nghiên cứu mức độ nhiễm vi khuẩn vibrio spp gây bệnh trên tôm sú (penaeus monodon fabricius, 1798) nuôi thâm canh trong hệ thống nuôi đa cấp tại hải phòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ TRƯƠNG THỊ HÀ NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM SÚ Penaeus Monodon Fabricius, 1798 NUÔI THÂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

TRƯƠNG THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM VI KHUẨN

VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus Monodon Fabricius, 1798) NUÔI THÂM

CANH TRONG HỆ THỐNG NUÔI ðA CẤP

TẠI HẢI PHÒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản

Mã số : 60.62.70 Người hướng dẫn khoa học: TS BÙI QUANG TỀ

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng ñây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Số liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược công bố ở bất kỳ công trình nghiên cứu nào Các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Trương Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Lời ựầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến Ban giám hiệu Trường ựại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban giám ựốc và Phòng đào tạo Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I ựã ủng hộ, giúp ựỡ, tạo mọi ựiều kiện ựể tôi hoàn thành tốt khóa học này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S Bùi Quang Tề, người thầy ựã tận tình ựịnh hướng, chỉ bảo và giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Qua ựây, tôi cũng xin cảm ơn tới các cán bộ Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện nghiên cứu NTTS I và các cán bộ thuộc ựề tài KC - 07.11/06 -

10 ựã tạo mọi ựiều kiện tốt nhất ựể tôi thực hiện ựề tài

Lời cảm ơn chân thành xin gửi tới gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp, những người ựã giúp ựỡ và ựộng viên tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

Tác giả

Trương Thị Hà

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Danh mục viết tắt vii

MỞ ðẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số ñặc ñiểm về ñối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 ðặc ñiểm phân loại và hình thái vi khuẩn Vibrio 3

1.1.2 ðặc tính phân bố và nuôi cấy 4

1.1.3 ðặc tính sinh hóa 4

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú 6

1.2.1 Trên thế giới 6

1.2.2 Ở Việt Nam 12

1.3 Mô hình nuôi tôm thâm canh ña cấp 14

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian, ñịa ñiểm nghiên cứu 19

2.1.1 Thời gian: Từ tháng 4 ñến tháng 10/2010 19

2.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu: 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 20

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 20

2.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 26

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả về thành phần loài vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm ở các mô hình nuôi 27

3.2 Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình nuôi 31

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 31

3.2.3 Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3 33

3.2.4 Tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 4 34

3.3 Mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình nuôi 34

3.3.1 Mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 34

3.3.2 Mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2 35

3.3.3 Mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3 36

3.3.4 Mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 4 36

3.4 Thảo luận 37

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT Ý KIẾN 40

4.1 Kết luận 40

4.2 ðề xuất 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn V parahaemolyticus……… 3

Hình 1.2 Vi khuẩn V vulnificus 3

Hình 1.3 Vi khuẩn V harveyi ……….4

Hình 1.4 Vi khuẩn V alginolyticus 4

Hình 1.5 Các mô hình nuôi tôm sú ña cấp (mô hình 1 cấp và 2 cấp) 16

Hình 1.6 Các mô hình nuôi tôm sú ña cấp (mô hình 3 cấp) 16

Hình 2.1 Sơ ñồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn 19

Hình 3.10 Biểu ñồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 32

Hình 3.11 Biểu ñồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2 32

Hình 3.12 Biểu ñồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3 33

Hình 3.13 Biểu ñồ tỷ lệ nhiễm Vibrio spp trên tôm sú ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 4 34

Hình 3.14 Biểu ñồ mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 1 34

Hình 3.15 Biểu ñồ mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 2 35

Hình 3.16 Biểu ñồ mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 3 36

Hình 3.17 Biểu ñồ mật ñộ vi khuẩn Vibrio spp ở các mô hình trong tháng nuôi thứ 4 36

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

- ATVSTP: An toàn vệ sinh thực phẩm

- CFU: Colony Forming Unit (Số ñơn vị khuẩn lạc hay còn gọi là khuẩn lạc)

- TCBS: Thiosulphate Citrate Bilesalts Sucrose agar

- ctv: Cộng tác viên

- ðBSCL: ðồng bằng sông Cửu Long

MỞ ðẦU

Tôm sú (Penaeus monodon Fabricius, 1798) là ñối tượng thủy sản có

giá trị thương phẩm cao và cũng là ñối tượng nuôi quan trọng của một số nước ñang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn ðộ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam và Ecuador (Nam Mỹ) Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước trên mà còn có tác ñộng tích cực ñến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện ñời sống cho người nuôi thủy sản

Theo thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam, hàng năm diện tích nuôi trồng thuỷ sản của Việt Nam ngày càng ñược mở rộng Nếu năm 2000 diện tích nuôi tôm mới ñạt 283.610 ha với sản lượng ñạt 97.628 tấn thì năm 2005 diện tích ñã tăng lên 605.356 ha, sản lượng ñạt 324.680 tấn và ñến năm 2008 diện tích nuôi tôm nước lợ lên ñến khoảng 638.614 ha, sản lượng tôm nuôi ñạt khoảng 375.000 tấn, ñứng thứ 3 trên thế giới Những năm gần ñây do việc ảnh hưởng của sự suy thoái kinh tế toàn cầu nên giá trị kim ngạch xuất khẩu tôm có giảm, tuy nhiên trong hai năm gần ñây

