Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease trong thủy phân sụn cá đuối (daisyatis zugei) tạo chondrotin sunfat

đã được chiết xuất từ nguyên liệu còn lại của các nhà máy chế biến thuỷ sản như glucosamine được chiết xuất từ vỏ tôm, chondroitin từ sụn cá mập [14].Chondrotinsunfat là một thành phần c

- o0o -

HOÀNG VĂN TIẾN

NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE

TRONG THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ( Dasyatis zugei )

TẠO CHONDROTIN SUNFAT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS Vũ Ngọc Bội

Nha Trang, tháng 6 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này

Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập

và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho: TS Vũ Ngọc Bội - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và TS Nguyễn Duy Nhứt - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian qua

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 SỤN ĐỘNG VẬT 4

1.2 CHONDROITIN SUNFATE 5

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate 5

1.2.2 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate 10

1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô 10

1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate 11

1.2.3 Ứng dụng của Chondroitin sulfate 12

1.2.3.1 Ứng dụng trong y học 12

1.2.3.2 Các ứng dụng khác 14

1.3 PROTEASE 14

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme 17

1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ ĐUỐI 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 25

2.1.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) 25

2.1.2 Enzyme protease 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phương pháp phân tích 27

2.2.1.1 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson 27

2.2.1.2 Định lượng Chondroitin sulfate bằng so màu với Methylene blue 29

2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm ẩm 32

2.2.1.4 Phương pháp xác định tro toàn phần 32

2.2.1.5 Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số 33

2.2.2 Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate 35

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 36

2.2.3.1 Quy trình dự kiến thu nhận CS thô 36

2.2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm nguyên liệu nghiên cứu 39 2.2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích 41

2.2.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp 42

2.2.3.5.Thử nghiệm sơ bộ thủy phân sụn cá thu nhận và đánh giá CS thô 43 2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 44

2.3.1 Hóa chất 44

2.3.2 Thiết bị 45

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU 45

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 NGHIÊN CỨU XỬ LÍ SỤN CÁ ĐUỐI 46

3.1.1 Phân tích thành phần hóa học cơ bản của sụn cá đuối 46

3.1.2 Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối 42

3.2 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUỒN ENZYME THÍCH HỢP 48

3.2.1 Xác định hoạt độ enzym papain, alcalase, neutrase 49

3.2.2 Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá 50

3.2.3 So sánh khả năng thủy phân sụn cá của Papain, Alcalase và Neutrase 51

3.3 THỬ NGHIỆM SƠ SỘ THỦY PHÂN SỤN CÁ THU NHẬN CS THÔ 53

3.3.1 Đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân đã chọn 53

3.3.2 Đánh giá quá trình thủy phân và hiệu suất thu hồi của CS enzyme Neutrase 54 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56

I KẾT LUẬN 56

II KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn 4

Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate 9

Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn của tyrosine 28

Bảng 3.1 Tỷ lệ thành phần khối lượng sụn cá đuối 46

Bảng 3.2 Thành phần hóa học cơ bản của sụn cá đuối 46

Bảng 3.3 Bảng đánh giá mẫu sụn sau khi xử lý 47

Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson 49

Bảng 3.5: Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá 50

Bảng 3.5 Hiệu quả thuỷ phân sụn cá trong 4 giờ của các protease 52

Bảng 3.6 Hàm lượng CS thủy phân bằng enzyme Neutrase với các tỉ lệ khác nhau 53

Bảng 3.7 Bảng các chỉ tiêu đánh giá quá trình thủy phân 54

Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi CS thô của enzyme đã chọn 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS 7

Hình 1.2 Cấu trúc mạch của các CS 7

Hình 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme 19

Hình 1.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme 20

Hình 1.5 Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) 22

Hình 2.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) 25

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận CS thô từ sụn cá đuối 36

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm nguyên liệu nghiên cứu 39

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm chọn thời gian tối thích 41

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp 42

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân đã chọn 43

Hình 3.1 Hình ảnh về sụn cá đuối sau khi được xử lý 48

Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo thời gian thủy phân 51

Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme 52

đã được chiết xuất từ nguyên liệu còn lại của các nhà máy chế biến thuỷ sản như glucosamine được chiết xuất từ vỏ tôm, chondroitin từ sụn cá mập [14].Chondrotinsunfat là một thành phần có trong sụn các loại động vật: cá, gà, heo( lợn )… Do vậy từ các loại sụn này người ta có thể sản xuất ra chondroitin sunfat

