Nghiên cứu khả năng phòng chống vi khuẩn moraxella catarrhalis gây viêm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo docynia

Năm 2010, nhóm tác giả đã có những nghiên cứu sơ bộ với kết quả khả quan về tác dụng kháng khuẩn của dịch lên men quả táo mèo đối với M.. Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰNHIÊN

DƯƠNG THỊ PHƯƠNG

KHUẨN Moraxella catarrhalis GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ

QUẢTÁO M ÈO Docynia

2

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

thành tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật học, trường

ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Người đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội.Trong quá trình làm luận văn, tôi đã luôn nhận được sự chỉ bảo trực tiếp và được tạo điều kiện thuận lợi nhất

Đồng thời, tôi chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo tại khoa Sinh học nói chung và bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia

Hà Nội nói riêng đã tận tình dạy dỗ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và toàn thể các bạn trong nhóm.Những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập

Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2015

Học viên

Dương Thị Phương

3

MỤC LỤC

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 5

1.2.2.Vai trò của M.catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 5 1.2.3 Tính kháng kháng sinh của M catarrhalis 8

4

2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học - OD 23 2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn

23

2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và giấm táo mèo 24 2.2.8 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn

26

3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN

QUẢ TÁO MÈO

30

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 32

3.2.3 Một số đặc điểm sinh học của chủng TM5.2 35 3.3 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƯỞNG VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

5

3.3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủngTM5.2 42 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO

VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN

51

3.5.1.Hoạt tính kháng khuẩn của cao dịch chiết táo mèo 51 3.5.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 51 3.5.3 Sắc ký bản mỏng các phân đoạn kháng khuẩn của dịch lên men chủng TM5.2 và dịch chiết táo mèo

6

BẢNG MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethylcellulose

7

DANH SÁCH BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ

Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính 7

Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M.catarrhalis 9

Bảng 1.4: So sánh bacteriocin và chất kháng sinh 13

Hình 3.1: Vòng vô khuẩn của dịch chiết táo mèo nguyên chất với

M.catarrhalis

30

Bảng 3.1: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo 31

Bảng 3.2: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của 4 chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 lên các chủng vi khuẩn

kiểm định

33

Hình 3.2: Vị trí phân loại của chủng TM5.2 với các loài quan hệ họ hàng gần 35 Bảng 3.4: Một số đặc điểm sinh học của chủng TM5.2 36 Hình 3.3: Quan sát bào tử chủng TM5.2 dưới kính hiển vi quang học (A) và

kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (B)

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và

hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2

42

Bảng 3.11: Hoạt tính kháng sinh của dịch chiết từ sinh khối 43 Hình 3.6: Hoạt tính kháng sinh của dịch chiết từ sinh khối với 8 loại dung

môi

44

Hình 3.7: Hoạt tính kháng sinh của dịch ngoại bào 45 Hình 3.8: Hoạt tính kháng sinh từ dịch chiết ngoại bào 45

Hình 3.9: Khả năng bền của kháng sinh với nhiệt độ 47 Hình 3.10: Hoạt tính kháng sinh khi xử lý ở các mức nhiệt độ và thời gian

Hình 3.14: Sơ đồ tách chiết chất kháng sinh từ chủng TM5.2 50

Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của cao dịch

chiết táo mèo tại các nồng độ khác nhau

51

Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của các phân

đoạn từ dịch chiết táo mèo

52

Bảng 3.15: Kết quả thử định tính các nhóm hợp chất của dịch chiết quả táo

mèo và các phân đoạn

53

Hình 3.16: Vòng vô khuẩn với M.catarrhaliscủa các mẫu giấm táo mèo lên

men tự nhiên sau 5 tháng

57

10

MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số

10 bệnh lý nhiễm khuẩn ở các nước có thu nhập thấp Chương trình toàn cầu về phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã được WHO phát động, tại Việt Nam chương trình này đã được triển khai từ năm 1984 Kiểm soát và phòng chống bệnh được ưu tiên hàng đầu tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, nhưng đã

và đang chịu tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

Bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đường hô hấp trên

và nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm phần lớn so với các bệnh về hô hấp khác, là bệnh thường gặp, mắc hàng năm, theo mùa nhưng có thể gây nhiều biến chứng nặng như viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đường hô hấp trên có thể lây nhiễm xuống đường hô hấp dưới gây viêm khí, phế quản và viêm phổi nặng.Có thể thấy bệnh gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, người già và gây thiệt hại kinh tế

Moraxella catarrhalis là căn nguyên gây ra phần lớn các trường hợp mắc

bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt hiện nay được coi như tác nhân gây bệnh viêm

tai giữa phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae Trong khi đó M catarrhalis hiện đã kháng lại hầu hết các chất kháng sinh thuộc

nhóm beta-lactam, chỉ còn nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 2, 3 và ciprofloxacin

thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh của M catarrhalis nói riêng, các

vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đã và đang đem đến gánh nặng kinh tế,

xã hội trong việc thay thế kháng sinh thế hệ cũ bằng kháng sinh thế hệ mới đắt tiền Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học hiện đại đem lại một triển vọng lớn cho nền Y học khi tìm kiếm thêm những hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng và điều trị bệnh trên Các hợp chất này góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn

Độ, Myanma, tại Việt Nam tập trung ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu

và Lâm Đồng Năm 2010, nhóm tác giả đã có những nghiên cứu sơ bộ với kết quả

khả quan về tác dụng kháng khuẩn của dịch lên men quả táo mèo đối với M Catarrhalis- gây bệnh đường hô hấp ở người Các nghiên cứu này, đã mở ra một

hướng nghiên cứu mới cũng như định hướng ứng dụng của dịch lên men quả táo mèo trong việc hỗ trợ và nâng cao thể trạng cho con người Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ vai trò chủ đạo của các tác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt là công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên đã kháng kháng sinh thông dụng, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng phòng chống vi khuẩn Moraxella catarrhalis gây viêm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo Docynia”