ñã tăng trở lại: Cũng theo số liệu thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam, trong 10 tháng ñầu năm 2008, xuất khẩu tôm cả nước là 158.527 tấn, trị giá hơn 1.3 tỉ USD chiếm tỷ trọng 35,4%; còn năm 2009, theo

số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, tính ñến hết tháng 10 tôm vẫn ñứng ñầu về kim ngạch xuất khẩu, chiếm 38,4% tỷ trọng tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản, xuất khẩu 170.3 tấn với kim ngạch ñạt 1354.7 triệu USD, tăng 7,4% về khối lượng và tăng 0,03% về giá trị so với cùng kỳ năm 2008 Bên cạnh những thành tựu to lớn mà nghề nuôi tôm ñem lại, còn nhiều vấn ñề phát sinh liên quan ñến việc phát triển nuôi tôm như ô nhiễm môi trường nuôi, dịch bệnh Một thực tế cho thấy, trong những năm gần ñây bệnh ñã xuất hiện với tần suất dày và diễn biến phức tạp hơn, bệnh tôm ñã trở

thành rào cản chắnh ựối với sự phát triển và mở rộng nuôi tôm cả về mặt số lượng, chất lượng, tắnh cân ựối, tắnh liên tục và ảnh hưởng tới thị trường xuất khẩu Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành cho thấy

cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong ựó diện tắch có tôm bị bệnh và chết là 30.083 ha; các tỉnh từ đà Nẵng ựến Kiên Giang có tới 29.200 ha, chiếm 97,06% diện tắch có tôm bị chết trong cả nước Năm 2008 diện tắch tôm sú và tôm thẻ bị bệnh của cả nước là 98.955 ha và tổng thiệt hại

là 160 tỷ ựồng Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm thất bại liên tục ựã bị bỏ hoang, gây nên những tác ựộng nghiêm trọng về kinh tế - xã hội

Trong số các tác nhân gây bệnh cho tôm, ta thấy vi khuẩn Vibrio spp là

tác nhân phân bố rộng khắp; hầu như chúng ựều xuất hiện trong các môi trường nuôi nước mặn, lợ và gây bệnh phổ biến nhất ở tôm Hệ thống nuôi tôm ựa cấp là một hệ thống nuôi mới, ựược thử nghiệm ở Việt Nam Vậy ựể

xác ựịnh ựược thành phần loài, tỷ lệ nhiễm và mật ựộ của vi khuẩn Vibrio spp

nhiễm trên tôm trong hệ thống nuôi này, tôi tiến hành ựề tài "Nghiên cứu

mức ựộ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon

Fabricius, 1798) nuôi thâm canh trong hệ thống nuôi ựa cấp tại Hải

Phòng"

* Mục tiêu

Xác ựịnh ựược mức ựộ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp trên tôm sú nuôi

thâm canh trong hệ thống nuôi ựa cấp

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số ñặc ñiểm về ñối tượng nghiên cứu

1.1.1 ðặc ñiểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio

ðặc ñiểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm,

hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5x1,4-2,6 µm; chúng không hình thành bào tử và chuyển ñộng nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh

Hình 1.1 Vi khuẩn V parahaemolyticus Hình 1.2 Vi khuẩn V vulnificus

Nguồn: www.khoahoc.com.vn Nguồn: www.golbamboo.com

Hình 1.3 Vi khuẩn V harveyi Hình 1.4 Vi khuẩn V alginolyticus

Nguồn: University of Wisconsin Nguồn: www.soc.nii.ac.jp

1.1.2 ðặc tính phân bố và nuôi cấy

Ngoài tự nhiên vi khuẩn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường

nước biển và vùng nước lợ ven biển; có thể tìm thấy chúng trong các tầng nước, vùi trong trầm tích ñáy hoặc bám trên bề mặt của các sinh vật sống

trong vùng nước ñó Vibrio là vi khuẩn ñặc trưng cho vùng nước biển ấm,

phát triển mạnh ở nhiệt ñộ 20-300C [5]

Trong môi trường nuôi cấy tất cả các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio

ñều cần muối (NaCl) ñể phát triển, nồng ñộ muối cho phép trong môi trường nuôi cấy thường là 1 - 2 %

TCBS là môi trường chọn lọc của các loài vi khuẩn Vibrio, sau 18 - 24h

nuôi cấy hình thành khuẩn lạc với kích thước khoảng 2 – 5mm, có màu vàng

(V cholerae, V alginolyticus, V fluvialis) hoặc xanh (V parahaemolyticus,

V harveyi, V vulnificus)

1.1.3 ðặc tính sinh hóa

Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio ñều yếm khí tuỳ tiện, hầu hết là

oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh

Bảng 1.1 ðặc ñiểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác

nhân gây bệnh ở ñộng vật thuỷ sản [6]

ðặc ñiểm sinh hóa 1 2 3 4 5 6

Chú thích:

1 - Vibrio parahaemolyticus 4 - Vibrio anguillarum

2 - Vibrio harveyi 5 - Vibrio vulnificus

3 - Vibrio alginolyticus 6 - Vibrio salmonicida " + " > 90 % các chủng phản ứng dương

Dịch bệnh xảy ra và những thiệt hại to lớn của nó là ñộng lực thúc ñẩy

sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học và cùng với nhu cầu cấp thiết của nền sản xuất mà trong một thời gian ngắn, hàng loạt các thành tựu nghiên cứu bệnh tôm ñã ñược công bố và áp dụng Dựa vào tác nhân gây bệnh, các nhà khoa học chia ra thành những bệnh chủ yếu: Bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn, bệnh do nấm, bệnh do ký sinh trùng và một số bệnh do các yếu tố vô sinh gây ra ở tôm

