Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây quao nước (dolichandrone spathaceae)

DANH M C SƠ ĐỒ VÀ BẢN S đồ v S đồ 2.1 Phân lập các phân đoạn từ cặn chiết n-hexan của Bản 1.1 Hoạt tính ức chế enzyme sucrase và maltase trên chuột của các bộ phận hoa, lá và vỏ cây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LỜ CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Tổng hợp Hữu cơ

Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới giáo viên hướng

dẫn TS Trần T ị P ư n T ảo cùng với sự trợ giúp của thầy giáo ThS

N u ễn Văn Tuấn - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam đã trực tiếp quan tâm và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình

thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện

Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, tạo

điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm để hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

NAFOSTED đã tài trợ kinh phí cho đề tài khóa luận tốt nghiệp của tôi

Trong quá trình hoàn thành khóa luận tôi đã nhận được sự quan tâm,

giúp đỡ của cô giáo Trưởng khoa TS Đ o T ị Việt An cùng toàn thể các

thầy cô giáo trong khoa Hóa học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 Tôi xin

chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

H Nội, tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Lệ Qu n

LỜ CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành dưới sự cố gắng, nỗ lực của bản thân và sự giúp đỡ tận tình của TS Trần Thị Phương Thảo và Th.S Nguyễn Văn Tuấn Các kết quả thu được trong khóa luận tốt nghiệp không trùng với kết quả nghiên cứu của bất kì tác giả nào khác Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

H Nội, t án 05 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Lệ Quyên

1.2.Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài trong

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất 13 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm 14

định hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào

2.2.4.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm

của tế bào ung thư thực nghiệm 17

2.3.1 Chiết mẫu với các dung môi có độ phân cực khác nhau 18

2.3.2 Phân lập các chất sạch từ cặn chiết n-hexan 19

3.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học của cặn chiết n-hexan 33

3.3.1 Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33

3.3.2 Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa 35 3.3.3 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào

Hình 1.6 Các chất được phân lập từ dịch chiết ete dầu hỏa và etyl

DANH M C SƠ ĐỒ VÀ BẢN

S đồ v

S đồ 2.1 Phân lập các phân đoạn từ cặn chiết n-hexan của

Bản 1.1 Hoạt tính ức chế enzyme sucrase và maltase trên

chuột của các bộ phận hoa, lá và vỏ cây Quao nước 11

Bản 3.1

Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

của dịch chiết n-hexan từ cành, lá và vỏ thân của

cây Quao nước

34

Bản 3.2 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết

n-hexan từ cành, lá và vỏ thân của cây Quao nước 35

Bản 3.3

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư thực nghiệm của dịch chiết n-hexan

từ cành và lá cây Quao nước

35

DANH M C CHỮ V ẾT TẮT VÀ CÁC KÍ H ỆU

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer - Phổ

DEPT

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

IR Infrared spectroscopy - Phổ hồng ngoại

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry - Phổ khối

lượng phun mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation - Tương tác dị hạt

nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence - Tương tác dị

hạt nhân qua một liên kết COSY Correlated Spectroscopy - Phổ tương quan

IC50 Nồng độ cần để ức chế 50% MIC Nồng độ ức chế tối thiểu MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu EtOAc Etyl axetat

DMSO Đimetyl sunfoxit

D spathaceae Dolichandron spathaceae

D falcata Dolichandron falcata

D serrulata Dolichandron serrulata

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau

Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam là 10.500 loài, ước đoán

hệ thực vật Việt Nam có khoảng 12.000 loài Trong số này, nguồn tài nguyên làm thuốc chiếm khoảng 30% Kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001-2005 của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn vì được sử dụng rộng rãi để chữa nhiều các chứng bệnh khác nhau Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với các loại thuốc

có nguồn gốc từ thiên nhiên, đi sâu nghiên cứu xác minh y học cổ truyền, tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cao

để làm thuốc từ dược liệu

Họ Quao hay họ Núc Nác (Bignoniaceae) là một họ lớn thuộc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có nhiều loài như Đào tiên, Đạt phước, Cây dồi, Đang tiêu… được sử dụng trong y học dân gian để trị ho, sốt, làm lành vết thương, đau đầu, lợi tiểu, hạ nhiệt Ở Việt Nam, cây Quao nước

