phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá phục vụ chọn tạo giống lúa lai ba dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI Là VINH HOA PHÁT HIỆN NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA LAI BA DÒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LÃ VINH HOA

PHÁT HIỆN NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA LAI BA DÒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số : 62 62 05 01

Người hướng dẫn : 1.PGS.TS PHAN HỮU TÔN 2.GS TS LÝ DƯƠNG THỤY

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng ñây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa ñược công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác

Tất cả các thông tin trích dẫn sử dụng trong luận án ñều ñược ghi rõ nguồn gốc Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả

Lã Vinh Hoa

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ñến PGS.TS Phan Hữu Tôn của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và GS.TS Lý Dương Thụy của Viện Khoa học Nông nghiệp Quảng Tây, Trung Quốc ñã tận tình hướng dẫn

và tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận án tiến sĩ này

Xin cảm ơn các Thầy cô giáo, kỹ thuật viên và sinh viên của Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Khoa Nông học giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 07 năm 2010

Tác giả

Lã Vinh Hoa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 5

1.2 Các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá lúa, phân lập và lây nhiễm nhân tạo 11

1.3.1 Khái niệm về tắnh kháng và phân tắch di truyền tắnh kháng 18

1.3.3 Nghiên cứu chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh

1.3.6 Ứng dụng chỉ thị phân tử nghiên cứu gen kháng bệnh bạc lá 24

1.4.4 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của một số dòng bố mẹ

1.6.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử ựánh dấu gen phục hồi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.4.1 Nội dung 1: Sử dụng chỉ thị phân tử DNA tìm nguồn gen

2.4.2 Nội dung 2: đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây

2.4.3 Nội dung 3: đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học các mẫu

2.4.4 Nội dung 4: Lai thử các dòng CMS với các giống có chứa

gen kháng bệnh, tìm các dòng duy trì, dòng phục hồi, dòng

2.4.5 Nội dung 5: đánh giá khả năng cho ưu thế lai về những tổ

hợp chứa gen (Xa4, Xa7) kháng bệnh bạc lá ở con lai F1 58

3.1 Phát hiện các mẫu giống mang gen kháng bệnh bạc lá trong

3.1.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh

3.1.2 đánh giá tỷ lệ mẫu giống chứa gen kháng bạc lá ở các loài phụ 623.1.3 Kết quả ựánh giá tắnh kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo 643.2 đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học của các mẫu giống lúa chứa

3.2.2 Kết quả chọn lọc các mẫu giống theo các tắnh trạng mục tiêu 823.3 Phát hiện dòng có khả năng chứa gen duy trì, phục hồi và có tế

3.3.1 Kết quả ựánh giá khả năng chứa gen duy trì, phục hồi của

3.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA xác ựịnh các dòng duy trì,

3.4 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá và một số tắnh trạng của

3.4.2 Một số tắnh trạng nông sinh học của con lai F1 và tuyển chọn

MAS : Marker assisted selection

NIL : Near isogenic line, dòng ñẳng gen

NSCT : Năng suất cá thể

QTLs : Quantitative trait loci

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP : Restriction Fragment Length polymorphism

TGMS : Thermo sensitive Genic Male Sterile

Dòng bất dục ñực chức năng di truyền nhân mẫn cảm với nhiệt ñộ TGST : Thời gian sinh trưởng

WA : Bất dục ñực hoang dại (Wild Abortive)

DANH MỤC BẢNG

1.4 Trình tự mồi trong nhân gen PCR phát hiện gen kháng bệnh bạc

1.7 Kiểu gen dòng bất dục và duy trì cho các dạng CMS WA, HL và BT 401.8 Một số dạng CMS và dòng bố lúa lai 3 dòng ựang sử dụng ở

1.9 Khả năng phục hồi tắnh trạng số lượng do nhiều gen quy ựịnh 46

2.3 Chỉ thị DNA sử dụng ựể phát hiện và chọn lọc gen kháng bệnh

2.6 Chuẩn bị dung dịch TAE (2M Tris Ờ acete pH 8,0; 0,05M EDTA) 54

2.8 Chỉ thị DNA sử dụng ựể phát hiện gen duy trì, phục hồi và CMS 583.1 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các mẫu giống lúa

3.2 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá các mẫu giống lúa chứa

3.3 Một số ựặc ựiểm nông sinh học của các mẫu giống loài phụ

Indica chứa gen Xa4 733.4 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các mẫu giống loài phụ

3.5 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các mẫu giống loài phụ

3.6 Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các mẫu giống loài phụ

3.7 Kết quả tuyển chọn bằng chỉ số chọn lọc các mẫu giống thuộc

3.8 Kết quả tuyển chọn bằng chỉ số chọn lọc các mẫu giống thuộc

3.9 Kết quả tuyển chọn bằng chỉ số chọn lọc các mẫu giống thuộc

3.10 Kết quả tuyển chọn bằng chỉ số chọn lọc các mẫu giống thuộc

3.16 Kết quả phát hiện các mẫu giống chứa gen CMS, duy trì và phục hồi 953.17 Các mẫu giống lúa có triển vọng phục vụ công tác chọn tạo lúa

3.20 Một số ñặc ñiểm nông sinh học các tổ hợp hữu dục của con lai F1 102

3.22 Kết quả tuyển chọn mốt số tổ hợp tốt bằng chỉ số chọn lọc 105

DANH MỤC HÌNH

1.2 Tần suất phân bố các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá ở miền Bắc và

1.3 Bản ñồ phân bố các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt

1.4 Bản ñồ một số gen kháng bệnh bạc lá lúa liên kết với chỉ thị RFLP 22

MỞ ðẦU

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây

ra là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng ñối với nhiều vùng trồng lúa trên thế giới, ñặc biệt ñối với vùng nhiệt ñới có trình ñộ thâm canh cao Ký sinh gây bệnh hiện thường tồn tại rất nhiều nòi sinh lý khác nhau tùy theo mỗi nước và mỗi vùng sinh thái, khác nhau về tính gây bệnh và tính ñộc ñối với các giống (Zhang Qi,et al 2007) [111]

Ở miền Bắc Việt Nam bệnh có thể phát sinh phát triển ở hầu hết các vụ trồng lúa Tuy nhiên, bệnh hại nặng ở vụ mùa hơn vụ xuân Vụ mùa bệnh có thể phát sinh sớm từ tháng 8 Vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh vào tháng 3-4, phát triển mạnh hơn vào tháng 5-6 khi lúa trỗ và chín Cây lúa có thể bị giảm năng suất từ 20-25% khi bệnh phát triển sớm và hại ở lá ñòng (Mohiuddin, et al.1997) [46]

ðể phòng trừ bệnh, người ta ñã sử dụng một số biện pháp như: xử lý hạt giống trước khi gieo; Bón phân cân ñối, bón sớm, tập trung Về thuốc hoá học ñể phòng trừ người ta sử dụng thuốc Sasa.v.v Tuy nhiên, sử dụng giống kháng bệnh có hiệu quả kinh tế hơn cả vì không gây ô nhiễm môi trường và tạo ra nông sản sạch, chi phí cho công tác phòng trừ ít, không tốn kém

Hiện người ta ñã xác ñịnh ñược 30 gen kháng bệnh khác nhau trên thế giới Tương ứng với mỗi gen kháng bệnh cũng tồn tại nhiều chủng bệnh khác nhau tùy từng vùng sinh thái trồng lúa, có gen kháng ñược chủng này nhưng lại nhiễm bởi chủng khác, hoặc mỗi gen có thể bị nhiễm hoặc kháng ñược nhiều chủng (Xu J L, 2007) [102], ( Zhang Qi, 2007) [108]

ðể chọn tạo giống kháng bệnh bền vững, lâu dài thì cần phải tổ hợp ñược nhiều gen kháng vào một giống, các gen này kháng ñược các chủng bệnh ñang tồn tại ở giống lúa trong sản xuất, muốn làm ñiều ñó thì cần phải

xác định được gen kháng hữu hiệu các chủng đang tồn tại và sẽ xuất hiện các giống lúa trong sản xuất ở các vùng sinh thái khác nhau

