NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill

BÁO CÁO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN

Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

NGƯỜI THỰC HIỆN: NGUYỄN HIỆP HÒA

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NỘI DUNG

1 Mở đầu

2 Tổng quan tài liệu

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

5 Kết luận và đề nghị

1 MỞ ĐẦU

1.1 Lí do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae),

đây là một trong những cây lương thực có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới, tuy nhiên đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém Chính vì vậy vấn

đề cải thiện tính chịu hạn của đậu tương có ý nghĩa vô cùng quan trọng

trong việc nâng cao năng suất.

Prorein DREB là nhân tố phiên mã kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương không phụ thuộc vào ABA, sản phẩm của gen DREB được tìm thấy nhiều khi cây gặp hạn, lạnh và mặn Trong phân họ DREB ở đậu tương, việc nghiên cứu cấu trúc DREB5 vẫn còn mới mẻ cho đến nay mới có một công trình duy nhất của Chen M và cs (2007)

Xuất phát từ các lí do trên chúng tôi đã tiến hànhđề tài luận văn thạc

sĩ là: “Nghiên cứu gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến quá trình

phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.)

Merrill]”

1.2 Mục tiêu đề tài

So sánh khả năng chịu hạn của các giống đậu tương và xác định đặc điểm về cấu trúc của gen DREB5 ở cây đậu tương.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây đậu tương non 3 lá chét;

- Thu thập thông tin về gen DREB5, thiết kế mồi để nhân gen DREB5;

- Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược tạo cDNA và khuếch đại gen DREB5 bằng kỹ thuật PCR;

- Tách dòng và đọc trình tự gen DREB5 ở cây đậu tương;

- So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương nghiên cứu với trình tự đã công bố trên GenBank

1.4 Ý nghĩa khoa học

Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen DREB5 ở đậu tương nhằm cải thiện tính chịu hạn.

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

*Trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 29 tài

liệu và nhận thấy rằng:

-Đậu tương là cây đứng hàng thứ 3 về tầm quan trọng đối với con người, sau lúa và ngô

-Đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém

-Protein của gen DREB tham gia tích cực vào quá trình chống

chịu hạn ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng

-DREB5 thuộc họ gen DREB5 vẫn còn ít được quan tâm nghiên cứu, cho đến nay chỉ có một công trình nghiên cứu duy nhất của Chen M (2007)

3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

Bảng 3.1 Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu

STT Tên giống Kí hiệu Nguồn gốc Nơi cung cấp

3.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

• Các loại hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp.

• Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện KHSS - ĐHTN; Phòng thí nghiệm Di truyền và SHHĐ - Khoa Sinh - KTNN- Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN và Phòng Miễn Dịch học - Viện CNSH.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

• 2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương

pháp gây hạn nhân tạo

• Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1].

• 3.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

• Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc)

• Kỹ thuật RT-PCR

• Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR

• Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo

Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non

được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1].

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit

(Bioneer – Hàn Quốc)

Kỹ thuật RT-PCR

Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)

Phương pháp tách chiết plasmid

Phương pháp xác định trình tự nucleotit

2.3.3.Phương pháp xử lí số liệu

Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel

Phương pháp xử lý trình tự gen

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của một số giống đậu tương nghiên cứu

Hình 4.1 Hình dạng hạt đậu tương nghiên cứu

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của các giống đậu tương nghiên cứu

Bảng 3.1 Mầu sắc, khối lượng, kích thước hạt đậu tương nghiên cứu

Giống Hình

dạng hạt

Màu sắc hạt Màu sắc rốn hạt 1000 hạt (g) Khối lượng Dài (cm) Kích thước hạt Rộng (cm)

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.2 Đánh giá khả năng chịu hạn tương đối của các giống đậu tương

Bảng 3.3 Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.3 Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu tương

4.3.1 Tách chiết RNA từ lá mầm của các giống đậu tương

3.4.2 Kết quả RT-PCR tạo DNA

Hình 4.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR

với cặp mồi DREBsoy5F và DREBsoy5R

Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể  được cắt

bằng HindIII.

1 : Xanh tiên đài

2 : ĐT84

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.4 Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu tương

4.4.3 Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DRED5 trong vector tách dòng

Hình 4.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các

khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh.

4.4.5 Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen DREB5

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 ở đậu tương Xanh Tiên Đài – Việt Nam

Theo trình tự này gen DREB5 gồm 924bp trong đó mạch nghiên cứu có 207 T, 268

A, 190 G và 259 C

4.4.6 So sánh trình tự nucleotit giữa DREB5 của Xanh tiên đài Việt Nam và DREB5 của EF 583447 trong ngân hành gen có

nguồn gốc từ Trung Quốc bằng phần mềm Bioedit

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 4.11 So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài

của Việt Nam và EF 583447 có trong ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tương của Trung Quốc

Theo hình 3.11 chúng tôi xác định được những vị trí khác nhau về trình tự nucleotit như sau:

- Gen DREB5 Xanh Tiên Đài của Việt Nam đã không có nucleotit ứng với vị trí

từ 193 đến 202 (AGCACCA GC)và từ vị trí 527 đến 535 (AAGA ACAAC)so với EF583447

- EF583447 của Trung Quốc không có nucleotit ứng với vị trí từ 605 đến 607 (CCC) 675 đến 677 (GGT)và từ 882 đến 890 (TGATGCTCA)

Theo kết quả này chúng tôi đã xác định được sự tương đồng về trình tự gen DREB5 của hai giống đạt 90,4%

Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin của DREB5 ở giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và

giống đậu tương có mã số EF 583447.1 của Trung Quốc có trong ngân hàng gen quốc tế

Theo kết quả này Xanh tiên đài của Việt Nam đã không có axit amin ở các vị trí từ 58-60 (ứng với HHQ ), 177,178, 180 (ứng với EQQ) EF 583447 Trung Quốc không có axit amin ở các vị trí 201(ứng với P), 292-294 (ứng với DAD) Sự tương đồng của hai giống về trình tự axit amin đạt 87,8%

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

- Các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng về đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt Hạt của giống địa phương thường có kích thước nhỏ, đa dạng về hình dạng, mầu sắc hạt cũng như mầu rốn hạt, các giống đậu tương lai thường có kích thước lớn hơn

-Các giống đậu tương địa phương có khả năng chịu hạn tốt hơn các

giống lai, chỉ số chịu hạn tương đối của giống đậu tương DB là cao nhất (41,03), nhỏ nhất là ĐT84 (21,22).

- Đã thiết kế, tổng hợp cặp mồi DREBsoy5F-DREBsoy5R và khuếch đại thành công gen DREB5 từ mRNA của giống đậu tương Xanh Tiên Đài, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 từ giống đậu tương

Xanh Tiên Đài, gen có kích thước 924bp

- Trình tự nucleotit của gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và trình tự gen DREB 5 có mã số EF 583447.1 của giống đậu tương Trung Quốc có độ tương đồng đạt 90,4% Trình tự axit amin của protein của hai gen này có độ tương đồng đạt 87,8%.

5.2 Đề nghị

Tiếp tục phân tích so sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với nhóm chịu hạn kém để xác định mối liên quan giữa sự thay đổi trong cấu trúc gen

DREB5 với khả năng chịu hạn của cây đậu tương.

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