(Dolichandrone spathacea) là một loài cây rất đặc trưng trong họ Quao

thường gặp ở một số tỉnh ven biển, vùng rừng ngập mặn Nam Bộ Loài cây này có khá nhiều công dụng, được sử dụng trong y học cổ truyền để khử trùng vết thương, làm thuốc điều kinh, bổ huyết, nhuận gan, trị hen suyễn, tiêu độc [3] Mặc dù có nhiều công dụng thiết thực nhưng cho đến nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chỉ có một công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Quao nước

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt

nghiệp: “N i n ứu t n p ần ọ v oạt tín sin ọ ủ â

Quao nướ (Dolichandrone spathacea)’’ nhằm đóng góp vào việc tìm hiểu

hóa thực vật của loài cây này và cung cấp mẫu chất cho các thử nghiệm sinh học về sau

Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cặn chiết

n-hexan của cành và lá cây Quao nước bao gồm những nội dung chính sau:

1 Thu mẫu cành, lá và vỏ thân cây Quao nước (Dolichandrone

spathacea), xử lý mẫu và tạo các dịch chiết

2 Phân lập một số chất từ cặn chiết n-hexan của cành và lá cây Quao nước

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

4 Thử hoạt tính sinh học của cặn chiết n-hexan từ cành và lá cây Quao nước

C ư n 1 TỔN QUAN

1.1 iới t iệu về ọ Qu o

Họ Quao (Bignoniaceae) là một trong những họ thực vật thuộc ngành Mộc lan (Magnoliophyta), với khoảng hơn 107 chi và 900 loài [4], phân bố chủ yếu

ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, họ Quao có khoảng 8 chi với

22 loài và taxon dưới loài [7] phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam, từ vùng ven biển đến núi cao Trong đó, nhiều loài có giá trị làm thuốc, làm cảnh, cho gỗ, làm rau….Riêng vùng Nam bộ Việt Nam có 7 chi với 8 loài và 1 taxon dưới loài Nhiều loài họ Quao có tác dụng trị bệnh, đã được nghiên cứu từ rất sớm

Núc nác (Oroxylon indicum) được biết từ lâu với các tính năng: gỗ sắc

uống trị dị ứng; vỏ rễ bổ, trị kiết, chống viêm, trị tê thấp; lá trị ăn không ngon, đau dạ dày, ho lâu ngày Hoa, quả, và hột non thường được xào ăn như rau

Rễ trị đau ngực và đau đầu; vỏ bổ lợi tiểu, trị đau dạ dày, đau gan, suyễn, sốt rét; hoa, rễ, lá hạ nhiệt Lapachol thu được từ cây Núc nác có khả năng chống

tế bào ung thư Walker 256 [3]

Vỏ cây Hồng kỳ (Spathodea campanulata) dùng đắp hay sắc uống trị viêm loét dạ dày, tiểu đường, sưng đường tiểu, sốt rét do Plasmodium berghei [3] Kén tim (Tabebuia rosea): trái và vỏ có tác dụng lợi tiểu [3]

Đào tiên (Crescentia cujete): Nạc của quả trị ho, sốt, lợi tiểu Vỏ sắc rửa

vết thương, lá đắp trị nhức đầu Trái chứa nhiều iridoid [3]

Đạt phước (Millingtonia hortensis): Lá trị lao, viêm mũi, suyễn Lá có

chứa Hispidulin làm nở cuống phổi ở chuột [3]

Cây dồi (Kigelia africana): Nạc của quả lợi sữa, trị ung nhọt, đau bao tử,

trị tê thấp Trái chứa lapachol chống ung thư da và ung thư thận Quả có chứa

6 – metoxymelein, kigelin, stigmasterol và một số steroit mà cơ cấu giống hormon nữ Gỗ chứa kigelol, vanilin, kigelinon (gây độc tế bào)

Đang tiêu (Campsis radicans): Rễ làm lành vết thương [3]

Huỳnh liên (Tecoma stans): Rễ lợi tiểu, bổ; hoa trị đau bụng ở mexico, trị

đái đường (do tecostanin, tecomanin, tác động vào quá trình tiết insulin); trị nọc bò cạp, rắn [3]

