ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM THỊ OANH

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH

(Vigna radiata (L.) Wilczek)

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2010

NỘI DUNG

1 Mở đầu

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3 Kết quả và thảo luận

4 Kết luận và đề nghị

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính trong

nhóm các cây đậu ăn hạt, là cây trồng có vị trí quan trọng Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm một số bệnh như: sâu keo, sâu xanh… Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu về khả năng chịu hạn đã được tiến hành Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen LTP (Lipid Transfer Protein).

LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì Khi gặp stress hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng

độ dày của lớp vỏ ngoài [36] Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế.

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu

xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển

gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn.

MỞ ĐẦU

2 Mục tiêu nghiên cứu

• Đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích một

số chỉ tiêu hoá sinh.

• Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một số giống đậu xanh.

• Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn

3 Nội dung nghiên cứu

• Phân tích một số đặc điểm hình thái

• Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lượng lipid, protein tan tổng số của các giống đậu xanh thu thập được

• Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non.

• Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh.

• Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

• Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất

• Xác định trình tự gen LTP và phân tích cấu trúc gen LTP

4 Ý nghĩa khoa học

Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanh mang gen LTP.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Bảng 2.1 Các giống đậu xanh nghiên cứu

2 ĐXVN 5 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 04 với ĐX 113

4 044/ĐX06 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

Hình 2.1 Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

• Các loại hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu phân lập gen.

• Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện KHSS - ĐHTN; Phòng thí nghiệm Di truyền và SHHĐ - Khoa Sinh - KTNN- Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN và Phòng Miễn Dịch học - Viện CNSH.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sinh lí, hoá sinh

2.3.1.1 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998) [1].

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sinh lí, hoá sinh

2.3.1.2 Định lượng lipid tổng số

a: khối lượng mẫu trước khi chiết

b: khối lượng mẫu sau khi chiết

2.3.1.3 Định lượng protein

Định lượng protein tan trong hạt đậu xanh theo phương pháp Lowry.

a: số đo trên máy quang phổ

H : hệ số pha loãng

G : số mg mẫu phân tích

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

• PP tách chiết DNA tổng số (Gawel và Jarret, 1991)

• Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

• Kỹ thuật PCR (Mullis và cs, 1985)

• Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

• Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

• Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5αα

• Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN TÍCH ĐĐ HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐXNC

3.1.1 Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đx

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các giống đậu xanh nghiên cứu

TT Tên giống Màu gốc

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.2 Chiều dài rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non Bảng 3.2 Kích thước rễ, thân của các giống đậu xanh ở gđ cây non

STT Tên giống Chiều dài thân (cm) Chiều dài rễ (cm)

3.1.3 Đặc điểm hoá sinh hạt của các giống đậu xanh

Bảng 3.3 Hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

STT Tên giống Hàm lượng lipid (%) Hàm lượng protein (%)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

y = -3.7843x + 37.263

R 2 = 0.9666

0 5 10 15 20 25 30 35

Hình 3.1 Mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống

đậu xanh nghiên cứu

3.2 KQ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐXNC

Bảng 3.4 Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tên giống 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày chịu hạn Chỉ số

%CKH %CPH %CK H %CPH %CK H %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH ĐXVN 4 93,33 46,66 76,66 46,66 56,66 33,33 36,66 16,66 13,33 6,66 5524 ĐXVN 5 93,33 46,66 76,66 33,33 43,33 20,00 30,00 10,00 16,66 6,66 4288

VN 99-3 90,00 40,00 70,00 23,33 30,00 16,66 23,33 10,00 6,66 0,00 2915 044/ĐX06 100,0 73,33 86,66 46,66 66,66 60,00 46,66 26,66 36,66 10,00 9174

HG 1 96,66 63,33 73,33 43,33 56,66 43,33 36,66 16,66 16,66 6,66 6488

HG 2 96,66 60,00 73,33 40,00 53,33 43,33 33,33 10,00 13,33 6,66 5940

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

HG 1

HG 2

Hình 3.2 Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

y = 972.57x - 3611.7

010002000300040005000600070008000900010000

Hình 3.3 Mối tương quan giữa chỉ số chịu hạn và chiều dài rễ

của các giống đậu xanh nghiên cứu

Hình 3.4 Hình ảnh của 4 giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.5 DNA tổng số của giống đậu xanh

044/ĐX06 và HN 2

Ký hiệu : 1 044/ĐX06; 2 HN 2

Bảng 3.5 Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm của

giống đậu xanh 044/ĐX06 và BG 3

Tên giống A260 A280 A260/A280 Hàm lượng

DNA (ng/l)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3.2 Kết quả nhân gen LTP