Trong số các tác nhân gây bệnh ở tôm nuôi thì vi khuẩn là một trong những tác nhân thường gặp, ñược coi là có ảnh hưởng kinh tế rất lớn tới các trang trại nuôi tôm trên toàn thế giới [49] Trong ñiều kiện ao nuôi có mật ñộ cao, ñầu tư thức ăn lớn, hiện tượng ô nhiễm thường xuyên xảy ra là ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và gây tác hại Theo thống kê của Sindermann và Lighter (1988), các bệnh ở tôm do vi khuẩn gây ra chiếm 45,5% trong tổng số các loại bệnh, trong khi virus chỉ chiếm 25,3%, nấm chiếm 2,7%, ký sinh trùng chiếm 26,5% [24] Bệnh do vi khuẩn chủ yếu là

các bệnh do Vibrio gây ra, chúng ñược báo cáo trong các hệ thống nuôi tôm

trên toàn thế giới gồm có ít nhất 14 loài: Vibrio harveyi, V splendidus, V

parahaemolyticus, V alginolyticus, V anguillarum, V vulnificus, V

campbelli, V fischeri, V damsella, V pelagicus, V orientalis, V ordalii, V mediterrani và V logei [49]

Theo một số tác giả, Vibriosis là bệnh vi khuẩn có liên quan ñến tỉ lệ

chết ở tôm nuôi trên toàn thế giới Sự nhiễm vi khuẩn Vibrio thường xuất hiện

trong các trại sản xuất giống, nhưng dịch bệnh lại hay xảy ra ở ao nuôi tôm [49] Sự bùng phát dịch bệnh có thể xảy ra khi các yếu tố môi trường gây nên

sự nhân lên nhanh chóng mật ñộ vi khuẩn ñã nhiễm ở mức thấp trong máu tôm (Sizemore & Davis, 1985), hoặc do sự xâm nhập của vi khuẩn vào rào

cản vật chủ [49]

Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh Vibrio ở tôm sú (P monodon),

Jiravanichpaisal (1995) cho rằng: Có 2 con ñường xâm nhập của vi khuẩn là xâm nhập vào gan tụy và xâm nhập vào biểu mô phụ Sự xâm nhập theo con ñường gan tụy lại rất mạnh và thường xảy ra ở giai ñoạn ấu trùng và tôm giống, trong khi ñó sự xâm nhập theo ñường biểu mô phụ xảy ra chủ yếu trên tôm trưởng thành [22]; vì ở giai ñoạn tôm trưởng thành, hoạt ñộng kháng khuẩn có thể mạnh ở ống gan tụy [38] Theo Anderson (1988) khi bề mặt cơ

thể tôm bị tổn thương sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Vibrio xâm nhập

qua con ñường này [13]

Khi nghiên cứu về bệnh do Vibrio trong các trại sản xuất tôm giống,

Adam (1991) và nhiều tác giả khác cho rằng: Tôm ấu trùng và hậu ấu trùng khi bị nhiễm khuẩn nặng có thể gây hiện tượng phát sáng và chết hàng loạt [12], [25] Lightner và cộng sự (1996) cũng ñã thông báo, trong số các bệnh gây ra ở ấu trùng tôm, bệnh phát sáng là bệnh nhiễm trùng toàn thân và gây thiệt hại lớn nhất, hiện tượng phát sáng trong bóng tối là dấu hiệu ñặc thù của bệnh này [27], [33] Còn theo Tonguthai (1995), ấu trùng tôm bị bệnh phát sáng thì cơ thể trở nên yếu ớt, chuyển màu trắng nhợt và lắng xuống ñáy, tỷ lệ chết có thể lên tới 100% trong 1 ñến 2 ngày, khi bệnh phát sáng xuất hiện

trong trại sản xuất thì việc ngăn ngừa giữa các bể ương nuôi là rất khó khăn

và có thể ñợt sản xuất ñó bị thất bại hoàn toàn [39] Tiến hành giải phẫu ấu trùng tôm bị nhiễm bệnh phát sáng và quan sát dưới kính hiển vi cho thấy vi khuẩn nhiễm dày ñặc trong khoang máu của ấu trùng phát quang ñã gần chết [30] Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú,

Baticados (1988) và nhiều tác giả khác ñều có chung nhận ñịnh: V harveyi

ñược coi là vi khuẩn chủ yếu gây ra bệnh phát sáng [14], [17], [33] Tác nhân

gây bệnh V harveyi tồn tại tự nhiên trong môi trường nước biển, ở ñó có thể

tìm thấy chúng trong những thành viên bậc thấp [35] Khi bệnh phát sáng xảy

ra trong bể ương ấu trùng tôm, số lượng vi khuẩn Vibrio tăng dần theo thời

gian Tuy vậy, Lightner (1996) cho rằng ấu trùng tôm sú có thể bị phát sáng

khi nhiễm ở mật ñộ cao các loại vi khuẩn V harveyi, V parahaemolyticus và

V vulnificus [26] Theo de la Pẽna và ctv (2001), vi khuẩn gây bệnh phát sáng

V harveyi ñã gây ra tỉ lệ chết cao trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở

Philippin và là loài hiện diện trong ao nuôi với tỷ lệ rất cao, chiếm 65,5% (trích từ [19]) Liên quan tới tần số xuất hiện Vibriosis trên tôm nuôi tại một

số trang trại ở Ấn ðộ, theo Otta và ctv (2000) thì V alginolyticus chiếm tỉ lệ cao nhất từ 7,8% ñến 50%, sau ñó là V harveyi 13% - 23%, V parahaemolyticus 6,6% - 11,5% và một số loài khác [37]

Khi nghiên cứu về khả năng gây bệnh do vi khuẩn Vibrio trên tôm, nhiều tác giả ñã khẳng ñịnh hầu hết vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh thứ

cấp Theo Lightner (1998), cơ thể tôm có khả năng ñề kháng với vi khuẩn

Vibrio, cho nên ngay cả trên tôm khỏe vẫn tồn tại một lượng vi khuẩn này,

chúng chờ cơ hội ñể tăng số lượng và ñộc lực gây bệnh cho tôm [28] Các nghiên cứu về bệnh tôm ở Châu Á cho thấy có sự kết hợp giữa vi khuẩn