Quao núi (Stereospermum colais): Rễ trị đau ngực và đầu; vỏ bổ, lợi tiểu,

trị đau người, đau dạ dày, đau gan, hen suyễn, sốt rét; hoa, rễ và lá hạ nhiệt

1.2 T n p ần ọ v oạt tín sin ọ ủ một số lo i tron i Dolichandrone

Trên thế giới có khoảng 10 loài thuộc chi Dolichandrone Ở Việt Nam có

ba loài là Quao cột (Dolichandrone columnaris), Quao răng (Dolichandrone

serrulata), Quao nước (Dolichandrone spathacea) Cả ba loài Quao này

thường được tìm thấy nhiều ở các tỉnh Bình Thuận, Bình Phước, Đồng Nai Riêng loài Quao nước còn được phân bố rải rác ở một số tỉnh từ miền Bắc tới miền Trung như Quảng Ninh, Đà Nẵng, Huế, Quảng Nam [6]

Dolichandrone falcata có nhiều đặc tính chữa bệnh và đã được dân gian

dùng làm thuốc [8, 9] Ở Philippin, lá cây dùng làm thuốc đắp vết thương và vỏ cây được dùng trị sự đầy hơi của phụ nữ sau khi sinh [10] Ngoài ra lá còn có

tác dụng trị tiểu đường [11] Năm 1955, từ vỏ của D falcata, Kincl đã tìm thấy

chrysin (1) và sapogenin (2) [12] Đến năm 1956, từ hạt của cây này, Kincl và Gedeo tiếp tục tìm thấy saponin (3) và một số sapogenin [13] Năm 1972, Subramanian và cộng sự xác định được một flavonoid là chrysin (1) cùng với

hai dẫn xuất glycosid của chrysin từ lá cây D falcata (Hình 1.1) [14]

Hình 1.1: Cấu trúc của các chất phân lập được từ hạt và lá cây D falcata

Hình 1.2: Cấu trúc của các chất phân lập được từ cành của cây D serrulata

Năm 2006, Sinaphet và cộng sự phân lập được từ cành của cây D

serrulata một phenol triglycosit mới là dolichandrosit (9) cùng với 6 phenol

triglycosit đã biết là 2′′-O-apiosylverbascosit (10), luteosit B (11), markhamiosit

A (12), verbascosit (5), decaffeoyl-verbascosit (13), isoverbascosit (14) và một hợp chất iridoit glucosidt là ixosit (15) (Hình 1.2) [15]

Năm 2009, từ cao etyl axetat của gỗ cây D falcata, Aparna và cộng sự phân

lập được một phenylpropanoid glycosid mới là dolichandrosit A (4) cùng với

7 hợp chất là verbascosit (5), aloesaponarin II (6), α-lapachon (7), lapachol(8), β-sitosterol, 8-hydroxydehydroiso-α-lapachon và 3,8-dihydroxydehydroiso-α-lapachon (Hình 1.3) [16]

Hình 1.3: Cấu trúc của các chất phân lập được từ gỗ của cây D falcata

1.3 Tình hình nghiên cứu cây Quao nước

Cây Quao nước có tên khoa học là Dolichandrone spathacea (L.f.) K

Schum., thuộc họ Quao hay còn gọi là họ Núc nác (Bignoniaceae)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Cây đại mộc, cao 15-20m, thân không thẳng, với nhiều cành nhánh Lá kép lông chim một lần, lẻ, lá phụ không lông, mỏng, phiến không đối xứng, thường có 7-9 lá chét Lá chét hình trứng mác, dài 7-16 cm, rộng 3-7 cm, nhẵn cả hai mặt, màu đen khi khô [1]

Hình 1.4 Cây Quao nước (Dolichandrone spathacea)

Cụm hoa chùm rất ngắn ở đầu cành, mang 2–8 hoa Hoa màu trắng, mùi thơm nhẹ; sớm dụng; tràng màu trắng, dài 10–18 cm, có 5 thùy cong , khía tai bèo; nhị 4, thụt vào trong ống tràn Mùa hoa là tháng 4–6 Hoa nở vào lúc bình minh và rụng trước khi mặt trời mọc Cần có loài bướm co vòi dài ăn đêm mới thụ phấn được Thường trong một chùm hoa chỉ có một cụm hoa nở vào một thời điểm nhất định [1]

Hình 1.5 Hình hoa, quả và hạt Quao nước

Trái là manh nang, thòng dài, tròn, nhọn Quả khô tự nở, gân hình trụ, dài 40–60 cm, mang nhiều hạt dẹt, rộng 1,5–2,3 cm [1]

