùng, đĩa petri, tủ cấy vô trùng, tủ ủ nấm men, tủ lạnh, kính hiển vi

quang học, cân phân tích, cân điện tử, pH kế, Brix kế, cồn kế, nhiệt kế, buồng đếm hồng cầu, ống nghiệm, chuông durham, bình tam giác, ống đong, micropipete và một số dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm

3.1.4 Hóa chất và môi trường sử dụng

Hóa chất thanh trùng NaHSO3

Chất điều chỉnh pH: Acid citric, NaHCO3

Môi trường nuôi cấy nấm men: Potato Glucose Agar (PGA), Potato Glucose (PG)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 6 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm

3.2.2 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch quả quách lên men

* Mục đích: tìm ra các dòng nấm men thuần để tiến hành các thí nghiệm sau

* Bố trí thí nghiệm:

Dịch quả quách

Bổ sung đường

Không đường Lên men

Phân lập nấm men PGA

Nhân giống trong bình tam giác

PG

Lên men (10 ngày)

Phân tích các chỉ tiêu Brix, pH, Ethanol

(Thí nghiệm 3)

Thanh trùng (NaHSO3 140mg/lít,

30 phút)

Dịch quả quách

Điều chỉnh tỉ lệ pha loãng, pH, Brix

Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

* Tiến hành thí nghiệm:

- Phương pháp lấy mẫu: nguyên liệu được thu tại vườn, quách vừa chính tới phù hợp cho quá trình lên men Chọn nguyên liệu tại 4 địa điểm ký hiệu A, B, C, D (của hai tỉnh Trà Vinh và Vĩnh Long) Sử dụng nguồn nguyên liệu tại nhiều địa điểm nhằm phân lập được các chủng nấm men sẽ đa dạng

- Chuẩn bị dịch lên men: đập lớp vỏ bên ngoài của quả quách, lấy phần thịt quả bên trong cho vào bình tam giác 250ml (cho vào bình tam giác 100ml nước cất có

và không có bổ sung 10% glucose) đến khi dân đến 150ml có bổ sung một ít vỏ quả quách Đậy nắp kính lên men trong tủ ủ 30o

C trong 48 giờ Các dòng nấm men có sẵn trong dịch quả sẽ tăng sinh khối và lên men chuyển hóa đường thành rượu

- Chuẩn bị môi trường phân lập: Nấm men được phân lập trên môi trường Potato Glucose Agar (PGA)

- Phân lập nấm men: Thực hiện trong tủ cấy vô trùng, nấm men được phân lập bằng cách dùng micropipete (vô trùng) lấy dịch lên men cho vào đĩa môi trường đặc, dùng que cấy trãi điều lên mặt môi trường PGA đặc Sau đó úp ngược đĩa lại ủ

Quách

Xử lý Dịch quả

Lên men, 300C 48

giờ

PGA Phân lập

trong tủ ủ 30oC Sau 24 giờ nấm men phát triển thành dạng khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc đơn lẽ rời rạc để cấy chuyển Quan sát bằng mắt thường chọn những khuẫn lạc đơn lẽ, khác nhau tiếp tục cấy chuyển và tách ròng vào từng đĩa môi trường Cuối cùng quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ ròng và sau đó trữ giống trong ống nghiệm trên môi trường thạch nghiêng ủ 24 giờ sau đó bảo quản ở 4oC

- Chỉ tiêu theo dõi: Hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa, độ nổi của khuẩn lạc, đặc điểm tế bào dưới kính hiển vi

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt lực lên men của các dòng nấm men đã phân

lập và so sánh với dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae của Úc và Mỹ

Tuyển chọn ra dòng nấm men có hoạt lực tốt nhất

* Mục đích:

Chọn ra dòng nấm men có hoạt lực lên men tốt nhất và cho hàm lượng rượu cao nhất so với các dòng nấm men đã phân lập

* Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí theo một nhân tố:

- Nhân tố A: Dòng nấm men (21 mức độ 19 dòng nấm men phân lập + 2 dòng nấm men thương mại)