Vibrio với các tác nhân khác như virus, ký sinh trùng gây tác hại tổng hợp trên tôm [16], [23] Theo Chanratchakool (1995), vi khuẩn Vibrio là tác nhân

cơ hội tấn công vào tôm nuôi khi tôm bị nhiễm virus ựốm trắng, nghiên cứu mẫu bệnh phẩm thì ngoài việc tìm thấy các tiểu thể virus còn có một số lượng

lớn vi khuẩn Vibrio [15]

Theo nhiều báo cáo nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn Vibrio nhiễm trên

tôm ở Châu Á thì dịch bệnh ngày càng trở nên phổ biến ở các trang trại nuôi tôm thuộc các quốc gia này; Theo Daud (1992), mầm bệnh vi khuẩn phổ biến

nhất trên tôm he ở Philippine là V ordalii, V anguillarum, V vulnificus, V harveyi và V splendilus [18] Theo Kou và ctv, ở đài Loan những loài vi khuẩn Vibrio ựược tìm thấy gồm: V tubiashii, V anguillarum, V harveyi, V mereis hoặc V damsela (trắch từ [23]) Ruangpan và Kitao (1991) ựã phân lập

và xác ựịnh ựược 5 loài Vibrio (V parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V fluvialis và Vibrio spp) từ tôm sú bị bệnh nuôi ở Thái Lan [32] Nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn Vibrio trong tự nhiên cho thấy, một lượng ựáng kể vi khuẩn Vibrio tồn tại trong nước biển, trong các bể ương

ấp và ựặc biệt là trong ruột tôm bố mẹ Trong ruột tôm bố mẹ, vi khuẩn Vibrio

có thể nhiễm với mật ựộ 2x109 cfu/g, chiếm từ 63 - 67% và khoảng 16 - 18%

trong tổng số vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh phát sáng [31] Theo Ruangpan (1995) cho rằng, số lượng vi khuẩn Vibrio tồn tại và phát triển

trong bể ấp và ao nuôi phụ thuộc vào mật ựộ nuôi, ao nuôi tôm mật ựộ cao thì

số lượng vi khuẩn này luôn cao hơn so với ao nuôi mật ựộ thấp [34]

Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho tôm

nuôi, chúng là vi khuẩn cơ hội vì bình thường chúng luôn tồn tại trong môi trường ương nuôi Khi ựiều kiện sống có những thay ựổi bất lợi như các yếu

tố về khắ hậu, môi trường, dinh dưỡng hoặc do mắc các bệnh gây trạng thái

ỘstressỢ làm giảm sức ựề kháng của tôm nuôi, lúc ựó chúng mới tấn công gây nên bệnh Theo Lavila-Pitogo (1995), bệnh vi khuẩn ở tôm nuôi luôn xuất hiện cùng với những quá trình bệnh lý khác hoặc phản ánh hậu quả của việc

phá vỡ cân bằng sinh thái trong bể hoặc ao nuôi [30] Theo Chanratchakool

(1995), tôm nuôi trước khi cảm nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio ñã có sự thay ñổi

màu sắc tự nhiên sang màu ñỏ, ñiều ñó chứng tỏ là tôm nuôi bị “stress” Sự suy giảm môi trường ao nuôi ñóng một vai trò quan trọng trong việc gây

“stress” của tôm, dẫn ñến vi khuẩn Vibrio nhiễm thứ phát [15]

ðể giảm thiểu tác hại của các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm

nuôi, người ta ñã sử dụng một số loại hóa chất và thuốc kháng sinh trong công tác phòng trị bệnh Hóa chất thường ñược sử dụng rộng rãi là Chlorin A, tuy nhiên chúng luôn có tác dụng hai mặt; theo Pitogo (1995) Chlorine chỉ có tác dụng kìm hãm vi khuẩn ở nồng ñộ 15 - 30 ppm và vi khuẩn xuất hiện lại trong

12 giờ sau khi ngừng khử trùng bằng Chlorine [30]; ngoài ra khi sử dụng Chlorin còn kích thích sự phát triển của gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn và tiêu diệt tảo [43]

Một số loại kháng sinh ñã ñược sử dụng nhiều trong các trại nuôi tôm trên thế giới như Chloramphenicol, Furazolidone, Oxytetracycline và Streptomycin Tuy nhiên việc sử dụng thuốc kháng sinh chỉ có hiệu quả trước mắt nhưng ñể lại hậu quả về hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, ñồng thời thị trường tiêu thụ của một số nước nhập khẩu không chấp nhận do sự tồn

dư thuốc trong sản phẩm dẫn ñến sự ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng Nhằm hạn chế nhược ñiểm của thuốc kháng sinh, ñã có một số nghiên cứu với nhiều giải pháp thay thế như: Dùng chế phẩm sinh học ñể bổ sung vào ao nuôi hoặc vào thức ăn cho tôm ñược cho là rất an toàn và có hiệu quả Theo David (1999), tôm nuôi ở một số nông trại thuộc Negros – Philippines