để sử dụng trong điều trị các bệnh về khớp, mắt và các bệnh khác Vì vậy, việc điều tra và nghiên cứu nguồn dược liệu từ nguyên liệu còn lại sau chế biến là rất cần thiết, không những tận dụng được nguồn phế liệu còn lại mà còn nâng cao hiệu quả của chế biến

Chondroitin sulfate (CS) là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp, CS còn

có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp CS làm tăng sản xuất chất nhầy

và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh dưỡng và sự vận động linh hoạt của khớp Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn quá trình thoái hoá khớp [6] CS còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng ức chế các enzym phá huỷ sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase

[4] Ngoài ra CS cũng góp phần nuôi dưỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái

tạo lớp giác mạc Một trong những tác dụng quan trọng khác của CS là khả năng

ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển CS có khả năng kháng viêm, ức chế sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự

do [9] Hiện nay các thuốc kết hợp CS và glucosamine đang được sử dụng

hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp

Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên CS chưa được tổng hợp bằng con đường hóa học mới chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên Những năm trước đây CS được tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, do đó giá thành rất cao Một số nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn

nguyên liệu như từ da của cá Labeo rohita [21], cá mập [22], sụn gà [23], sụn

bò [24] Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

vẫn được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành

sản phẩm

Để sản xuất CS từ sụn động vật có nhiều phương pháp khác nhau như sử dụng acid, sử dụng nhiệt, sử dụng enzyme protease Trong số các phương pháp sử dụng thủy phân sụn động vật thì phương pháp sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm như không độc hại, sản phẩm sau thủy phân không bị biến đổi gốc sunfat…do vậy hiện nay các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến việc sử dụng enzyme protease để thủy phân sụn động vật

Trong các loại động vật có sụn, cá là loại động vật hiện đang được nghiên cứu nhiều bởi sụn cá thường được tách khi chế biến Mặt khác, một số loại cá sụn như

cá đuối, cá mập lại có giá thành thấp Vì thế việc nghiên cứu tận dụng các loại cá sụn trong sản xuất CS là một trong những nghiên cứu mới đáng quan tâm Mà trong

các loại cá sụn thì cá đuối (Dasyatis zuge) là loại động vật dễ kiếm và giá thành

thấp ở Việt Nam

Do vậy, đề tài: " Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease trong thủy

phân sụn cá đuối ( Dasyatis zugei ) tạo Chondrotin sunfat” có ý nghĩa thực

tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà trong giai đoạn tới

Mục tiêu của đề tài:

Thử nghiệm sử dụng enzyme protease thay thế hóa chất trong thủy phân sụn

cá đuối để sản xuất CS

Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau:

Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối tiền thủy phân;

Nghiên cứu lựa chọn loại protease thích hợp thể thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin sulphate trong số 3 loại protease ( Neutrase, alcalase, papain)

Sơ bộ thử nghiệm thủy phân sụn cá đuối bằng protease đã chọn

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống việc tìm chọn các enzym và các thông số cho quy trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá đuối, vì vậy là nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các tính chất dược lý của CS Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho các nhà nghiên cứu các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế thải thuỷ sản

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm

sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của sụn cá

Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều

bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn

là phần chính trong bộ xương của bào thai, nhưng nó sẽ biến đổi thành xương khi cơ thể trưởng thành Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi

ở tuổi trưởng thành Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết (alymphatic) [25]

Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes) Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [25]

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn

(%) Sụn khớp 68,0 – 85,0 10,0 - 20,0 ( loại I) 5,0-10,0 Sụn chêm 60,0 – 70,0 15,0 - 25,0 ( loại II) 1,0- 2,0

Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.1 Ba thành phần chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn Sự thay đổi của các thành phần này (do bị bệnh lão hoá ) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào thời gian của sụn Có tới 30% nước nằm trong khoảng không

giữa các sợi collagen Kích thước sợi collagen và hàm lượng nước được xác định nhờ áp suất trương sinh ra do mật độ điện tích của các đại phân tử proteoglycan mang điện tích âm phân bố trong khối collagen Sự gắn kết của proteoglycan ảnh hưởng đến trương lực và sự chuyển động của pha lỏng khi bị nén ép Chondroitin

là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn [25]

1.2 CHONDROITIN SUNFATE

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate

CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60

do Davidson và Meyer CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là

glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một

polime mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đường (disaccharide)

N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau

(polymeric D- galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hay không bị sulfate hoá [8], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA) CS là một polime có phân tử lớn gồm 15-150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc Khối lượng phân tử của

CS thường biến động trong khoảng 10.000 - 100.000 Dalton [12]

Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các

protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG)

(glucoprotein), là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [5]

Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl(-COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có mật độ điện tích âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở một số protein Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được làm sáng tỏ GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl- Gal-Gal-GlcA; xylose được gắn với

protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong

hệ Golgi [18]

CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá, bị sulfate hoá 1 lần hay 2 lần Đa phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate hoá, đối với một số chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA Quá trình sulfate hoá là nhờ các enzym sulfotransferase đặc hiệu Việc sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS

Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong

cơ thể sống Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn Về điều khiển,

CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan

hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [8]

Công thức hoá học của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n :

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS

Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H Chondroitin-6-sulfate:

R1 = SO3H; R2, R3 = H

n

Hình 1.2 Cấu trúc mạch của các CS

Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số lượng và

vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulfate, CS6) Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có

vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá

sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates) ) Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [18]

+ Chondroitin Sulfate A (GlcA-GalNAc-4S)-CS4

+ Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S) -CS4

Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid),

thường có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid

+ Chondroitin Sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6

CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định Vì vậy tên gọi của CS cũng có sự thay đổi Ngoài ra còn có chondroitin sulfate D và E Phân loại các CS được tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate

Tên Vị trí bị sulfate hoá Tên phân loại

Chondroitin sulfate A

Carbon 4 của đường - N- acety-D-galactosamine (GalNAc)

Chondroitin-4-sulfate (CS4); ở người có trong: sụn khớp, giác mạc, da, thành mạch

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước

vì thế rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm

thuốc là thấp hơn, khoảng 15000 - 20000 Dalton

1.2.2 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate

Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên chưa thu nhận CS được bằng con đường tổng hợp hoá học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một

số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển

và phân hoá của neron thần kinh, còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên

Vì thế, hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ

các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất CS từ các loại mô động vật Sụn cá mập

(xương sọ, xương sống, vây ) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng

CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân

tử CS

1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô

Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn

Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…) Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS khi thu nhận CS

Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp

có hiệu quả để thu nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất

(muối, kiềm, acid ) gây nên Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain, actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết Sau khi loại bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch Phương

pháp này đã được dùng để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita , cá mập, cá sấu, cá

đuối

Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone

và methanol, vì vậy có thể sử dụng các dung môi này để thu CS thô Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa được hàm lượng CS cao nhất và tách

CS với một số polysaccharide khác [17]

1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên

liệu như từ da của cá Labeo rohita , sụn của cá mực , cá mập, sụn gà, sụn bò

Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật

có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành Đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm và có chứa thành phần CS Cho đến nay, nghiên cứu ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá trình thu nhận CS từ sụn động vật (đặc biệt các nguồn sụn nguyên liệu thuỷ sản) là rất cần thiết để giảm

độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ, có rất ít công trình đề cập

đến vấn đề này Mới có đề tài “Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ

xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học” của Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị

Lan Oanh, (2010), được đăng trên Tạp chí Viện nghiên cứu Hải sản số 16: 26-30

Vì phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS: tổng hợp được một số CS tetrasaccharid [11], có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron trong khi đó disaccharid không có tác dụng trên Vì vậy, các CS chủ yếu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên

Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu Methylene blue khi nó gắn với CS Hoà tan bột CS khô vào nước đã loại ion để nhận dung dịch 8-12% (w/v) và xác định hàm lượng CS của dung dịch theo Beer- Lambert và cộng sự dùng CS4 và CS6 tinh khiết làm chất chuẩn, và

đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 664nm trên máy quang phổ [19] Hàm lượng CS được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau qua các phương pháp đã mô tả được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau [7]

STT Nguyên liệu CS4 (%) CS6 (%) Loại CS

1 Vây cá mập 9,60 ± 1,05 8,76 ± 0,96 CS6,CS4

2

Cá sấu Sụn lưỡi 14,84 ± 0,38 13,54 ± 0,35 CS6,CS4 Xương sườn 5,56 ± 0,96 5,08 ± 0,87 CS6,CS4 Xương ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 CS6,CS4

1.2.3 Ứng dụng của Chondroitin sulfate

CS đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng (dietary supplements) khác nhau trong thời gian dài và đang ngày càng được mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau Thị trường chế phẩm

bổ sung CS và glucosamine rất lớn Trong một năm (1998-1999) doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh

lý cũng như trong các lĩnh vực khác

1.2.3.1 Ứng dụng trong y học

Bệnh khớp (osteoarthritis):

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ chế :

- Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch

- CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp

- Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp

- Bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, elastase, proteoglycanase, phospholipase A2 và Nacetylglucosamindase; kích thích hoạt động các enzym xúc tác phản ứng tổng hợp

hyaluronic acid giúp khớp hoạt động tốt [3]

Điều trị CS với liều 800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy CS được sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm trọng xảy ra [13]

Bệnh mắt:

CS là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính, chống tình trạng khô mắt Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương thấu kính mắt CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc [10] Ngoài

ra CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy thường được dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [2] Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết

kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi

 Các bệnh khác

CS của sụn cá mập được một số công trình nghiên cứu chứng minh là có khả năng ức chế một số loại ung thư Vì từ sụn cá mập tinh chế chứa các chất có khả năng ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh mà các mô ung thư rất cần để phát triển, nên có thể hạn chế các khối u CS cùng với mitomycin C

có thể ức chế các tế bào ung thư cổ trướng sarcoma 180

Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm (eczema), luput đỏ [2]

Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cường kháng viêm, ức chế

sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự do

1.2.3.2 Các ứng dụng khác

CS có trong thành phần các mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng

và chất giữ ẩm…) CS còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin (thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh)

CS còn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác động chống đông máu

CS có tác động điều khiển tế bào CS làm tăng sinh một số loại tế bào bạch cầu, tăng tổng hợp RNA trong tế bào sụn nuôi cấy do đó làm tăng tổng hợp proteoglycogens và collagens, thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan, tuỵ và hạt lympho

1.3 PROTEASE

Protease là những enzym xúc tác quá trình thuỷ phân mối liên kết peptit của các peptit hoặc protein Trong các protease, protease tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Từ thế kỉ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Reomur đã phát hiện ra trong dich dạ dày của chim ăn thịt có tác dụng tiêu hoá thịt Corvisart

(1857) đã tách được tripxin từ dịch tụy Đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Sau đó, Bruke đã tách pepxin từ dạ dày chó (1861)… Ngoài ra, thời bấy giờ người ta cũng đã có những quan sát đầu tiên về protease trong máu Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn và Warts được coi là người đầu tiên tách được protease ở thực vật vào năm 1879 Đó là papain từ đu đủ (Carica papaya) Đến nửa đầu thế kỉ 20, người ta phát hiện thêm các peptithydrolase khác

là bromelain ở dứa, catepxin ở mô cơ động vật Tuy nhiên nguồn protease chủ yếu

là từ các vi sinh vật, đặc biệt từ các vi sinh vật Bacillus, Aspergilus, Streptomyces…Các vi sinh vật này thường tổng hợp nhiều protease khác nhau Cùng với những hiểu biết về protease, việc phân loại và gọi tên các protease cũng thay đổi qua các thời kỳ Năm 1960, Harley phân chia protease thành 4 nhóm theo cơ chế xúc tác, nhưng do có những hiểu biết mới về mặt hoá học của trung tâm xúc tác ở các nhóm này nên Barrett (1980) đã sửa đổi cho phù hợp và được uỷ ban danh pháp hoá sinh quốc tế công nhận (1984) Theo Barrett, tên gọi của 4 nhóm protease này bao gồm tên của acid amin quan trọng nhất đối với vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động và theo đó chúng được chia thành 4 nhóm nhỏ Chúng là các enzym thuộc nhóm 3-hydrolases (thuỷ phân), và phân nhóm 3.4 - peptide hydrolases (thuỷ phân peptide) hay peptidases, có ký hiệu chung là nhóm EC 3.4 Theo tên của acid amin quan trọng nhất hay nhóm hoạt chất đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động

mà protease được chia thành 4 nhóm nhỏ: Protease- serine [E.C 3.4.21]; Protease-cysteine (thiol) [E.C 3.4.22]; Protease-aspartic hay endopeptidase [E.C 3.4.23] và Protease kim loại (metallo-protease hay metalloendopeptidase) [E.C 3.4.24]

Nhiều protease, đặc biệt protease của động vật được tổng hợp ở dạng không hoạt động gọi là tiền enzym (zimogen hay proenzym) Các zimogen có thể chuyển thành dạng hoạt động nhờ quá trình thuỷ phân giới hạn hoặc quá trình chuyển vị cầu disulfit

Các protease tham gia vào hầu hết các quá trình quan trọng của hệ

thống sống, chúng không chỉ đóng vai trò là chìa khoá trong việc điều hoà quá trình đổi mới protein trong tế bào mà còn tham gia điều hoà nhiều quá trình sinh lý khác Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y dược và trong nghiên cứu khoa học… Ở nước

ta việc nghiên cứu và sử dụng protease đã được bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu được một số thành tựu đáng kể và tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: sản xuất nước mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh dưỡng cao cấp