Việt Nam là nước cĩ nguồn gốc xuất xứ cây lúa, cĩ nguồn gen lúa địa phương đa dạng và phong phú Hiện vẫn cịn tồn tại nhiều giống lúa địa phương đang được trồng ở vùng núi nơi cĩ trình độ thâm canh chưa cao Các giống lúa địa phương do quá trình chọn lọc tự nhiên lâu đời cĩ nhiều đặc điểm tốt như: chất lượng tốt, thích ứng, chống chịu cao, đặc biệt là cĩ khả năng kháng bệnh bạc lá Chính vì thế cần phải thu thập đánh giá, khai thác và

sử dụng nguồn tài nguyên di truyền phong phú này khơng những để xây dựng

dữ liệu di truyền khoa học cho các nhà chọn tạo giống sử dụng mà cịn phục

vụ trực tiếp cho các chương trình chọn tạo giống lúa lai năng suất cao, ngắn ngày, chất lượng tốt và kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam

Thời gian vừa qua, Việt Nam cĩ nhập nội một số giống lúa lai ba dịng được chọn tạo ở Trung Quốc, các giống này cĩ nhiều ưu điểm như năng suất cao, chất lượng tốt, kháng được các chủng bệnh bạc lá ở Trung Quốc, nhưng khi nhập nội vào Việt Nam cĩ thể do điều kiện sinh thái, chủng vi khuẩn khác nhau nên thường bị nhiễm bệnh nặng Nhiệm vụ đặt ra cho các nhà chọn giống Việt Nam là phải tìm, sử dụng và tạo được các dịng giống bố mẹ cĩ chứa gen kháng bệnh bạc lá, để tạo ra các tổ hợp lúa lai F1 ba dịng vừa cĩ năng suất cao, chất lượng tốt vừa kháng được bệnh bạc lá là việc làm cần thiết

Chính vì thế chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá phục vụ chọn tạo giống lúa lai ba dịng”

2.1 Mục đích

+ Phát hiện gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, Xa7) trong các tập đồn mẫu

giống lúa

+ Sử dụng các mẫu giống mang gen kháng bệnh bạc lá lai với một số dòng CMS và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện giống mang gen duy trì, bất dục CMS và phục hồi

+ Chọn ựược một số dòng có mang gen kháng bệnh bạc lá, gen duy trì, bất dục và phục hồi phục vụ chọn tạo lúa lai ba dòng, năng suất cao, kháng bệnh bạc lá

2.2 Yêu cầu

+ đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học của mẫu giống lúa

+ Sử dụng phương pháp chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh bạc lá

+ Sử dụng 10 chủng vi khuẩn bệnh bạc lá lây nhiễm nhân tạo với mẫu giống lúa

+ Sử dụng mẫu giống chứa gen kháng bệnh bạc lá lai thử với một số dòng CMS, ựánh giá con lai F1

+ Sử dụng phương pháp chỉ thị phân tử DNA xác ựịnh khả năng mang gen duy trì, bất dục và phục hồi

+ đánh giá ưu thế lai

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

+ Phát hiện được 76 mẫu giống chứa gen Xa4, 26 mẫu giống chứa gen

Xa7 và 1 mẫu giống chứa cả gen Xa4 và Xa7

+ Phát hiện được 7 mẫu giống cĩ chứa gen duy trì, 3 mẫu giống mang gen quy định tế bào chất bất dục dạng “WA” và 7 mẫu giống cĩ khả năng chứa gen phục hồi

+ Chọn lọc được 5 mẫu giống lúa và 3 tổ hợp lai F1 năng suất cao, kháng bệnh bạc lá

ðề tài sử dụng 304 mẫu giống lúa, một số dịng CMS, duy trì, phục hồi, đánh giá một số đặc điểm nơng sinh học, đánh giá khả năng chống chịu bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo và kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá ðồng thời sử dụng một số mẫu giống lúa cĩ chứa gen kháng bệnh bạc lá lai thử với một số dịng CMS, sau đĩ sử dụng kết quả đánh giá con lai F1 bất dục và hữu dục để dự đốn khả năng chứa gen duy trì, phục hồi bằng phương pháp chỉ thị phân tử DNA phát hiện khả năng chứa gen duy trì, phục hồi và mang gen bất dục tế bào chất dạng “WA” của chúng

Tồn bộ quá trình đánh giá đặc điểm nơng sinh học, lây nhiễm nhân tạo, phân tích PCR được thực hiện tại cánh đồng số 4 - Khoa Nơng học và phịng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ mơn Cơng nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Cơng nghệ sinh học – Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI

1.1 NGHIÊN CỨU BỆNH BẠC LÁ LÚA

1.1.1 Bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae (Ishiyama) pv oryzae, Swings gây ra Ishiyama (1922) [36] ñầu tiên ñặt tên là Bacterium oryzay Năm 1939, Dowson ñổi tên là Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson Năm

1978, Dye ñặt tên là X.campestris pv oryzae (Ishiyama) Dye Năm 1990, Swings et al [59] phục hồi lại tên Xanthomonas oryzae Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae pv oryzae, viết tắt là Xoo (Zhang Qi, 2007)

[109]

Bệnh bạc lá lúa ñược phát hiện ñầu tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm

1884 - 1885 Hiện nay bệnh phổ biến ở hầu khắp các nước trồng lúa trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin, Ấn ðộ v.v…Ở Việt Nam bệnh bạc

lá lúa ñã ñược phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, ñặc biệt từ năm

1965 - 1966 trở lại ñây, bệnh thường xuyên phá hại nặng ở các vùng trồng lúa miền Bắc, nơi gieo trồng các giống nhập nội có năng suất cao ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa nhưng ñặc biệt hại nghiêm trọng ở vụ mùa (Vũ Triệu Mân và ctv, 1998) [6], (Lê Lương Tề và ctv, 2007) [10]

Cây lúa có thể bị giảm năng suất tới 20-25% khi bệnh phát triển và hại

trên lá ñòng Theo nghiên cứu của Sharma et al (1984) [57] về thời gian nhiễm bệnh cho thấy lúa có thế bị giảm năng suất tới 54-57% nếu bệnh phát triển sớm vào giai ñoạn ñẻ nhánh tối ña, bị giảm năng suất 30-48% khi bệnh phát triển vào thời kỳ ñòng và bị giảm năng suất tới 29-38% khi bệnh phát triển vào thời

kỳ nở hoa Mohiuddin et al (1977) [46] khi phân tích mối quan hệ giữa diện tích lá bị bệnh với năng suất, cho thấy: Năng suất giảm 5-6% thì diện tích lá bị bệnh 10%, giảm năng suất 17-46% diện tích lá bị bệnh 25-100%

1.1.3 Triệu chứng bệnh

Bệnh bạc lá phát sinh phá hại

suốt từ thời kỳ mạ ñến khi lúa chín,

nhưng có triệu chứng ñiển hình là thời

kỳ lúa cấy trên ruộng từ sau khi lúa ñẻ

– trỗ – chín sữa (xem hình1.1)

- Trên mạ: Triệu chứng bệnh

không thể hiện ñặc trưng như trên cây

lúa, do ñó cũng dễ nhầm lẫn, vết bệnh

có ñộ dài ngắn khác nhau, có màu

xanh vàng, nâu bạc rồi khô xác

- Trên cây lúa: Triệu chứng bệnh

thể hiện rõ rệt hơn, tuy nhiên vết bệnh

có thể biến ñổi ít nhiều tuỳ theo giống

và ñiều kiện ngoại cảnh Vết bệnh lúc ñầu xuất hiện từ mép lá, mút lá lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính, nhưng cũng có khi vết bệnh xuất hiện từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra Vết bệnh lan rộng theo ñường gợn sóng màu vàng, sau ñó mô bệnh chuyền xanh tái, vàng lục và nâu, bạc khô và chết

Kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây - Trường ðại học Nông nghiệp

Hà Nội cho thấy có hai loại hình triệu chứng của bệnh bạc lá là: Bạc lá gợn vàng

1.Bệnh lá mới 2.Bệnh lá hậu kỳ 3.4 Dịch

vi khuẩn 5.Héo lá 6.Bệnh cây chen ra mủ

7 Dạng vi khuẩn [93]

Hình 1.1 Bệnh bạc lá lúa

và bạc lá tái xanh, loại hình bạc lá gợn vàng là phổ biến trên hầu hết các giống

và ở các mùa vụ, cịn loại hình bạc lá tái xanh thường chỉ thấy xuất hiện trên một

số giống lúa mẫn cảm, ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to, thế lá đứng, ví dụ như giống T1, X1, NN27 v.v (Vũ Triệu Mân và ctv, 1998) [6]