Thí nghiệm được lập lại 2 lần, tổng số đơn vị thí nghiệm là: 21 x 2 = 42

- A1 A2 A3 A4 AD1 AD2….DD2 là ký hiệu các dòng nấm men phân lập theo thứ tự bốn điểm A, B, C, D Và dòng thị trường Úc, Mỹ

* Sơ đồ bố trí thí nghiệm

C trong 24h

- Chuẩn bị dịch lên mem và tiến hành thí nghiệm

+ Quách đập vỡ vỏ lấy thịt quả chà với nước cất với tỷ lệ 1:1,5 Do pH của dịch quả 4,5( lấy pH ban đầu của dịch quả để tiến hành lên men) Đo Brix dịch quả (Brix ban đầu của dịch quả là 6) rồi chỉnh Brix đạt 23

+ Thí nghiệm khảo sát tốc độ lên men bằng cách xác định lượng CO2 sinh ra

* Chuẩn bị: Dịch quả pha loãng tỷ lệ 1: 2,5 lọc lấy dịch trong

150 ml dịch quả

pH 4.5, Độ Brix 23o

Thanh trùng bằng NaHSO3 140mg/lít trong 30 phút

Chủng nấm mem đã tăng sinh

* Dụng cụ: Ống nghiệm 10ml có nấp đậy, chuông Durham

* Tiến hành: Cho 9ml dịch quả vào ống nghiệm và úp ngược chuông Durham

cho vào ống nghiệm thanh trùng 115oC trong 15 phút Sau đó, làm nguội trong tủ cấy vô trùng, tiến hành chủng 1ml dung dịch tăng sinh các dòng nấm men vào,vặn nắp và lắc ngang cho nấm men phân tán đều Đặt ống nghiện đứng trên giá đỡ (chú

ý sao cho bọt khí không còn trong chuông Durham úp ngược)

- Song song với thí nghiệm trong ống Durham:

Cho 150ml dịch quả vào mỗi chai thủy tinh 250ml thanh trùng bằng NaHSO3140mg/lít trong 30 phút NaHSO3 dễ bay hơi, không gây độc cho sản phẩm ổn định được Vitamin Cchống oxy hóa

Sau đó tiến hành chủng nấm men tiến hành trong tủ cấy vô trùng Chủng các dòng nấm men cần khảo sát gồm:19 dòng nấm men phân lập + 2 dòng của Úc và Mỹ Chủng 1,5ml nấm men (mật số 108 tb/ml) vào lắc đều cho nấm men phân tán đều trong các bình lên men dùng Waterclock đậy kính trên miệng chai lên men, quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ phòng 28-32oC Quan sát quá trình lên men và tiến hành phân tích kiểm tra các chỉ tiêu Khi kết thúc quá trình lên men 10 ngày

- Theo dõi kết quả:

+ Durham: Theo dõi 3 chỉ tiêu:

∙ Thời gian xuất hiện bọt khí,

∙ Chiều cao cột khí ở từng thời điểm,

∙ Thời gian kết thúc (đầy cột khí)

Ống nào có cột khí đầy sớm nhất ở cùng thời điểm lên men thì biểu hiện sự lên men mạnh nhất Chọn dòng có cường độ lên men mạnh nhất

+ Thí nghiệm thử hoạt tính lên men:

* Chỉ tiêu theo dõi:

- pH sau khi lên men đo bằng pH kế

- Nồng độ đường sau khi lên men xác định bằng Brix kế

- Độ cồn bằng phương pháp chưng cất

→ Kết hợp thí nghiệm chiều cao cột khí CO2 và các chỉ tiêu theo dõi quá trình lên men rượu để chọn ra dòng nấm men có cường độ lên men tốt nhất

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH, tỉ lệ pha loãng đến quá trình lên men rượu Quách

* Mục đích: Tối ưu hóa các thông số của quá trình lên men nhằm tạo ra sản

phẩm rượu vang có giá trị tốt nhất