Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (spongia sp )

Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống ox

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM




VÕ THỊ ĐẦM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT BẰNG NƯỚC CẤT VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA DỊCH

CHIẾT TỪ HẢI MIÊN (Spongia sp.)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Chế biến Thủy sản

KHÁNH HÒA, 2015

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM




VÕ THỊ ĐẦM

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT BẰNG NƯỚC CẤT VỚI SỰ HỖ TRỢ CỦA SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA DỊCH

CHIẾT TỪ HẢI MIÊN (Spongia sp.)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Chế biến Thủy sản

GVHD: TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

KHÁNH HÒA, 2015

Để hoàn thành đề tài này, trước tiên, em muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Khoa Công Nghệ Thực phẩm, Trung tâm TNTH, các thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dậy trong suốt quá trình học tập, định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian nghiên cứu và rèn luyện ở Trường Đại học Nha Trang

Xin chân thành cảm ơn Thầy TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trung tâm TNTH, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp em hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sau sắc đến gia đình, bạn bè, những người đã cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực

tế sản xuất cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa thấy được Em rất mong được sự góp ý của quý Thầy giáo và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 28 tháng 06 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Đầm

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

LỜI NÓI ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về hải miên .4

1.1.1 Giới thiệu chung về nguồn gốc .4

1.1.2 Đặc điểm của ngành thân lỗ 5

1.1.3 Phân loại khoa học 5

1.1.4 Đặc tính của hải miên 7

1.1.5 Phân bố và sinh thái 8

1.1.6 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của hải miên 10

1.1.7 Thành phần hóa học của loài: 12

1.1.8 Ứng dụng của hải miên 13

1.2 Tổng quan về quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa .21

1.2.1 Quá trình oxy hóa .21

1.2.2 Chất chống oxy hóa 23

1.2.3 Đặc điểm các nhóm hợp chất sinh học có trong hải miên 24

1.2.3.1 Nhóm hợp chất phenol 24

1.2.3.2 Nhóm hợp chất sterol 25

1.2.3.3 Nhóm hợp chất flavonoid 25

1.2.3.4 Nhóm hợp chất saponin 25

1.2.3.5 Nhóm hợp chất polypeptide 26

1.2.3.6 Nhóm hợp chất glycoside 26

1.2.3.7 Protein 26

1.2.4 Các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa 27

1.2.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl 27

1.2.4.2 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử28 1.3 Các phương pháp tách chiết xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ hải miên .29

1.3.1 Nguyên lý 29

1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất: 29

1.3.3 Những yếu tố thuộc về dung môi: 30

1.3.4 Những yếu tố thuộc về kỹ thuật: 31

1.3.5 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm (Elma, S 300H, Elmasnonis, Germany) 32 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 34

2.1.1 Nguyên liệu 34

2.1.2 Hóa chất 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Bố trí thí nghiệm 34

2.2.1.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất (tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết) bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) 35

2.2.1.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để thu được dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao từ hải miên (Spongia sp.) 43

2.2.2 Các phương pháp phân tích 50

2.2.2.1 Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH 50

2.2.2.2 Phương pháp phân tích tổng năng lực khử 50

2.2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng protein 51

2.3 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN 52

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hả miên (Spongia sp.) 52 3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm

lượng protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) 52

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chổng oxy hóa của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) 56

3.1.3 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên 60

3.1.4 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên .64

3.2 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) .68

3.2.1 Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu giá trị IC50 cho khả năng khử gốc tự do DPPH 69

3.2.1.1 Tính hệ số bj 69

3.2.1.2 Kiểm định mức ý nghĩa hệ số bj 69

3.2.1.3 Kiểm định sự phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm 70

3.2.2 Xây dựng mô tả toán học cho hàm mục tiêu giá trị IC50 cho khả năng khử gốc tự do tổng năng lực khử 72

3.2.2.1 Tính hệ số bj 72

3.2.2.2 Kiểm định mức ý nghĩa hệ số bj. 72

3.2.2.3 Kiểm định sự phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm 73

3.2.2.4 Tối ưu hóa thực nghiệm để thu được hàm lượng IC50 là thấp nhất (Y1Min) 74 3.2.3 Tối ưu hóa hàm đa mục tiêu bằng phương pháp chập tuyến tính 75

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

1 Kết luận 78

2 Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

PHỤ LỤC 82

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Điều kiện thí nghệm được chọn 44

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 2 và hàm mục tiêu 45

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm tìm hàm tuyến tính 45

Bảng 2.4 Thí nghiệm ở tâm 46

Bảng 2.5 Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố 49

Bảng 2.6 Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc 49

Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k=2 và kết quả 68

Bảng 3.2 Kết quả bố trí thí nghiệm hàm tuyến tính 69

Bảng 3.3 Bảng hệ số bj 69

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm tại tâm 69

Bảng 3.5 Kết quả tính Sbj 70

Bảng 3.6 Kết quả tính tj 70

Bảng 3.7: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher 70

Bảng 3.8 : Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố 71

Bảng 3.9 Kết quả thí nghiệm leo dốc 71

Bảng 3.10 Kết quả bố trí thí nghiệm hàm tuyến tính 72

Bảng 3.11 Bảng hệ số bj 72

Bảng 3.12 Kết quả thí nghiệm tại tâm 73

Bảng 3.13 Kết quả tính Sbj 73

Bảng 3.14 Kết quả tính tj 73

Bảng 3.15: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher 74

Bảng 3.16 : Kết quả bước chuyển động phụ thuộc vào các yếu tố 74

Bảng 3.17 Kết quả thí nghiệm leo dốc 75

Bảng 3.18 Tính hệ số phương trình hồi quy 75

Bảng 3.19 Tính bước chuyển động của các mức yếu tố .76

Bảng 3.20 Kết quả thí nghiệm leo dốc của hàm chập YL 76

Bảng 3.21 Kết quả giá trị leo dốc của từng hàm mục tiêu 77

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hải miên Spongia sp ở vùng biển Phú Quốc 4

Hình 1.2 Loại tế bào chính của ngành thân lỗ .5

Hình 1.3 Sinh sản vô tính của hải miên [3] 9

Hình 1.4 Cấu trúc thân lỗ [3] 10

Hình 1.5 Các kiểu gai xương thân lỗ [3] 11

Hình 1.6 Cấu trúc của hải miên 12

Hình 1.7.Hoạt dộng chuyển hóa của các chất có trong hải miên [1] 13

Hình.1.8 Sự hình thành các gốc tự do .22

Hình 1.9 Cơ chết hoạt động của chất chống oxy hóa [17] 23

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH 27

Hình 2.1 Loài hải miên Spongia s,lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc 34

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên 36

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .38

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .40

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .42

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để tìm hàm tuyến tính và thí nghiệm tại tâm .48

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến khả năng khử gốc tự do (a), tổng năng lực khử dịch (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải miên (Spongia sp.) 53

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (ml/g) đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50;(a): khả năng khử gốc tự do DPPH, (b): khả năng khử tổng năng lực khử 55