12

Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI

Nhiễm khuẩn hô hấp là tình trạng một hoặc một số bộ phận thuộc bộ máy

hô hấp bị viêm nhiễm do vi khuẩn hoặc virut gây ra

Về phương diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn

hô hấp trên và nhiễm khuẩn hô hấp dưới

Nhiễm khuẩn hô hấp trên không phải là một bệnh lý riêng biệt mà gồm nhiều bệnh lý (các bệnh tai mũi họng) như:

Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp dưới được coi là bệnh cảnh nặng nhưng trên thực

tế bệnh chiếm tỷ lệ thấp và không dễ mắc Trong khi đó nhiễm khuẩn hô hấp trên là chứng bệnh thường gặp hàng năm, mắc tái diễn theo mùa, tái mắc nhiều lần trong năm, dễ gây biến chứng nặng nề và chiếm tỷ lệ lớn so với các bệnh về hô hấp khác Theo thống kê của các tổ chức y tế Hoa Kỳ, trung bình người trưởng thành có thể bị viêm đường hô hấp trên khoảng 2 - 4 lần mỗi năm và con số này cao hơn rất nhiều ở trẻ em, trong đó trẻ có thể nhiễm đến 10 lần Mỗi năm tại Hoa Kỳ, nhiễm khuẩn hô hấp trên gây giảm khả năng làm việc trong 170 triệu ngày, 23 triệu ngày trẻ phải nghỉ học, 18 triệu ngày phải nghỉ làm Điều này cho thấy dù là loại bệnh được cho

là tự khỏi nhưng chúng đã gây ra những thiệt hại đáng kể không chỉ về sức khỏe mà còn cả về kinh tế xã hội

Đối tượng mắc bệnh chủ yếu là trẻ em Ước tính trên toàn cầu mỗi năm có khoảng trên 2 tỷ lượt trẻ bị bệnh nhiễm khuẩn hô hấp cấp, chiếm 15 -20% số tử vong trong độ tuổi dưới 5 Tại khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam bệnh trên là nguyên nhân cao nhất (25%) gây tử vong ở trẻ, tiếp theo là tiêu chảy và sơ sinh kết hợp với các bệnh khác, còn lại là do các nguyên nhân khác [22] Ở trẻ em

- Tác nhân virut gây bệnh gồm có:

+) Rhinovirus là một picornavirut, phân lập được hơn 110 serotyp- thường

+ Sức đề kháng yếu của con người: sinh non, suy dinh dưỡng,

+ Điều kiện khí hậu, thời tiết: ở Việt Nam có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp nói riêng và các bệnh nhiễm khuẩn nói chung phát triển Việt Nam được coi là một trong các quốc gia có tỷ lệ các bệnh nhiễm khuẩn cao nhất nên việc điều trị và phòng bệnh càng trở nên cần thiết

+ Do ô nhiễm môi trường sống, đời sống kinh tế xã hội kém

14

1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN

1.2.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy

Moraxella catarrhalis lần đầu tiên được mô tả vào năm 1896, gọi là Micrococcus catarrhalis sau đó đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi

là Moraxella (Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae

đường hô hấp của con người [36]

Quá trình phân lập M catarrhalis được tiến hành theo tiêu chuẩn WHO:

Bệnh phẩm lấy từ vùng họng của bệnh nhân, tiến hành nhuộm Gram và cuối cùng đem nuôi cấy trong môi trường thạch máu 5% hoặc thạch sôcola với điều kiện 370C + CO2 5% [38]

1.2.2 Vai trò của Moraxella catarrhalistrong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp

Nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã chỉ ra rằng M catarrhalis

là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với đường hô hấp

 Các nghiên cứu trên thế giới:

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu chỉ ra M catarrhalis là nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm đường hô hấp.M catarrhalis là vi khuẩn cộng sinh phổ biến ở

vòm họng của trẻ em [41], một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh đã cho thấy 66% trẻ một tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% ở trẻ hai năm tuổi, điều này cho thấy trẻ em có nguy cơ cao bị các bệnh đường hô hấp, đặc biệt là hô hấp trên [20] Những nghiên cứu khác cũng cho thấy 48,9% gặp ở trẻ độ tuổi từ 3-12 [32] và 54%

ở trẻ dưới 4 tuổi [22] Tuy nhiên ở người lớn tỷ lệ này thấp hơn với 1% trong 561 ca phụ nữ trong tuổi lao động nhập viện [32], 5,8% ở người lớn khỏe mạnh và tăng

15

đến 26,5% ở người có độ tuổi trên 60 [48] và tăng cao vào mùa đông Timothy [47]

đã đưa ra các biểu hiện lâm sàng và dịch tễ học của M catarrhalis, đặc biệt sự liên

quan giữa bệnh viêm tai giữa ở trẻ em và bệnh COPD ở người lớn, hai căn bệnh

truyền nhiễm phổ biến nhất gây ra bởi M catarrhalis Viêm tai giữa là bệnh hay

gặp nhất trong thời thơ ấu của con người và là lý do phổ biến nhất mà trẻ em được

kê đơn kháng sinh, trung bình khoảng 80% trẻ em trong 3 năm đầu đời mắc bệnh

Trong đó M catarrhalis chiếm 15-20% nguyên nhân gây các đợt bệnh viêm tai giữa cấp tính, rất nguy hiểm với trẻ em nếu không phát hiện và điều trị kịp thời M catarrhalis còn là nguyên nhân gây ra một loạt các bệnh về hô hấp khác như: viêm

xoang cấp, viêm vòm họng, viêm phế quản mãn tính Catlin [26] đã chỉ ra những

bằng chứng cho thấy M catarrhalis đã gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng

não, viêm nội tâm mạc Đặc biệt trong các báo cáo tổng hợp lại về các bệnh viêm

phổi, viêm tai giữa và AIDS chỉ ra rằng M catarrhalis là nguyên nhân thường gặp

gây ra nhiễm trùng máu [44] Nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề đang rất được quan

tâm và M catarrhalis được xác định là một trong những vi khuẩn bị lây truyền,

nhất là ở những khu phòng quá tải bệnh nhân và trong những tháng mùa đông

 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, trong những năm gần đây lại chịu tác động mạnh của biến đổi khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển Trên Thế giới, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ các bệnh nhiễm khuẩn cao nhất, trong đó nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm tỷ

lệ cao Ngay từ năm 1984 chương trình chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã chính

thức bắt đầu tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh hô hấp xác nhận M catarrhalis là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu Tại bệnh viện Bạch Mai vào năm 1987 [17] xác nhận tỷ lệ M catarrhalis chiếm 3,5%, đến năm 1998 Lê Bá