Cây tái sinh bằng hạt

Cây có ở Ấn Độ, Campuchia, Malaisia, Inđônêsia, quần đảo Nuven Calêđôni

Ở nước ta, cây có ở Quảng Nam–Đà Nẵng (Hòa Vang, Nam Ô), Lâm Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh, Long An (Cần Đước, Rạch Cát), Đồng Tháp, An Giang [2]

Cây mọc trên bùn, dựa rạch có triều và rừng sác, sau rừng sú vẹt và dọc dừa, thường có dạng cây bụi và có khi cũng gặp ở những nơi gần bãi biển Ở vùng sau sú vẹt thường là cây gỗ, có khi chỉ mang lá trong một thời gian ngắn (vào mùa khô); cũng có lúc cây có cả lá và hoa quanh năm [2]

1.3.2 Ứng dụng trong dân gian

Hạt có tác dụng khử trùng

Dân gian thường dùng lá Quao nước phối hợp với ích mẫu, ngải cứu, cỏ gấu, muồng hoe để làm thuốc điều kinh, bổ huyết Lá còn dùng cho phụ nữa sau khi sinh uống vào cho khỏe người, ăn ngon cơm

Vỏ và lá dùng làm thuốc nhuận gan Lá dùng trị hen suyễn Vỏ, rễ dùng làm thuốc tiêu độc

Người ta dùng rễ và lá quao nước phối hợp với rễ hoặc cây Ô rô chế thành biệt dược Ô rô – Quao làm thuốc giải độc nhuận gan

Dân gian thường dùng vỏ cây, rễ và lá sao qua sắc nước uống, hoặc dùng các bộ phận của cây nấu thành cao lỏng để dùng

Hoa, trái non ăn được; gỗ, vỏ trị dị ứng; hạt + gừng: trấn luyến súc [3]

Ở Ấn Độ, hạt còn được dùng phối hợp với gừng trị đau co thắt

Ngoài ra cây còn cho gỗ, tham gia cố định các bãi cát bùn sau thảm cây sú vẹt ở ven biển, cửa sông

Từ cao etyl axetat của vỏ cây Quao nước đã thu được 3 hợp chất là

stigmasta-1,4-dien-3-on (19), axit ferulic (20) và axit p-hydroxycinnamic (21)

Hình 1.6: Các chất phân lập từ dịch chiết ete dầu hỏa và etyl axetat của vỏ

cây Quao nước

1.3.4 Hoạt tính sinh học

Năm 2007, một nhóm nhà khoa học Thái Lan khi sàng lọc hoạt tính ức chế enzym sucrase và maltase trên chuột của một số cây thuốc dân tộc ở Thái Lan

đã công bố kết quả về hoạt tính hạ đường huyết của cây Quao nước

(Dolichandrone spathacea) Hoạt tính hạ đường huyết từ các bộ phận của cây

Quao nước được chỉ ra ở bảng 1.1

Bản 1.1 Hoạt tính ức chế enzyme sucrase và maltase trên chuột của các bộ

phận hoa, lá và vỏ cây Quao nước

(% ứ ế)

Enzym maltase (% ứ ế)

Năm 2012, một nhóm nhà khoa học Thái Lan khác cũng đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính ức chế lipase và hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân tộc ở Thái Lan trong đó có cây Quao nước Kết quả cho thấy dịch chiết etanol của lá cây Quao nước cho hoạt tính chống oxy hóa tốt với giá trị EC50 = 5,17 μg/ml (chất chuẩn ascorbic axit có giá trị EC50 = 10 μg/ml Các hoạt tính khác được thử nghiệm đều cho kết quả âm tính [18] Kết quả sàng lọc về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của một số loài cây ngập mặn ở Sudan cũng cho thấy cây Quao nước không có hoạt tính đối với các chủng vi khuẩn và nấm được thử [19].Cho đến nay theo tra cứu tài liệu, ở Việt Nam hiện chưa có công trình khoa học nào công bố về hoạt tính sinh học của cây Quao nước

(Dolichandronre spathacea)

C ư n 2 THỰC N H ỆM VÀ PHƯƠN PHÁP N H ÊN CỨU 2.1 N u n liệu, ất v t iết bị n i n ứu

2.1.1 Nguyên liệu

Cành, lá và vỏ thân cây Quao nước được thu hái tại Sóc Trăng vào tháng 04/2014 do Thạc sĩ Nguyễn Thế Anh xác định có tên khoa học là