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết (phút) đến khả năng khử gố tự do DPPH (a), tổng năng lực khử dịch (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải

miên (Spongia sp.) .57

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ

hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50, (a): khả năng khử gốc tự do DPPH, (b): Tổng năng lực khử .59 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết khác nhau đến khả năng khử gốc tự do DPPH (a), tổng năng lực khử(b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải

miên (Spongia sp.) .61

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ

hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50 (a): Khả năng khử gốc tự do DPPH, (b): Tổng năng lực khử .63 Hình 3.7 Ảnh hưởng của số lần chiết khác nhau đến khả năng khử gố tự do DPPH (a), tổng năng lực khử (b) và hàm lượng protein (c) của dịch chiết hải

miên (Spogia sp.) .65

Hình 3.8 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch

chiết từ hải miên (Spongia sp.) thể hiện qua giá trị IC50 (a): Khả năng khử gốc tự

do DPPH, (b): Tổng năng lực khử .67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DM/NL: Dung môi/Nghiên liệu

UV-Vis ( Ultraviolet – Visite ): Tử ngoại - khả kiến

TN: Thí nghiệm

STD: Độ lệch chuẩn

TB: Trung bình

LỜI NÓI ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dương là một nguồn tài nguyên vô cùng lớn, nơi chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất Đại dương là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất

và với hơn 300.000 loài động thực vật đã được biết đến [14]

Việt Nam được mệnh danh là nước giàu tài nguyên thiên nhiên nhất, dân

gian xưa có câu nước ta có “Rừng vàng, biển bạc” Vùng biển Việt Nam trải dài

trên 15 vĩ độ, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á Vị trí địa lý cũng như những đặc trưng về lịch sử phát triển địa chất, điều kiện khí hậu, thủy lý hóa học… đã tạo nơi đây một môi trường sống riêng cho từng loài sinh vật biển, là điều kiện thích hợp cho các công trình nghiên cứu, phát triển đất nước

Trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, chăm sóc và bảo vệ sức khỏe

là vấn đề người người, nhà nhà ai cũng mong muốn Nhưng, cuộc sống không như

ta mong đợi, không một con người nào luôn có sự hoàn hảo, những căn bệnh nguy hiểm luôn rình rập chúng ta, nó làm ta đau, sức khỏe suy yếu Kể từ đó, các hợp chất thiên nhiên biển ngày càng được thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của chúng Những công trình nghiên cứu sinh vật biển Việt Nam đầu tiên đã có từ cuối thế kỷ XVIII, với những khảo sát về trai ốc ở vùng biển côn đảo, kết quả được công bố từ năm 1784 Bên cạnh đó không thể bỏ sót lòai sinh vật vô cùng có ích cho công cuộc nghiên cứu hoạt tính sinh học, đó là hải miên

Hải miên được xếp đầu danh sách đối với việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng trong dược phẩm do sự đa dạng trong các cấu trúc hóa học của chất chuyển hóa có trong hải miên

Chúng đã được coi như một mỏ vàng trong suốt 50 năm qua, nhờ sự đa dạng của các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng Tác động sinh học của các chất chuyển hóa mới từ hải miên đã được báo cáo trong hàng trăm bài báo khoa học [9]

Trong tương lai, hải miên có khả năng cung cấp các loại thuốc chống lại

bệnh quan trọng, chẳng hạn như ung thư, một loạt các bệnh do virus, sốt rét và viêm, kháng virus và kháng HIV Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất từ hải miên

Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene

butylated (BHT) Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao

Trong những năm gần đây có một số các hợp chất thiên nhiên mới trong hải miên được dùng để đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I-III để điều trị các bệnh ung thư khác nhau Một chương trình hợp tác đã được khởi xướng vào năm 1990 giữa một phòng thí nghiệm hóa học sản phẩm tự nhiên (Đại học California Santa Cruz và một phòng thí nghiệm thử nghiệm phương pháp điều trị của Bệnh viện Henry Ford ở Detroit) tập trung vào việc phát hiện và phát triển các loại thuốc chống ung thư được chiết xuất từ hải miên

Các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để làm thuốc Ngày nay, với những bước tiến lớn trong công nghệ hiện đại nên việc tách chiết protein ngày càng dễ dàng

Với những mong muốn chinh phục thiên nhiên, lại tạo ra các loại thuốc trị bệnh không nguy hại đến sức khỏe Vì thế nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên là một vấn đề rất nóng và mới ở Việt Nam Khi nói đến hải miên nhiều người vẫn chưa biết đến, cũng chưa hình dung ra chúng như thế nào, dịch chiết sẽ là chất có hoạt tính sinh học cao không, đó là vấn đề mà nhiều người muốn biết

Xuất phát từ những điều kiện thực tế trên với sự hướng dẫn của TS Huỳnh

Nguyễn Duy Bảo, em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa

và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.)” Nhằm tìm ra điều

kiện chiết hoạt chất chống oxy hóa và hàm lượng protein từ hải miên là tốt nhất, nhằm góp phần nào đó vào nền y học hiện tại

2 MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Mục đích đề tài:

Xác định ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lương

protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.)

Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng

protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.)

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa và ham lượng

protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.)

Xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm

lượng protein từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.)

Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất để thu được dịch chiết có hoạt tính chống

oxy hóa cao từ hải miên (Spongia sp.)

1.2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Là cơ sở để áp dụng vào việc nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính chống oxy hóa từ các loài hải miên nói chung và các sinh vật biển nói riêng

Thành công của đề tài sẽ tạo ra chấtc có hoạt tính chống oxy hóa ứng dụng trong ngành công y học

Trong quá trình thực hiện đề tài với những nổ lực và cố gắng hết mình để hoàn thành đề tài, song do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, những khó khăn về điều kiện thực nghiệm và kiện thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót Kính mong sự chỉ bảo của quý thầy cô và sự đóng góp của các bạn sinh viên để đề tài có thể hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn !

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hải miên

1.1.1 Giới thiệu chung về nguồn gốc

Hải miên (spongia sp.) hay còn gọi bọt biển thuộc ngành thân lỗ (Porifera),

có nguồn gốc từ quần thể trùng roi cổ áo, độc lập về nguồn gốc với động vật đa bào khác Hỉa miên là một ngành động vật đa bào nguyên thuỷ, có cấu trúc tế bào tách biệt và phần lớn là sinh sống ở biển, được tìm thấy ở Đại dương sâu nhất Chúng có lịch sử địa chất cổ xưa nhất trong thời kỳ tiền Cambri (khoảng 750 triệu năm trước)

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất

Hải miên là một dạng sống chính ở đáy biển, bao gồm hệ sinh thái rạn san

hô Hỉa miên thường khó được biết đến vì thường ẩn trong các rạn san hô nổi bật hơn, hoặc sống trong vùng nước sâu và trầm tích mềm Tuy nhiên, có rất nhiều loài hải miên hơn san hô

Tốc độ tăng trưởng của hải miên và tuổi thọ của chúng rất khác nhau Một số loài thân mềm đang phát triển rất nhanh chóng và chúng được đo với số tuổi là hơn

1000 năm tuổi

Hình 1.1 Hải miên Spongia sp ở vùng biển Phú Quốc

1.1.2 Đặc điểm của ngành thân lỗ

Động vật thuộc ngành thân lỗ không có đối xứng xác định, thân đa bào, vài

mô, bộ phận cơ thể không có Các tế bào và các mô bao quanh một không gian chứa đầy nước nhưng không có khoang cơ thể thật Tất cả đều không cuống, sống gắn trên cơ thể khác, không có hệ thống thần kinh,tất cả ăn bằng cách lọc, thường có một bộ xương của gai

Mesohyl

Hình 1.2 Loại tế bào chính của ngành thân lỗ

1.1.3 Phân loại khoa học

- Ngành Porifera (bọt biển)