Nhàn và cộng sự khi nghiên cứu bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở trẻ em tại

phường Kim Long, thành phố Huế đã phân lập được M catarrhalis với tỷ lệ 19,2%

Nghiên cứu của Đào Đình Đức và cộng sự [8] tại bệnh viện Bạch Mai trong 5 năm (1990-1994) cho thấy chủng vi khuẩn này gây nhiễm bệnh hô hấp với tỷ lệ trung

16

bình là 2,2% Tại trạm y tế phường Huế thành phố Hà Nội, năm 1991 đã phân lập

được 36 chủng M catarrhalis chiếm 18,8% tổng số vi khuẩn gây bệnh cho trẻ em,

tại bệnh viện Việt Nam- Cuba tỷ lệ lên đến 23,72% [34] Khi nghiên cứu tác nhân vi sinh gây bệnh viêm phổi cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy từ ngày 01/03/2005 đến ngày 30/06/2006 đã cho thấy tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn Gram âm, trong

đó tần suất gặp cao là Haemophilus influenzae (25%) sau đó là M catarrhalis với

17% Cũng với khảo sát tương tự diễn ra tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương trong khoảng thời gian từ tháng 1/2005 đến tháng 9/2006 do Phạm Hùng Vân phụ trách

đã cho kết quả M catarrhalis chiếm 8% trong tổng số vi sinh vật gây bệnh Theo

Đỗ Quyết [19] từ tháng 6/2007 đến tháng 6/2008 tại khoa lao và bệnh phổi, bệnh viện 103 Hà Nội trên 40 bệnh nhân trong đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mãn

tính cho thấy M catarrhalis chiếm 14,3% nguyên nhân gây bệnh Cũng theo

Nguyễn Minh Hải (2006) [10] tỷ lệ gây bệnh tương tự là 51,6%, theo Nguyễn Ngọc Bích (2007) chiếm 30,75% số vi khuẩn gây bệnh Thống kê của viện dịch tễ trung

ương và bệnh viện nhi Thụy Điển về tình hình nhiễm khuẩn đường hô hấp, M catarrhalis chiếm tỷ lệ 18,8-29,6% trong tổng số các chủng phân lập được [2] Phân

lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh viêm họng mạn tính tại bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương cho bảng kết quả sau[13]:

Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính

17

Những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy M catarrhalis

là một trong những tác nhân chủ yếu gây ra các bệnh hô hấp với tỷ lệ gây bệnh cao

và mức độ nguy hiểm của chúng đối với sức khỏe con người, đặc biệt là với trẻ em, người già Một vấn đề rất được quan tâm và chú trọng nghiên cứu hiện nay chính là tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh hô hấp, trong đó đặc biệt là

của M catarrhalis

1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis

Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới đắt tiền Cùng với bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, bệnh lây nhiễm qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện, bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp là một trong những nguyên nhân hàng đầu có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở các nước đang phát triển Thực tế việc kiểm soát bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn

M catarrhalis là vi khuẩn Gram âm, có khả năng tổng hợp enzym β-

lactamaza Enzym này làm mất hoạt tính kháng sinh của nhóm kháng sinh β- lactam bằng cách thủy phân vòng β- lactam

Trước đây khi điều trị các bệnh nhiễm khuẩn M Catarrhalis, thuốc kháng

sinh Ampicillin vẫn được coi là kháng sinh đặc trị hữu hiệu Tuy nhiên hiện nay

kháng sinh điều trị theo kinh nghiệm này đã được ghi nhận là bị M catarrhalis đề

kháng với tỷ lệ cao lên đến 100% như ở Thái Lan [30], hay 79% như ở Malaysia [46] Theo báo cáo gần đây cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc thế hệ kháng sinh

quinolon mới có phổ kháng rộng của M catarrhalis cao nhất là với ofloxacin

(29,4%), tỷ lệ kháng thấp hơn với ciprofoxacin, levofloxacin, moxiloxacin

Tại Việt Nam, khi phân tích các chủng M catarrhalis về tỷ lệ và xu hướng

của kháng kháng sinh trong số tất cả các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong chương trình Quốc gia giám sát kháng kháng sinh, Phạm Văn Ca [4] cho thấy cho thấy tỷ lệ

18

kháng kháng sinh của vi khuẩn này thấp vào trước năm 2000(dưới 2,5%), nhưng hiện đã cao hơn 13% Tỷ lệ kháng kháng sinh Ampicillin có xu hướng ngày càng tăng (16,1%) Các kháng sinh có tỷ lệ bị kháng cao nhất là Tetracycline và Co-trimoxazole với trên 30% Khi khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh thông dụng thường được dùng trong cộng đồng, dạng uống, Phạm Hùng Vân cho biết có 50% - 60% vi khuẩn kháng Ampicillin với cơ chế tiết β-lactamaza ngày càng tăng và chỉ còn nhạy cảm với Cephalosporin thế hệ II, III và Ciprofloxacin thuộc họ quinolon Theo

nghiên cứu của Nguyễn Hồng Lâm (2008) – (Bảng 1.2) cho thấy M catarrhalis đã

kháng lại hoặc nhạy cảm thấp với hầu hết kháng sinh thuộc nhóm β-lactam nhưng nhạy cảm rất cao với Cefoperazol (Cephalosporin thế hệ III) với tỷ lệ 100%, Cefotaxime (Cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 98,04%, Ceftriaxone đạt tỷ lệ 96,08%, Cefuroxime (Cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 78,43%

Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M catarrhalis

STT Tên kháng sinh Ký

hiệu

Số chủng

Tỷ lệ phần trăm %

Nhạy (S) Trung

gian (I)

Kháng (R)

