Nghiên cứu và chế tạo hạt nano chitosan gắn peg bọc insulin ứng dụng điều trị bệnh tiểu đường

LÊ THỊ NỮ THANH NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô Chuyên ngành đào tạo thí điểm LUẬN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO

LÊ THỊ NỮ THANH

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO HẠT NANO CHITOSAN GẮN PEG BỌC INSULIN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐẶNG MẬU CHIẾN

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO

Luận Văn Thạc Sĩ i CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2015

BẢN XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA CÁC THIẾU SÓT CỦA LUẬN VĂN

Trường Đại học Công nghệ đã có Quyết định số 399/QĐ-ĐT ngày 19 tháng 6 năm 2015 về việc thành lập Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ cho học viên Lê Thị Nữ Thanh, sinh ngày 29/05/1987, tại Bình Thuận, chuyên ngành Vật Liệu và Linh Kiện Nano, ngành ………

Ngày 26 tháng 6 năm 2015, Trường Đại học Công nghệ (ĐHCN) đã tổ chức cho học viên bảo vệ luận văn Thạc sĩ trước Hội đồng chấm (có biên bản kèm theo) Theo Quyết nghị của Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ, học viên phải bổ sung và sửa chữa các điểm sau đây trước khi nộp quyển luận văn cuối cùng cho Nhà trường để hoàn thiện hồ sơ sau bảo vệ:

Đề nghị Trường Đại học Công nghệ, ĐHQG HN cho phép học viên được làm các thủ tục khác để được công nhận và cấp bằng Thạc sĩ

Xin trân trọng cảm ơn!

XÁC NHẬN CỦA THÀNH VIÊN HỘI ĐỒNG/HỘI ĐỒNG

ĐỀ NGHỊ HỌC VIÊN SỬA CHỮA LUẬN VĂN

Luận Văn Thạc Sĩ iii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ v CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Lê Thị Nữ Thanh, học viên cao học chuyên ngành Vật liệu và Linh kiện Nano thuộc chương trình liên kết giữa Trường Đại học Công nghệ - ĐHQG Hà Nội và Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP HCM Tôi đã thực hiện đề tài thạc sĩ “Nghiên cứu và chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường” tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG

TP HCM với sự hướng dẫn của PGS.TS Đặng Mậu Chiến

Tôi xin cam đoan những kết quả ghi nhận trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa có trong các công trình nào khác mà tôi không tham gia

Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

Luận Văn Thạc Sĩ vii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Quý Thầy Cô giáo viên cho tôi những kiến thức khoa học quý giá trong quá trình giảng dạy suốt những năm học qua Tôi đặc biệt cảm ơn Thầy PGS.TS Ðặng Mậu Chiến - Giám đốc Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - đã quan tâm tiếp nhận và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi thực hiện Luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn ThS Hồ Thanh Hà đã luôn theo sát, hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình làm các thí nghiệm nghiên cứu, cho tôi những ý kiến đóng góp và cùng tôi thảo luận những vấn đề liên quan đến Luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn các anh, chị, em, bạn bè đồng nghiệp tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - ĐHQG TP HCM đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tôi làm Luận văn

Sau cùng, xin cám ơn các bạn lớp Cao học “Vật liệu và Linh kiện Nano” Khóa 8 đã cùng tôi trao đổi và giải quyết những thắc mắc giúp tôi hoàn thành Luận văn

Xin trân trọng cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, 25 ngày tháng 05 năm 2015

Lê Thị Nữ Thanh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN vii

MỤC LỤC viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH SÁCH CÁCHÌNH xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 4

1.1 Công nghệ nano dược 4

1.1.1 Các thuốc tạo bởi công nghệ nano 4

1.1.2 Hệ dẫn thuốc nano 4

1.2 Bệnh tiểu đường 5

1.2.1 Giới thiệu về bệnh tiểu đường 5

1.2.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 5

1.2.3 Điều trị bệnh ĐTĐ 6

1.3 Tổng quan về insulin 6

1.3.1 Sơ lược về ra đời của insulin 6

1.3.2 Cấu trúc insulin 7

1.3.3 Vai trò của insulin 8

1.4 Tính cấp thiết của đề tài 9

1.5 Hệ tải thuốc nano chitosan gắn mPEG 10

1.5.1 Giới thiệu về vật liệu chitosan 10

1.5.1.1 Cấu trúc của chitosan 10

1.5.1.2 Tính chất của chitosan 10

1.5.1.3 Ứng dụng của chitosan 11

1.5.2 Giới thiệu về nano chitosan 11

Luận Văn Thạc Sĩ ix CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

1.5.3 Giới thiệu về TPP 13

1.5.4 Giới thiệu về mPEG 14

1.5.5 Giới thiệu về chitosan gắn mPEG 15

1.6 Các phương pháp chế tạo nano chitosan 15

1.6.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương 16

1.6.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa 17

1.6.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 17

1.6.5 Phương pháp mixen đảo 19

1.7 Các thiết bị phân tích lý hóa[2] 19

1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM 19

1.7.2 Thiết bị đo phổ truyền qua UV-Vis 20

1.7.3 Máy đo phổ hồng ngoại(IR) 21

1.7.4 Máy phân tích kích thước hạt (particle size analysis) 22

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Hóa chất và dụng cụ- thiết bị 23

2.1.1 Hóa chất 23

2.1.2 Dụng cụ 24

2.2 Phương pháp 24

2.2.2 Quy trình tổng hợp gắn PEG lên chitosan 24

2.2.2.1 Giai đoạn 1 24

2.2.2.2 Giai đoạn 2 25

2.2.2.3 Giai đoạn 3 26

2.2.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin 27

2.2.3.1 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG 27

2.2.3.2 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc Insulin 28

2.2.4 Hiệu suất bao thuốc 30

2.2.4.1 Dựng đường chuẩn nồng độ Insulin bằng UV-Vis 30

2.2.4.2 Xác định hiệu suất bao gói của hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin bằng túi thẩm tách cellulose 31