Thủy sản nguyên thủy không xương động vật; khoảng 5.000 loài trong tất cả các vùng biển; gắn vào bề mặt từ khu vực bãi triều đến độ sâu 8.500 m (29.000 ft) trở lên; đẩy nước có chứa các hạt lương thực thông qua một hệ thống kênh rạch trong cơ thể (ăn lọc); gồm nhiều loại tế bào (archaeocytes các loại, pinacocytes, collencytes); cấu trúc của hệ thống biến nước hiện nay (Ascon, sycon, leucon); skeleton hoặc khoáng chất (canxi cacbonat hoặc axit silicic), spongin, đôi khi không có, hoặc các thành phần hỗn hợp; đơn vị xương (spicules) biến dạng; cả

tình dục và sinh sản vô tính sinh sản (gemmulation); khả năng tái tạo các bộ phận bị mất; chứa nhiều hợp chất hóa học độc đáo; hình thành các mối quan hệ cộng sinh với nhiều loại khác của các sinh vật

Dựa trên hình thái và thành phần hóa học của bộ xương Ngành thân lỗ được xắp xếp thành 3 lớp:

Thân lỗ đá vôi (calcarea) sống ở biển nông

Thân lỗ mềm (demospongiae) lớp lớn chiếm khoảng 80% thân lỗ hiện đại

sống ở biển và nước ngọt

Lớp thân lỗ (hexactinellida) Thân lỗ đơn độc, thân cao, sống ở biển sâu từ

cực tới xích đạo còn gọi là thân lỗ thủy tinh do có cấu trúc cơ thể tinh tế và đối xứng

Phân loại Hải miên rất khó khăn Việc phân loại hiện tại của Ngành Porifera dựa chủ yếu vào các tính năng của bộ xương hữu cơ và vô cơ, đó là không chính xác và do đó có rất nhiều trường hợp ngoại lệ cho quy tắc

- Lớp Calcarea

Skeleton của spicules canxi cacbonat; loài hoặc bình hình cấu trúc nhỏ gọn, mạng lưới lỏng lẻo của các ống mỏng, hoặc thuộc địa lớn không thường xuyên; chủ yếu là ở quy mô nhỏ; sống vùng nước nông của biển cả, từ các vùng bãi triều đến độ sâu 200 m (660 ft); một vài loài đến 800 m (2.600 ft); khoảng 300 loài

- Lớp phụ Calcinea

Larva gọi parenchymella (rắn, nhỏ gọn, với lớp ngoài của tế bào hình roi, khối lượng bên trong của tế bào); roi của choanocytes (tế bào cổ áo) phát sinh độc lập của nhân; một số spicules 3-quang trong hầu hết các loài; nước hiện nay hệ thống Ascon, sycon, hoặc loại leucon; bao gồm bọt biển pharetronid với bộ xương cứng nhắc của spicules nung chảy hoặc của một mạng vôi; chi bao gồm Clathrina, Leucetta, Petrobiona (một pharetronid)

- Lớp phụ Calcaronea

Larva gọi amphiblastula (hình bầu dục với nửa phía trước của các tế bào hình roi, một nửa phía sau mà không có tế bào hình roi); roi của choanocytes phát sinh trực tiếp từ hạt nhân; spicules 3-quang, với một ray đặc trưng còn hơn hai khác; hệ

thống nước hiện Ascon, sycon, hoặc loại leucon; Leucosolenia, Scypha (trước đây gọi là Sycon), Grantia, Lelapia (với một bộ xương cứng bao gồm các bó spicules quang sửa đổi)

- Lớp Hexactinellida (Hyalospongiae)

Skeleton cơ bản của hexactinal (6-quang) spicules silic và thiếu spongin; độc quyền biển, trong vùng nước sâu của biển cả, độ sâu từ 25 đến 8.500 m (80-29,000 ft);thường được cố định vững chắc cho một bề mặt cứng, một số loài neo trong trầm tích đáy mềm; Hexactinella, Aphrocallistes, Farrea, Dactylocalyx, Euplectella, Rhabdocalyptus; khoảng 500 loài

- Lớp Demospongiae

Skeleton của một trong hai spicules 1 hoặc 4-quang silic, sợi spongin, hoặc

cả hai; bộ xương thiếu một vài chi nguyên thủy; nhóm phong phú nhất và phân bố rộng rãi của bọt biển; xảy ra từ vùng triều đến độ sâu khoảng 5.500 m (18.000 ft) trong vùng biển; Spongillidae các miếng bọt biển nước ngọt trong gia đình Loài khác nhau rất nhiều về hình thức và kích thước; phạm vi từ encrustations mỏng vài

cm đường kính đối với các loài bánh hình lớn 2 m (6.6 ft), đường kính; nhiều loài

có desmas (phát triển như là một kết quả của các khoản tiền gửi trung học của silica quanh spicules bình thường); tiến hóa độc lập giữa một số đơn đặt hàng của lồng vào nhau của desmas liền kề để tạo thành một bộ xương đá (bọt biển lithistid); hình thức ăn thịt (bọt biển cladorhizid) thiếu một hệ thống nước hiện hành Khoảng 4.200 loài

Phân loại phân loài được dựa chủ yếu vào cấu trúc xương và thành phần, nhưng ngày càng nhiều vào các nhân vật không xương như phương thức sinh sản, nhân vật di động, hình thái của ấu trùng, vvv

Sự đa dạng của các loài khác nhau cho thấy những đặc tính khác nhau

1.1.4 Đặc tính của hải miên

Màu sắc trong hải miên có thể thay đổi Hải miên nước sâu này thường hiển thị một màu trung tính, màu nâu xám hoặc nâu; Hải miên nước nông, thường có màu sắc rực rỡ, phạm vi từ màu đỏ, vàng, và màu cam sang tím và đôi khi màu đen

Hầu hết các loại hải miên đá vôi có màu trắng

Spongia officinalis tất cả trung gian giữa màu đen và trắng, đen hơn khi tiếp

xúc với ánh sáng trực tiếp, ánh sáng khi trồng trong bóng tối

Một số hải miên (ví dụ, các Spongillidae) thường là màu xanh lục vì tảo xanh

sống trong một mối quan hệ cộng sinh trong chúng; những người khác có màu tím hay hồng nhạt, vì họ còn nuôi dưỡng loài tảo màu xanh-màu xanh lá cây cộng sinh Những vật cộng sinh phú cho các bọt biển với màu miễn là ánh sáng có sẵn; các Hải miên trở thành màu trắng trong

Hải miên sản xuất hóa chất phòng thủ chống lại kẻ thù Tuy nhiên, nó không nguy hiểm đến các sinh vật biển, chủ yếu là để đe dọa các loài gây hại cho chúng

1.1.5 Phân bố và sinh thái

Hải miên phân bố trên toàn thế giới, sống trong các môi trường sống đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới Có thể được tìm thấy từ mức thủy triều đến độ sâu khoảng 200 feet, thường được thu hoạch bằng cách gắn hoặc harpooning trong vùng nước nông, bằng cách lặn nước sâu

Hải miên có giá trị nhất được tìm thấy ở khu vực Địa Trung Hải phía đông, tuy nhiên chúng cũng được thu hoạch ngoài khơi bờ biển phía tây của Florida và Florida Keys, ở Tây Ấn, ngoài khơi Mexico và Belize, và ở một mức độ giới hạn, ngoài khơi Philippines Bởi vì họ có khả năng tái tạo các bộ phận bị mất và có thể được trồng từ những mảnh nhỏ