Các protease chiếm vị trí then chốt về chức năng sinh lý trong cơ thể sống đồng thời có tiềm năng ứng dụng thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% thị phần enzym công nghiệp toàn cầu [20] Nguồn nguyên liệu để thu protease rất đa dạng và phong phú bao gồm các cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); Phycin từ nhựa cây cọ (Ficus carica); Keratinase thuỷ phân tóc và len đã được nghiên cứu và thu nhận Papain và Bromelin là những enzym thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (dược phẩm, mỹ phẩm, chế biến thực phẩm ) Việc sản xuất protease thực vật bị hạn chế vì phụ thuộc vào các yếu

tố như diện tích và điều kiện khí hậu để trồng nguyên liệu, hơn nữa quy trình thu nhận enzym tốn nhiều thời gian.Vì thế cho đến nay chỉ có Papain và Bromelain còn đang được sản xuất để ứng dụng [20]

Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều như trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu để thu các enzym này cũng bị hạn chế vì phụ thuộc nhiều vào sự phát triển của ngành chăn nuôi

Khối lượng protease thực vật và động vật thu được không có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thực tiễn cho nên các protease từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut ) đang được quan tâm đặc biệt Riêng protease vi khuẩn chiếm trên 40% thị phần enzym toàn cầu Đặc điểm ưu việt là chúng có

tất cả các đặc tính cần thiết cho các ứng dụng về công nghệ sinh học, nguồn nguyên liệu lại vô cùng lớn, đa dạng và phong phú, hơn nữa quy trình thu nhận lại ít tốn kém về thời gian và chi phí, hạ được giá thành Trong phạm

vi đề tài này chỉ đề cập tới nhóm protease của vi khuẩn là những vi sinh vật sản sinh nhiều loại protease ngoại bào đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm, dệt may, tẩy rửa, thực phẩm và xử lý phế thải

Đa số các protease thương mại từ vi khuẩn chủ yếu thuộc loại enzym

trung tính và kiềm được sản suất từ chi (giống) Bacillus Các protease vi khuẩn

trung tính hoạt động trong dải pH hẹp (pH 5-8) và nhiệt độ tương đối thấp, chúng làm giảm vị đắng (so với protease động vật) cho các sản phẩm thuỷ phân protein, có ái lực cao với các amino acid kỵ nước nên nó được ưa chuộng cho công nghệ chế biến thực phẩm và sữa Một số protease trung tính thuộc protease chứa kim loại nên đòi hỏi các ion kim loại hoá trị 2 cho hoạt động của chúng Các protease vi khuẩn mang tính kiềm có hoạt độ cao ở pH cao

(pH 10) và có đặc thù về phổ cơ chất rộng, nhiệt độ tối ưu khoảng 60oC cho nên rất thích hợp cho công nghệ giặt tẩy [8]

Ở nước ta việc nghiên cứu và sử dụng protease đã được bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu được một số thành tựu đáng kể tạo nhiều chế phẩm

có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất nước mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh dưỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt may, thức ăn cho chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi trường [1]

1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme

Quá trình thủy phân protein:

Protein  polypeptide  peptite  acid amine

Quá trình thủy phân bắt đầu thực hiện khi ở điều kiện hoạt động ( nhiệt độ, pH,…) thích hợp Enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động, tiến hành cắt đứt các liên kết peptide trong cơ chất Ban đầu sản phẩm tạo thành là polypeptide sau một thành gian thủy phân sẽ hình thành các peptide ngắn hơn và

một số acid amine

1.3.1.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50oC Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác nhau Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu

ở 70oC, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động

Hình 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme 1.3.1.2 pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và

cả pH acid

VD: một số protease hoạt động ở pH kiềm (protease kiềm), một số lại hoạt động ở pH acid (protease acid) và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính (protease trung tính)

Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật…

Hình 1.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme

1.3.1.3 Nồng độ cơ chất [S], nồng độ enzyme [E]

- Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất S khi [S] còn ở mức thấp Khi [S] tăng thì tốc độ phản ứng càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt giá trị