2.2.4.3 Khả năng phóng thích 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả phản ứng tổng hợp gắn PEG lên chitosan 33

3.1.1 Phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan 33

3.1.2 Phản ứng gắn PEG lên chitosan 34

3.1.3 Phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan 35

3.2 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG 36

3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIR 37

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEG 38

3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan 40

3.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin 42

3.4 Xác định hiệu suất bao gói và khả năng phóng thích 43

3.4.1 Xác định hiệu suất bao gói bằng túi thẩm tách cellulose 43

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 46

A Kết luận 46

A1 Những công việc đã thực hiện 46

A2.Những kết quả đã đạt được 46

B.Hướng phát triển 48

PHỤ LỤC 52

Phụ lục 1: Danh mục các công trình liên quan được công bố 52

Phụ lục 2: Toàn văn các bài báo liên quan được công bố 52

Luận Văn Thạc Sĩ xi CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐHQG TP HCM Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh

TEM Transmission Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử truyền

qua UV-Vis Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến

DLS Phương pháp phân tích kích thước hạtbằng pp tán xạ ánh sáng

(Dynamic Light Scattering)FTIR Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

DANH SÁCH CÁCHÌNH

Hình 1.1: Biến chứng của bệnh tiểu đường 5

Hình 1.2: Loại thuốc điều trị bệnh tiểu đường được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Bangting và Charles Best tìm ra năm 1922 7

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử insulin 8

Hình 1.4: Cấu trúc của chitin và chitosan 10

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Sodium Tripolyphosphate và PGA 13

Hình 1.6: Sự tương tác giữa chitosan và tác nhân liên kết ngang 14

Hình 1.7: Cấu trúc mPEG 15

Hình 1.8: Một trong những cơ chế gắn mPEG lên chitosan 15

Hình 1.9: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương 16

Hình 1.10: Sơ đồ chế tạo bằng phương pháp giọt tụ 17

Hình 1.11: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 18

Hình 1.12: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion 18

Hình 1.13: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo 19

Hình 1.14: Máy TEM JEM 1010 20

Hình 1.15: Máy đo phổ truyền qua UV-Vis, cary 100 Conc 20

Hình 1.16: Máy đo phổ IR Tensor TM 37 21

Hình 1.17:Dao động hoá trị và dao động biến dạng 21

Hình 1 18:Máy phân tích kích thước hạt 22

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng bảo vệ nhóm chức amin 25

Hình 2.2: Phản ứng bảo vệ gốc amin 25

Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng gắn PEG 26

Hình 2.4: Phản ứng gắn PEG 26

Hình 2.5: sơ đồ phản ứng hủy bảo vệ phản ứng gốc amin của chitosan 27

Hình 2.6: Phản ứng hủy bảo vệ gốc amin 27

Hình 2.7: Sơ đồ chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG 28

Hình 2.8: sơ đồ chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin 29

Hình 2.9: Phản ứng chế tạo hạt cts gắn PEG bọc insulin 29

Luận Văn Thạc Sĩ xiii CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Hình 2.10: Phổ hấp thu UV-Vis của Insulin tại các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 75 µg/ml 30 Hình 2.11: Đồ thị đường chuẩn dung dịch insulin tại bước sóng 276nm 31

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi bảo vệ nhóm chức amin 34 Hình 3.2 : Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi gắn PEG 35 Hình 3.3: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan, PEG và chitosan sau khi gắn PEG 36 Hình 3.4: Phổ hồng ngoại FTIR của TPP và hạt chitosan gắn PEG-TPP 37 Hình 3.5: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 1:1 (w/w) 38 Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w) 39 Hình 3.7: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 4:1 (w/w) 39 Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1, 2:1, 4:1 40 Hình 3.9: Ảnh kích thước hạt của hạt nano chitosan gắn PEG theo thời gian theo bảng 3.1 41 Hình 3.10: Ảnh của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1 (w/w) sau 4 tuần 42 Hình 3.11: Ảnh phổ DLS của hạt chitosan gắn PEG –TPP(a) và hạt chitosan gắn PEG bọc insulin(b) 42 Hình 3.12: Ảnh TEM của hạt nano chitosao gắn PEG (a) và hạt chitosan gắn PEG bọc insulin (b) 43 Hình 3.13: Phổ UV-Vis của dung dịch ngoài túi thẩm tách trước và sau khi hiệu chỉnh nồng độ 44 Hình 3.14: Đồ thị nội suy giá trị nồng độ Insulin trong dung dịch mẫu sau khi hiệu chỉnh 44 Hình 3.15: Khả năng phóng thích của insulin theo thời gian 45