Hình 3.6 Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP

500bp

350 bp

Hình 3.7 Kết quả điện di DNA thu được từ kỹ thuật thôi gel

Kí hiệu: M Marker 1 Kb; 1 044/ĐX06; 2 HN 2.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3.4 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

3.3.6 Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2

Kí hiệu: 1 044/ĐX06; 2 HN 2

3.3.7 Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen LTP

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

| | | | | | | | | |

10 20 30 40 50

044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT

HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT

| | | | | | | | | |

60 70 80 90 100

044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT

HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT

| | | | | | | | | |

110 120 130 140 150

044/ĐX06 CTTTGG CTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG

HN 2 CTTTGG AATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG

| | | | | | | | | |

160 170 180 190 200

044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC

HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC

| | | | | | | | | |

210 220 230 240 250

044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT

HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT

| | | | | | | | | |

260 270 280 290 300

044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGC ATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC

HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGC TTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC

| | | | | | | | | |

310 320 330 340 350

044/ĐX06 A TCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA

HN 2 A ACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA

044/ĐX06 A

HN 2 A

Hình 3.11 Trình tự nucleotide của gen LTP

ở 2 giống đậu xanh nghiên cứu

044/ĐX06, HN 2

3.3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 mẫu đxnc với trình tự nucleotide công bố trên ngân hàng gen với mã số AY300807

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

| | | | | | | | | |

10 20 30 40 50

AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT

044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT

HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT

| | | | | | | | | |

60 70 80 90 100

AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT

044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT

HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT

| | | | | | | | | |

110 120 130 140 150

AY300807 CTTTGG CTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG

044/ĐX06 CTTTGG CTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG

HN 2 CTTTGG AATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG

| | | | | | | | | |

160 170 180 190 200

AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC

044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC

HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC

| | | | | | | | | |

210 220 230 240 250

AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT

044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT

HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT

| | | | | | | | | |

260 270 280 290 300

AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGC TTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC

044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGC ATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC

HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGC TTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC

| | | | | | | | | |

310 320 330 340 350

AY300807 A ACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA

044/ĐX06 A TCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA

HN 2 A ACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA

.

AY300807 A

044/ĐX06 A

HN 2 A

Hình 3.12 So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đx

044/ĐX06 và HN 2 với trình tự đã công bố AY300807

Kq so sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đx 044/ĐX06 và HN2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

| | | | | | | | | |

10 20 30 40 50

044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSL APCIS YLQKGGVPSA

HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSL ESSIS YLQKGGVPSA

| | | | | | | | | |

60 70 80 90 100

044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV

HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV

| | |

110

044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK

HN 2 NVPYKISTFT NCANIK

Kq so sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06

và HN 2 với giống đậu xanh có mã số AY300807

| | | | | | | | | |

10 20 30 40 50

AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSL APCIS YLQKGGVPSA

044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSL APCIS YLQKGGVPSA

HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSL ESSIS YLQKGGVPSA

| | | | | | | | | |

60 70 80 90 100

AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV

044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV

HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV

| | |

110

AY300807 NVPYKISTFT NCANIK

044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK

HN 2 Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP NVPYKISTFT NCANIK

ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

I KẾT LUẬN

1 13 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau được sử dụng trong

nghiên cứu có: khối lượng 1000 hạt dao dộng từ 46,40 g (ở

cm (ở giống 044/ĐX06), chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 6,24 cm (ở giống HN 2) đến 11,45 cm (ở giống 044/ĐX06).

2 Các giống đậu xanh nghiên cứu có hàm lượng lipid dao động từ

lượng protein dao động từ 18,54 % (HN 2) đến 28,78 % (ở giống 044/ĐX06).

3 Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có sự

khác biệt Hai giống có khả năng chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và BG 3 còn hai giống có khả năng chịu hạn kém nhất là HN 1 và HN 2.

I KẾT LUẬN

4 Đã nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của giống chịu

hạn tốt (044/ĐX06) và giống chịu hạn kém (HN 2) thành công Chiều dài gen LTP ở hai giống đậu xanh trên có kích thước 351 nucleotide với độ tương đồng là 97,7 % Độ tương đồng về trình

tự amino acid trong protein của gen LTP ở hai giống đậu xanh trên đạt 95,6 %

5 Độ tương đồng giữa trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh

nghiên cứu với trình tự gen LTP trên đậu xanh đã được công bố trong ngân hàng gen đều là 98,8 % Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã

số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2 % và 97,4 %

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

II ĐỀ NGHỊ

Cần tiếp tục nhân bản, chọn dòng và đọc trình

tự gen LTP của nhiều giống đậu xanh khác nhau

để tìm ra chỉ thị phân tử về tính chịu hạn của cây đậu xanh.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