V = Vmax, nếu tăng [S] thì tốc độ phản ứng hầu như không tăng

- Khi [S] tiến tới giá trị cực đại thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E] [E] thấp và lượng cơ chất lớn thì tốc độ phản ứng enzyme tuyến tính vào [E] ( [E] tăng, tốc độ phản ứng tăng) Khi [E] cao thì quá trình thủy phân sẽ xảy ra nhanh chóng nhưng khi tốc độ phản ứng tăng đến một giá trị V = Vmax, việc tăng thêm [E] thì tốc độ thủy phân rất chậm hoặc không tăng

1.3.1.4 Chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân

tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa

enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng

1.3.1.5 Chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau Chúng có thể là những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoạt những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme

1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ ĐUỐI

Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt,

và, giống như cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn chủ yếu sinh sống ngoài biển, nghĩa là chúng có bộ xương không cấu tạo từ chất xương mà là từ chất sụn cứng và đàn hồi Phần lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng, gọi là các khe mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt Phần lớn các loài cá đuối có 5 khe mang nhưng

có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi ở cá nhám và cá mập thì các khe mang ở hai bên đầu Phần lớn các loài cá đuối có thân phẳng, giống như cái đĩa bẹt, với ngoại lệ là cá giống và cá đao, trong khi phần lớn các loài cá nhám có cơ thể thuôn động học Nhiều loài cá đuối có các vây ngực phát triển thành các phần phụ rộng và bẹt, giống như cánh Chúng không có vây hậu môn Các mắt và các lỗ thở nằm trên đỉnh đầu

Hình 1.5 Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei)

Phần lớn các loài cá đuối sống tại đáy biển, trong các khu vực địa lý khác nhau - nhiều loài trong vùng nước ven bờ, một vài loài tại vùng biển sâu tới độ sâu ít nhất là 3.000 m (9.800 ft), phần lớn các loài cá đuối có sự phân bố rộng khắp thế giới, trong các môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới, ôn đới hay vùng nước lạnh Chỉ vài loài, như cá ó nạng hải (Manta birostris), là sinh sống ngoài biển khơi, và chỉ vài loài sinh sống trong vùng nước ngọt Một số loài cá đuối có thể sống trong các vùng nước lợ và cửa sông Các loài cá đuối sinh sống tại tầng đáy thở bằng cách lấy nước vào thông qua các lỗ thở, chứ không phải thông qua miệng như phần lớn các loài cá khác vẫn làm, và đẩy nước qua các mang ra ngoài

Phần lớn các loài cá đuối có các răng phát triển, nặng, thuôn tròn để nghiền mai hay vỏ cuat các loài sinh vật tầng đáy như ốc, trai, hàu, động vật giáp xác, và một vài loài cá, phụ thuộc vào từng loài Cá ó nạng hải ăn các thức ăn là động vật phù du

Cá đuối được chia thành 2 bộ:

- Bộ Cá đuối thường (Rajiformes) không có cơ quan phát điện Bộ cá

này trông giống như cá mập, có đuôi để bơi và các vây ức nhỏ hơn so với phần lớn các loài cá đuối khác Các vây ức của chúng gắn với phần trên của mang như ở mọi loài cá đuối khác, làm cho chúng có bề ngoài với đầu rộng Chúng

có mõm dài, phẳng với một hàng các tấm răng ở cả hai hàm Mõm chúng dài tới 1,8 mét (6 ft), và rộng 30 cm (1 ft), được dùng để chém và xiên qua các con

cá nhỏ cũng như để thăm dò trong bùn nhằm tìm kiếm các sinh vật ẩn nấp trong đó Cá đao có thể tiến vào các sông và hồ nước ngọt Một vài loài dài

tới 6 mét (20 ft) Bộ CĐ thường gồm nhiều họ: CĐ đĩa (Platyrhinidae), CĐ bướm (Gymnuridae), ngoài ra còn có các họ cá ó, có hình dạng như hình con

chim, là loài cá đắt nhất do thịt của chúng rất ngon như cá ó thường

(Myliobatidae), cá ó dơi (Mobulidae), cá ó một hàng răng (Aetobatidae), cá ó mõm bò (Rhinopteridae)

- Bộ CĐ điện (Torpediniformes) có cơ quan phát điện, có hình dạng như cây đàn ghi ta, nếu đâm chúng bằng xiên sắt tay sẽ bị tê giật như điện giật Cá đuối điện có các cơ quan phát ra điện trong các tấm vây ức Các cơ quan này được sử dụng để phóng ra tia điện nhằm làm tê liệt con mồi và để phòng ngự Dòng điện này đủ mạnh để làm con người bất tỉnh, và những người Hy Lạp cùng La Mã cổ đại sử dụng các loài cá này để điều trị chứng đau đầu