Luận Văn Thạc Sĩ 1 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

MỞ ĐẦU

Ngày nay, với sự phát triển trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khỏe con người, nhiều công nghệ mới đã được sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu là ứng dụng của công nghệ nano vào quá trình tổng hợp những chất dẫn thuốc mới, tạo ra những sản phẩm tốt hơn, ngày càng đáp ứng được những yêu cầu cao trong lĩnh vực điều trị bệnh, sản phẩm tạo

ra có đặc tính phân hủy sinh học và không gây hại cho sức khỏe con người

Với sự phát triển như vũ bão về kinh tế làm cho chất lượng cuộc sống ở nước ta cải thiện rất nhiều Tuy vậy, chính sự phát triển nhanh chóng kéo theo sự tăng lên đột biến một số bệnh mang đặc thù của những nền kinh tế phát triển như: bệnh tiểu đường, bệnh gút, bệnh rối loạn chuyển hóa lipid… Trong đó bệnh tiểu đường nằm trong nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa đang trở nên phổ biến và là vấn đề y tế nhức nhối hiện nay Hiện nay, hầu hết việc điều trị bệnh đái tháo đường được thực hiện bằng cách tiêm insulin vào cơ thể mỗi ngày Việc tiêm insulin vào cơ thể được cho là gây nhiều đau đớn và nguy cơ nhiễm trùng Các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới đã tích cực nghiên cứu vấn đề này nhưng chưa đạt được kết quả như ý Insulin bản thân là một protein bị phân hủy nhanh chóng trong thành ruột bởi các men tiêu hóa và môi trường

pH thấp Điều này cản trở việc đưa insulin vào cơ thể bằng đường uống Viên uống insulin có thể giúp bệnh nhân tiểu đường uống thuốc dễ dàng mà không cần phải tiêm Nhờ lớp vỏ bọc, chất insulin được bảo vệ cho đến khi tiếp cận ruột non và được hấp thụ vào máu chứ không bị hủy hoại bởi axit ở miệng, họng và dạ dày Cho đến hiện tại chỉ có thuốc tiêm insulin, một số ít có dạng khác như hít, dán… Chính vì vậy, lĩnh vực thuốc uống insulin thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

Chitosan là một trong những polymer được ứng dụng rộng rãi trong quá trình truyền dẫn thuốc Việc dẫn truyền thành công những loại thuốc như protein, insulin,… là một trong những chủ đề được nhiều nghiên cứu nhiều năm nay trong ngành dược Trong số những phương pháp dẫn truyền khác nhau, dẫn truyền đường uống là cách dẫn truyền thuận tiện nhất, đặc biệt khi quá trình điều trị bệnh kéo dài Hơn nữa với hệ tải này, còn có khả năng giúp quá trình tải thuốc chậm hơn, tăng khả năng hấp thụ insulin vào trong máu, từ đó tăng khả năng trị bệnh tiểu đường của thuốc

Những hạt chitosan gắn mPEG (Methoxypolyethylene glycol amine), là một polymer được sử dụng rất phổ biến cho việc gắn lên bề mặt hạt nano với vai trò làm giảm sự

đào thải của cơ thể đối với thuốc Cấu trúc phân tử mPEG khá đơn giản và linh động mPEG gắn lên bề mặt hạt có vai trò tăng tính ái nước và ái hữu cơ, tính mềm dẻo và tính tương thích sinh học và kéo dài thời gian phân hủy thuốc của hạt Những hạt này gây chú ý bởi khả năng dẫn thuốc và khả năng hòa tan thuốc vào cơ thể, vì chúng có khả năng bảo vệ insulin khỏi sự phân hủy của enzyme trong có trong đường ruột Do kích thước nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, nâng cao hiệu quả trị bệnh tiểu đường[3]

Mục đích của đề tài đề tài luận văn luận văn thạc sĩ ‘‘ Nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường’’ là tạo ra

một hệ dẫn thuốc insulin-chitosan-PEG thành công Việc nghiên cứu này sẽ tạo ra một tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo, nhằm mục đích năng cao hiệu quả dẫn thuốc, tạo

ra một tiềm năng to lớn cho việc sản sản xuất thuốc insulin dùng cho đường uống bởi thị trường này vẫn chưa mở rộng Đây là một lĩnh vực mới mở ra nhiều ứng dụng sau này, ví dụ như việc bọc các loại thuốc khác, ví dụ như vaccine…, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng

Vì vậy, đề tài luận này nhằm xây dựng hệ dẫn thuốc thu được hạt nano chitosan gắn PEG có kích thước nhỏ, dưới 500 nm, hạt đồng đều, có khả năng dẫn insulin hiệu quả nhằm ứng dụng trong dẫn truyền thuốc

 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu quy trình tổng hợp hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa-bay hơi dung môi, để hình thành các hạt nano chitosan, từ đó tìm ra quy trình thích hợp cho việc gắn polyethylen glycol Với mục đích tạo ra các hạt nano chitosan gắn PEG tải insulin ứng dụng cho việc điều trị bệnh tiểu đường Với việc nghiên cứu thành công hệ dẫn thuốc insulin-chitosan-PEG sẽ tạo ra một tiềm năng lớn cho việc sản xuất thuốc uống insulin cho thị trường dược phẩm hiện nay

Luận Văn Thạc Sĩ 3 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

 Nội dung của đề tài bao gồm lời mở đầu, 3 chương kết luận và hướng phát triển:

-Lời mở đầu: Mục đích nghiên cứu và hướng ứng dụng, phát triển của hạt nano chitosan trong việc điều trị bệnh tiểu đường và trong ngành dược phẩm

-Chương 1: Giới thiệu về nano dược hiện nay, các khái niệm về chitosan, nano chitosan, insulin và bệnh tiểu đường, đồng thời giới thiệu khát quát về các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan, và các phương pháp đo đạc khi thí nghiệm

-Chương 2: Trình bày quy trình chế tạo hạt nano chitosan, quy trình gắn PEG lên nano chitosan và quy trình tải insulin vào hạt PEG gắn chitosan Trong phần này cũng giới thiệu các thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm

-Chương 3: Trình bày kết quả nghiên cứu và đánh giá kết quả của các mẫu thí nghiệm được chế tạo bằng hai phương pháp trên So sánh kết quả phân tích kích thước hạt (DLS), cùng với phương pháp phân tích phổ hồng ngoại(FTIR) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các mẫu thí nghiệm, chúng tôi kết luận rằng đã chế tạo thành công các hạt nano chitosan gắn PEG và thực hiện được quy trình tải insulin lên các hạt chitosan gắn PEG có hình dạng rõ và kích thước ổn định theo thời gian tốt