Dolichandrone spathacea (L.f.) K Schum., thuộc họ Núc nác (Bignoniaceae)

Mẫu tiêu bản QN.1 (vỏ thân) và QNL.1a và QNL.1b (cành và lá ) được lưu giữ tại phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2 mm

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm Merck và Sephadex LH – 20

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối HP 5989B MS Engine, LC/MSD Agilent Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H–NMR, 13C-NMR đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz Phổ hồng ngoại (FT – IR) đo dưới dạng viên nén KBr trên máy quang phổ IMACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254 nm và 365 nm dùng để soi bản mỏng

Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy siêu âm, các dụng cụ thủy tinh, vv…

Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng vanilin 1% trong dung dịch metanol – H2SO4 đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110oC

Dung môi dùng chạy cột và triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm n-hexan,

DCM, EtOAC và MeOH tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi

sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm

2.2 P ư n p áp n i n ứu

2.2.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu cành và lá cây Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) K

Schum.) được làm sạch sấy khô ở nhiệt độ 40 - 45°C xay nhỏ thành bột và

chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan,

điclometan, axeton, metanol và nước Mẫu được chiết ba lần với mỗi loại dung môi Gộp các dịch chiết của từng loại dung môi, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng

Mẫu vỏ thân cây Quao nước (Dolichandrone spathacea (L.f.) K Schum.)

được làm sạch, cắt nhỏ Phơi khô mẫu dưới nắng tự nhiên trong hai ngày, sấy khô một lần nữa bằng tủ sấy công nghiệp ở nhiệt độ 45o

C Mẫu được xay nhỏ

thành bột và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là

n-hexan, EtOAc, MeOH/H2O Mẫu được chiết ba lần với mỗi loại dung môi Gộp các dịch chiết của từng loại dung môi, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp tách và tinh chế chất

Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc khí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc khí cột gồm sắc khí cột thường và sắc khí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silica gel Đối với các chất phân cực cao có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi thích hợp

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT- IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR)

như 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC Các loại phổ được

đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào

2.2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu của

các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minium inhibitor

concentration – nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration – nồng độ ức chế 50%), MBC (Minium bactericidal concentration – nồng độ

diệt khuẩn tối thiểu)

2.2.4.1.1 Các chủng vi sinh vật kiểm định

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:

- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không

gây bệnh

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương,

vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột

lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu

hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây

nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,

nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và

các bệnh phụ khoa

2.2.4.1.2 Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm men

2.2.4.1.3 Cách tiến hành

 Pha loãng mẫu thử:

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 g/ml và với chất sạch là 128 g/ml

- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế

sự phát triển của vi sinh vật

- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường

nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data

- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

 Chất tham khảo

STT Loài C ủn C ất t m k ảo IC 50

(g/ml)

1 Staphylococcus

aureus ATCC 13709 Ampicillin 0,0015

2 Bacillus subtilis ATCC 6633 Ampicillin 0,0078

3 Lactobacillus

fermentum Lp B14 Ampicillin 1,11

4 Salmonella enterica ATCC 13076 Ampicillin 0,138

5 Escherichia coli ATCC 25922 Streptomycin 0,186

6 Pseudomonas

aeruginosa ATCC 15442 Streptomycin 15,56

7 Candida albicans ATCC 10231 Amphotericin B 0,263

2.2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) tạo ra gốc oxy hóa tự do được dùng để sàng lọc các chất chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được đánh giá dựa trên khả năng loại bỏ gốc tự do thông qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng đo tại bước sóng  = 517 nm

 Cách thử hoạt tính DPPH

Được tiến hành trên đĩa 96 giếng Chuẩn bị dung dịch DPPH nồng độ 0,5 mM trong metanol và đưa vào các giếng Bổ sung chất thử (pha trong DMSO 100%) sao cho nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 256; 64; 16; 4; 1

g/ml Ủ đĩa ở 370 C trong 30 phút để phản ứng diễn ra Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng trên máy quang phổ Tecan Genios ở bước sóng

517 nm (Absorption) Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của mẫu thử ở các nồng độ khác nhau được tính theo công thức:

SC % = (ODđối chứng âm – ODmẫu thử)/ ODđối chứng âm x100%

SC: Scavenge capacity - khả năng bẫy gốc tự do