Bộ CĐ điện có 2 họ: CĐ điện hai vây lưng (Torpedinidae) và CĐ điện một vây lưng (Narkidae)

Cá đuối rất đa dạng, nặng từ vài kilôgam đến trên một tấn, dài từ vài chục centimet đến 6 - 7m, phần lớn là cá đáy, ăn chủ yếu các loài động vật trôi nổi, động vật đáy, thân mềm, giáp xác, cá con Ở Việt Nam, đã phát hiện 33 loài, thuộc 16 chi, 10 họ Loài có giá trị kinh tế đáng kể nhất: CĐ bồng gai

(Dasyatis uarnak) có thể dài đến 2m, được khai thác chủ yếu bằng lưới kéo

đáy Cá đuối thường xuất hiện nhiều từ tháng giêng đến tháng ba âm lịch, xương của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn

có thể nhai được Bộ xương của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn Trong sụn cá đuối với hàm ẩm 65% thì có khoảng 13,8 % protein; 0,19% chất

béo; 17,12% là các chất khoáng và khoảng 3,61% là các hydrate cacbon khác [7]

Hiện nay hầu hết các chế phẩm CS có bán trên thị trường được sản xuất

từ sụn cá mập là chủ yếu, một phần từ sụn bò, sụn gà nên giá thành cao

Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu CS là nhập từ nước ngoài giá thành lại càng cao và cũng chưa có một công trình nào nghiên cứu thu nhận CS

Vì thế việc nghiên cứu tách chiết CS từ sụn các loài cá nhám, cá đuối có trong nước ta là điều rất cần thiết để thay thế nguồn nguyên liệu đắt tiền là cá mập

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei )

Cá đuối bồng mõm nhọn là loại cá thân dẹp bằng, hình trám như một đĩa lớn, chiều rộng đĩa thân xấp xỉ bằng chiều dài đĩa thân Mõm nhọn dài bằng 0.3- 0.33 lần chiều dài đĩa thân Mắt bé hình bầu dục hơi lồi Đuôi rất nhỏ và dài như roi gần bằng 0.6 chiều dài toàn thân Gai đuôi có một đôi, trên cạnh có rang cưa nhỏ

Cá đuối bồng mõm nhọn phân bố ở Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Trung Quốc, Nhật Bản và ở Việt Nam phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vùng biển Tây Nam Cá đuối được thu mua tươi tại cảng cá Lương Sơn – Vĩnh Lương – Nha Trang Sau khi thu mua cá được vận chuyển về phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm và được xử lý để thu sụn cá dùng trong thí nghiệm

Hình 2.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei )

2.1.2 Enzyme protease

 Papain ( P3375 )

- Chế phẩm papain thương mại do công ty Sigma ( Mỹ ) sản xuất và được công

ty TNHH thương mại dịch vụ Nam Giang – TP Hồ Chí Minh phân phối

- Papain có hoạt tính 1,5-10UI/mg

- Nhiệt độ bảo quản là 6 – 100C

- Nhiệt độ thích hợp của enzyme: 600C- 650C , khoảng pH thích hợp: 4.5- 8.5

- pH tối thích = 7 và nhiệt độ tối thích 650C

Sản phẩm này được công bố chất lượng với BYT Việt Nam số BYT [25]

27/2012/TT- Alcalase: ( B4882 )

- Chế phẩm alcalase được mua tại công ty Novozyme – TP Hồ Chí Minh

- Alcalase có hoạt tính 2,4 AU/mg

- Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0 - 100C

- Nhiệt độ thích hợp của enzyme: 500C – 600C, khoảng pH thích hợp 7.5 - 8

- pH tối thích = 8 và nhiệt độ tối thích = 550C

Sản phẩm này được công bố chất lượng với BYT Việt Nam số 27/2012/TT-BYT [25]

 Neutrase: (P1236 )

- Chế phẩm neutrase được mua tại hãng Novozyme Đan Mạch

- Hoạt tính 50000 UI/g

- Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là -100C

- Nhiệt độ thích hợp của enzyme: 450C – 550C, khoảng pH thích hợp: 5.5- 7.5

- Trên nhãn bao bì có ghi hoạt động tối ưu ở pH 7.2 và nhiệt độ 450C

Sản phẩm này được công bố chất lượng với BYT Việt Nam số 16536/2005/YT-CNTC

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích

2.2.1.1 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

- Dùng protein casein hoặc Hb ( Hemoglobin ) làm cơ chất xác định hoạt

độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin- Ciocalteau Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme protease