-Cuối cùng là phần Kết Luận và hướng phát triển, chúng tôi nêu lên những công việc đã được thực hiện trong quá trình nghiên cứu và những kết quả nổi bật của luận văn Ngoài ra, hướng nghiên cứu phát triển tương lai của đề tài cũng được đề xuất

CHƯƠNG 1: NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT

1.1 Công nghệ nano dược

Rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành nhằm ứng dụng công nghệ nano trong lĩnh vực điều trị Với kích thước siêu nhỏ, các hạt nano chỉ có thể cấu tạo từ một số rất it các phân tử, khi kích thước của nguyên liệu giảm xuống dưới 100nm, vật chất sẽ thể hiện bản chất của vật lý lượng tử với những đặc tính hoàn toàn mới Ví dụ, vật chất có thể mạnh hơn, nhẹ hơn và có độ hòa tan cao, ít hút ẩm, nói chung là thể hiện đặc tính hóa lý hoàn toàn mới Ngày nay, nhân loại hoàn toàn có thể, với công nghệ nano, tạo

ra nhiều vật liệu, thiết bị và cấu trục hoàn toàn mới [8],[7]

Trong nghành nano dược, các sản phẩm ứng dụng công nghệ nano có thể phân thành 2 lĩnh vực chính: các thuốc tạo ra bởi công nghệ nano và hệ dẫn thuốc nano.[8]

1.1.1 Các thuốc tạo bởi công nghệ nano

Các nhà khoa học dược đã điều khiển các phân tử thuốc để tạo ra những đặc tính vật lý mong muốn thông qua quá trình kết tinh, muối hóa hoặc sử dụng các phân tử nước của dạng kết tinh Nhờ vậy, các phân tử thuốc trở nên bền vững hơn về mặt hóa học, có nhiều ưu việt hơn cho mục đích chế dược học, tăng sinh khả dụng hoặc tăng hiệu quả điều trị.[8]

1.1.2 Hệ dẫn thuốc nano

Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất có kích thước từ vài nanomet tới vài trăm nanomet được sử dụng để vận chuyển dược chất đến các bộ phận trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mong muốn, nói tóm lại là đảm bảo 3 yếu

tố góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều Các dược chất hoặc tác nhân chẩn đoán sẽ được đưa vào bên trong, liên kết hóa học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt Hệ vận chuyển thuốc tiêu biểu có nhiều triển vọng nhất là dạng thuốc liposome.[9]

 Tóm lại, các dược phẩm công nghệ nano và rộng hơn nữa là sản phẩm công nghệ nano sử dụng trong chẩn đoán, phòng ngừa, điều trị bệnh, nâng cao chất lượng sống con người ( ví dụ như mỹ phẩm, dược phẩm…) đã và đang góp phần không những cho cuộc sống con người mà còn tạo ra những chuyển biến lớn cho các ngành sản xuất

Luận Văn Thạc Sĩ 5 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

1.2 Bệnh tiểu đường

1.2.1 Giới thiệu về bệnh tiểu đường

Đái tháo đường, còn gọi là bệnh tiểu đường hay còn gọi là bệnh dư đường, là một trong những nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbonhidrat khi hoóc môn insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao; trong giai đoạn mới phát bệnh, nó thường làm bệnh nhân đi tiểu nhiều,tiểu ban đêm và do đó làm khát nước Bệnh tiểu đường là một trong những bệnh hiểm nghèo, nó gây ra nhiều biến chứng cho bệnh nhân sau này như: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, suy thận, mù mắt,… [6]

Theo thống kê của tổ chức Y Thế Giới (WHO), đái tháo đường (ĐTĐ) xếp thứ 9 trong những bệnh có khả năng gây ra tử vong ở người và là một trong những bệnh có tốc độ người mắc bệnh tăng nhanh nhất Ước tính trong năm 2011, ĐTĐ đã lấy đi sinh mệnh của hơn 1 triệu người, và dự đoán đến năm 2030 trên toàn cầu có thể có tới hơn 336 triệu người mắc bệnh ĐTĐ Nguyên nhân chính gây ra con số tử vong lớn như vậy là

do khả năng gây biến chứng thành những bệnh như tai biến mạch máu não, suy thận, hoại tử chi, nhiễm khuẩn,… [6]

1.2.2 Phân loại bệnh đái tháo đường

Dựa vào các dạng rối loạn hoạt động của insulin, người ta chia bệnh ĐTĐ ra thành 2 type chính:

- ĐTĐ loại 1: các tế bào beta tại tuyến tụy không đủ hoặc không tiết insulin Type 1 chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường, phần lớn xảy ra ở trẻ

em và tuổi thiếu niên Các triệu chứng thường khởi phát đột ngột và tiến triển nhanh

Hình 1.1: Biến chứng của bệnh tiểu đường

nếu không điều trị Giai đoạn toàn phát có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng đường huyết và nhiễm Ceton Những triệu chứng thường thấy của bệnh ĐTĐ type 1 như: ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều, mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng

- ĐTĐ loại 2: xảy ra tình trạng kháng insulin, khi được tiết vào máu, insulin không thực hiện được chức năng của mình do hoạt động của các tác nhân kháng insulin Thường gặp ở người trưởng thành và chiếm phần lớn trong trường hợp bệnh ĐTĐ Đối với bệnh ĐTĐ type 2, bệnh nhân thường ít có triệu chứng và thường chỉ phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu…

