ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill

Cây Đậu tương Glycine max (L.) Merrill, có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (

Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS CHU HOÀNG MẬU

 Më ®Çu

 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

 Cây Đậu tương Glycine max (L.) Merrill, có vị trí quan

trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp

 Khí hậu nước ta phức tạp, tác động bất lợi đến cây trồng

Më ®Çu

 Đậu tương thuộc nhóm chịu hạn kém Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính chịu hạn và cơ sở phân tử của đặc tính này để tuyển chọn giống chất lượng, chịu hạn Tuy nhiên, sự hiểu biết về gen liên quan đến chịu hạn còn ít và chưa đầy đủ

1 Lý do chọn đề tài

 Cystatin và gen cystatin được xác định có liên quan với khả năng chịu hạn của thực vật và đã được nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng khác nhau Vậy gen cystatin liên quan thế nào đến khả năng chịu hạn của đậu tương?

 Mục đích: Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

2 Mục tiêu :

 Xác định khả năng chịu hạn và phân nhóm về mức độ

chịu hạn của các giống đậu tương ngiên cứu

 Phân tích đặc điểm gen cystatin liên quan đến tính

chịu hạn của cây đậu tương

3 Nội dung:

 Xác định khả năng phản ứng với hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo;

 Tách ARN tổng số từ hạt đậu tương ở giai đoạn hạt non;

 Thu thập thông tin về gen cystatin, thiết kế và tổng hợp cặp mồi để nhân gen cystatin;

 Tạo dòng cADN từ mARN bằng phản ứng phiên ma ngược

và nhân gen cystatin bằng kĩ thuật PCR;

 Đọc trình tự nu của gen cystatin ở cây đậu tương

Më ®Çu

Đề tài luận văn đã tổng kết 56 tài liệu có liên quan thể hiện một số vấn đề sau:

 Đặc điểm, giá trị kinh tế và tình hình sản xuất của cây đậu tương

 Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương

 Gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cystatin và gen cystatin

 Cystatin là chất ức chế có bản chất protein, có khả năng ức chế đặc hiệu hoạt động của papain và các enzyme phân hủy cysteine (cysteine proteinase).

 Khi stress hạn xảy ra, một số protein bị biến tính và tổn thương Cysteine protease tham gia loại bỏ các protein biến tính; tham gia hoàn thiện, tái tạo protein nhằm giúp cây thích ứng với những tác động của ngoại cảnh Quá trình này có thể

bị cản trở bởi cystatin.

 Sự biểu hiện của gen cystatin thường trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật

 Do vậy, phân lập gen cystatin nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích luỹ cystatin là rất cần thiết.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

 Các loại hóa chất, thiết bị dùng cho các thí nghiệm phân tích hoá sinh

và sinh học học phân tử: gồm các loại mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc

 Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào Thực

vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đánh gía khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo, theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp sinh học phân tử

 PP tách chiết RNA tổng số từ hạt ở quả đậu tương non PP tách chiết RNA tổng số

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

Hình 3.1 Hạt của 5 giống đậu

tương

Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

Bảng 3.1 Màu sắc, số lượng và khối lượng hạt của 5

giống đậu tương nghiên cứu

Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt 5 giống đậu tương nghiên cứu

Giống Màu vỏ hạt Màu rốn hạt

Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 9 ngày

Hình 3.2 Hình ảnh cây đậu tương non 3 lá

A trước khi xử lí bởi hạn; B sau khi xử lý hạn

Khả năng chịu hạn của giống đậu tương

B

A

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

Khả năng chịu hạn của giống đậu tương

Bảng 3.2 Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tương nghiên cứu

Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá: BD > BH> TN> CT> DT84

STT Tên giống Chỉ số chịu hạn

tương đối (%) Số ngày hạn cây chết 100 %(ngày)

Hình 3.3 Kết quả tách chiết RNA tổng số

3.2.1 Kết quả tách chiết ARN tổng số

2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN

Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN

Chương 3 kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

bp

1000

750

Hình 3.4 Kết quả PCR nhân gen cystatin từ hạt non của giống đậu tương

Thái Nguyên

3.2.2 Kết quả khuếch đại gen cystatin

Hình 3.5

Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc

3.2.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

E.coli DH5

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

3.2.4 Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp

M: Marker 1Kb ; Các giếng còn lại:

Plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn lạc

H.3.8 Kết quả cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI

3.2.6 Kết quả kiểm tra các dòng plasmid

738

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

3.2.7 Kết quả đọc trình tự nucleotit

Đọc trình tự nucleotit trên máy xác định trình tự ADN tự

động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analizer, xử lí bằng

phần mề̀m DNAstar

So sánh trình tự này trong BLAST của ngân hàng NCBI, kết quả cho thấy đây là trình tự gen cystatin của đậu tương kích thước mong muốn dài 738 bp

SO SÁNH TRÌNH TỰ NU CỦA GEN CYSTATIN CỦA GIỐNG ĐẬU

TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI 4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK

70 80 90 100 110 120

Thái Nguyên GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của

10 giống đậu tương

kÕt qu¶ VÀ TH O LU N ẢO LUẬN ẬN

So với gen cystatin mã số D31700; AK246065;

D64115: khác 1 nucleotide (ở vị trí nu 109) dẫn tới sự

thay đổi 1 axit amin

MÃ HÓA CỦA GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI

4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK

So với gen cystatin mã số BT098957 : khác 2 nucleotide ở

2 vị trí nucleotide 109 và 207) dẫn tới sai khác 2 axit amin

Bộ ba GAA (mã hóa aa Glutamic)

 Ở vị trí nucleotide số 109: G thay bằng T Do đó:

Bộ ba TAA (kết thúc dịch mã)

1 Trong quá trình tổng hợp cDNA từ mRNA, hay nhân gen PCR có sự lắp ghép sai một nucleotide, ở vị trí nu 109 G thay bằng T;

3 Gen cystatin phân lập từ ADN (4 exon và 3 intron) Trình tự gen

cystatin giống nghiên cứu tách từ mRNA tương đồng với trình tự nu ở

4 exon Khi phiên mã tổng hợp mRNA, các đoạn không mã hóa và mã hóa đều được sao thành phân tử tiền mRNA Qua giai đoạn cắt bỏ các đoạn intron và nối các exon lại với nhau của phân tử tiền mRNA tạo ARN hoàn chỉnh có thể dẫn tới sự sai sót trên.

2 Trong quá trình tái bản hoặc phiên mã gen bị đột biến thay thế một

nucleotide;

4 Ở khả năng do đột biến thay thế thì đoạn polypeptide được dịch mã là

36 axit amin; vì chuỗi polypeptide được suy từ trình tự nucleotide của cADN ( phiên mã từ mARN) nên rất có thể xảy ra:

proteinase không bị ức chế.

hoạt động sinh lý, hóa sinh của tế bào SỰ THAY THẾ G BỞI T CÓ THỂ XẢY RA MỘT SỐ KHẢ NĂNG:

KẾT LUẬN

5 So với 9 trình tự nu của gen cystatin đậu tương trên

genbank thấy trình tự nu của gen cystatin giống đậu tương TN

có độ tương đồng dao động từ 94,5% - 99,8%

2 Ở giai đoạn cây non ba lá, 5 giống nghiên cứu phản ứng khác nhau với hạn Chỉ số chịu hạn tương đối (215,07 -

3595,77) Khả năng chịu hạn: BD> BH > TN> CT> DT84

3 Đã thiết kế cặp mồi và khuếch đại thành công gen cystatin

từ mARN tách chiết ở hạt non của giống đậu tương TN

4 Gen cystatin của giống đậu tương TN(738 bp), xuất hiện đột biến thay thế ở vị trí nu thứ 109 làm bộ ba GAA thay bằng TAA (mã kết thúc) và chuỗi polypeptit tổng hợp chỉ có 36 aa

1 Các giống đậu tương nghiên cứu đa dạng về hình thái

hạt, số quả và số hạt Khối lượng 1000 hạt của 5 giống:

DT84> BH> BD> CT = TN.

ĐỀ NGHỊ

ở các giống đậu tương khác

giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với giống đậu tương chịu hạn kém, để xác định mối liên quan giữa sự thay đổi cấu trúc gen với đặc tính chịu hạn của cây đậu tương.