Bảng1.3: Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [9]

20

1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn

1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu

Từ rất xa xưa, với sự tìm tòi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, con người đã phát hiện, ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học Và một kỷ nguyên mới trong y học đã được mở ra với phát minh vĩ đại của Alexander Fleming vào năm 1928 khi ông phát hiện ra Penicillin – một chất

kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium notatum [7] Năm 1942, quy trình sản

xuất Penicillin G Procain được phát minh bởi Howard Florey (1898-1968) và Ernst Chain (1906-1979) Penicillin lúc này đã được bán như một loại thuốc Fleming, Florey và Chain đã cùng được trao giải Nobel Y học vào năm 1945 cho thành tựu của mình Nhà vi sinh vật học Mỹ, Selman Waksman (1888-1973) năm 1943 đã tìm

ra chất kháng sinh Streptomycin từ vi khuẩn đất, được sử dụng để điều trị các bệnh như lao,viêm màng não Và đây là một trong những kháng sinh có phổ rộng có khả năng kháng được cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của chất kháng sinh, hàng loạt chất được tách chiết và xác định: Actonomixin (Waksman, 1940), Chloramphenicol (Erhlich, 1947), Chlotetracylin (Dugar, 1948), Tetracyclin (Lloyd Conover, 1955), Nystatin (1957) dùng trong điều trị bệnh nhiễm nấm Ngày nay, số lượng chất kháng sinh đã được phát hiện lên tới trên 10.000 chất, trong đó hàng trăm chất được dùng trong y học thực tiễn Năm 1981, Amoxicillin ra đời, là một kháng sinh bán tổng hợp và lần đầu tiên được bán vào năm 1998 dưới tên thương mại là Amoxicillin, Amoxil và Trimox

Tại Việt Nam, vào những năm 1951-1952 giáo sư Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu sản xuất dịch lọc Penicillin để rửa vết thương cho các thương binh [7] Trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu, ứng dụng khoa học kỹ thuật để sản xuất các chất kháng sinhnhư: Clotetracilin, Oxytetracilin, Erythromixin, Neomicin,…và cũng đã thu được những kinh nghiệm nhất định

 Dựa vào cơ chế tác dụng

 Dựa vào cấu trúc phân tử và các nhóm chức đặc trưng: đây là nguyên lý

cơ bản được sử dụng để phân loại chất kháng sinh vì chúng đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng sinh

 Bacteriocin

Hiện nay con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” bởi tình trạng kháng thuốc, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới[35] Trong bối cảnh này song song với việc phát triển các

chất kháng sinh phổ rộng thì việc nghiên cứu bacteriocin là vấn đề rất đáng được

quan tâm

Bacteriocin là peptit hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng

khuẩn [29], thuật ngữ này được đề xuất từ năm 1953 [28] Tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các peptit có hoạt tính kháng khuẩn tiết ra từ vi khuẩn Tiếp tố này

được viết thêm vào tên chi hoặc tên loài Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E coli được gọi là colicin, từ Bacillus subtilis được gọi là subtilin Các chữ cái đứng sau tên bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin được tìm ra ở cùng một loài Bacteriocin được

phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số loài có khả năng tiết hàng chục, thậm chí hàng trăm loại [45] Chúng rất đa dạng về chủng sản xuất, kích thước phân tử, tính chất vật lý, hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơ chế tác

22

động Tập hợp các gen cấu trúc, gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn

rất đa dạng, cớ thể nằm trong hệ gen hoặc plasmit hoặc trong cả transposon

Bacteriocin được phân chia thành 2 nhóm lớn là bacteriocin của vi khuẩn

Gram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [45] Vi khuẩn Gram dương

tổng hợp bacteriocin phong phú và đa dạng hơn nhiều so với vi khuẩn Gram âm Đa phần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt

các vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi hoặc tương đồng, có sự cạnh tranh trực

tiếp về nơi sống và nguồn dinh dưỡng [39] Phổ kháng khuẩn của bacteriocin của vi

khuẩn Gram dương rộng hơn so với của vi khuẩn Gram âm

Bảng 1.4 So sánh bacteriocin và chất kháng sinh dùng trong y tế [14]

Yêu cầu tương tác Đôi khi cần cắt ngắn phân tử Đích đặc hiệu

Phương thức hoạt

động

Hầu hết là tạo lỗ trên màng

tế bào chất (một số ít có thể ảnh hưởng đến sinh tổng hợp thành tế bào)

Màng tế bào hoặc các đích nội bào

Độc tính/tác dụng phụ Chưa thấy Có

23

1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật

Từ thời cổ đại, con người đã biết dùng thực vật làm thuốc chữa bệnh, trong những năm gần đây, ngành dược phẩm và các nhà khoa học đã dành mối quan tâm lớn đến dược liệu và phân tích thành phần kháng sinh thực vật bổ sung vào nguồn kháng sinh nhằm khắc phục tình trạng kháng thuốc hiện nay, đem lại những sản phẩm với giá thành thấp hơn Ước tính có 14- 28% các loài thực vật được sử dụng làm dược liệu trong y học và 74% đã được phát hiện có hoạt tính sinh học [31]

1.3.3.1 Khái niệm

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng

độ thường rất nhỏ [50]

Những tính chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như: ankaloit, tannin, flavonoit, tinh dầu

1.3.3.2 Khái quát lịch sử nghiên cứu

Trên trái đất ước tính có từ 250.000 đến 500.000 loài thực vật [25], nhưng chỉ một tỷ lệ tương đối nhỏ (1- 10%) trong số này được sử dụng như thực phẩm cho

cả con người và động vật Thực vật cũng được sử dụng như là nguồn dược liệu quý giá cho con người từ ngàn xưa Vào cuối thế kỷ thứ V trước Công nguyên, Hippocrates đã đề cập 300 đến 400 dược liệu từ thực vật Theo Moerman[44] người

Mỹ bản xứ tại Bắc Mỹ đã sử dụng 1.625 loài thực vật làm thực phẩm, trong khi đó

có đến 2.564 loài được dùng làm thuốc Uớc tính có 14-28% các loài thực vật được

sử dụng trong y học và 74% đã được phát hiện là có hoạt tính sinh học [31] Châu

Á là khu vực có nền y học cổ truyền phát triển từ lâu đời đặc biệt là tại Trung Quốc,