ñã bị bệnh do vi khuẩn phát sáng Vibrio, thay vì sử dụng kháng sinh người ta

ñã bổ sung vi khuẩn có ích vào ao nuôi tôm và kết quả cho thấy số lượng lớn

vi khuẩn phát sáng giảm khi bổ sung dòng chọn lọc Bacillus [43] Hoặc thử nghiệm bổ sung probiotic Arthrobacter XE – 7 vào thức ăn cho tôm chân

trắng (Penaeus vannamei), sau ñó cảm nhiễm V parahaemolyticus bằng cách

tắm, kết quả cho thấy tỉ lệ chết của tôm giảm ñáng kể so với lô ñối chứng [47] Hiện nay một số nước Châu Á như Philippin, Trung Quốc, Việt Nam ñã

sử dụng chế phẩm sinh học như một chất không thể thiếu ñể bổ sung vào thức

ăn hoặc cho vào môi trường ao nuôi nhằm phòng và trị bệnh do Vibrio gây ra

trên tôm, hiệu quả là giảm thiểu bệnh xảy ra và tăng tỉ lệ sống cho tôm, một

số chế phẩm sinh học ñược sử dụng: ES 2A Aquakit, EMS, Bio - DW

Việc nghiên cứu sử dụng các chất kích thích hệ miễn dịch cho tôm cũng ñã ñược quan tâm như: Felix, Herald Robins và Rajeev (2004) với việc

thử nghiệm nâng cao khả năng miễn dịch của tôm sú (P monodon) ñối với vi khuẩn V parahaemolyticus bằng cách sử dụng các hợp chất chiết xuất từ một loại tảo biển (Sargassum wightii) phối hợp vào thức ăn cho tôm, kết quả cho

thấy tôm có khả năng miễn dịch cao (tỉ lệ sống 83%), ñây là nghiên cứu mở ñầu ñể sử dụng nguồn thực vật tự nhiên dồi dào ở biển thay thế cho một số chất kích thích miễn dịch ñược lấy từ ñộng vật (trích từ [45]) Chen (2008) ñã

thử nghiệm dùng các hợp chất chiết xuất từ cây cỏ biển (Chondrus crispus) ñể tiêm cho tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei), sau ñó cảm nhiễm V alginolyticus lên tôm, kết quả cho thấy tôm có khả năng miễn dịch với loại vi

khuẩn này [48]

Ngoài ra, người ta cũng ñã nghiên cứu các hình thức nuôi ghép ñể hạn

chế mật ñộ vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm như: Eleonor A Tendencia (2007) nuôi ghép tôm sú (P monodon) với vẹm hoặc hầu ñã làm giảm mật ñộ

vi khuẩn phát sáng V harveyi; thí nghiệm của ông chỉ ra rằng khi nuôi ghép vẹm xanh (Perna viridis), vẹm nâu (Perna indica) hoặc hàu (Crassostrea sp)

với tôm sú theo mật ñộ phù hợp ñã làm giảm mật ñộ vi khuẩn phát sáng trong

ao từ 104 cfu/ml xuống còn 101 cfu/ml, ngoài ra ñộng vật thân mềm còn góp phần làm sạch môi trường ao nuôi [44]

Năm 2003, Lý Thị Thanh Loan ñã nghiên cứu một cách có hệ thống

các vi sinh vật gây bệnh quan trọng như nhóm Vibrio, MBV, WSSV trên tôm

sú nuôi ở các mô hình khác nhau tại các tỉnh ðBSCL Khi xác ñịnh tần số xuất hiện của Vibriosis trong các hệ thống nuôi, kết quả cho thấy các loài gây

bệnh thường gặp gồm: V parahaemolyticus, V harveyi và V alginolyticus

chiếm tỉ lệ cao hơn hẳn những loài khác trong các mẫu phân tích [3]

Nghiên cứu về bệnh Vibriosis ở tôm thì theo một số tác giả, những loài

gây bệnh cho tôm là: Vibrio parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus, V splendidus, V alginolyticus, V anguilarum và V damsela gây bệnh phát

sáng, ñỏ thân và ăn mòn vỏ ki tin Những loài này thường là tác nhân cơ hội; khi tôm bị sốc do môi trường biến ñổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, ký sinh trùng thì chúng sẽ tấn công gây bệnh, làm tôm chết rải rác tới hàng loạt Tôm bị bệnh phát sáng thường biểu hiện yếu, lờ ñờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục; bệnh xảy ra ở trong các trại giống tác hại thường lớn, ñặc biệt ở các giai ñoạn tiền

ấu trùng như Zoea, Mysis Nếu bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, có thể làm tôm

ấu trùng chết hàng lọat, tỷ lệ chết có thể lên ñến 100% trong bể ấp do sự nhiễm khuẩn toàn thân; ñặt ấu trùng bị phát sáng lên kính hiển vi ở ñộ phóng ñại > 400X có thể quan sát thấy từng ñám vi khuẩn ñang họat ñộng chiếm chỗ

ở một số nội quan như: máu, gan tụy, mang Bệnh phát sáng thường gây tác

hại lớn ở giai ñoạn ấu trùng và hậu ấu trùng, giai ñoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng nhưng tác hại thấp hơn Từ mẫu tôm bị phát

sáng, người ta ñã phân lập ñược V harveyi, V vulnificus, và V parahaemolyticus [5]

Theo Bùi Quang Tề (2003), tôm nuôi ngoài ao khi bị bệnh do Vibrio thì

có hiện tượng: Nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo ñàn bơi lòng vòng Tôm ở trạng thái hôn mê, lờ ñờ, kém ăn hoặc bỏ ăn Có sự biến ñổi màu ñỏ hay màu xanh,

vỏ mềm và xuất hiện các vết hoại tử, ăn mòn trên vỏ, các phần phụ bị mòn

gẫy hoặc cụt dần; ông cho rằng tác nhân gây ra là do các loài V parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus, V anguillarum Còn ở tôm sú

ấu trùng V alginolyticus gây ra bệnh ñỏ thân, với các dấu hiệu xuất hiện các

ñiểm ñỏ ở gốc râu, vùng ñầu ngực, thân và các phần phụ của ấu trùng [4]

Trong các hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể

theo một số con ñường: Nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ, tôm giống và thức ăn tươi sống hoặc chúng có thể nằm sẵn trên thành bể, dưới ñáy ao

Trong bể ương ấu trùng thì mật ñộ Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng ñáy cao hơn tầng mặt, do ñó khi xiphông tầng ñáy có tác dụng giảm mật ñộ Vibrio

trong bể ương [5]