Thơng thường ranh giới giữa mơ bệnh và mơ khoẻ được phân biệt rõ ràng, cĩ giới hạn theo đường gợn sĩng màu vàng hoặc khơng vàng, cĩ khi chỉ

là một đường viền màu nâu đứt quãng hay khơng đứt quãng

Trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao, trên bề mặt vết bệnh dễ xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn hình trịn nhỏ, cĩ màu vàng đục, đơi khi keo đặc rắn cứng và cĩ màu nâu hổ phách

Tuy nhiên, nếu vết bệnh quá cũ, vết bệnh sẽ biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống và điều kiện ngoại cảnh, nhất là ở giai đoạn mạ, v.v Do vậy, dễ nhầm lẫn với bệnh vàng lá hoặc khơ đầu là do sinh lý Vì thế, muốn chẩn đốn nhanh và chính xác, nên áp dụng phương pháp giọt dịch, là phương pháp chẩn đốn nhanh, sớm và cho kết quả chính xác Cách tiến hành như sau: Cắt hai đầu đoạn vết bệnh dài 3-5cm, quấn bơng thấm nước thành từng bĩ nhỏ vào phía nối, đặt vào cốc nước vơ trùng hoặc nước muối sinh lý 0,85%, ngâm ngập 2/3 Trên cốc đậy nắp kín Sau 2-3 giờ hoặc qua đêm nếu phía các mơ lá bệnh xuất hiện các giọt dịch nhỏ màu hơi vàng trên đầu lát cắt, đĩ là biểu hiện giọt dịch vi khuẩn bệnh bạc lá (Lê Lương Tề và ctv, 2007) [10]

1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzae pv oryzae cĩ dạng hình

gậy hai đầu hơi trịn, cĩ một lơng roi ở một đầu, kích thước 1-2 × 0,5-0,9µm (Vũ Triệu Mân và ctv, 1998) [6]

Trên mơi trường nhân tạo khuẩn lạc của vi khuẩn cĩ dạng hình trịn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm gram âm Vi khuẩn khơng cĩ khả năng phân giải nitrat, khơng dịch hố gelatin, khơng tạo

NH3, indon, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có ñường Nhiệt ñộ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26-30ºC, nhiệt ñộ tối thiểu 0-5ºC, tối ña 40ºC Nhiệt ñộ làm vi khuẩn chết là 53ºC

Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7-8,5, thích hợp nhất là pH 6,8-7,2

Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ ñộng, có thể xâm nhiễm qua thủy khổng, lỗ khí ở trên mút lá, mép lá, ñặc biệt qua vết thương sây sát trên lá Khi ñã tiếp xúc với bề mặt có màng nước, vi khuẩn dễ dàng di ñộng xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương cơ giới mà sinh sản nhân lên về

số lượng và qua các bó mạch dẫn lan rộng ñi Trong ñiều kiện mưa ẩm, gió và nhiệt ñộ thích hợp sẽ thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, trên bề mặt lá bệnh tiết

ra những giọt keo vi khuẩn, thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới các lá, cây khác ñể tiến hành xâm nhiễm Vì thế bệnh bạc lá tuy là một loại bệnh có cự ly truyền lan hẹp, song nó còn tuỳ thuộc vào mưa, gió, dông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh có thể truyền lan với phạm

vi không gian tương ñối rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, ñó là một trong những nguyên nhân quan trọng làm cho bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh sau những ñợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ lúa mùa ở miền Bắc Việt Nam (Lê Lương Tề và ctv, 2007)[10]

Về nguồn bệnh bạc lá lúa còn có nhiều ý kiến khác nhau Một số tác giả Nhật Bản cho rằng: Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số loài cỏ dại họ hoà

thảo, các loài cỏ dại này có thể là kí chủ phụ của vi khuẩn X.oryzae

Theo Phương Trung ðạt et al (Trung Quốc) (1991) [79] cho rằng nguồn bệnh chủ yếu tồn tại trên cây lúa bị bệnh hoặc qua tàn dư trên ñồng ruộng và trên hạt giống

Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội thì: Nguồn bệnh bạc lá lúa tồn tại ở hạt giống và

tàn dư cây bệnh là chủ yếu, ñồng thời, nó còn tồn tại ở dạng viên keo vi khuẩn, ở cỏ dại như cỏ lồng vực, cỏ môi, cỏ lá tre, cỏ tranh, cỏ gừng bò, cỏ cá nước, cỏ xương cá lông cứng, ñó cũng là nguồn bệnh cho vụ sau và năm sau (Vũ Triệu Mân và ctv, 1998)[6], (Lê Lương Tề và ctv, 2007)[10]

1.1.5 Quy luật phát sinh phát triển của bệnh

Ở miền Bắc Việt Nam bệnh có thể phát sinh phát triển ở cả vụ lúa chiêm xuân và vụ mùa Trong vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh vào tháng 3-4 nhưng phát triển mạnh hơn vào cuối giai ñoạn sinh trưởng của lúa vào tháng 5-6 dương lịch khi lúa xuân ñã trỗ và chín Nói chung bệnh ở vụ xuân thường nhẹ hơn, tác hại ít hơn so với vụ mùa, trừ một số trường hợp lúa xuân cấy muộn bị bệnh ngay từ giai ñoạn ñòng thì bệnh có thể phát triển nặng

và gây tác hại ít nhiều

Bệnh bạc lá thường phát sinh và gây tác hại nghiêm trọng trong vụ mùa, bệnh có thể phát sinh sớm từ trung tuần tháng 8 ngay khi lúa mùa ñang

ñẻ và tiếp tục phát triển mạnh vào thời kì làm ñòng, trỗ ñến chín Các trà lúa mùa cấy các giống lúa mới dễ mẫn cảm với bệnh thường bị nhiễm bệnh rất sớm và khá nặng, làm giảm năng suất nhiều, ñặc biệt là trong những năm có nhiều mưa bão Các trà lúa cấy muộn hơn vào tháng 10 dương lịch thường bị bệnh nhẹ hơn, do ñó ít ảnh hưởng tới năng suất, nhưng những năm có nhiều mưa bão lúa vẫn có thể bị nặng vì vậy năng suất cũng có thể giảm

Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai ñoạn cây lúa dễ nhiễm bệnh, nhất là lúc lúa làm ñòng ñến chín sữa

Bệnh phát triển mạnh và truyền lan nhanh trong ñiều kiện nhiệt ñộ tương ñối cao 26-30ºC, ẩm ñộ cao từ 90% trở lên Nếu nhiệt ñộ bảo ñảm cho bệnh phát triển, thì ẩm ñộ, lượng mưa lớn có ý nghĩa quyết ñịnh ñến mức ñộ

bị bệnh Những ñợt mưa gió vào tháng 8 không những tạo ra vết thương trên

lá mà còn làm cho vi khuẩn sản sinh nhanh, số lượng keo vi khuẩn hình thành

nhiều, tạo ñiều kiện cho sự xâm nhiễm và truyền lan nhanh chóng Kỹ thuật trồng trọt là một trong những ñiều kiện quan trọng có ảnh hưởng ñến sự phát ktạp, bởi vì một mặt nó ảnh hưởng ñến sự phát triển của cây lúa – làm tăng hay giảm sức chống chịu, mặt khác nó còn ảnh hưởng tới tiểu khí hậu ñồng ruộng Những vùng ñất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ, bệnh thường phát triển nhiều hơn ở chân ñất xấu, cằn cỗi Trong các yếu tố kỹ thuật chăm sóc thì phân bón (ñặc biệt là phân ñạm vô cơ) có ảnh hưởng rõ rệt tới sự phát sinh, phát triển của bệnh Các dạng ñạm vô cơ dễ làm cho cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn ñạm hữu cơ, phân xanh bón vùi giập cũng làm cho lúa nhiễm bệnh mạnh hơn phân chuồng ñược ủ hoai mục