Ấn Độ, Việt Nam…

Với tình trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay việc nghiên cứu, phát triển sản xuất các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật đang là mối quan tâm

24

lớn của các nhà khoa học, ngành y học, dược học Việt Nam với điều kiện khí hậu

và thảm thực vật đa dạng, phong phú đã và đang phát triển các nghiên cứu về các hoạt chất có tính kháng khuẩn từ thực vật dựa vào những bài thuốc cổ truyền từ ngàn xưa để lại Theo các số liệu thống kê mới đây, thảm thực vật tại Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài được sử dụng làm thuốc trong Y học

cổ truyền [16] Tại Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu về hợp chất kháng khuẩn từ thực vật và đã thu được những kết quả nhất định trên các đối tượng như: tỏi, đu đủ, anh đào, lá dứa, thanh long, lá lốt, dừa cạn, dâm bụt, sống đời, xoan, bồ công anh Việt Nam, diệp hạ châu, đinh lăng…

1.3.3.3 Phân loại các hợp chất kháng khuẩn của thực vật

Thực vật có khả năng tổng hợp chất thơm, hầu hết là phenol hoặc dẫn xuất oxy Chúng đều là hợp chất thứ cấp, hiện nay đã phân lập được khoảng 12000 loại, chiếm tỷ lệ ước tính dưới 10% tổng số hợp chất thứ cấp [42] Trong đó đa số các hợp chất thứ cấp có vai trò bảo vệ cây trồng chống lại những sinh vật hại chúng như: vi sinh vật, côn trùng, động vật Ví dụ như nhóm terpenoid tạo mùi hôi, nhóm quinon và tannin tạo sắc tố trên thực vật, một số chất tạo hương vị và một số được dùng làm dược phẩm và thực phẩm cho con người

Các hợp chất kháng khuẩn thực vật gồm có:

 Ankaloit: berberin, piperin

 Phenol và polyphenol: phenol, axit phenol, catechol, pyrogallol, quinon, flavon, flavonoit…

 Terpenoit: tinh dầu, saponin

 Và một số hợp chất khác như: lectin, polyacetylen

1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn

Chất kháng sinh có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trưng nên không có một cơ chế tác dụng chung đối với vi sinh vật Đặc tính và cơ chế phụ thuộc vào

 Ức chế chức năng của màng tế bào: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài, vi khuẩn bị tiêu diệt

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

- Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosomlàm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosom ức chế enzym peptidyltransferazadẫn đến không kéo dài chuỗi

- Nhóm macrolid và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosomsẽ ức chế giải phóng axit amin khỏi phức hợp aa-tARN-riboxom-mARN

 Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic:

- Nhóm refampin gắn với enzym ARN polymeraza ngăn cản quá trình sao mã tạo thành ARN thông tin

- Nhóm quinolon ức chế tác dụng của enzym DNA gyraza làm cho hai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn, ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN

- Nhóm sulfamid có cấu trúc giống PABA (axit p- aminobenzoic) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp axit nucleic

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzym xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic

26

1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO

1.4.1 Đặc điểm thực vật học

Cây táo mèo hay còn gọi là cây chua chát, tên khoa học là Docyniaindica,

thuộc họ hoa hồng (Rosaceae)

Dạng sống là dạng bụi hoặc gỗ nhỏ, ưa sáng, chiều cao 5-10 mét, cây phân cành sớm, tán tròn, trên nhánh và thân non có gai, mọc rải rác trong rừng ở độ cao 1300-2000 mét

Lá mọc so le, hình thuôn, gốc tròn đầu nhọn, mép lá nguyên, mặt dưới có lông bạc mịn, mặt trên màu xanh lục, có 2 lá kèm rụng sớm Rụng lá hoàn toàn vào cuối mùa đông, ra lá non vào tháng 3

Mùa ra hoa vào tháng 2-4, hoa màu trắng, mọc thành cụm 3- 5 hoa ở nách lá hoặc đầu cành, cuống ngắn, đài dày có lông trắng, hoa mỏng manh và không có lông, nhị ngắn, vòi nhụy dài…[6]

Quả chín vào tầm tháng 8- 9-10, quả thịt hình trứng, chín có màu vàng nhạt,

vị chua chát và có mùi thơm đặc trưng

1.4.2 Sự phân bố

Cây táo mèo là cây ưa sáng, ưa khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao, nhiệt độ trung bình năm 15- 180C, lượng mưa 1.500 - 3.800mm/năm và độ ẩm trung bình khoảng 85%

Trên thế giới cây có ở một số nước như: Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma, Thái Lan Tại Việt Nam, cây phân bố tại: Ðiện Biên (Tuần Giáo, đèo Pha Ðin), Lai Châu (Sìn Hồ), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Ðồng Văn, Quản Bạ, Mèo Vạc); Yên Bái (Mù Cang Chải) [6]

1.4.3 Tác dụng dược lý

Quả táo mèo được dùng phổ biến trong Đông y, có thể dùng thay thế hay tương tự như vị thuốc sơn tra với nhiều tác dụng như làm thuốc bổ tỳ, vị, kích thích

27

tiêu hóa, giúp ăn ngon, dễ tiêu chống đầy bụng, ợ chua, giúp tăng cường miễm dịch, giảm cholesterol, hạ mỡ máu, đại tiện xuất huyết, chữa toàn thân đau mỏi dưới dạng thuốc sắc, cao lỏng hoặc tán bột uống

Điều đáng chú ý nhất táo mèo có tác dụng hạ huyết áp nhờ làm giãn mạch ngoại vi Mặt khác còn giúp hạ mỡ máu, chống huyết khối làm giãn động mạch vành, cải thiện sức co bóp của cơ tim, phòng chống tích cực các biến chứng do cao huyết áp gây ra

Ngoài ra, chúng còn có tác dụng ức chế các trực khuẩn: thương hàn, bạch hầu, lị, tụ cầu vàng, giảm chứng suy hô hấp…