Xác ñịnh mức ñộ nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio trên tôm thông qua

ñịnh lượng, ðỗ Thị Hòa và ctv (1994-1995) ñưa ra các thông số [4]:

Tôm ấu trùng: Tôm khỏe trung bình nhiễm 358 khuẩn lạc/cá thể, tôm bệnh trung bình nhiễm 3.255 khuẩn lạc/cá thể

Tôm giống: Tôm khỏe trung bình nhiễm 3.008 khuẩn lạc/cá thể, tôm bệnh trung bình nhiễm 14.450 khuẩn lạc/cá thể

Nhằm hạn chế tác hại của bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm nuôi,

các tác giả ñã khuyến cáo việc áp dụng các biện pháp phòng trị thích hợp như:

ðể phòng bệnh, cần áp dụng biện pháp phòng bệnh tổng hợp như sát trùng ao

bể, dụng cụ, nguồn nước, tôm bố mẹ, rửa trứng hoặc rửa Nauplius, thức ăn tươi sống bằng các thuốc diệt khuẩn như: Benzalkonium chloride (BKC), Iodine, Formalin Ngoài ra cần thường xuyên xiphông, thay nước ñể loại bỏ các chất hữu cơ trong ao bể nuôi, quản lý thức ăn tốt, dùng chế phẩm vi sinh

(Probiotic), bổ sung các loại vitamin ñể tăng cường khả năng miễn dịch của tôm [4], [5] ðể trị bệnh do Vibrio gây ra trên tôm thì các tác giả ñã ñưa ra 2

giải pháp: (1) Dùng thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulphamid, Oxytetracyline, Erythromycin trộn vào thức ăn ñể diệt vi khuẩn cảm nhiễm bên trong cơ thể tôm (2) Giảm mật ñộ vi khuẩn trong nước và cải thiện ñiều kiện môi trường bằng một số biện pháp kỹ thuật như xiphông và thay nước ñáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn như trên, sau ñó thay một phần nước trong ao, gây lại màu nước Tuy nhiên, họ cũng cho rằng, ở giai ñoạn tôm tiền ấu trùng và hậu

ấu trùng, do sức chịu ñựng của chúng với thuốc rất kém và khi bệnh ñã xảy

ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp ñã bỏ ăn, do vậy dùng thuốc khó khăn

và ít có hiệu quả [4], [5]; ngoài ra việc sử dụng thuốc kháng sinh hiện nay ñã bộc lộ nhiều nhược ñiểm, ñó là tạo sự kháng thuốc và tồn dư thuốc trong sản phẩm

ðể hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong công tác phòng trị bệnh cho tôm nuôi, ñã có nhiều công trình nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thay thế: như

sử dụng Ozon giúp làm giảm mật ñộ vi khuẩn Vibrio trong bể ương nuôi ấu trùng và tăng tỷ lệ sống cho tôm [41] Phòng và trị bệnh Vibrio spp bằng thảo

dược cho tôm ñược coi là một cách an toàn và hiệu quả có thể thay thế kháng sinh như: Ekavarin, Microcin Dùng dịch chiết từ lá trầu không, với tên thương mại là chế phẩm sinh học Bokashi ñể phòng và trị một số bệnh do vi

khuẩn gây ra trên tôm, trong ñó có vi khuẩn Vibrio spp cho hiệu quả tốt [40]

1.3 Mô hình nuôi tôm thâm canh ña cấp

Lịch sử của nghề nuôi tôm sú (Penaeus monodon) trên thế giới nói chung,

ở Việt Nam nói riêng ñã có từ lâu ñời: Từ hình thức nuôi ñơn giản là nuôi quảng canh, rồi ñến quảng canh cải tiến, sau ñó là bán thâm canh và thâm canh Thực tế cho thấy các mô hình này thường ẩn chứa nhiều rủi ro, ñặc biệt là dịch bệnh Năm 2003, Wetstone và cộng sự ñã có những phân tích, ñánh giá về các yếu tố làm cho nghề nuôi tôm ở Mỹ cũng như một số nước khác trên thế giới gặp nhiều khó khăn, trong ñó ông nhấn mạnh yếu tố dịch bệnh và chất lượng môi trường suy giảm ðồng thời tác giả cũng ñề xuất ý tưởng về một số giải pháp nhằm hạn chế các mối nguy này, trong ñó tập trung nhiều về vấn ñề ñổi mới công nghệ nuôi Ông cho rằng: Việc nuôi tôm theo giai ñoạn khác nhau và bằng phương pháp lưu thông hoặc tuần hoàn khép kín sẽ làm giảm ñáng kể những rủi ro nói trên [20] Trước ñó, năm 2000 Wang và Leiman (2000) cũng ñã giới thiệu hệ thống nuôi tôm he thương phẩm ña giai ñoạn, trong ñó khi chuyển từ một giai ñoạn sang giai ñoạn tiếp theo thì mật ñộ tôm

sẽ thay ñổi theo kích cỡ sinh trưởng; qua quá trình nghiên cứu, lựa chọn số giai ñoạn tối ưu cho chu kỳ sản xuất và dùng những dữ liệu giá trị ñể chứng minh, tác giả cho rằng hiệu quả tối ưu có thể ñạt ñược trong hầu hết các trường hợp dùng hệ thống nuôi hai giai ñoạn, bao gồm giai ñoạn ương giống

và giai ñoạn thương phẩm [21] Năm 2005, nhóm tác giả ñã giới thiệu cấu tạo mạng của một mô hình chương trình tối ưu cho hệ thống nuôi tôm ña cấp dựa trên giả thuyết thu hoạch tối ưu cho một ñơn vị sản xuất; họ ñã áp dụng mô hình này cho nuôi tôm ở Hawaii với 40 ao (mỗi ao 0,4 ha) và hoạt ñộng tối ưu ñược thực hiện trong toàn bộ một năm sản xuất, mô hình hoạt ñộng ñã làm tăng tổng sản lượng 5% so với mô hình thông thường [36]