Trong số khoảng 15.000 loài bọt biển, hầu hết xảy ra trong môi trường biển Chỉ có khoảng 1% các loài cá sống ở nước ngọt [10]

Hải miên sống trong một loạt các môi trường sống đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới Hầu hết chúng sống trong vùng nước yên tĩnh bởi vì sóng hoặc các dòng nước sẽ khuấy động lớp trầm tích làm chặn các lỗ hút nước gây khó khăn cho chúng ăn và hô hấp Phần lớn hải miên được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, một số loài hải miên gắn vào trầm tích mềm

Hải miên ở vùng biển ôn đới dồi dào nhưng ít đa dạng hơn hải miên ở vùng biển nhiệt đới, có thể vì nguồn thức ăn của hải miên ở vùng biển nhiệt đới có nhiều

loại và phong phú hơn Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống trong ít nhất một vài năm, nhưng một số loàinhiệt đới và một số loài ở những đại dương sâu có thể sống

200 năm hoặc hơn

Hải miên thủy tinh sống phổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và nơi sâu của vùng biển ôn đới và nhiệt đới Hải miên đá vôi rất phong phú và đa dạng ở các vùng nước nông hơn

Ở Việt Nam, đã biết 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo

Hầu hết hải miên là loài lưỡng tính (có chức năng như cả hai giới cùng một lúc), mặc dù hải miên không có tuyến sinh dục (cơ quan sinh sản)

Hải miên có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Trong đó sinh sản vô tính bằng cách phân mảnh, mọc chồi, và bằng cách sản xuất gemmules

Hình 1.3 Sinh sản vô tính của hải miên [3]

Những mảnh vỡ của hải miên được tách ra và đi theo dòng chảy hoặc sóng

vỗ, chúng sử dụng đặc tính di chuyển của mình gắn vào một bề mặt phù hợp nào đó, hình thành nên hải miên mới và ổn định lại chức năng sau quá trình trôi dạc Hải miên có khả năng tái sinh cao Từ một mảnh cơ thể tách rời hoặc từ một đám tế bào sau khi nghiền nát hoặc sàng qua lưới vẫn có thể phát triển thành một cơ thể toàn vẹn

Một số sinh sản vô tính bằng mọc chồi hoặc tạo mầm Chồi là những múm nhỏ mọc trên thành cơ thể Mầm là khối tế bào amip được một lớp vỏ kép cách nhiệt bọc ngoài

Gemmules là "kén còn sống" mà một vài hải miên biển và nhiều loài cá nước ngọt sản xuất, thường xuyên sản xuất vào mùa thu Gemmules từ cùng một loài nhưng các cá thể khác nhau có thể tham gia hợp thành một miếng hải miên

Sinh sản hữu tính: phần lớn thân lỗ lưỡng tính Tế bào sinh dục do tế bào amip hoặc tế bào cổ áo tạo thành, chúng ở tầng keo và nằm dưới các phòng roi, tinh trùng chín lọt vào phòng roi theo dòng nước thoát ra ngoài, rồi tới thụ tinh noãn của một cá thể khác

Phần lớn thân lỗ sống ở biển, nhất là ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới

có độ sâu dưới 500m, thân lỗ ưa sống ở nền đá, nhóm sống ở đáy bùn thường có gai dài hoặc thân cao nhô khỏi bùn Số ít thân lỗ sống ở nước ngọt

1.1.6 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của hải miên

Vì hải miên thuộc ngành thân lỗ nên mang các đặc điểm của thân lỗ

Hình 1.4 Cấu trúc thân lỗ [3]

Cơ thể động vật thân lỗ có hình cốc gồm các tế động vật đa bào sớm nhất, phát triển từ các tập đoàn tế bào Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong, hay khả năng vận động

Thân lỗ có nhiều đặc điểm của một nhóm động vật đa bào thấp, không tương

đồng với cấu tạo cơ thể của các nhóm động vật đa bào khác: cơ thể chưa có kiểu đối xứng ổn định, chưa có lỗ miệng, chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh

Cấu trúc chung: nước đưa thức ăn và oxy vào cơ thể qua lỗ hút nước và theo ống dẫn nước trong thành cơ thể và khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài

Thành cơ thể của thân lỗ có 2 lớp tế bào và một tầng keo xen giữa (mesohyl) Lớp tế bào ngoài giới hạn cơ thể với môi trường lớp tế bào trong ngăn cách với xoang trung tâm và các phòng roi Tầng keo có nhiều loại tế bào cùng các gai xương

Hình 1.5 Các kiểu gai xương thân lỗ [3]

Bộ xương nâng đỡ cơ thể có ở hầu hết các thân lỗ cỡ lớn chúng gồm các xương gai có thể bằng đá vôi, bằng silic, bằng các sợi hữu cơ sponging do tế bào sinh xương tạo thành Có nhiều loại gai xương, có thể có một hoặc nhiều trục, có thể xếp riêng hoặc thành từng bó Gai xương và sợi sponging do tế bào sinh xương tạo thành

Hình 1.6 Cấu trúc của hải miên 1.1.7 Thành phần hóa học của loài:

Theo các tài liệu đã công bố của J Q Ronald and J T David (1985) [12]; J

Q Ronald and J T David (1991) [13] và củaP B Ngoc và cộng sự (1999) [16], thành phần hóa học chủ yếu của loài hải miên là các acid béo không no và hợp chất steroite

TheoNguyễn Xuân Cường và cộng sự [6], đã tìm ra được 8 thành phần hóa

học có trong loài hải miên X testudinaria Bao gồm:

- Saringosterol, tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ 1600C – 1610C

- 5,8-Epidioxycholest-6-en-3-ol: Tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ

1020C – 1050C

- Cholest-7-en-3-one: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 1470C – 1480C

- Cholesterol: Tinh thể kim màu trắng, điểm chảy từ 1480C – 1490C

- Thymidine: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 1860C – 1870C

- Thymine: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 3260C

- Batitol: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 700C – 710C

- Chimyl alcohol: Tinh thể màu trắng, điểm chảy từ 640C – 650C

1.1.8 Ứng dụng của hải miên

Ứng dụng trong y học

Hải miên chịu trách nhiệm cho hơn 5.300 sản phẩm khác nhau, và mỗi năm

có hàng trăm hợp chất mới được phát hiện Hầu hết các hợp chất hoạt tính sinh học

từ hải miên có thể được phân loại như kháng viêm, chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng virus, chống sốt rét, thuốc kháng sinh

Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên, với sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên Các chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên, với nhiều chất chuyển hóa có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào, chống viêm và hoạt tính kháng virus Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành công nghiệp dược phẩm để tạo ra các loại thuốc mới Tuy nhiên việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển rất khó khăn Theo nghiên cứ cho thấy rằng lượng sản phẩm của quá trình trao đổi chất rất nhỏ, 10,7mg spongistatin 4 chiết

từ 2,5 tấn bọt biển Spirastrella spinispirulifera từ vùng biển Nam Phi, tinh chế bằng

HPLC kích thước cột 3 m x 15 cm

Hình 1.7.Hoạt dộng chuyển hóa của các chất có trong hải miên [1]

Một số các hoạt chất từ hải miên như sau:

Các hoạt chất kháng viêm

Trong số các hợp chất phân lập được từ hải miên phải kể đến Manoalide A,

một sestertecpen phân lập được từ loài Luffatiella variabilis, hợp chất này thể hiện

hoạt tính kháng viêm rất mạnh trên cơ chế kìm hãm PLA2 (enzim xúc tác quá trình tạo arachidonic) Cho đến nay, manoalide A vẫn được coi là chất chuẩn trong các thí nghiệm phát triển thuốc kháng viêm theo co chế kìm hãm PLA2

Hải miên chính là loài sinh vật biển chứa rất nhiều các sterol dị thường Một

trong số đó là Contignasterol phân lập từ Petrosia contignata, hợp chất này thể hiện

hoạt tính kháng viêm rất cao Do đó, chúng được xếp vào nhóm các thuốc chống viêm kìm hãm đặc hiệu bạch cầu Dựa trên những đặc tính đó mà contignasterol đã được thử nghiệm trong điều trị chống hen suyễn, thí nghiệm được thực hiện bởi hãng InflaZyme và Aventis Pharma Cũng bởi cấu trúc đặc biệt phức tạp và tính bền động học, hoạt chất này đã được lựa chọn nghiên cứu thay đổi và tối ưu hóa cấu trúc để tạo nên một loạt các dẫn xuất quan trọng như IPL576, 902, IPL512, 602 Các chất này sau đó đã được tiếp tục nghiên cứu điều trị bệnh hen đến giai đoạn lâm sàng pha II

Cogtinasterol IPL 512,602

Cũng phải kể đến một số hoạt chất có hoạt tính kháng viêm mạnh khác như

sestertecpen Variabilin từ Icrinia variabilis, Cacospongionolide B từ Fasciospongia

cavernosa và Petrosaspongiolide M từ Petrospongia nigra, chúng đều là những hoạt

chất thể hiên hoạt tính kháng viêm mạnh Theo một vài thí nghiệm khác, hai hợp

chất halipeptins A và halipeptins B đã được phân lập từ loài hải miên Haliclona sp Chúng thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh trên các thí nghiệm in vivo Đáng chú ý

là hoạt tính của halipeptins A mạnh gấp 40 đến 130 lần các thuốc kháng viêm đang

sử dụng trong điều trị hiện nay

Các hoạt chất chống ung thư

Agosterol A, một hợp chất tách được từ loài hải miên Spongia sp Người ta

đã chứng minh được rằng việc liên kết của azido agosterol-A trên MRP1 (một protein có hoạt tính kháng nhiều thuốc) và làm bất hoạt protein này đã tăng hiệu quả điều trị khối u của nó

Halichondrin B, Loganzo và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sâu trên

các dẫn xuất tổng hợp từ hemiasterin, một tripeptide dị thường phân lập từ Auletta

sp Những nghiên cứu này đã dẫn đến sự phát triển dẫn xuất có tên HTI-286

Một hợp chất mới hiên đang được nghiên cứu tiền lâm sàng trong chống lây nhiễm và chống tạo mạch đó là một alcaloit có tên motuporamine, phân lập từ loài

hải miên Xetospongia exigua Từ những nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của nó,

nguời ta đã tiến hành tổng hợp nên một dẫn xuất mới, Dihydromotuporamine C, có tác dụng rất cao trong ngăn chặn quá trình lây lan của các tế bào ung thư Các tác giả đã cho rằng đây là một hợp chất rất đáng quan tâm để có thể được phát triển thành các thành tố chống ung thư trong tương lai

Salicylihamide A, một alcaloit phân lập từ Haliclona sp được cho là một

chất kìm hãm đặc hiêu enzim ATPase đồng thời cũng thể hiên hoạt tính độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư cao gấp 60 lần các tế bào bình thường khác Gần đây, cũng có nhiều các alcaloit mới được phân lập và thử nghiệm hoạt tính chống

khối u cho kết quả rất cao như Naamine D một imidazole alcaloit từ Leucetta cf

chagosensis, Jaspamide từ Hemiastrella sp., hay với n-methyl-epi- manzamine D,

hoạt chất cho khả năng diêt tế bào ung thư rất mạnh (IC50 đối với dòng B16F10 là 0.1 pg/ml), Đáng chú ý hơn nữa đó là hợp chất Halitulin 14, một cấu trúc thuộc

khung bisquinolinylpyrrole mới từ loài hải miên Haliclona tulearensis Chất này

cho thấy hiệu quả diệt tế bào ung thư rất mạnh với các dòng tế bào ung thư bạch cầu

chuột P-388 (IC50=0.025 pg/ml), tế bào ung thư phổi người A-549 (IC50=0.012 pg/ml), tế bào ung thư ruột kết HT-29 (IC50=0.012 pg/ml) và tế bào ung thư hắc

sắc tố (IC50=0.025 pg/ml) Hoạt chất dercitin phân lập từ loài hải miên Dercitus

sp ở nồng độ nM cũng cho hoạt động chống ung thư rất mạnh đối với các dòng tế

bào P-388 và B16

Kirin Brewery đã phát triển một dẫn xuất ceramide mới KRN 7000 dựa trên

các hợp chất phân lập được từ loài Agelas mauritianus để tạo nên một dược chất

chống ung thư rất mạnh KRN 7000 thể hiên khả năng tăng cường miễn dịch và khả năng chống di căn theo cơ chế thúc đẩy các chức năng miễn dịch tế bào Lâm sàng pha 1 của hợp chất này trên các khối u rắn đã chứng tỏ tính không độc của thuốc, khả năng tăng cường các yếu tố miễn dịch như inteuleukin và các yếu tố thúc đẩy hoạt động đại thực bào và tế bào diêt tự nhiên (NKT) Cần chú ý rằng mức độ các tế bào NKT trong máu đối với các bênh nhân ung thư và bênh nhân mắc bênh đái đường thấp hơn so với người khỏe mạnh Các thí nghiêm trên chuột đã chứng minh rằng các tế bào ung thư có thể bị loại trừ nếu hệ thống miễn dịch được tăng cường, đặc biêt khi sử dụng KRN 7000

Các hoạt chất kháng virus

Hải miên cũng là nguồn cung cấp phong phú các hoạt chất kháng virus Việc tìm kiếm các thuốc mới trong điều trị HIV đang là yêu cầu cấp bách Trong những năm gần đây đã có rất nhiều dược chất có khả năng chống HIV cao đã được phát triển có nguồn gốc từ sinh vật biển AZT, một trong những thuốc chống HIV đầu tiên, đã xuất phát từ nghiên cứu thay đổi cấu trúc các nucleosit từ hải miên Cụ thể

đó là hợp chất Ara-A, nucleosit phân lập từ loài Cryptotethya crypta, đây chính là

dẫn xuất có nguồn gốc từ biển có mặt trên thị trường thuốc ngày nay

Bên cạnh hoạt tính kháng viêm, chống vi khuẩn và diệt trừ sâu bệnh, hợp chất japamide phân lập từ loài hải miên ở Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương cũng cho hoạt tính kháng HIV mạnh nhất từng được biết ở các hợp chất phân lập từ biển Chúng có EC50 là 0.019 pM, tuy vậy hoạt tính này không cao bằng hoạt chất AZT (0.004 pM) Một điều đáng tiếc là hợp chất này có tính độc tế bào rất cao, do vậy,

những nghiên cứu gần đây đang tập trung tạo các dẫn xuất ít độc, tăng cường hoạt tính của jaspamide