Trong dân gian, táo mèo dùng ngâm với rượu uống để tăng cường sức khỏe, kích thích tiêu hóa và dùng làm siro táo mèo hay chế biến rượu vang Dịch lên men quả táo mèo - giấm táo mèo gần đây được lan truyền và phổ biến rộng rãi trong cộng đồng với tác dụng phòng chống béo phì, tăng cường khả năng miễn dịch và khả năng kháng khuẩn, chữa bệnh viêm đường hô hấp: ho, viêm amidan

1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo tại Việt Nam

Hiện nay trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về cây táo mèo Docynia indica, đặc biệt là về tác dụng kháng khuẩn của quả táo mèo

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Loan [15] cho thấy tác

dụng chống béo phì và giảm trọng lượng của dịch chiết quả Táo mèo Docynia

28

indica (Wall.) Decne trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm Theo Vũ Thị Hạnh

Tâm [20] nghiên cứu và ghi nhận vai trò hạ lipit và đường huyết của dịch chiết quả táo mèo trên chuột Hoàng Thị Minh Tân [21] quả và lá táo mèo có khả năng chống rối loạn trao đổi gluxit và lipit Vũ Thị Huê, Bùi Thị Việt Hà [49] đã có những nghiên cứu sơ bộ ghi nhận về tác dụng kháng khuẩn của dịch lên men quả táo mèo

29

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nguồn giống

Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Viện

VSV và Công Nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội, gồm các chủng; Shigella flexneri Klebsiella VTCC-B-814, E coli VTCC-B-883; Salmolella typhi VTCC-B-

897; Vibrio VTCC-B-652, Moraxella catarrhalis ATCC 43617

Chủng Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh, Staphylococcus aureus phân

lập tại Bệnh viện Tai - Mũi - Họng Trung ương

2.2.1 Phương pháp lên men quả táo mèo

Táo mèo tươi, thu hoạch, rửa sạch, thái lát, bỏ lọ và sử dụng công thức lên men dưới đây Sau một tháng lên thu dịch lên men quả táo mèo – giấm táo mèo

Công thức 1: 1kg táo mèo + 150g sucrose + 3 lít nước cất

Ngâm theo công thức 1 gồm 5 lọ, giảm dần lượng đường mỗi lọ 0,5g kể từ lọ 1

+ Lọ 1: 150g táo mèo + 22,5g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 2: 150g táo mèo + 22g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 3: 150g táo mèo + 21,5g sucrose + 0,45l nước cất

30

+ Lọ 4: 150g táo mèo + 21g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 5: 150g táo mèo + 20,5g sucrose + 0,45l nước cất

Công thức 2: 1kg táo mèo + 100g sucrose + 3l nước cất

Ngâm theo công thức 2 gồm 9 lọ:

+ Lọ 6: 150g táo mèo + 15g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 7: 150g táo mèo + 14,5g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 8: 150g táo mèo + 14g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 9: 150g táo mèo + 13,5g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 10: 150g táo mèo + 13g sucrose + 0,45l nước cất

→ Giảm dần lượng đường mỗi lọ 0,5g kể từ lọ 6

+ Lọ 11: 150g táo mèo + 15,5g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 12: 150g táo mèo + 16g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 13: 150g táo mèo + 16,5g sucrose + 0,45l nước cất

+ Lọ 14: 150g táo mèo + 17g sucrose + 0,45l nước cất

→ Tăng dần lượng đường mỗi lọ 0,5g kể từ lọ 6

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Dịch lên men quả táo mèo đã thu được nhỏ vào các giếng thạch trên đĩa Petri

có chứa sẵn vi khuẩn Moraxalla catarrhalis Để lạnh từ 4-8 giờ trong tủ lạnh, sau

đó cất vào tủ ấm Kết quả sau 72 giờ cho thấy giấm táo mèo có khả năng ức chế sự

sinh trưởng của vi khuẩn M catarrhalis Vì vậy, tiến hành phân lập vi khuẩn từ

dịch lên men quả táo mèo Pha loãng dịch giấm bằng nước cất khử trùng theo hệ thập phân ở các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-6 và tran đều trên đĩa petri chứa môi trường thạch thường để tìm chủng vi khuẩn có hoạt tính mong muốn

31

2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh và enzym

2.2.3.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa petri Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốc

độ 6000 vòng/phút, ở 40C trong 15 phút sau đó được nhỏ với lượng 0,1 ml vào mỗi

lỗ thạch Đọc kết quả sau 2 ngày hoạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D-d, mm).Trong đó, D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính lỗ khoan

2.2.3.2 Xác định hoạt tính enzym

Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza, amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán trên thạch chứa 1% cơ chất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan)

Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sau

đó được đổ vào các đĩa Petri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợi nguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trường Nhỏ 200µl dịch nuôi cấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4-5h cho enzym khuếch tán vào thạch, sau đó chuyển vào tủ ấm 30-320C Sau 24 giờ đem ra hiện vòng phân giải bằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất là CMC, kitin, tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein

Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân giải theo công thức: Hoạt tính enzym = D-d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ khoan

Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng được phân lập

Về mặt hình thái, các chủng cũng như bào tử của các chủng được kiểm tra dưới kính hiển vi và kính hiển vi điện tử (TEM)

Sau đó, các chủng được kiểm tra khả năng mọc trong các môi trường hiếu khí hay kị khí, các nhiệt độ khác nhau và các tính chất khác như khả năng phân giải

32

tinh bột, tan huyết, phân giải sữa, phân giải gelatin và khả năng kháng một số chất kháng sinh

2.2.4 Bảo quản giống

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau khoảng 10-14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-

60C Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ống cát, trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm

2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học-OD

Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo

mật độ quang học Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 620nm 2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn

Vi khuẩn được lên men trên môi trường dịch thể trong bình nón dung tích

250ml với các thành phần và các yếu tố liên quan như sau:

 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Chủng nghiên được nuôi cấy lắc 220 vòng / phút trên các môi trường khác nhau ở nhiệt độ và pH thích hợp Sau 2 ngày xác định pH sau nuôi cấy, mật độ tế bào và hoạt tính kháng khuẩn