Tại Việt Nam, nuôi tôm sú thâm canh chủ yếu theo quy trình công nghệ

ít thay nước và nuôi một giai ñoạn (một cấp), năng suất 4 - 6 tấn/ha/vụ khá phổ biến ở ba miền Bắc Trung Nam [7], [9], [10] Ưu ñiểm của công nghệ này

là một năm nuôi một vụ chính từ tháng 4 - 9 ít bị rủi ro, còn nuôi vào thời gian khác gặp rất nhiều rủi ro do thời tiết và những yếu tố môi trường khác Dựa trên các thông tin ñã công bố ở nước ngoài về hiệu quả của mô hình nuôi thâm canh tôm chân trắng trong hệ thống ña cấp Năm 2008, Bùi Quang Tề và cộng sự ñã ñề xuất mô hình nuôi tôm sú thâm canh theo hình thức ña cấp tại trạm nghiên cứu Hải sản nước lợ Tân Thành - Dương Kinh - Hải Phòng [7]

Hình 1.5 Các mô hình nuôi tôm sú ña cấp ( mô hình 1 cấp và 2 cấp)

Hình 1.6 Các mô hình nuôi tôm sú ña cấp ( mô hình 3 cấp)

Với quy trình nuôi tuần hoàn khép kín, nước nuôi tôm ñược tái sử dụng qua các hệ thống xử lý, lắng, lọc bằng các biện pháp cơ học, vi sinh vật và vi tảo ñể tạo ra nguồn nước an toàn sinh học bổ sung cho ao nuôi tiếp theo Thiết

bị và hệ thống ao nuôi, ao xử lý ñáp ứng ñược yêu cầu của quy trình công nghệ Hệ thống ao nuôi các cấp ñược xây dựng phù hợp về diện tích và kiên

cố ñể các ao hoạt ñộng liên tục trong năm

Mô hình nuôi một cấp (mô hình truyền thống – không chuyển ao) ñược lấy làm mô hình ñối chứng so với mô hình nuôi 2 cấp và 3 cấp Mỗi chu kì nuôi kéo dài 120 ngày, ở mô hình nuôi 2 cấp, tính từ thời gian sau khi tôm thả

40 ngày thì chuyển sang ao nuôi cấp 2, sau 80 ngày nuôi thì thu hoạch Còn ñối với mô hình nuôi 3 cấp, tôm sẽ ñược luân chuyển 3 lần trong một chu kì nuôi, nghĩa là cứ sau 40 ngày chuyển tôm sang ao tiếp theo Ao nuôi trước và sau khi chuyển tôm ñều ñược cải tạo ñạt yêu cầu Vì vậy có thể ñược nuôi lặp lại nhiều lần trong một năm nên vụ thu hoạch tăng lên và có thể rải ra các tháng trong năm, giải quyết ñược sức ép của nhu cầu thị trường và tổ chức lao ñộng ðồng thời giải quyết cho tất cả các ao trong hệ thống ñều ñược hoạt ñộng nuôi tôm phù hợp với các yếu tố sinh học và kinh tế Ngoài ra, do mô hình nuôi ñã áp dụng việc luân chuyển tôm nuôi từ ao theo cấp, sau mỗi giai ñoạn nuôi chất lượng môi trường nước suy giảm nên việc luân chuyển tôm sang các ao mới ñã qua xử lí, san thưa mật ñộ kết hợp với việc sử dụng chế phẩm vi sinh ñể cải thiện môi trường trong quá trình nuôi có thể góp phần hạn chế dịch bệnh xảy ra trên tôm

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, ựịa ựiểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian: Từ tháng 4 ựến tháng 10/2010

2.1.2 địa ựiểm nghiên cứu

- Thu mẫu tôm ở hệ thống nuôi ựa cấp tại trạm nghiên cứu Hải sản nước lợ Tân Thành - Dương Kinh - Hải Phòng

- Phân tắch mẫu tại Phòng Sinh học Thực nghiệm - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I - đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh

2.2 Vật liệu nghiên cứu:

Tôm sú (Penaeus monodon)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Dựa vào phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá và ựộng vật thuỷ sản của Frerichs và Millar (1993), Nicky B Buller (2004)

Hình 2.1 Sơ ựồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn

Tách gan tụy

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

- Sử dụng chài thu ở các ñiểm khác nhau trong ao ñể thu tôm nhằm ñảm bảo tính ñại diện của mẫu

- Cho tôm vào túi nilon có bơm oxy, ghi rõ nhãn tôm thu từ các mô

hình nào trong hệ thống ña cấp và vận chuyển về phòng thí nghiệm Sau khi chuyển về phòng thí nghiệm, mẫu tôm ñược phân tích trong vòng 24h kể từ lúc có mẫu Yêu cầu tất cả các dụng cụ chứa mẫu phải khô, sạch, ñã ñược khử trùng, và kín ñể tránh sự lây nhiễm làm hư hỏng mẫu trong quá trình vận chuyển

- Số mẫu thu: Mỗi mô hình nuôi thu 25 con tôm, ñịnh kỳ 30 ngày thu 1 lần

- Tách lấy gan tụy của tôm ñem nuôi cấy, phân lập

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

* Nuôi cấy vi khuẩn:

- Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống cho 9ml nước muối 2%

- Thực hiện việc ñồng nhất mẫu: Dùng bộ ñồ giải phẫu ñã ñược khử trùng, tách lấy gan tụy của tôm ñể cân và cho vào cối sứ, dùng chày nghiền nhỏ mẫu, có thể cho thêm 1 - 2 ml nước muối 2% ñể nghiền

- Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với ñầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối 2% Trộn mẫu trong ống nghiệm cho ñồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dùng pipet hút ñảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần Dung dịch mẫu này có ñộ pha loãng 10-2 Sau ñó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetmen có cùng ñầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tự ñể có dịch mẫu với ñộ pha loãng 10-3, 104, 105

- Dùng pipet hút 0,1 ml dung dịch ñã ñược pha loãng trang trên ñĩa môi trường TCBS, mỗi hệ số pha loãng cấy trên 2 ñĩa

- Cấy xong nuôi trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 28 – 300C trong 24h

- Sau 24h, kiểm tra hình dạng, màu sắc, kích thước và ñếm số lượng khuẩn lạc

* Nuôi cấy thuần chủng:

- Mở ñĩa phân lập có khuẩn lạc nghi ngờ bên cạnh ngọn lửa ñèn cồn

- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ

- Cấy lên ñĩa thạch Nu Agar 2% NaCl

- Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 28 - 300C trong 24h

* Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn:

ðể nghiên cứu hình thái vi khuẩn, người ta dùng phương pháp nhuộm gram Nhuộm gram tiến hành như sau:

- Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn thuần ñưa lên lam kính, cho thêm

1 ñến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng ñầu que cấy dàn mỏng

- ðể mẫu tự khô ở nhiệt ñộ phòng

- Hơ cao lam kính trên ngọn lửa ñèn cồn ñể cố ñịnh vi khuẩn

- Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tím tinh thể) lên tiêu bản, ñể yên 30-60 giây

- Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) ñể cố ñịnh trong 1 phút (tiêu bản có màu ñen)

- Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 3 (Cồn Aceton) ñể nghiêng ñầu một bên lam ñể cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu

- Rửa nước nhanh, vẩy khô

- Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) ñể cố ñịnh 1 ñến 2 phút

- Rửa nước, ñể khô hoặc dùng giấy thấm khô, không ñược ñể xước mẫu

- Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (ñộ phóng ñại x1000)

Dưới kính hiển vi ta có thể xác ñịnh ñược vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gram dương bắt màu xanh tím

* Phương pháp kiểm tra các ựặc ựiểm sinh hóa của vi khuẩn:

- Thử ựặc ựiểm sinh hóa bằng các phản ứng sinh hóa thường:

+ Thử phản ứng lên men và ôxy hóa của vi khuẩn bằng phản ứng O/F Cấy vi khuẩn thuần vào 2 ống nghiệm có môi trường O/F (màu xanh), một ống hở và một ống kắn ựược phủ bằng dầu paraffin trên mặt dầy 1 cm Nuôi vi khuẩn trong thời gian 18 - 24h ở nhiệt ựộ phòng, sau ựó ựọc kết quả:

Lên men: Ống hở và ống kắn có màu vàng

Oxy hóa: Ống hở màu vàng, ống kắn màu xanh

Không oxy hóa và lên men: Cả hai ống màu xanh

+ Thử thạch sắt 3 ựường (TSI)

Cấy vi khuẩn thuần trên bề mặt thạch nghiêng môi trường TSI hoặc KIA (màu ựỏ) và từ giữa mặt thạch cấy một ựường thẳng ựứng xuống ựáy Nuôi cấy vi khuẩn sau 18 - 24 giờ ở nhiệt ựộ phòng, ựọc kết quả:

Chỉ lên men ựường Glucose: đáy ống màu vàng (acid - A); phần nghiêng màu ựỏ (kiềm - K) K/A (ựỏ/vàng)

Lên men cả 3 ựường glucose, lactose và sucrose: đáy và phần nghiêng ựều màu vàng (acid - A) A/A (vàng/vàng)

Lên men ựường lactose hoặc sucrose: Phần nghiêng màu vàng (acid), ựáy ống màu ựỏ (kiềm) A/K (vàng/ựỏ)

Không lên men cả 3 loại ựường: đáy và phần nghiêng màu ựỏ (kiềm) K/K (ựỏ/ựỏ)

Môi trường rạn nứt là sinh hơi

đáy ống có màu ựen là sinh H2S

+ Phản ứng indol

Cấy vi khuẩn thuần trong nước tryptone, nuôi cấy vi khuẩn trong 24 -

48 giờ ở nhiệt ựộ phòng Nhỏ 0,2 - 0,3 ml thuốc thử KovacỖs vào 5ml môi trường ựã nuôi cấy vi khuẩn, ựọc kết quả:

Bề mặt môi trường có vòng màu ñỏ là vi khuẩn sinh indol - dương tính Môi trường có màu vàng là vi khuẩn không sinh indol - âm tính

- Thử phản ứng sinh hoá bằng kít thử API - 20 E:

Khi ñược vi khuẩn thuần, tiến hành pha loãng vi khuẩn thành dung dịch

ở dạng huyền phù ñể thử phản ứng sinh hoá

Nguyên lý

Phương pháp này dùng 21 tiêu chuẩn thử sinh hóa cho phép ñịnh tên

một số loài vi khuẩn hình que, gram âm và thuộc họ Enterobacteriaceae

Kít thử API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền ñã khử nước Trong quá trình ủ, hoạt ñộng của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm ñục môi trường Sau 24h ñọc các phản ứng ñối chiếu theo bảng kết quả ñể ñịnh tên

+ Kít thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phẩm

+ Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường chọn lọc Sau ñó tiến hành

chọn khuẩn lạc ñể nuôi thuần; sau 24 giờ nuôi cấy, lấy vi khuẩn thuần ñể pha

loãng thành dịch huyền phù bằng 5ml NaCl 2%

Chuẩn bị ủ

+ Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho ñầy vào các ống

OF-F OF-O ONPG ADH LDC OCD CIT H 2 S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA

3

4