Ảnh hưởng của phân ñạm ñến bệnh bạc lá phụ thuộc vào số lượng ñạm

và thời kỳ bón Nếu bón quá nhiều ñạm, cây lúa xanh tốt, thân lá mềm yếu, hàm lượng ñạm tự do trong cây tích lũy cao thì cây dễ bị nhiễm bệnh nặng Ở

vụ xuân, có thể bón ñạm với số lượng cao hơn vụ mùa Ngoài ra, cùng một lượng ñạm nhưng cách bón, kỹ thuật bón ñều ảnh hưởng rõ rệt tới mức ñộ phát sinh bệnh Bón phân sâu, bón tập trung, bón nặng ñầu nhẹ cuối, bón thúc sớm làm cho cây lúa ñẻ tập trung thì bệnh lá sẽ nhẹ hơn nhiều so với việc bón rải rác và bón muộn Nếu bón ñạm cân ñối với kali và lân thì bệnh sẽ nhẹ hơn nhiều so với việc bón riêng rẽ không cân ñối Tuy nhiên, khi ñã bón với lượng ñạm quá cao (120-150 kg N/ha) thì dù có bón thêm kali và lân thì tác dụng làm giảm bệnh cũng không thể rõ rệt Vì vậy, mức ñộ bón ñạm cân ñối với kali ngay từ ñầu có ý nghĩa hết sức quan trọng với việc phòng chống và hạn chế tác hại của bệnh bạc lá

Ở những nơi ñất chua, úng ngập nước hoặc mực nước sâu, ñặc biệt ở những vùng ñất hẩu, nhiều mùn, hàng lúa bị bóng cây che phủ thì bệnh bạc lá

có thể phát sinh mạnh hơn Những kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Bảo vệ thực vật, Trung tâm Bảo

vệ thực vật phía Bắc, v.v…ñã chứng minh những nhận ñịnh trên

Trong tất cả các giai ñoạn sinh trưởng của cây ñều có khả năng bị bệnh nhưng mức ñộ nhiễm bệnh cũng khác nhau ở các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau Nói chung thời kỳ mạ ñến lúa ñẻ nhánh là thời kỳ bệnh tương ñối ít so với giai ñoạn cuối ñẻ nhánh Giai ñoạn lúa làm ñòng - trổ - chín sữa là giai ñoạn rất mẫn cảm với bệnh, hiện tượng này thể hiện khá rõ nét trên các giống lúa ngắn ngày phàm ăn, chịu phân, có năng suất cao cấy trong vụ xuân và vụ mùa

Nhìn chung, các giống lúa hiện nay ñang trồng trong sản xuất ñều có thể bị nhiễm bệnh bạc lá, nhưng mức ñộ có khác nhau và tác hại cũng khác nhau Các giống lúa cũ, ñịa phương như Di Hương, Tám Thơm … bị bệnh rất nhẹ, còn các giống lúa mới nhập nội có thời gian sinh trưởng dài hoặc ngắn, thấp cây, phàm ăn, phiến lá to có năng suất cao ñều có thể nhiễm bệnh bạc lá tương ñối nặng như NN8, CR203, CR101, IR156 1-1-2, DT10v.v…Tuy nhiên, cũng có một số giống có năng suất cao và có tính kháng ñối với một số nhóm nòi vi khuẩn ñã xác ñịnh (nòi 1; 2; 3 và 4) ở Việt Nam ñó là các giống: IR579; IR22; X20; X21; OM90 v.v…(Vũ Triệu Mân và ctv, 1998)[6]

1.2 CÁC CHỦNG VI KHUẨN BỆNH BẠC LÁ LÚA, PHÂN LẬP VÀ

LÂY NHIỄM NHÂN TẠO

1.2.1 Các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá

Theo Ogawa et al (1983) [54] và Noda et al (1989) [52] nghiên cứu giống kháng và chủng bạc lá cho thấy ở Nhật Bản có 8 giống có chứa gen kháng bệnh bạc lá là: Kinmaze, Kogyoku, Rantai-Emas, Wase Aikoku, Java, Elwee, Heen Dikwee và IR8 tương ứng phát hiện có 9 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá khác nhau là: IA (7174), IB (T7156), II (T7147), IIIA (T7133), IIIB (Q6803), IV (H75303), V (H75304), VI và VII (H8584) (Zhang Qi, 2007) [109]

Các nhà khoa học IRRI ñã tạo ñược các dòng ñẳng gen kháng bệnh bạc lá là: IRBB4, IRBB10, IRBB5, IRBB7, IRBB14 và IRBB21, ñồng thời ñã xác ñịnh

có 10 chủng vi khuẩn Xoo: Race1 (PXO61), Race2 (PXO86), Race3 (PXO79),

Race4 (PXO71), Race5 (PXO112), Race6 (PXO99), Race7 (PXO145), Race8 (PXO280), Race9 (PXO330) và Race10 (PXO341) (Zhang Qi, 2007) [108]

Theo nghiên cứu của Fang Zhong Da et al (1991) [80], Trung Quốc có

5 giống chứa gen kháng bệnh bạc lá là: IR26, Java14, Nan Geng 15, Tetep và Jin Gang30, tương ứng ñã xác ñịnh có 7 chủng vi khuẩn bệnh bạc lá kí hiệu: I,

II, III, IV, V, VI, VII Miền Bắc Trung Quốc vùng trồng lúa Japonica chủ yếu tồn tại là chủng I và II, miền Nam khu vực trồng lúa Indica chủ yếu tồn tại

chủng IV, sau ñó là chủng II, chủng V chỉ rất ít, ñồng bằng Trường Giang khu

vực trồng các loài phụ Indica và Japonica tồn tại chủ yếu các chủng II và IV

(Zhang Qi, 2007) [108]

Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2004) [18], Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã phân lập ñược 10 chủng

vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa và bảo quản tại phòng thí nghiệm Bộ môn

So sánh với các chủng vi khuẩn miền Nam thấy:

Miền Bắc và miền Nam của Việt Nam ñều bị bệnh bạc lá, trong số 10 chủng vi khuẩn tồn tại thì chủ yếu có 7 chủng chính, ñó là chủng 1, chủng 2, chủng 3, chủng 4, chủng 5, chủng 7 và chủng 10 Miền Bắc tồn tại chủ yếu là chủng 1, chủng 2, chủng 3, chủng 4, chủng 5 và chủng 7, trong khi ñó Miền Nam chủ yếu tồn tại chủng 2, chủng 5 và chủng 10 (Phan Hữu Tôn, 2004) [14], (Phan Hữu Tôn và ctv, 2003) [17], (Naruto Furuya, et al., 2002) [48]

Hình 1.2 Tần suất phân bố các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá ở miền Bắc

và miền Nam Việt Nam (Trích theo Naruto Furuya et al., 2002)[48]

Hình 1.3 Bản ñồ phân bố các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá ở miền Bắc

Việt Nam (Trích theo Phan Hữu Tôn, 2004) [18]

1.2.2 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn bệnh bạc lá

+ Phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn Xoo so với các loại vi khuẩn khác thường phát triển chậm hơn

khi nuôi cấy ở môi trường nhân tạo, việc phân lập vi khuẩn sẽ khó hơn, ñặc biệt là từ hạt giống và ñất Thông thường ñể phân lập người ta chọn những vết bệnh còn tươi Vi khuẩn sinh trưởng thích hợp ở ñiều kiện môi trường trung tính hoặc hơi chua (pH 6,5-7,0), nhiệt ñộ thích hợp khoảng 28oC

+ Môi trường nuôi vi khuẩn bệnh bạc lá

Môi trường PSA (Potato semi-synthetic agar) và NA rất thích hợp cho vi khuẩn phát triển, môi trường PSA do Wakimoto (1954) [65] sáng tạo ra

Karganilla et al (1973) [38] nghiên cứu cho thấy môi trường trên nếu thêm 0,05g/L FeSO4 thì vi khuẩn sẽ phát triển rất tốt, vì FeSO4 có tác dụng trung hòa hóa chất Na2HPO4, chất này làm cho sự phát triển của vi khuẩn bị

ức chế Nếu nuôi vi khuẩn với số lượng lớn thì nên sử dụng môi trường WF-P

và SB (Sliver DNA Buddenhagen) (Zhang Qi,2007) [110]