 Ảnh hưởng của pH

Nuôi lắc vi khuẩn 220 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp sau khi đã điều chỉnh

pH ban đầu của môi trường ở các giá trị pH khác nhau với bước nhảy bằng 1 Xác định OD, pH, hoạt tính kháng khuẩn sau nuôi cấy

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp 1% các nguồn cacbon khác nhau là: kitin, tinh bột tan, dextrin, glucoza, CMC, lactoza, bột ngô Tiến hành nuôi cấy lắc vi khuẩn với vận tốc 220 vòng/phút Sau 2 ngày xác định OD, pH sau khi nuôi cấy, hoạt tính kháng khuẩn

33

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Bổ sung nguồn nitơ khác nhau vào môi trường thích hợp với các hàm lượng 1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, bột đậu tương, cao nấm men, peptone Các bước tiếp theo tiến hành tương tự như trên

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường với nguồn cacbon, nitơ, pH thích hợp, cứ sau 24h lại lấy mẫu để xác định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuẩn

2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và dịch lên men quả

táo mèo

2.2.7.1 Phương pháp sắc ký cột

 Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ

Nhồi pha hấp phụ rắn (Silicagel 0,063-0,2mm, Florisil 100-200 U.S.mesh) vào cột xilanh cỡ 1 (d = 5mm) từng lượng nhỏ, lắc đều, thông số thiết kế cột được trình bày ở Bảng 2.1:

Bảng 2.1: Thông số thiết kế cột nhồi

Pha hấp phụ Khối lượng (g) Chiều cao cột nhồi (cm)

Pha mẫu vào methanol nồng đô ̣ khoảng 0,01 g/ml rồi đưa lên cô ̣t 0,2 ml dung dịch này Đưa cột lên hê ̣ thống chiết pha rắn và thử nghiê ̣m sơ bô ̣ để khảo sát chất hấp phu ̣ và hê ̣ dung môi rửa giải

Hê ̣ dung môi rửa giải được thử nghiê ̣m là:

n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol n-Hexan, n-Butanol, Aceton, Nước Kết quả nghiên cứu sơ bô ̣ thấy chất hấp phu ̣ silicagel và hê ̣ dung môi rửa giải n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol có thể tách phân đoa ̣n tương đối tốt và phù

34

hơ ̣p Do đó ta đi khảo sát quá trình tách phân đoa ̣n di ̣ch chiết táo mèo và di ̣ch lên men trên cô ̣t sắc ký nhồi to hơn

 Phân đoạn di ̣ch chiết trên sắc ký cột

- Nhồi cô ̣t: Silicagel được sấy ở 3000C trong 2h và để nguội trong bình hút

ẩm sau đó nhồi cột có đường kính 1cm, chiều cao là 22cm

- Luyện cột: dùng metanol để hoạt hóa pha rắn, làm ướt để pha rắn có thể

sẵn sàng tiếp xúc và tương tác với các chất tan Tránh không làm khô pha rắn trong

và sau khi luyện cột

- Cân bằng cột: tương tự như bước 2 (nhưng phải dùng chính dung môi chứa

mẫu như ban đầu để cho vào cột) dùng metanol

- Đưa mẫu vào cột: pha các mẫu cao chiết trong methanol ở nồng đô ̣ 0,01g/ml Đưa 5ml dung dịch trên lên cột nhồi

- Rửa gia ̉ i trên cột : dùng hệ dung môi rửa giải là : n-Hexan, Cloroform,

Aceton, methanol vớ i tỷ lê ̣ phối trô ̣n khác nhau sao cho mức đô ̣ phân cực tăng dần Tốc độ dòng điều chỉnh sao cho thời gian tiếp xúc giữa dung môi rửa và pha rắn kéo dài trong 1-2 phút

Kiểm tra các phân đoa ̣n trên sắc ký bản mỏng để thu gom các phân đoa ̣n có kết quả triển khai tương tự nhau trong cùng mô ̣t hê ̣ dung môi có kết quả gần giống nhau

2.2.7.2 Phương pha ́ p kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng

Sấy bản mỏng rồi cắt thành từng tấm theo kích thước nhất đi ̣nh Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 0,5 –1 cm Dùng ống mao quản hút dung d ịch mẫu thử rồi chấm lên b ản mỏng Vết chấm phải tròn, gọn và đưa được lư ợng mẫu phù

hơ ̣p Sau đó đặt bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký với hê ̣ dung môi triển khai đã đư ợc bão hòa, đậy nắp bình Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 0,5-1 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên bản mỏng, sấy khô bản mỏng rồi soi UV hoặc phun các thuốc thử hiện màu như dung d ịch H2SO4 10% rồi sấy khô cho dung môi bay hết để vết triển khai trên bản mỏng được hiện rõ

35

Các hệ dung môi triển khai đã thử nghiệm khi nghiên cứ u các phân đoa ̣n trên bản mỏng bao gồm:

1 TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1

2 Ethylaxetat: axit focmic: nước = 8:1:1

3 Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1

4 [Axit acetic (2,4%) – Etanol –Acetonitril (35: 5: 10)] - Metanol : (70: 30)

5 Metanol – Axit acetic – Nước (36,7%: 0,3%: 63%)

6 Axit acetic (0,28%) – Metanol – Acetonitril (35: 5: 10)

7 n-Butanol – Axit acetic – Nước (85: 5: 10)

8 n-Butanol – Etyl acetat – Dimetyl formamit – Nước (10: 6: 3: 2)

9 Toluen – Etyl acetat – Aceton – Axit formic (15: 2: 2: 1)

10 Benzen – Aceton (4:1): Benzen – Pyridin – Axit formic (36: 9: 5)

2.2.8 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn

2.2.8.1 Thử định tính flavonoit

Phản ứng Shinoda Pha mẫu thử trong ethanol với một lượng thích hợp, bổ

sung vài giọt axit clohidric đặc và chia dung dịch thành hai ống nghiệm

Phản ứng gelatin/ NaCl: Cũng tiến hành tương tự như trên nhưng bổ sung

vào ống 2 vài giọt thuốc thử gelatin/NaCl Kết quả dương tính khi ống nghiệm có hiện tượng vẩn đục