Papuamide A và B phân lập từ loài hải miên Theonella mirabilis và T

swinhoei hiện đang là những hợp chất tự nhiên biển có triển vọng nhất trong việc

phát triển thành thuốc chống HIV Thí nghiệm sau 6 ngày nhiễm HIV, cả hai hợp chất này đều cho hiệu quả kìm hãm quá trình lây nhiễm của HIV đến các tế bào T rất mạnh và độ độc rất thấp Avarol và Avarone là hai sesquitecpen phân lập từ loài

hải miên Dysidea avara cũng thể hiện hoạt tính chống HIV khá cao Cơ chế hoạt

động của chúng cũng đã được biết đến ít nhiều Hoạt động của các hoạt chất này được cho là kìm hãm hiệu quả một RNA vận chuyển RNA này đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường sự sao chép của virus cũng như có tham gia vào hoạt động tổng hợp các enzim protease của vi rút HIV

Cùng với các hoạt tính kìm hãm glucosidase, chống đái tháo đường, callyspongym cũng cho thấy phổ kháng vi rút rộng như virus HIV, HBV, hay virus gây bệnh tiêu chảy Topsentin và bromotopsentin là những hợp chất mới phân lập

từ loài phân lập từ loài hải miên S rueyzleri, cho hoạt tính kháng HSV - 1 Ngoài ra,

một vài hợp chất chống vi rút được phân lập từ hải miên như 2’-5’ oligoadenylate (2-5A), Hamigeran B, weinbersterol A và B, Mycalamide A cũng thể hiện hoạt động mạnh trên các dòng virus được thí nghiệm

Các hoạt chất kháng sinh, kháng nấm

Arenosclerin A-C phân lập từ loài Arenosclera brasiliensis thể hiên hoạt tính

kháng sinh rất mạnh trên 12 dòng vi khuẩn thử nghiệm ở các bệnh viện Cribrostatin

3 phân lập từ Crebrochalina sp cho hoạt động kháng sinh mạnh đối với dòng vi sinh vật thử nghiêm là Neisseria gonorrheae với nồng độ ức chế tối thiểu đạt 0.09

pg/ml, hợp chất này cho hoạt động chống dòng vi khuẩn kháng kháng sinh

peniciline N gonorrheae với MIC đạt 0.39 pg/ml Fascaplysin, một hợp chất có cấu

trúc thuộc nhóm alcaloit 5 vòng, phân lập từ loài hải miên Fascaplysinopsis sp có hoạt tính kìm hãm rất cao đối với các dòng vi sinh vật thử nghiiệm như S aureus (0.1 pg/disk), E coli (5 pg/disk), C albicans (1 pg/disk), S cerevisiea (1 pg/disk)

Amphotericin B là một trong những hợp chất kháng nấm hiệu quả đầu tiên được biết đến

Các nghiên cứu tổng quan về biển gần đây đã cho thấy các hợp chất phân lập

được từ sinh vật biển thường cho hoạt động kháng nấm cao với ba dòng Candida,

Aspergillus, và Cryptococcus

Một loạt các hợp chất dị vòng nhỏ đã được phát hiện từ loài hải miên thuộc

chi Dysidea và Penares Theo đó, hợp chất 2-Dysidazirine cho thấy hoạt động kháng nấm rất mạnh trên hai chủng nấm là Candida albicans và Saccharomyces

cerevisiae (4 pg/đĩa) đồng thời cũng có hoạt tính chống ung thu rất cao trên dòng

L1210 (0.27 pg /ml) Đặc biệt là hợp chất này tồn tại trong dịch khô của loài hải miên là rất cao, với luợng lên dến 4% trọng luợng thô Các nghiên cứu về tổng hợp toàn phần của hợp chất này cũng đã đuợc công bố

Vào năm 1989, hoạt chất rhizochalin đã đuợc phân lập từ loài hải miên

Rhizochalina incrustata bởi nhóm nghiên cứu của Stonik Tiếp đó, một dẫn xuất

springolipit của rhizochalin có tên là Oceanapiside phân lập từ loài hải miên nước

nóng là Oceanapia phiuipensis đã đuợc phát hiện Hai hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng mạnh nấm Candida glataba, dòng nấm kháng thuốc Fuconazole nhưng không cho hiệu quả trên các dòng nấm C albicans hay là C krusei Và chính sự

khác biệt của nhóm thế đường đã giúp cho Oceanapiside có hoạt động mạnh hơn Rhizochalin Như đã được nhắc đến, hợp chất japamide cũng cho hoạt tính kháng nấm rất mạnh Các nghiên cứu trên cơ chế hoạt động của nó đã cho thấy chúng có thể gây độc cho các tế bào của động vật có vú, do vậy mà hợp chất này đã không được quan tâm phát triển nữa

Nhóm chất bengazole cũng cho hiệu quả kháng nấm rất cao Từ loài hải miên

Japis sp Crews và các cộng sự đã phân lập được 2 alcaloit bengazole A và B Ban

đầu, chúng cho hoạt động chống giun sán Nippostrongylus braziliensis, sau đó, các

hoạt chất này cũng chứng tỏ khả năng kháng nấm rất ấn tượng trên rất nhiều chủng

nấm khác nhau như: Candida albicans, Saccharomyces carlsbergensis, C krusei Kabiramide C được phân lập từ loài Hexabranchus sanguineus và sau đó là loài

Icrinia sp Hợp chất này thể hiện hoạt tính kìm hãm đặc hiệu với dòng C albicans

nhưng không thể hiện hoạt tính chống khuẩn Đặc biệt là dẫn xuất của nó, halichondramide A thể hiện hoạt tính cực mạnh với MIC đạt 0.2 pg/ml Tuy vậy, cũng giống như nhiều loại triazole khác, Kabiramide C và các dẫn xuất có khả năng gây độc tế bào cao vì thế mà nó đã không được phát triển tiếp ở các giai đoạn lâm sàng Một số macrolide chống nấm đáng chú ý đó là phorboxazole A và B, mycalolide A

Sốt rét là căn bệnh nguy hiểm thường xuất hiện ở các khu vực thuộc Châu Á

và Châu Phi Manzamine A, một alcaloit phân lập được từ rất nhiều loài hải miên khác nhau thể hiện như là một trong những dược tố biển hứa hẹn nhất trong lĩnh vực này Phát hiện về manzamine đã tạo nên bước đột phá mới trong tìm kiếm các dược liệu từ biển Manzamine A có tác dụng chống sốt rét rất cao, hoạt động của chúng được cho là hoạt động tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Một số hoạt tính khác của các hợp chất phân lập được từ hải miên

Bên cạnh các hoạt tính kháng viêm, chống khối u và kháng sinh, các hoạt chất từ hải miên cũng thể hiện rất nhiều hoạt động dược học đa dạng khác như các hoạt tính chống lao, điều hòa cơ, ức chế miễn dịch hay ức chế thần kinh Ba hợp

chất sterol phân lập từ loài Dysidea sp ở phía Bắc Australia có hoạt động ức chế

miễn dịch đặc hiệu thông qua việc ức chế sự liên kết của interleukin 8, một cytokine

có khả năng thu hút các bạch cầu trung tính tới vị trí các mô thương tổn Pateamin

A, một hợp chất phân lập từ loài Mycale sp có khả năng ức chế sự sản sinh

interleukin 2 từ đó sẽ hoạt hóa các tế bào T còn lại trong phạm vi hẹp hơn

Thrombin là một enzim serin proterase có khả năng bổ chẻ các mảnh peptit

từ các fibrinogen gây nên sự tạo thành các fibrin, một thành phần chính của các cục