1.2.3 Phương pháp lây nhiễm và ñánh giá khả năng kháng bệnh

Vi khuẩn gây bệnh lây nhiễm qua vết thương vào cây ñể gây hại, con ñường vi khuẩn xâm nhiễm có thể thông qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá, mép lá, ñặc biệt qua vết thương sây sát trên lá, rễ lúa, thân lúa Vì vậy các nhà khoa học ñã lợi dụng vết thương cơ giới ñể lây nhiễm nhân tạo, có nhiều phương pháp lây nhiễm nhân tạo khác nhau

Trước khi nhổ mạ cấy 1-2 ngày, phun ñều vi khuẩn cho lúa, giữ ẩm ñộ sau lây nhiễm, phương pháp này giống với phương pháp lây nhiễm tự nhiên

Phương pháp này tiếp cận xâm nhiễm tự nhiên Phương pháp ngâm do Fang Zhong ða et al (1956) [80] ñề xuất, dùng nước vi chứa khuẩn ngâm tưới luống mạ, phương pháp này thường sử dụng gieo mạ trên khay hoặc diện

tích nhỏ (Zhang Qi, 2007) [110]

Khi cây mạ bị tổn thương rễ khi nhổ cấy hoặc người ta cắt một phần rễ trước khi lây nhiễm, ngâm rễ vào trong nước chứa vi khuẩn với thời gian 3-6 giờ Watanabe (1975) [66] ñã cải tiến phương pháp bằng cách trộn vi khuẩn lẫn vào ñất, sau ñó gieo hạt giống trên ñất khô, làm như vậy sẽ tạo cơ hội xâm nhiễm ñồng nhất khi hạt giống nảy mầm (Zhang Qi, 2007) [110]

Chuẩn bị bọc xốp ñã ñược thấm dung dịch vi khuẩn, ñặt lá lên trên bọc xốp, sử dụng kim ñơn hoặc kim kép ñâm xuyên qua lá ñể tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập (Mukoo H, Yoshid K,1951)[47], (Yoshida K, Mukoo H, 1961) [70]

Do Kauffman et al (1973) [40] ñề xuất, dùng kéo vô trùng nhúng vào

nước chứa vi khuẩn sau ñó cắt một lát cắt cách ñầu lá 1-3 cm (tùy theo thời kỳ sinh trưởng của cây lúa), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào vị trí vết thương Hiệu quả xâm nhiễm của phương pháp này giống với phương pháp bấm kim Hệ số tương quan giữa hai phương pháp tương ứng r = 0,728 – 0,753 (Wu et al 1983) [100] Các nhà khoa học IRRI khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên qui

mô diện tích lớn ñều chủ yếu sử dụng phương pháp cắt ñầu lá

1.2.4 Thời kỳ lây nhiễm và chọn vi khuẩn lây nhiễm

Chọn chủng vi khuẩn ñể ñánh giá: Tiến hành xác ñịnh tính kháng bệnh bạc lá người ta chủ yếu sử dụng các chủng vi khuẩn nội ñịa, kết hợp với việc

bổ sung các chủng vi khuẩn khác Vi khuẩn nuôi trong môi trường 48-72 giờ, dung dịch vi khuẩn lây nhiễm có nồng ñộ từ 108 - 109 tế bào/ml

Thời kỳ lây nhiễm: Các nhà khoa học Nhật Bản cho biết tính kháng bệnh ở thời kỳ mạ không ổn ñịnh, ñề nghị nên lây nhiễm vào các thời kỳ cấy Các nhà khoa học IRRI chủ yếu lây nhiễm vào thời kỳ ñẻ nhánh (sau cấy 45-

50 ngày) ðể xác ñịnh khả năng kháng bệnh của một giống nào ñó thì nên tiến

hành lây nhiễm vào thời kỳ mạ và thời kỳ ñòng thì sẽ chính xác hơn (Zhang

Qi, 2007) [110]

1.2.5 Nghiên cứu về thời gian ñánh giá tính kháng

Về thời gian ñánh giá tính kháng: Ở thời kỳ mạ, thông thường ñánh giá sau 10-14 ngày lây nhiễm, còn ở thời kỳ ñòng, sau 14-21 ngày lây nhiễm

Tiêu chuẩn ñiều tra: Có 3 tiêu chuẩn tham khảo như sau:

+ Ở IRRI theo Kauffman et al (1973) [40] khi sử dụng phương pháp cắt ñầu lá lây nhiễm ñã ñề ra hệ thống ñánh giá chuẩn SES (Standardized evaluation system)

-Tiêu chuẩn phân chia theo diện tích vết bệnh lá khô (ño diện tích vết bệnh của 3 lá trên cùng diện tích bị bệnh, tính trung bình diện tích %), chia ra

9 thang ñiểm như sau:

+ Nếu dùng phương pháp lây nhiễm châm kim, theo Ezuka và Horino chia ra (1974) [32]:

ðiểm :

0 : Không có vết bệnh

1 : Cạnh lỗ kim có màu xám

2 : Chiều dài vết bệnh nhỏ hơn 15 mm

3 :Chiều dài vết bệnh nhỏ hơn chiều dài lá khoảng 1/4 (tính từ lỗ kim châm ñến ñầu lá)

4 : Chiều dài vết bệnh chiếm 1/4 - 1/2 chiều dài lá

5 : Chiều dài vết bệnh chiếm 1/2 – toàn bộ chiều dài lá

6 : Vết bệnh chiếm hết lá, còn một ít có màu xanh

7 : Lá héo hoặc chết, không còn màu xanh

Trong trường hợp này, thang ñiểm 1, 2, 3 là kháng bệnh, thang ñiểm 4,

5, 6, 7 là nhiễm bệnh

Tiêu chuẩn ñiều tra, ñánh giá tính kháng bệnh bạc lá lúa theo Trung Quốc [(Chinese Evaluation System (CES)] (Zhang Qi, 2007) [110]

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn ñánh giá bệnh bạc lá ở lúa Trung Quốc

0 (miễn dịch) Không có vết bệnh Không có vết bệnh

1 (kháng) Vết bệnh nhỏ hơn 2cm Vết bệnh nhỏ hơn 2cm

2 (kháng vừa) Vết bệnh dài hơn 2cm, ñến không quá

1/4 lá

Vết bệnh hơn 2cm, không quá 1/4 lá

3 (nhiễm vừa) Chiều dài vết bệnh chiếm từ 1/4-1/2 lá Lá trên lỗ kim chiết

4 (nhiễm) Chiều dài vết bệnh chiếm từ 1/2-3/4 lá Chiều dài vết bệnh chiếm 1/2-3/4 diện

tích lá

5 (nhiễm nặng) Chiều dài vết bệnh chiếm lá trên 3/4 Chiều dài vết bệnh chiếm lá trên 3/4

+ Thang ñiểm ñánh giá của IRRI:

Tính diện tích vết bệnh và thang ñiểm theo hệ thống tiêu chuẩn ñánh giá cây lúa trong nhà lưới và ñồng ruộng [3]

Bảng 1.2 Thang ñiểm ñánh giá khả năng kháng nhiễm các giống(dùng

cho thí nghiệm nhà lưới)

Bảng 1.3 Thang ñiểm ñánh giá ñồng ruộng (diện tích vết bệnh)

cơ sở ño chiều dài vết bệnh sau 18-20 ngày (vụ mùa)

Nếu:

a) Chiều dài vết bệnh ñánh giá là < 8 cm, kháng bệnh (R)

b) Chiều dài 8-12cm là nhiễm trung bình hay nhiễm vừa (M)

c) Chiều dài >12cm là nhiễm nặng (S)

1.3 DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

1.3.1 Khái niệm về tính kháng và phân tích di truyền tính kháng

Người ta có thể chia tính kháng sâu bệnh thành hai nhóm:

+ Tính kháng dọc (vertical resistance) còn ñược gọi là tính kháng chuyên ñối với một vài nòi sinh lý nhất ñịnh, hay tính kháng không ñồng

nhất, tính kháng chất lượng, tính kháng này thường không bền vững Nhược ñiểm là nòi sinh lý thay ñổi sẽ làm mất tính kháng

Cơ sở và ñặc ñiểm của tính kháng nhiễm này là:

- Sự chuyên tính của một nòi nào ñó cho phản ứng kháng hoặc nhiễm ñối với cây ký chủ

- Tính kháng nhiễm ñược kiểm soát bởi một hoặc một vài gen

- Tính kháng ít chịu ảnh hưởng của môi trường

- Rất hiệu quả ñối với một số ít nòi, nhưng không hiệu quả ñối với nhiều nòi khác

+ Tính kháng ngang (horizontance resistance) là phản ứng kháng tương ñương nhau với hầu hết các nòi và ñược kiểm soát bởi nhiều gen Tính kháng này còn ñược gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng ñồng nhất, tính kháng

ña gen

Cơ sở tính kháng này là do:

- Sự không chuyên tính của các nòi cho phản ứng kháng với nhiều nòi không nhất thiết có cùng mức ñộ

- ðược kiểm soát bởi ña gen

- Chịu ảnh hưởng tương tác với môi trường

- Có hiệu quả kháng ở một mức ñộ nhất ñịnh với nhiều nòi cho dù không cùng mức ñộ như nhau

- Có suy giảm ảnh hưởng nhất ñịnh sau khi hình thành quần thể ký sinh

ñủ mạnh trên cây chủ

Do bản chất di truyền khác nhau nên khả năng kháng ngang, kháng dọc không giống nhau Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban ñầu và trì hoãn sự bùng nổ của dịch bệnh Thời gian tồn tại khả năng kháng dọc phụ thuộc vào sự ña dạng di truyền trong quần thể ký sinh Kháng ngang không làm

giảm bớt nguồn bệnh ban ñầu nhưng lại làm giảm tốc ñộ phát triển của dịch bệnh Do ñó, kháng ngang có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1995) [2]

Di truyền tính kháng chất lượng bệnh lạc lá, theo Zhang (2007) [109], tính kháng của giống với ñộ ñộc tính của chủng có quan hệ ñiển hình, tính kháng của giống do gen chính trong nhân khống chế Biểu hiện di truyền tính kháng của giống là số lượng phụ thuộc vào tính kháng của hai bố mẹ chứa gen chính kháng bệnh, bao gồm gen trội/lặn, tác dụng giữa các gen, liên kết gen, loại hình tính kháng (kháng suốt trong thời gian sinh trưởng hoặc kháng khi cây ñã lớn)

Theo Zhu et al (2000) [96] ñể nghiên cứu mối quan hệ giữa tính kháng bệnh bạc lá ở lúa lai do nhân hay do tế bào chất Họ ñã sử dụng 8 dòng bất dục ñực, dòng duy trì (tế bào chất khác nhau) với 9 dòng phục hồi sử dụng ñể lai tạo con lai F1, sau ñó sử dụng chủng vi khuẩn IV và II (của Trung Quốc) xác ñịnh tính kháng Kết quả cho thấy, tính kháng của con lai F1 do gen trong nhân ñiều khiển và không có quan hệ với tế bào chất (Zhang Qi, 2007) [109]

Di truyền tính kháng là di truyền số lượng bệnh bạc lá: Theo nghiên cứu của Wan và Zhen (2007) [95] cho biết, tính kháng bệnh bạc lá là tính trạng chất lượng di truyền do gen chính khống chế, ñồng thời cũng có thể là tính trạng số lượng di truyền do ña gen khống chế; gen kháng bệnh liên kết với gen không lây nhiễm thì biểu hiện hiệu ứng kháng của gen chính, nếu liên kết với gen ñộc tính thì biểu hiện kháng một phần hoặc tính kháng số lượng; gen chính với QRL (Quantitative Resistance Loci) tác dụng cấu thành phức tạp mang di truyền tính kháng bệnh bạc lá

Tính kháng của giống: Các giống khác nhau có tính kháng khác nhau

rất lớn, thông thường lúa nếp và các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có tính kháng cao hơn loài phụ Inidca; Giống có dạng lá hẹp và ñứng tính kháng cao

hơn lá to và nằm ngang; Giống có thủy khổng lá ít sẽ kháng mạnh hơn giống

có thuỷ khổng lá nhiều; Giống chịu phân tốt sẽ có tính kháng cao hơn giống không chịu phân bón (Xiong et al., 1990) [101]

1.3.2 Gen kháng bệnh bạc lá lúa

Theo Xu và Zhang (2007) [102] tính ñến năm 2006, kết quả ñăng ký trên tạp chí Quốc tế ñã phát hiện ñược 30 gen kháng bệnh bạc lá lúa trong ñó

có 21 gen trội (dominant) (Xa), 9 gen lặn (recessive) (xa), và trong số ñó có

18 gen kháng suốt thời gian sinh trưởng (gồm 2 gen bắt ñầu từ ñẻ nhánh tối

ña biểu hiện tính kháng) và 18 gen kháng ở cây lớn Có 18 gen ñược ñánh

dấu Trên nhiễm sắc thể 1 có 1 gen (Xa29t), nhiễm sắc thể 4 có 4 gen (Xa1,

(Xa7 và Xa27t), nhiễm sắc thể 7 có 1 gen (xa8), nhiễm sắc thể 8 có 1 gen (xa13), nhiễm sắc thể 11 có 7 gen (Xa3, Xa4, Xa10, Xa21, Xa22t, Xa23 và

10 chưa phát hiện chứa gen kháng bệnh bạc lá Gen Xa1, xa5, xa13, Xa21,

Gen xa5 kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá miền Bắc

Việt Nam

Wang Wen Ming (2003) ñã xác ñịnh gen Xa4 nằm ở nhiễn sắc thể số

11, và ñã xác ñịnh ñược marker RFLP nằm giữa G181 và M55, với khoảng

cách di truyền là 4,4cM và 3,8cM Sun et al (2003) [67] ñã ñánh dấu gen này

nằm giữa chỉ thị R1506 và S12886 với khoảng cách di truyền ñều là 0,5cM

Theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và công sự (2004) [18], gen Xa7 là

gen kháng hữu hiệu, gen này kháng ñược hầu hết các chủng bệnh bạc lá miền Bắc Việt Nam

Trong khi ñó Xa14 là gen kháng hữu hiệu chủng bệnh bạc lá ở Trung

Quốc, nằm ở nhiễm sắc thể số 11, Tan Zhen Bo et al (1998) [94] qua marker

RFLP ñã xác ñịnh Xa14 liên kết nằm giữa chỉ thị RG620 và G282 với khoảng

cách di truyền là 20,1cM và 19,1cM

Theo kết quả nghiên cứu của JICA-HUA, một số gen ñã ñược ñịnh vị trên các nhiễm sắc thể khác nhau (xem Hình 1.4) (Naruto Furuya, et al., 2002)[48]

Hình 1.4 Bản ñồ một số gen kháng bệnh bạc lá lúa

liên kết với chỉ thị RFLP

Qua hình 1.4 ta thấy, gen Xa1, Xa2 và Xa12 liên kết nhau và nằm trên nhiễm sắc thể 4S; gen xa5 nằm trên nhiễm sắc thể 5S; Xa7 nằm trên nhiễm sắc thể 6S; xa13 nằm trên nhiễm sắc thể 8S; Xa10, Xa3, Xa4, Xa21 và Xa23 nằm trên nhiễm sắc thể 11S, là các nhiễm sắc thể có chứa nhiều gen Xa nhất

1.3.3 Nghiên cứu chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa

Hiện ñã có một số marker phân tử ñược sử dụng ñể xác ñịnh gen kháng bệnh bạc lá Trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá lúa, người ta sử dụng rất

nhiều gen kháng bệnh khác nhau như: Xa4, xa5, Xa7, Xa13, Xa21 và Xa23

v.v tuỳ theo thành phần mỗi một vùng và khả năng kháng của từng gen Một

số trình tự mồi nhằm phát hiện gen kháng bệnh bạc lá ñã ñược nêu trong bảng

R: 5´agacgcggtaatcgaaagatgaaa3´

1033bp <1 Chunwongse

et al., 1993[30] RM21 F: 5´acagtattccgtaggcacgg3´

R: 5´cgttccatcgatccgtatgg3´

150bp 1,9 Pan et al.,

2003[92] RG556STS xa5 5 F: 5´tagctgctgccgtgctgtgc3´

R: 5´gcagactccagtttgacttc3´

2300bp 3,8 Huang et al.,

1997[35]