Phản ứng với acetate chì: Bổ sung vài giọt thuốc thử acetat chì 10% vào

dung dịch mẫu thử với cách pha tương tự như trên Kết quả là dương tính thì sẽ xuất hiện kết tủa

Phản ứng với FeCl 3 1% trong nước Cách pha mẫu và phân chia mẫu tương

Phản ứng Dragendrorff cải tiến

Lấy lượng 0.01g cao dịch chiết trong 1ml CH3COOH 2%, lọc để thu dịch lọc Lấy khoảng 1ml mẫu thử cho vào ống nghiệm

Ống 1 : Dùng làm đối chứng

Dung dịch 1: 50 ml CHCOOH 10% + 5,5 ml dung dịch FeCl3 5%

Dung dịch 2: 50ml H2SO4 đặc + 0,5 ml dung dịch FeCl3 5%

Lấy 0,01g cao chiết ở các phân đoạn cho vào ống nghiệm Sau đó, bổ sung 1

ml dung dịch 1, lắc cho hòa tan hết, nghiêng ống nghiệm khoảng 450 rồi nhỏ từ từ dung dịch 2 vào Kết quả dương tính khi phản ứng cho màu đỏ nâu giữa hai lớp chất lỏng

2.2.8.5 Phương pháp sắc ký HPLC

Dịch kháng sinh thô sau khi tách chiết với Ethylacetate, rồi cô quay

HPLC sử dụng cột C18(4,6 x 250 mm), pha di động chứa methanol, và cột HPLC grade water bổ sung thêm 0.05% TFA Bơm 50 µL dung dịch chiết vào cột Chạy cột từ 20 đến 40% methanol trong 10p, từ 40%- 60% trong 5p từ 60%-70% trong 10p ở tốc độ 0.5 mL, bước sóng 200 nm

38

2.2.8.5 Xác định hợp chất kháng sinh bằng phương pháp khối phổ MS

Chất kháng khuẩn có khả năng kháng M.catarrhalis được tinh sạch thông

qua hệ thống HPLC được phân tích khối lượng phân tử bởi phương pháp khối phổ

MS Mẫu được đưa trực tiếp vào khối phổ trong trạng thái tích điện dương Sau quá trình tinh sạch sơ bộ bằng dung môi hữu cơ, kháng sinh thô sau đó được cô quay và thu lấy cặn Cặn này được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với các thông

số như sau: cột C18 (4,6 x 250 mm), pha di động chứa methanol, và cột HPLC grade water bổ sung thêm 0.05% TFA Bơm 50 µL dung dịch chiết vào cột, chạy cột từ 20 đến 40% methanol trong 10 phút, từ 40- 60 trong 5 phút từ 60-70% trong 10p ở tốc độ 0.5 mL, bước sóng 200 nm

Sơ đồ thí nghiệm

Các phân đoạn

vật trong dịch lên men có khả

năng kháng M catrrrhalis

Xác định các đặc điểm sinh

học, đặc điểm phân loại

Lên men và tách chiết chất

kháng sinh kháng M

catarrhalis từ chủng vi khuẩn

lựa chọn

Xác định sơ bộ bản chất

các phân đoạn thu được

Xác định sơ bộ cấu trúc hoá học bằng HPLC và MS của phân đoạn có hoạt tính kháng

khuẩn

Táo mèo tươi – thu mua tháng 8

(sau 1 tháng)

Rửa sạch, thái lát (hoặc nghiền nhỏ)

Bản chất các phân đoạn

Bản chất của chất tách chiết

39

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN VÀ

DỊCH CHIẾT QUẢ TÁO MÈO

Quả táo mèo tươi, sau khi thu hoạch được rửa sạch, thái lát và lên men với công thức nêu trong phương pháp nghiên cứu Sau thời gian lên men 1 tháng, tiến

hành thu dịch, thử hoạt tính kháng M catarrhalis Bên cạnh đó một thí nghiệm

tương tự cũng được tiến hành song song khi tách chiết các chất từ quả táo mèo tươi

Dịch chiết được nhỏ vào các giếng thạch trên đĩa Petri có chứa sẵn vi khuẩn M catarrhalis để trong tủ lạnh từ 4-8 giờ, sau đó để vào tủ ấm Kết quả sau 24 giờ cho thấy giấm táo mèo có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn M.catarrhalis

với kích thước vòng vô khuẩn được thể hiện ở Bảng 3.1

Hình 3.1: Vòng vô khuẩn của dịch chiết táo mèo nguyên chất với M.catarrhalis

Như vậy, dịch chiết táo mèo nguyên chất có khả năng kháng M.catarrhalis khá mạnh Tiếp tục nghiên cứu công thức ngâm táo mèo để tăng hiệu quả kháng M catarrhalis

40

Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn kháng M catarrhalis của dịch lên men quả táo

mèo và dịch chiết quả táo mèo

V 1 : V 2 (ml: ml) HTKK

(D-d,mm)

pH sau cuối

Dịch lên men quả táo mèo 31 3.3 3.1 0.2

Dịch lên men quả táo mèo

hiện ở đường kính vòng vô khuẩn 31  3.3 mm Còn các chất từ dịch chiết quả táo

mèo cũng cho hoạt tính kháng M catarrhalis và giảm dần theo tỷ lệ pha loãng, kết

quả còn cho thấy tỷ lệ pha loãng 1: 4, dịch không còn hoạt tính

Tuy nhiên, đối với dịch lên men quả táo mèo khi đưa về pH trung tính vẫn có

có hoạt tính kháng khuẩn tuy có thấp hơn so với pH axit ban đầu điều đó cho thấy khả năng kháng khuẩn không những do các acid tạo thành sau quá trình lên men mà còn có thể do các chất được tổng hợp nhờ các vi khuẩn có trong dịch lên men Do

đó, từ dịch lên men quả táo mèo chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn vi

khuẩn có khả năng kháng M Catarrhalis đã kháng kháng sinh