1.2.3 Điều trị bệnh ĐTĐ

Insulin được chỉ định dùng cho bệnh nhân ĐTĐ loại 1, nó chỉ dùng cho bệnh nhân ĐTĐ loại 2 khi đã thay đổi chế độ ăn, luyện tập và dùng các loại thuốc điều trị ĐTĐ tổng hợp mà không đạt hiệu quả

Tuy nhiên, việc điều trị bệnh ĐTĐ bằng cách dùng insulin là một quá trình không dễ chịu đối với người bệnh, vì:

 Việc tiêm insulin tùy tình trạng bệnh nhưng hầu hết đều phải tiến hành mỗi ngày, trước mỗi bữa ăn Điều này gây bất tiện cho người bệnh

 Việc tiêm lâu dài khiến cho chỗ tiêm bị bầm tím, cứng lại

1.3 Tổng quan về insulin

1.3.1 Sơ lược về ra đời của insulin

Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại Những tài liệu cổ của người Ai Cập

từ 1500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suy mòn với tình trạng nước tiểu

có vị ngọt[25] Từ những năm 1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi bệnh nhân bị tiểu đường đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năng bình thường Nhiều bác sĩ cho rằng tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảo Langerhan, sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đường trong máu Bệnh tiểu đường xuất hiện khi hóa chất này không được sản sinh

Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Năm 1922, Fred Bangting và Charles Best thu

thông báo họ đã tìm ra insulin và

ĐTĐ ở người Vào thời điểm đó, ng

tại và chưa có biện pháp điều trị hiệu quả n

những bộ xương di động và thư

Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, v

đường ( thử nghiệm có vẻ tàn nh

Họ đã cố gắng tinh chế ra một hoóc môn hóa học từ tụy v

từ tiểu đảo Langerhan Sau đó, những chất n

nghiệm và họ nhận thấy bệnh ĐTĐ đ

1.3.2 Cấu trúc insulin

Insulin là một hoocmon prote

ra Phân tử insulin tương đ

bởi hai chuỗi polipeptit A v

ngoài ra còn có một cầu nối disulfua nằm trong chuỗi A

Ở hầu hết các loài, chuỗi A gồm 21 axit amin c

trình tự các axit amin khác nhau giữa các lo

tử có tính bảo tồn cao, các đoạn có chứa 3 cầu nối disufua, cả hai đầu của chuỗi A vcác nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B Sự t

đến cấu trúc 3 chiều của insulin ở các lo

Hình 1.2: Loại thuốc điều trị bệnh ti

và Charles Best tìm ra năm 1922

Năm 1922, Fred Bangting và Charles Best thuộc đại học tổng hợp Toronto (

ã tìm ra insulin và ứng dụng thành công chất này trong đi

ời điểm đó, người bị tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn

ện pháp điều trị hiệu quả nào Bệnh nhân nhanh chóng trở th

à thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng

ắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và hậu quả l

àn nhẫn, nhưng nó đã giúp cứu sống hàng tri

ố gắng tinh chế ra một hoóc môn hóa học từ tụy và chiết xuất nhiều th

ểu đảo Langerhan Sau đó, những chất này được tiêm vào chó bị bệnh ĐTĐ để thử

ọ nhận thấy bệnh ĐTĐ đã bị đẩy lùi [6]

ột hoocmon protein do các tế bào tuyến tụy beta của đảo Langerhans sinh lin tương đối nhỏ, có khối lượng khoảng 6000 Dalton, đ

ởi hai chuỗi polipeptit A và B Các chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulfua,

ột cầu nối disulfua nằm trong chuỗi A

ỗi A gồm 21 axit amin còn chuỗi B gồm 30 axit amin Mặc d

ự các axit amin khác nhau giữa các loài những một số đoạn nhất định của phân

ử có tính bảo tồn cao, các đoạn có chứa 3 cầu nối disufua, cả hai đầu của chuỗi A v

ủa đầu COOH của chuỗi B Sự tương đồng trong trình t

ến cấu trúc 3 chiều của insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau Insulin chiết rút

nh tiểu đường được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred

ăm 1922

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

ộc đại học tổng hợp Toronto (Canada)

ày trong điều trị bệnh ờng phải vật lộn với căn bệnh để tồn ệnh nhân nhanh chóng trở thành

ết nhau bằng cầu nối disulfua,

ỗi B gồm 30 axit amin Mặc dù ững một số đoạn nhất định của phân

ử có tính bảo tồn cao, các đoạn có chứa 3 cầu nối disufua, cả hai đầu của chuỗi A và

ình tự axit amin dẫn

ất giống nhau Insulin chiết rút

i Canada là Fred Bangting

từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác Các phân tử insulin có xu hướng tạo thành dạng dime trong dung dịch do hình thành các liên kết H giữa các đầu COOH của các chuỗi B Ngoài ra, khi có mặt ion kẽm, các dime insulin liên kết tạo thành hexame Các mối tương tác này có ý nghĩa rất quan trọng trong điều trị Dạng momone và dime dễ dạng khuếch tán vào trong máu, trong khi đó dạng hexame khuếch tán rất kém Do đó, sự hấp thụ các thuốc chứa hàm lượng hexame cao thường

bị chậm và ngừng hẳn Vấn đề này đã thúc đẩy sự ra đời của một số chất insulin giảtái

tổ hợp Loại chất đầu tiên như thế được bán trên thị trường là insulin lispro, phân tử chất này có trật tự linsin và prolin trên đầu COOH của chuỗi B bị đảo ngược, làm giảm khả năng hình thành dạng dime và hexame [26]

Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng ‘‘ prepproinsulin’’ ( tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy Preoroinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A) Proinsulin bị phân cắt bởi enzym PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C Hai acid amin đầu N của peptide nối vơi đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H Kết quả cuối cùng là tạo thành insulin

1.3.3 Vai trò của insulin

Insulin là một trong những hoocmon điều hòa nồng độ Glucose trong máu Chức năng cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì Glucose là nguồn nguyên liệu chính của hô hấp tế bào và nguồn khung Cacbon quyết định cần cho tổng hợp các chất hữu cơ Cân bằng trao đổi chất phụ thuộc vào việc duy trì Glucose máu ở gần một điểm ổn định, khoảng 90g/ml ở người [3]

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử insulin

Luận Văn Thạc Sĩ 9 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

1.4 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay có nhiều phương pháp để điều trị bệnh tiểu đường như uống, tiêm,hít, dán,…Tuy nhiên trên thế giới ngày nay người ta thường dùng 2 phương pháp điều trị chính là sử dụng insulin tiêm tĩnh mạch và uống thuốc để làm tăng nhạy cảm của các

tế bào với insulin hoặc tăng tiết insulin ở tuyến tụy Ở ĐTĐ type 1 thì việc sử dụng insulin tiêm tĩnh mạch là bắt buộc Ở nhóm ĐTĐ type 2 có thể kiểm soát đường máu thông qua thuốc uống, tuy nhiên nếu điều trị trong thời gian dài thì cuối cùng việc sử dụng insulin là điều tất yếu.[5]

Nhưng các dạng thuốc tiêm lại có một số nhược điểm như có thể gây ra hiện tượng dị ứng khi sử dụng lần đầu, nếu tiêm lâu dài có thể khiến chỗ tiêm bị bầm tím, cứng lại, nếu tiêm quá liều có thể gây ra hiện tượng đường huyết đột ngột cao Việc tiêm insulin cũng cần phải thực hiện theo đúng thời gian, do vậy nó gây nhiều bất tiện cho bệnh nhân.[5]

Xuất phát từ những nhu cầu trên cũng như để khắc phục những nhược điểm của việc tiêm insulin, ngoài ra hiện nay trên thị trường vẫn chưa có thuốc uống insulin được thử nghiệm thành công và lưu hành Mặt khác tỉ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nói riêng

và cả thế giới nói chung đang có xu hướng tăng mạnh Nên vệc nghiên cứu hệ thuốc đưa insulin vào cơ thể bằng đường uống đòi hỏi một hệ dẫn thuốc phù hợp Nhưng có một trở ngại cần đặt ra là việc bảo vệ insulin khỏi tác động của enzym và pH acid đường ruột.Vì vậy yêu cầu chế tạo một hệ tải thuốc nano bao gói Insulin tránh sự tiếp xúc không cần thiết giữa Insulin và enzyme phân hủy protein có trong đường ruột, hơn thế nữa hệ tải này phải đảm bảo khả năng nhả thuốc chậm làm giúp lượng đường trong máu luôn giữ ở mức ổn định trong thời gian dùng thuốc.[29]

►►► Vì vậy đề tài này chúng tôi nghiên cứu nhằm mục đích tạo ra một hệ tải thuốc đáp ứng được những yêu cầu như trên, trong đó chất tải là polymer chitosan đã được gắn Methoxypolyethylene glycol amine (mPEG), hệ này được sử dụng để tải insulin ngoài ra, nếu thành công nó còn là tiền để để ứng dụng cho các đường truyền khác như vaccine cho trẻ em,… Mục đích của đề tài là tạo ra hệ tải thuốc insulin có kích thước nano Trong quá trình chế tạo hạt, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát để có được các thông số cần thiết để tạo hạt tải có kích thước nằm trong khoảng vài trăm nanomet và

ổn định theo thời gian Hệ tải thuốc này có thể nâng cao được hiệu quả tải thuốc do

tăng khả năng hấp thụ thuốc từ đường ruột trực tiếp vào máu, đạt được độ an toàn cao trong quá trình hạt lưu thông trong máu trước sự phát hiện của hệ miễn dịch

1.5 Hệ tải thuốc nano chitosan gắn mPEG

1.5.1 Giới thiệu về vật liệu chitosan

1.5.1.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một loại polymer carbonhydrate tự nhiên có thể được tạo thành bằng cách deacetyl hóa chitin

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2 Chitosan được cấu tạo từ các mắc xích D-glusamine liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside[10, 11]

Chitosan có thể được tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác như tôm cua Chitosan còn có thể được tìm thấy từ những loại vi sinh vật như nấm, men

1.5.1.2 Tính chất của chitosan

 Không độc, có tính tương thích sinh học cao, có khả năng phân hủy sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trường

 Tan tốt trong dung dịch axít loãng (pH<5.5), kết tủa ở những giá trị pH cao hơn, hóa tím trong dung dịch iod

Luận Văn Thạc Sĩ 11 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

 Là hợp chất cao phân tử nên trọng lượng của nó giảm dần theo thời gian do phản ứng tự cắt mạch Nhưng khi trọng lượng phân tử giảm thì hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi

 Ở pH<5.5, chitosan có tính điện dương cao

 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, –NH2 và nhóm –NHOCH3, có nghĩa là chúng vừa là alcol vừa là anime, vừa là amide Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-

 Mặt khác, chitosan là những polymers mà các monomer được nối với nhau bởi liên kết (1-4)-glycoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất như: acid, bazo, tác nhân oxi hóa và các enzyme thủy phân[10, 11]

1.5.1.3 Ứng dụng của chitosan

Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làm cốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng Hỗn hợp chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid Chitin được dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẩu thuật.[24],[30]

Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên trong sản phẩm

Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu của vải nhuộm Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc tăng trưởng thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây tươi cấy mô

Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính hiển vi,

xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm,… [10, 11]

1.5.2 Giới thiệu về nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó có ở kích thước nano Với nhiều tính năng như tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại,

nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học Do đó hạt nano chitosan trở thành hệ phân phối thuốc có tiềm năng lớn.[12],[26]

Hạt chitosan có kích thước nano (từ 10nm đến 1000nm) dễ dàng đi qua màng tế bào,

và vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài da, qua đường miệng, qua đường mũi,… Nano chitosan có diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong y sinh học như mang thuốc, vaccine, vectơ chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư,… Khi sử dụng nano chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự phân hủy sinh học Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị.[15]

Trên thế giới hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục đích chế tạo

ra những mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển vectơ chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư Một số công trình tiêu biểu là điều chế hạt nano chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian giải phóng thuốc, điều chế hạt nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt, biến tính với N-trimetyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi, tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [16] Ngoài ra nano chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [17],[18] ứng dụng trong thực phẩm chức năng[19],[20] Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nano chitosan, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano[21],[22] Tuy nhiên, kết quả nhận được rất khác nhau[23]

Ở nước ta, số lượng bài nghiên cứu về nano chitosan đang ngày càng tăng Hiện nay mức độ cập nhật của các nghiên cứu trong nước so với các nghiên cứu của các nhà khoa học khác trên thế giới đã gia tăng rất nhiều so với lúc trước Cụ thể thì có nhiều nhóm nghiên cứu như sau đã nghiên cứu về vấn đề này Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Anh Dũng[3] đã nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm tá chất miễn dịch cho vaccine cúm A H5N1 Nhóm nghiên cứu của TS Trần Đại Lâm đã nghiên cứu đề tài với nội dung: tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng dẫn thuốc của chitosan nano[3] Ngoài ra gần đây nhất còn có các nhóm nghiên cứu khác như: nhóm nghiên cứu của TS Nguyễn Thị Phương Phong [1], với đề tài ‘nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đỗ Trường Thiện [4] với đề tài ‘’ nghiên cứu chế tạo vật liệu nanochitosan ứng dụng trong dược phẩm và trong công nghiệp’’ Các khảo sát này

Luận Văn Thạc Sĩ 13 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

bước đầu cho thấy những kết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan làm chất mang, vaccine, thuốc Những nghiên cứu này một số ít đã không đi sâu vào khảo sát thực nghiệm và đánh giá kết quả tạo hạt nano chitosan, nhưng vẫn chưa đáp ứng được hết những tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan, đáp ứng được hết những tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang tới cho con người

1.5.3 Giới thiệu về TPP

-Tác nhân liên kết ngang: ion Tripolyphosphate (TPP)

Hệ tải thuốc sử dụng vật liệu chủ là Chitosan (Chitosan-based) được chế tạo bằng các tác nhân liên kết ngang hóa học(chemical cross-linking agent) như Glutaraldehyde (GA), Glyoxal, 2,2-dimethoxy phenylacetophenone…, các tác nhân liên kết ngang này có khả năng tạo liên kết hóa học bền vững với nhóm amino của chitosan Tuy nhiên chúng lại không được dùng phổ biến bởi chúng đều thể hiện độc tính trong môi trường sinh học, ví dụ GA có độc tính gây kích thích niêm mạc[13]

Các tác nhân liên kết ngang như ion Tripolyphosphate (TPP), poly (glytamic acid) (PGA) được dùng đề khắc phục nhược điểm trên Trong dung dịch chúng đều tích điện

âm, khi đó chúng có thể tương tác tĩnh điện với chitosan thông qua nhóm amino tích điện dương trong môi trường acid, tương tác này chỉ có thể thay đổi khi điện tích của nhóm amino trên chitosan thay đổi Đối với PGA, công thức phân tử của nó cồng kềnh hơn TPP rất nhiều (hình 1.5), chính vì thế nó tạo hiệu ứng lập thể lớn hơn làm cho hiệu suất tải thuốc thấp hơn, nên trong thực tế TPP vẫn là tác nhân tạo liên kết ngang ion được ưu chuộng nhất[13]

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Sodium Tripolyphosphate và PGA

-Sự hình thành của hạt nano chitosan với tác nhân liên kết ngang

Với tương tác tĩnh điện, TPP liên kết các chuỗi chitosan lại với nhau (hình 1.6), tạo nên hạt có một hệ thống lỗ xốp Các lỗ xốp là khoảng không dùng cho việc chứa hạt thuốc, và nó cũng tạo điều kiện thuận lợi hơn cho quá trình nhả thuốc chậm Tương tác tĩnh điện này chỉ có thể bị thay đổi khi một trong hai yếu tố cấu thành thay đổi, chitosan hoặc tác nhân liên kết ngang

Theo nghiên cứu, đối với những hạt có đường kính lớn hơn 100 nm thì bị gan, thận hấp thụ và đào thải càng nhanh, trong khi những hạt có kích thước nhỏ tồn tại trong hệ mạch lâu hơn, nhờ thế có thể nâng cao được hiệu suất tải thuốc[27], bên cạnh đó việc giảm kích thước hạt cũng là phương pháp hữu hiệu trong việc tăng cường tính chất của

nó, ở kích thước nano hạt có tỉ lệ diện tích bề mặt lớn hơn, vì thế có số nguyên tử trên

bề mặt nhiều hơn so với khi ở kích thước micro từ đó làm ảnh hưởng tới tới các mặt hóa lý, xúc tác và những phản ứng tương tác khác[14]