1.3.4 Dòng ñẳng gen kháng bệnh bạc lá lúa

Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) ñã xây dựng ñược 3 bộ dòng ñẳng

gen kháng bệnh bạc lá lúa, ñó là các dòng chứa gen Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5,

Xa7 , xa8, Xa10, Xa11, Xa14 và Xa21 Mỗi bộ dòng ñẳng gen có sử dụng nền

gen khác nhau như:

Trên nền gen giống IR24 (thuộc loài phụ Indica) gồm: IRBB1, IRBB2,

IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB8, IRBB10, IRBB11, IRBB14,

IRBB21(Xa21)

Milyang 23 (thuộc loài phụ Javanica) gồm: IRBB101- IRBB111

Còn trên nền gen Toyonshiki (thuộc loài phụ Japonica) gồm: IRBB201- IRBB211 (Ogawa et al.,1991) [53], (Zhang Qi, 2007) [109]

1.3.5 Gen không gây nhiễm của vi khuẩn bệnh bạc lá lúa

Hiện nay, từ vi khuẩn Xoo ñã xác ñịnh và nhân bản các gen không gây nhiễm ký hiệu avr của các gen như avr Xa10, avr Xa7, avr xa5, avr Xa3 và

2007) [97]

1.3.6 Ứng dụng chỉ thị phân tử nghiên cứu gen kháng bệnh bạc lá

Chỉ thị phân tử DNA là bất kì ñoạn DNA nào ñược sử dụng dùng ñể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống,

và giữa các loài ñều ñược gọi là phương pháp chỉ thị DNA ñánh dấu gen

Hiện nay có rất nhiều cách ñánh dấu phân tử như sự ña hình về các isozyme, protein và trình tự DNA Trong ñó chỉ thị phân tử DNA ñược sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu di truyền và chọn giống Trong chỉ thị DNA ñánh dấu gen có 7 phương pháp chính

Bảng 1.5 Các loại chỉ thị DNA chính ñược sử dụng thông dụng

RFLP ða hình chiều dài các ñoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length

polymorphism)

ALP ða hình chiều dài các ñoạn ñược nhân lên phát hiện trực tiếp bằng ñiện di sản

phẩm PCR (Amplicon length polymorphism)

AFLP ða hình chiều dài các ñoạn ñược nhân lên (Amplified fragment length

polymorphism)

RAPD DNA ña hình ñược nhân lên ngẫu nhiên (Random amplified polymorphic DNA)

DA F Phương pháp nhân DNA in vân tay (DNA amplification fingerprinting)

SSR Chỉ thị vi vệ tinh (Simple sequence repeat)

EST ðeo thẻ trình tự biểu hiện (Expressed sequence tags)

+ Chỉ thị phân tử và bản ñồ di truyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ ñược mối quan hệ: giữa Tính trạng – Gen – Môi trường Do vậy, họ có thể dễ dàng ñưa ra một chiến lược thích hợp và chuẩn xác trong chương trình chọn

giống của mình nhằm tìm kiếm, phát hiện ñược những biến dị di truyền giữa các cá thể trong quần thể phân ly, giữa các dòng, giống trong loài

+ Chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm Họ có thể quy tụ một số gen quý vào một giống, tạo giống

1.4.1 Chọn giống kháng bệnh bạc lá lúa ở Trung Quốc

+ Chọn giống lúa thuần kháng bệnh bạc lá

Chọn tạo giống kháng thuộc loài phụ Indica: theo Lin et al (1991) [87]

năm 60-70 ở Trung Quốc khi nghiên cứu khả năng kháng nhiễm các giống thấy trong số 177 giống nghiên cứu có 17 giống kháng (hoặc kháng vừa) bệnh bạc lá, chiếm 9,6%, giống tiêu biểu là Sang Zhu Zhuan, Jiangxi Si Miao Năm 1971-1980, trong số 296 giống có 53 giống kháng (hoặc kháng vừa) bệnh bạc

lá, chiếm 18,5%, có một số giống kháng tốt liên tục trên 10 năm, ñiển hình là giống E Zhao số 6, giống kháng vừa Guang Er 104 và Qing Gan Huang, giống kháng tốt nhất là Xiang Zhao Xian 3 Thời kỳ năm 1981- 1986, công tác nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá ở Trung Quốc ñã ñạt ñược thành công rất nhiều, diện tích trồng lúa trên 7000ha/năm có 87 giống, trong

ñó có 32 giống kháng tốt (hoặc kháng vừa) chiếm 36,8%, giống tiêu biểu kháng cao nhất là Te Qing, Qing Hua Ai 6, Wan Hua Ai 1, Qing Ye Qing Feng, 29 Feng và 32 Ai.v.v ðối với lúa lai từ 1990 ñến năm 2005, Trung

Quốc ñã công nhận thẩm ñịnh 271giống thuộc loài phụ Indica, khu Hoa Nam

và ñồng bằng Trường Giang có 191 tổ hợp, trong ñó lúa thường có 34 giống,

kháng bệnh bạc lá có 12 giống, chiếm 35,3% Giống tiêu biểu là Te Shan Zhan (năm 1997-2005, diện tắch trồng 465.000ha), Gia Yu 948 (năm 1997-

2005, diện tắch trồng 1.497.000ha), Yang Tao 6 (năm 2000-2005, diện tắch trồng 321.000ha), Ming Yan Nuo(năm 1994-2005, diện tắch trồng 199.000ha), Yue Feng Zhan (năm 2000-2005, diện tắch trồng 293.000ha), Feng Hua Zhan (năm 2002-2005, diện tắch trồng 124.000ha), Gia Zhao 935 (năm 1999-2005, diện tắch trồng 164.000) Giống kháng bệnh bạc lá (cấp 1)

E Zhao 18 năm 2005 thông qua thẩm ựịnh, trong năm 2004 ựã trồng 410.000ha (Yang Si Hua et al., 2005) [104]

+ Chọn giống kháng bệnh loài phụ Japonica

Từ 1960-1970 ở Trung Quốc, các giống thuộc loài phụ Japonica có

diện tắch gieo trồng trên 7000ha có 123 giống, trong ựó có 25 giống kháng bệnh bạc lá, chiếm 20,3% Từ 1971-1980 có 182 giống, trong ựó có 52 giống kháng bệnh bạc lá, chiếm 28,6% Từ 1981-1986 có 46 giống, trong ựó có 13 giống kháng bệnh bạc lá, chiếm 28,3%

Theo Yang et al (2005) [104] thống kê, từ 1996-2005, ở miền Nam

Trung Quốc ựã thẩm ựịnh có 4 giống thuộc loài phụ Japonica kháng bệnh bạc

lá ựó là: Wu Yun Geng 7, Zhe Nong Da 454, Zhen Tao 6 và Shao Nuo 9714, trong ựó giống Wu Yun Geng từ năm 1998-2005 ựược trồng với diện tắch

2.311.000ha Miền Bắc Trung Quốc là vùng trồng lúa Japonica phổ biến, có

môi trường sinh thái khác nhau nên bệnh bạc lá phát sinh cũng khác nhau Người ta phát hiện thấy giống kháng bệnh bạc lá Kinh Yue ở vùng Hoa Bắc, đông Bắc trồng ở ựó suốt 27 năm, biểu hiện năng suất cao và ổn ựịnh, từ

1969 ựến 1996 diện tắch 267.000ha Ở vùng Hà Bắc, Hà Nam, Thiên Tân trồng lúa kháng bệnh bạc lá tắch lũy diện tắch trên 333.000ha có giống Xin Tao 68-11(1978-1994, 439.000ha), Yi Geng 8 (1985-1998, 412.000ha), Liao Yan 2 (1998-1994, 355.000ha) Theo Yang et al (2005) [105] vùng lúa miền

Bắc trong những năm 1996-2005 thẩm ựịnh 64 giống (Japonica), chủ yếu

thuộc đông Bắc, vùng này chủ yếu chọn giống kháng ựạo ôn, vì chỉ có 5 tổ hợp kháng bệnh bạc lá: Liao Geng 294, Zhong Zuo 93, Zhao Shan 1, Lian Geng 2 và Xin Dao 10 (Zhang Qi, Que Geng Sheng, 2007) [111]