đông máu Cyclothenarnide A phân lập từ loài Theonella sp gần đây cho thấy sẽ là

một lớp chất kìm hãm các serin proterase rất hiệu quả Hợp chất này hứa hẹn sẽ là một thuốc điều trị huyết khối trong tương lai Một hợp chất khác cũng rất đáng quan

tâm đó là axít Callyspongynic phân lập từ Callyspongia trucata Đây là một hợp

chất kìm hãm hoạt động của a-glucosidase, vì đó mà sẽ giúp duy trì nồng độ đường

glucozo thấp ở trong máu, hứa hẹn trở thành một nhân tố chữa trị tiểu đường hiệu quả

Các hợp chất từ hải miên cũng thường có hoạt động ức chế thần kinh rất

đáng chú ý Keramidine phân lập từ Agelas sp là một ví dụ điển hình Đây là một

tác nhân đối kháng thụ thể serotonin và ngăn cản sự giao tiếp thần kinh điều khiển bởi serotonin Gần đây, Sakai và cộng sự đã thông báo việc phân lập hợp chất neodysiherbaine A, một axít amin có hoạt động gây động kinh mạnh từ loài hải miên D herbacea Hoạt động của hợp chất này cũng tương tự như hoạt động của

dysiherbaine Từ loài Xestospongia sp Gafni và các cộng sự đã tinh chế được hợp

chất xestospongin C có hoạt động điều hòa cơ rất đáng chú ý Hợp chất này là một chất ức chế rất hiệu quả các thụ thể inositol 1,4,5-triphophat và các bơm Ca2+ ở các thể lưới tế bào Mới đây, Yang và các cộng sự đã phân lập được Dragmacidin D và

E từ loài Dragmacidin sp., hai hợp chất này thể hiện hoạt tính ức chế enzim serinethreonine protein phophatase Dragmacidin D còn thể hiện rất tốt hoạt tính ức chế enzim nitric oxide synthase ở thần kinh (ßNOS), điều này gợi mở cho việc phát triển các thuốc điều trị bệnh Huntington, bệnh Parkinson và Alzheimer

Ứ ng dụng khác của hải miên

Sử dụng hải miên làm “bông tắm”, nhu cầu sử dụng hải miên làm “bông tắm” ngày càng tăng “bông tắm” từ Hải miên có thể được định nghĩa là bất kì loài hải miên nào sở hữu sợi chỉ spongin- đó là các sợi đàn hồi làm từ collagen chất lượng của miếng Hải miên dựa trên chất lượng của bộ xương xốp Các sợi mềm, bền và đàn hồi tốt sẽ có mức giá cao nhất

Bông tắm hiện đang được sản xuất bằng cách sử dụng hải miên matthewsi

Coscinoderma với sản lượng khoảng 12.000 miếng xốp/năm và được bán tại địa

phương cho người dân và du khách ở Pohnpei, Micronesia 100% Hải miên sản xuất từ tự nhiên không có hóa chất mạnh thêm vào khi chế biến Việc sản xuất nuôi

trồng thủy sản của hải miên C matthewsi được thực hiện bởi Marine và Viện

nghiên cứu môi trường của Pohnpei (MERIP)

Các hợp chất chống hà Một lớp cuối cùng của hợp chất bioactivem từ hải miên được sử dụng làm sơn chống hà Chúng không liên quan đến việc phát triển

các loại thuốc mới, nhưng có thể thay thế thân thiện với môi trường cho antifoulants hóa

Sơn chống hà tự nhiên từ phân tử hải miên gần đây đã được xem xét [10] và

có thể cung cấp cho hoạt động chống gỉ ít độc hại hơn và cụ thể hơn Các phân tử chống gỉ Sponge có nguồn gốc từ đã được tìm thấy để ức chế sự phát triển của ấu

trùng hàu, ức chế sự ô nhiễm bởi đại tảo, hay repell màu xanh hến Mytilus

1.2 Tổng quan về quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa

1.2.1 Quá trình oxy hóa

Quá trình oxy hóa là một loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật khi có mặt của oxy

Gốc tự do (Free radical) là phân tử chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử

Gốc tự do có điện tích không cân bằng, luôn có xu thế lấy điện tử từ phân tử khác và tạo ra gốc tự do mới gây ra sự rối loạn chức năng của tế bào [7] Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn sẵn sàng thực hiện oxy hoá, nhận điện tử của chất mà nó tiếp xúc để ghép đôi với điện tử độc thân của nó và làm phá hủy chất bị nó ôxy hoá Gốc tự do ảnh hưởng lên sức khỏe con người chủ yếu theo 3 con đường: thích nghi với hệ thống chống oxy hóa, gây tổn thương tế bào sống và làm chết tế bào sống trong cơ thể người Trong đó cơ chế làm chết tế bào sống có thể là làm hoại tử hoặc làm chết tế bào sống một cách hệ thống Những gốc như superoxide, hydroxyl, peroxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được coi là gốc tự do [8].

Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California [15],

là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ

có ở ngoài cơ thể

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH., O22-., NO.,…) như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và

dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch… Do

đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách

sử dụng các chất chống oxy hóa bổ sung như các VTM A, VTMC, VTM E, polyphenols, flavonoids, anthocyanins, carotenoids,…

Hình.1.8 Sự hình thành các gốc tự do

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí Tiếp theo, gốc tự do tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại Đôi khi chúng cũng

có một vài tác dụng hữu ích Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, tạo thuận lợi cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất dễ tham gia các phản ứng và gây ra nhiều tổn thương

Khói thuốc

Khí thải

ta hay dùng các chất khử như thiol, polyphenol thường được dùng làm chất chống oxy hóa [11].

Sự khử gốc tự do của chất chống oxy hóa, trong đó các electron không ghép đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống ôxi hóa để tạo thành các electron ghép đôi bền vững

Hình 1.9 Cơ chết hoạt động của chất chống oxy hóa [17]

Chất chống oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp thường phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzym xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể

Chất chống oxy hóa đưa ra một electron, khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chất chống oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định

và không còn khả năng gây hại

Vai trò của chất chống oxy hóa trong cơ thể con người

Gốc tự do

Chất chống oxy hóa

Điện tử chưa ghép đôi Nhường electron

Chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, nhờ vào khả năng ngăn chặn sự tấn công của gốc tự do lên tế bào nên các tế bào trong

cơ thể không bị hủy hoại, góp phần bảo vệ sức khỏe con người, ngăn chặn được nhiều căn bệnh nguy hiểm có sự tham gia của gốc tự do (tim mạch, xương khớp, đái tháo đường, đục thủy tinh thể, ung thư ) Chất chống oxy hóa góp phần ngăn chặn

sự lão hóa của cơ thể, làm đẹp da, do đó chúng ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm

1.2.3 Đặc điểm các nhóm hợp chất sinh học có trong hải miên

Theo kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của 23 loài hải miên được lấy mẫu ở vùng biển Việt Nam từ Quảng Ninh đến Phú Quốc cho thấy tất cả các loài hải miên phân tích đều có hoạt tính chống oxy hóa và trong thành phần có chứa các nhóm hợp chất polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và polyphenol, đây đều là những nhóm hợp chất có hoạt hoạt tính chống oxy hóa Trong đó, polypeptide và polyphenol là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao và được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm

1.2.3.1 Nhóm hợp chất phenol

Các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vòng thơm Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có (do nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no) Trong cấu trúc của chúng, vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên

tử hydro ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao Một số polyphenol thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin Polyphenol là những hợp chất phân cực nên thường dùng các dung môi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi nguyên liệu, các dung môi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol, methanol,… Trong đó, dung môi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do tính an toàn, có khả năng hòa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ

1.2.3.2 Nhóm hợp chất sterol

Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran Các sterol là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng…, không tan trong nước Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi nguyên liệu Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten, leucithin (đối với sterol thực vật) Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Thực hiện sắc ký (cột, lớp mỏng, giấy, ) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol

1.2.3.3 Nhóm hợp chất flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform

rất cao Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung môi phân cực

để chiết xuất saponin

1.2.3.5 Nhóm hợp chất polypeptide

Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống oxy hóa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008) Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide (Tang và cộng sự, 2009; Udenigwe và Aluko, 2011) Nước và các dung môi phân cực hòa tan tốt polypeptide nên chúng được sử dụng để chiết xuất peptide

1.2.3.6 Nhóm hợp chất glycoside

Glycoside là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, ramnose, digitoxose, xymarose, ) và phần aglycol (steroid, sterol, acid mật, hormon, ) Tùy theo đặc điểm cấu tạo của aglycol mà glycoside có hoạt tính sinh học khác nhau Hoạt tính chống oxy hóa của glycoside khác nhau phụ thuộc vào độ hòa tan và sự oxy hóa aglycon chứa monosaccharide hoặc disaccharide ở vị trí C3 Glycoside là hợp chất phân cực nên hòa được trong các dung môi phân cực như nước cất, methanol, ethanol, Vì vậy, để chiết xuất glycoside thường sử dụng các dung môi phân cực

1.2.3.7 Protein

Protein là đại các phân tử có số lượng lớn trong tất cả các loại tế bào và các bào quan Protein rất đa dạng, có hàng nghìn loại với kích thước khác nhau, từ những peptide nhỏ đến những đại phân tử với khối lượng phân tử lớn

Để thu được protein trước tiên phải phá vỡ cấu trúc tế bào, thông thường nên cắt nhỏ để cắt bỏ các mô liên kết

Muốn tách được protein trong các cấu tử tế bào, người ta còn phải dùng các

yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sử dụng song siêu âm, dùng các dung môi hữa cơ

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy

cơ học hay tác nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi làm biến tính protein

1.2.4 Các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa

Có nhiều phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa như: phương pháp

phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử, phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide, phương pháp phospho molebdenum… Trong đó hai phương pháp phân tích được áp dụng phổ biến nhất là phương pháp phân tích khử gốc tự do DPPH và phương pháp phân tích tổng năng lực khử

1.2.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa vì nó đơn giản, nhanh chóng và ổn định

Nguyên lý của phương pháp:

Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH

DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi và

có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl (DPPH- H) do trung hòa gốc DPPH bằng cách cho đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử Hoạt tính khử gốc tự do của chất chống oxy hóa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH

Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

1.2.4.2 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử

Nguyên lý của phương pháp:

Tổng năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử Do đó, tổng năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chất Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính chống oxy hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]) Ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid

Khi bổ sung Fe3+ Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức họp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức (K4[Fe(CN)6]) Phức họp này

có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm

4Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4+ → K4[Fe(CN)6]

(màu xanh)

Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành Do

đó cường độ màu càng cao chứng tỏ tổng năng lực khử của mẫu khử càng cao

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm để xác định tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa

1.3 Các phương pháp tách chiết xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ hải miên

1.3.1 Nguyên lý

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các

mô nguyên liệu mà vẫn giữ được thành phần và bản chất của nó Khi cho nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào nguyên liệu, sau đó những chất tan trong nguyên liệu hoà tan vào dung môi, rồi được khuếch tán ra ngoài Kết thúc quá trình chiết sẽ thu được dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Việc lựa chọn dung môi để chiết xuất phụ thuộc vào thành phần và bản chất của nguyên liệu

Quá trình chính trong chiết xuất là sự khuếch tán Về lý thuyết khuếch tán,

người ta nghiên cứu hai quá trình là quá trình khuếch tán phân tử và quá trình khuếch tán đối lưu Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đó quá trình khuếch tán qua màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử Trong nhân của dòng, quá trình di chuyển vật chất nhờ vào sự xáo trộn các phần tử của dòng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu Khuếch tán phân tử là sự di chuyển lẫn nhau giữ các phân tử khác nhau Cường độ về lực phân tử của chất tan tương tự như cường độ lực của phân tử dung môi, do đó bề mặt phân cách giữa chúng khó tồn tại Chuyển động nhiệt của bản thân phân tử chất tan làm cho chất tan đi vào dung môi, mặt khác phân tử của dung môi vào trong chất tan Quá trình di chuyển lẫn nhau đó do

sự chuyển động nhiệt của phân tử giữa phân tử chất tan và dung môi, sự chênh lệch

về nồng độ chất tan càng lớn thì lực khuếch tán của các phân tử càng mạnh Bề mặt khuếch tán càng lớn thì lượng vật chất khuếch tán càng nhiều Khuếch tán phân tử tuân theo định luật Fick còn khuếch tán đối lưu tuân theo phương trình vi phân của khuếch tán đối lưu

1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất:

-Màng tế bào: có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình khuếch tán Khi hải miên còn sống xảy ra quá trình trao đổi chất tại màng có tính chọn lọc và khi chiết màng

tế bào là nơi xảy ra hiện tượng khuếch tán thẩm thấu, tùy trong từng trường họp mà phải có biện pháp chiết rút hiệu quả

- Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh có tính bán thấm, chỉ thấm với dung môi, không cho chất tan đi qua, do đó để chiết xuất được chất tan trong tế bào phải tìm cách phá hủy được chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón bằng nhiệt

- Một số tạp chất có trong nguyên liệu (nguyên liệu có chứa nhiều pectin, gôm hoặc chất nhầy, nguyên liệu có chứa nhiều tinh bột, nguyên liệu có chứ nhiều chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa, enzyme ): chúng có thể trương nở gây tăng

độ nhớt cản trở quá trình chiết xuất, đối với nguyên liệu nhiều chất béo, tinh dầu, sáp, nhưa, thì chúng là những chất tan tốt trong dung môi không phân cực, vì vậy nếu dung môi chiết là nước thì chúng sẽ cản trở quá trình chiết xuất, do đó phải loại chứng đi bằng dung môi phân cực Đối với thực vật chứa nhiều enzyme thì tuỳ từng trường hợp mà gây cản trở hay thuận lợi cho quá trình chiết xuất

Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra chúng thuộc loại hải miên gì, được thu ở đâu, thời gian thu hái Tùy vào từng loài và từng địa điểm thu hái khác nhau thì cho các hoạt tính khác nhau, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất Nguyên liệu sau đó có thể làm khô nếu quá nhiều thiếu nơi bảo quản hoặc để tươi mà chiết Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym Kích thước của nguyên liệu sau khi nghiền cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng

và hiệu quả của quá trình chiết

1.3.3 Những yếu tố thuộc về dung môi:

Độ phân cực của dung môi: dung môi ít phân cực dễ hòa tan các chất không phân cực và ngược lại

Độ nhớt, sức căng bề mặt: dung môi có độ nhớt thấp và sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi dễ thấm và trong nguyên liệu tạo điều kiện cho quá trình chiết và ngược lại

Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp Về

nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosides, các muối của alcaloids, các