1.5.4 Giới thiệu về mPEG

Methoxypolyethylene glycol amin (mPEG) là một polymer trơ, hòa tan trong nước, không gây độc mPEG được sử dụng rất phổ biến cho việc gắn lên bề mặt hạt nano với vai trò làm giảm sự đào thải của cơ thể đối với thuốc Cấu trúc phân tử mPEG khá đơn giản và linh động mPEG gắn lên bề mặt hạt có vai trò tăng tính ái nước và ái hữu cơ, tính mềm dẻo và tính tương thích sinh học của hạt

Có nhiều cơ chế cho việc gắn mPEG lên chitosan Phổ biến là mPEG biến đổi aldehyde tương tác với nhóm amine của chitosan theo cơ chế khử alkyl hóa

Hình 1.6: Sự tương tác giữa chitosan và tác nhân liên kết ngang

Luận Văn Thạc Sĩ

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

Do mPEG có tính ưa nước n

vệ hạt nano chitosan bên trong, giúp tăng s

phân hủy thuốc, từ đó làm tăng hi

1.5.5 Giới thiệu về chitosan gắ

Có nhiều cơ chế cho việc gắn

của chitosan thông qua gốc

biến đổi aldehyde tương tác v

mPEG-g-cts sau đó được kết tủa bằng ph

acid) hoặc tripolyphosphate trong dung dịch có d

trong hạt

1.6 Các phương pháp chế tạo nano chitosan

Hiện nay có nhiều phương pháp ch

nhiều nhất là tạo gel ion, ưu đi

và không cần phải sử dụng dung môi hữu

pháp này được nghiên cứu rộng r

năng[15]

Hình 1.8: Một trong nh

15 CBHD: PGS.TS Đ

ớc nên sẽ hình thành lớp vỏ ngậm bên ngoài T

ên trong, giúp tăng sự ổn định của hạt thuốc, kéo d

àm tăng hiệu quả chữa bệnh của thuốc[31]

ới thiệu về chitosan gắn mPEG

ế cho việc gắn mPEG lên chitosan trong đó có gắn lên nhóm alcohol

ủa chitosan thông qua gốc -NCO Ngoài ra còn có 1 cơ chế phổ biến khác l

ương tác với nhóm amine của chitosan theo cơ chế khử alkyl hóa

ợc kết tủa bằng phương pháp cross linking với poly

ặc tripolyphosphate trong dung dịch có dược chất do đó dược chất đ

ế tạo nano chitosan ương pháp chế tạo nano chitosan Phương pháp đư

ưu điểm của phương pháp này là quá trình chu

ần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó ph

ứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và th

t trong những cơ chế gắn mPEG lên chitosan

Hình 1.7: Cấu trúc mPEG

CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

ên ngoài Từ đó giúp bảo

ự ổn định của hạt thuốc, kéo dài thời gian

ử dụng lực nén lớn, do đó phương

à thực phẩm chức

Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hóa của chitosan Hiệu quả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá trị pKa và độ hòa tan của thuốc Thuốc kết hợp với chitosan qua tương tác tĩnh điện, liên kết hidro,…… [15] Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan còn phụ thuộc vào bản chất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau[16] Theo như S.A Agnihotri,et al (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan: phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulison cross-linking), phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion- droplet coalesence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation) và phương pháp mixen đảo (reverse micellar)[28]

1.6.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu được tạo ra bằng cách phân tán dung dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề mặt Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp như glutaraldehyde Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan[28]

Hình 1.9: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương

Luận Văn Thạc Sĩ 17 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

1.6.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chiosan tiếp xúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano[28]

1.6.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999 Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong paraffin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ[28]

Hình 1.10: Sơ đồ chế tạo bằng phương pháp giọt tụ

1.6.4 Phương pháp tạo gel ion

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như tripolyphosphate Kỹ thuật này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước Đầu tiên chitosan được hoàn tan vào dung dịch acid acetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều khiển khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau[28]

Hình 1.11: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Hình 1.12: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion

Luận Văn Thạc Sĩ 19 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến

HVCH: Lê Thị Nữ Thanh

1.6.5 Phương pháp mixen đảo

Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môi hữu cơ

để tạo ra những hạt mixen đảo Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc được thêm từ

từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch Pha lỏng được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ tương suốt Sau đó tác nhân tạo nối ngang được thêm vào

và khuấy qua đêm Cô quay loại dung môi Phần còn lại phân tán lại trong nước Dung dịch muối thích hợp thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt Hỗn hợp được ly tâm Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ Đông cô chất lỏng thu được cho ta bột thuốc[28]

1.7 Các thiết bị phân tích lý hóa[2]

1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua- Transmission Electron Microscopy (TEM)- là một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano Nó cho phép quan sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0.2mm Do đó, phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu được chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu Công dụng chủ yếu của thiết

bị này là để xác định một cách chính xác kích thước của hạt nano mà cụ thể đây là hạt chitosan gắn PEG Dựa vào ảnh chụp các phần tử hạt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích thước và hình dạng của hạt nano tạo thành

Hình 1.13: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo

1.7.2 Thiết bị đo phổ truyền qua UV-Vis

Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thước phân tử khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ra một dạng phổ có chiều cao đỉnh phổ xác định và đặc trưng cho dạng hỗn hợp chất đó Do vậy, khi đo phổ hấp thu của dung dịch insulin, ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh với chiều cao tương ứng với bước sóng khoảng 276 nm Từ kết quả đó, ta xác định được sơ bộ rằng dung dịch ta thu được có chứa insulin với các chiều cao đỉnh phổ khác nhau tùy vào nồng độ insulin

Hình 1.14: Máy TEM JEM 1010

Hình 1.15: Máy đo phổ truyền qua UV-Vis, cary 100 Conc