- Hoạt độ enzyme của chế phẩm được biểu diễn bằng “ Đơn vị hoạt độ proteolytic” Một đơn vị hoạt độ proteolytic ( PU ) là lượng enzyme mà trong 1 phút ở 300C có khả năng thủy phân protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic cho phản ứng màu với thuốc thử Folin- Ciocalteau tương đương với một μmol tyrosin

- Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ proteolytic trên 1 mg protein của chế phẩm ( Số PU/ mg protein )

* Hoá chất- thiết bị

- Dung dịch chuẩn tyrosine (1 μmol/ml): hòa tan 18,12mg tyrosine tinh khiết trong 100ml dung dịch HCl 0,2 M Từ dung dịch này tiếp tục pha loãng bằng dung dịch HCl 0,2M để nhận được các dung dịch có chứa Tyr với nồng độ

từ 0,01 μmol/ml cho tới 0,1 μmol/ml

* Tiến hành

Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống đối chứng

- Ống thí nghiệm : cho vào 1ml dung dịch cơ chất đã đạt 300C và 1 ml dung

dịch enzyme protease đã đạt tới 300C giữ đúng 10 phút ở 300C sau đó cho ngay

vào 5ml dung dịch acid tricloacetic 0,4M lắc đều và giữ 30 phút ở 300C Lọc và

lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thước thử

Folin- Ciocalteau như sau: lấy 1ml dịch lọc cho vào một ống nghiệm sạch, thêm

vào 5ml dung dịch Na2CO3 0,4M lắc đều và cho thêm 1ml thuốc thử Folin đã được

pha loãng 5 lần lắc đều, giữ 20- 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó so màu trên máy

quang điện kế với kính lọc màu đỏ ở bước sóng 660nm

- Ống đối chứng: sau khi cho 1ml dung dịch enzyme cho ngay vào 5ml dung

dịch acid tricloacetic 0,4M rồi cho 1ml dung dịch cơ chất Các giai đoạn tiếp theo

tiến hành giống như ống thí nghiệm

- Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosine

Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ khác nhau 0,01- 0,1 µmol/ml

trong HCl 0,2N Lấy 1ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên Đo mật

độ quang học của các ống Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa

Tyrosine (ml) 0,05 0,1 0,15 0,20 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45

HCl 0,2N (ml) 4,95 4,9 4,85 4,8 4,75 4,7 4,65 4,6 4,55

* Tính kết quả:

- Lấy hiệu số mật độ quang đọc trên máy của mẫu thí nghiệm và mẫu đối

chứng Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine tính lượng μmol tyrosine tương ứng

- Tính số đơn vị hoạt độ proteolytic của 1ml dịch enzyme đã lấy để xác định

hoạt độ theo công thức:

PU/ml =μmol tyrosine × 7

10Trong đó: 7: là toàn bộ thể tích hỗn hợp phản ứng ( 1ml dung dịch cơ chất cộng 1 ml dung dịch enzyme cộng 5ml dung dịch acid tricloacetic 0,4 M) 10: là thời gian ủ enzyme với cơ chất ( 10 phút )

Hoạt độ riêng của enzyme: là số đơn vị hoạt độ enzyme tính trên 1mg protein enzyme ( PU/mg protein )

2.2.1.2 Định lượng Chondroitin sulfate bằng so màu với Methylene blue [19]

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

Một phương pháp so màu được đề xuất đã được áp dụng để xác định số lượng chondroitin sulfate bằng cách cho tương tác với xanh methylene Phương pháp này dựa trên nguyên tắc giảm độ hấp thụ của xanh methylene xuống còn 664 nm trong phức với chondroitin sulfate Định luật Beer-Lambert đã tuân theo ở tỷ lệ 0.5-4

μg/ml với hệ số tương quan là 0.9985 Kết quả được trình bày đã được xác nhận

về mặt thống kê theo hướng dẫn của ICH Các nghiên cứu được khôi phục được thực hiện tại ba cấp độ khác nhau Độ chính xác cao nhất khi RSD thấp hơn 2.0% Các phương pháp được phát triển đã cho thấy được tính dễ dàng, đơn giản, cụ thể, chính xác, có thể, thích hợp và chi phí hiệu quả

Phức hợp giữa chondroitin sunfat và xanh methylen

Xanh methylen là một loại thuốc nhuộm dương tính, khi tương tác với chondroitin sunfat sẽ bị giảm bước sóng hấp thụ tại 𝜆 max 664𝑛𝑚 Việc giảm hấp thụ tại bước sóng 664nm tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sunfat trong dung