+ Chọn giống lúa lai kháng bệnh bạc lá

Lúa lai 3 dòng loài phụ Indica có các dạng CMS như: CMS-WA,

CMS-G, CMS-D, CMS-DA, CMS-IA, CMS-HL Các dạng bất dục tế bào chất này ựều không kháng ựược bệnh bạc lá Ly et al (1993) [119] ựã xác ựịnh ựược một số vật liệu có tắnh kháng bệnh bạc lá tại Trung tâm nghiên cứu lúa lai Hồ Nam, trong số 175 dòng bất dục và 185 dòng duy trì nghiên cứu, chỉ có 1 dòng bất dục và 3 dòng duy trì biểu hiện kháng vừa, con lai ựều không kháng bệnh bạc lá Tuy nhiên trong số các dòng phục hồi của các dạng CMS trên, người ta ựã phát hiện một số dòng phục hồi như IR24, Tai Jin 1,

Mi Yang 46, IR26, IR28, IR30, IR32, IR36, IR50, IR54, Ce 64-7 và Gui 99

có chứa gen Xa4, gen này có khả năng kháng bệnh bạc lá bổ sung cho dòng

bất dục kháng Từ năm 2003-2005 trong số các dòng bất dục có dòng 29A, Zhong 1A và H28A là có biểu hiện tắnh kháng vừa trở lên (Yao, 2003 et al.) [106] Luo et al (2005) [88] kết hợp lai truyền thống với sử dụng chỉ thị phân

tử DNA, ựã thành công chọn ựược dòng bất dục có phổ kháng rộng như

R106A chứa gen Xa21 và Xa23

Năm 1973-1986 ở Trung Quốc ựã chọn tạo ựược 87 tổ hợp lúa lai 3

dòng (Indica), trong ựó kháng vừa có 31 tổ hợp, chiếm 35,6% Nếu tắnh diện

tắch trồng ựạt 267.000ha thì có 17 tổ hợp, ựiển hình là: Shan You6, Shan You Gui 33, Shan You Gui 34, Shan You 30 Xian, Wei You 6, Si You 6 và Wei You 64 Năm 1996 Ờ 2005, nhà nước Trung Quốc thẩm ựịnh 169 tổ hợp lúa

lai 3 dòng (Indica), trong ựó chỉ có 18 tổ hợp kháng bệnh bạc lá, chiếm 10,7%

(Yang et al., 2005) [105], tổ hợp Zhong II You 084, Te You Duo Xi 1, Zhong

9 You 838, Feng You Xiang Zhan, K You 047, You You 128, riêng tổ hợp K You 402 có khả năng kháng bệnh ựạo ôn nữa

Ngoài ra các nhà chọn giống Trung Quốc còn chọn ra ñược một số dòng phục hồi ưu tú Zhu et al (1990) [117] và Zhou et al (1993) [116] ñã sử

dụng các vật liệu chứa gen Xa7 và xa5 ñể chọn tạo ra các dòng phục hồi, trong ñó có chứa gen Xa7 là: Dòng Kuang Hui 63, Kuang Hui 98 và D 205

(Zhang Qi, 2007) [111]

+ Chọn giống lúa lai ba dòng kháng bệnh bạc lá (loài phụ Japonica)

Vào cuối những năm 70 của thập kỷ XX, ở Trung Quốc ñã chọn ra 43

dòng bất dục ñực lúa lai 3 dòng (Japonica) trong ñó có 60% kháng vừa bệnh

bạc lá như: Ly Ming A, Feng Jin A, Qiu Guang A, Liu Qian Xin A, Dang Xian Wan A và Xiu Ling A biểu hiện kháng bệnh bạc lá trung bình

Yuan (2002) [107] cho biết trong số 5 dòng phục hồi (Japonica) nghiên

cứu có 3 dòng kháng bệnh bạc lá vừa, ñó là dòng C418, dòng Hp121 và 77302-1 có khả năng phục hồi tốt và kháng bệnh ñạo ôn tốt

Zhu et al (1990) [117] ñã sử dụng vật liệu dòng DV859 chứa gen Xa7

tạo ra các dòng phục hồi Geng Hui 98, Zhen Hui 084, Yang 818 Sau ñó Zhang và Zhu (2004) [77] ñã sử dụng các dòng phục hồi trên và tạo ra tổ hợp lai Geng You 63, Geng You 98 và K You 818 có năng suất cao, chất lượng tốt

và chứa gen Xa7 (Zhang Qi, 2007) [111]

1.4.2 Chọn giống kháng bệnh bạc lá ở IRRI

Theo Khush (1977) [42] Việc nghiên cứu lúa quốc tế IRRI vào năm

1965 nhập ñã nội vật liệu TKM6, W1264 từ Ấn ðộ và Sigadis của Indonesia tiến hành cải tiến tính kháng bệnh bạc lá Năm 1969 IRRI ñã tạo ra ñược giống IR20 và IR22 là hai giống kháng bệnh bạc lá tốt Sau ñó vào năm 1973-

1975 họ tiếp tục sử dụng vật liệu TKM6 ñã tạo ra các giống kháng bệnh bạc

lá là: IR26, IR28, IR29, IR30 và IR34

Vào những năm cuối của thế kỷ XX, nhiều nước trên thế giới ñã ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá Theo

Huang et al., (1997) [35] các nhà khoa học của IRRI ñã kết hợp chọn giống

truyền thống với chỉ thị phân tử, ñã chuyển thành công gen Xa4, xa5, xa13, và

Xa21 vào giống IR24 và ñã chọn ra ñược 8 tổ hợp chứa 2 gen hoặc 3 gen, ký

hiệu là: 5059 (Xa4 và xa5), 5056 (Xa4 và xa13), 5061 (xa5 và xa21), 5062 (xa5 và xa13), 5063 (xa13 và Xa21), 5064 (Xa4 và Xa21), 5065 (Xa4, xa5 và

xa13 ), và 5066 (Xa4, xa5 và Xa21) ðồng thời, các nhà khoa học IRRI ñã tổ hợp nhiều gen kháng như: Xa4, xa5, Xa7, xa13 và Xa21 vào trong mỗi giống chứa các dòng như là: IRBB59-IRBB66 chứa ña gen (Datta et al., 2002) [31], trong ñó dòng IRBB60 chứa Xa4, xa5, xa13 và Xa21, dòng IRBB64 chứa

Xa4 , xa5, xa7 và Xa21, dòng IRBB65 chứa Xa4, Xa7, xa13 và Xa21 và dòng IRBB66 chứa Xa4, xa5, xa7, xa13 và Xa21 (Mew TW, 2004) [44]

1.4.3 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

Bệnh bạc lá lúa ñược phát hiện lần ñầu tiên ở Việt Nam sau năm 1954 trên các giống lúa ñịa phương cao cây, nhưng mức ñộ gây hại của chúng không nghiêm trọng Khi phong trào thâm canh lúa phát triển, ñặc biệt là việc gieo trồng các giống lúa mới chọn tạo có năng suất cao, chịu phân tốt, kết hợp với sử dụng nhiều phân bón hóa học là nguyên nhân chính dẫn ñến bệnh bạc

lá phát triển và lan tràn trong cả vụ xuân lẫn vụ mùa ở miền Bắc Việt Nam

Trong ba năm từ 2001 – 2003, nhóm nghiên cứu bệnh bạc lá của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã phân lập và bảo quản ñược 154

isolate vi khuẩn Xoo thu thập từ 11 tỉnh miền Bắc Việt Nam trên 27 giống lúa,

ñã xác ñịnh ñược một số gen kháng hữu hiệu với một số chủng bệnh bạc lá ở

các tỉnh phía Bắc là gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 ðồng thời còn khẳng ñịnh sự

có mặt của một gen kháng hữu hiệu trong mỗi dòng, giống có khả năng kháng hoặc bằng gen kháng biểu hiện ñó kết hợp với một gen kháng biểu hiện hoặc không biểu hiện kháng ñó chúng tôi thấy kháng trong cùng một tổ hợp Vì vậy, thay bằng việc chuyển ñồng thời 2 – 3 gen kháng ta chỉ cần tìm cách

chuyển một trong các gen kháng hữu hiệu như xa5 hoặc Xa7 cũng ñủ tạo cây