Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochiloride

Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, metformin là một thuốc tiểu đường được sử dụng theo đường uống chữa bệnh tiểu đường tuýp II..

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học GS.TS Nguyễn Văn Tuyến

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến người đã tạo điều kiện cho em được làm thực nghiệm tại phòng Hóa dược, các chuyên viên

kĩ thuật phòng Hóa dược - Viện hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Văn Tyến, người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt thời gian học tập, hướng dẫn, giúp chỉnh sửa và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân và bạn bè đã chia

sẻ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thành khóa luận

Do đây là lần đầu tiên em được làm quen với việc nghiên cứu, do điều kiện thời gian và trình độ hạn chế, nên khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của các thầy giáo, cô giáo để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 08 tháng 05 năm 2015

Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hạnh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát về bệnh tiểu đường 2

1.1.1 Phân loại bệnh tiểu đường 2

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết 3

1.1.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường 5

1.1.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường 5

1.2 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride 5

1.2.1 Tổng quan về Metformin hydrochloride 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.2.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

1.2.4 Các phương pháp nghiên cứu 10

1.3 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ 17

1.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 17

1.3.2 Độ quay cực ([α]D) 18

1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 18

1.3.4 Phổ khối lượng (Mass spectrocopy, MS) 20

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 21

2.1 Mục tiêu của khóa luận 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị 21

2.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng 24

2.4 Định lượng phản ứng 25

2.5 Phương pháp thực nghiệm 25

2.6 Tổng hợp Metformin hydrochloride 26

2.7 Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride 26

2.8 Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride 27

2.9 Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp HPLC-MS) 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tổng hợp metformine hydrochloride 28

3.2 Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride 31

3.3 Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride 32

3.4 Hàm lượng metformin hydrochloride theo phương pháp HPLC 34

KẾT LUẬN 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

(1H Nuclear Magnetic Resonance Spectromotry)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 1: Các thiết bị chính sử dụng trong phòng thí nghiệm 22

Bảng 2: Các dụng cụ chính sử dụng trong phòng thí nghiệm 23

Hình 1: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride 29

Hình 2: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride 30

Hình 3: Đồ thị về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết 34

Hình 4: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride 36

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid 7

Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine 7

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride 8

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theoShapiro 9

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi 9

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin 9

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin 10

MỞ ĐẦU

Tiểu đường là căn bệnh nguy hiểm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm trọng sức khoẻ con người và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu đường tuýp II (chiếm tới 90-95%) Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đường, tử vong của bệnh này đứng hàng thứ tư ở các nước phát triển, bệnh có thể gây nhiều tai biến nguy hiểm như: mù loà và giảm thị lực ở người trưởng thành; đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn người bình thường từ 15-40 lần; suy thận giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những biến chứng tim mạch nguy hiểm Theo ước tính, hiện thế giới có 194 triệu người mắc bệnh tiểu đường chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ước tính đến năm

2025 số người bị bệnh tiểu đường sẽ là 333 triệu người Theo thống kê năm

2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5 triệu người) và 7,2% tại các thành phố lớn TP Hồ Chí Minh có hơn 800.000 người mắc bệnh Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, metformin là một thuốc tiểu đường được sử dụng theo đường uống chữa bệnh tiểu đường tuýp II Metformin làm chậm hấp thụ đường trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đường dự trữ vào trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn Như vậy nếu tổng hợp được metformin thì chúng ta có thể chủ động sản xuất được loại thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đường tuýp II, làm tăng thêm sự lựa chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiểu đường và chủ động sản xuất thuốc generic chữa bệnh tiểu đường giá rẻ ở Việt Nam

Vì vậy, tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp thuốc

chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochloride” có ý nghĩa rất lớn về khoa

học và thực tiễn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về bệnh tiểu đường

1.1.1 Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao; trong giai đoạn mới phát thường

làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo,

điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy

thận, liệt dương, hoại thư, v.v

Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:

có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng đường huyết và nhiễm Ceton Những triệu chứng điển hình của bệnh tiểu đường loại I là: ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhiều (4 nhiều), mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng

Tiểu đường túyp II:

Bệnh tiểu đường tuýp II được đặc trưng bởi kháng insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường

Bệnh tiểu đường loại 2 chiếm khoảng 90-95% trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên

Bệnh nhân thường ít có triệu chứng và thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ hoặc khi có biến chứng như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não; khi bị nhiễm trùng da kéo dài; bệnh nhân nữ hay bị ngứa vùng do nhiễm nấm âm hộ; bệnh nhân nam bị liệt dương

Các túyp tăng đường huyết đặc hiệu khác:

- Đái tháo đường thai kỳ

- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào 

- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết

Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính như sau:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn

1.1.2.1 Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

+ Insulin:

Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thể Insulin là một trong những hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng lượng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống Tác dụng của

insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protid

+ Thuốc kích thích bài tiết insulin

Các sulfonylurea:

Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thương hàn Từ phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các sulfonylurea đã được tiến hành Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide) Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh

1.1.2.2 Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

1.1.2.3 Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym 

-glucosidase)

Acarbose:

Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột

Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng đường huyết sau ăn Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh

1.1.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường

Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều

1.1.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường

Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường chủ yếu là các thuốc có

nguồn gốc từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,

Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mướp đắng

(Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus

membranaceus, Fabaceae), huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,

Scrophulariaceae)

1.2 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride

1.2.1 Tổng quan về Metformin hydrochloride

- Tan nhiều trong nước, ít tan trong ancol, thực tế không tan trong acetone và dichloromethane;

- Điểm nóng chảy: 2250C – 2260C

1.2.1.3 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

Metformin là một thuốc chống tiểu đường nhóm biguanid, có cơ chế tác dụng khác với các thuốc tiểu đường nhóm sulfunylure, metformin không kích thích giải phóng insulin từ các tế bào tuyến tụy Metformin không có tác dụng hạ đường huyết ở người bình thường, metformin làm giảm sự tăng đường huyết nhưng không gây tai biến hạ đường huyết Metformin làm giảm nồng độ glucose trong huyết tương cả khi đói và sau bữa ăn của người bệnh tiểu đường tuýp II

Cơ chế tác dụng ngoại biên của metformin là:

- Làm tăng sử dụng glucose ở tế bào

- Cải thiện liên kết của insulin với thụ thể

- Ức chế tổng hợp glucose ở gan và làm giảm hấp thu glucose ở ruột

- Ngoài ra, metformin phần nào còn ảnh hưởng tốt trên chuyển hóa lipoprotein, thường bị rối loạn ở người bị đái tháo đường không phụ thuộc insulin

1.2.1.4 Dược động học

- Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đường tiêu hóa, sinh khả dụng tuyệt đối của 500mg metformin uống lúc đói là 50 – 60% Thức ăn làm giảm mức độ và tốc độ hấp thu của metformin

- Phân bố: Metformin liên kết với protein huyết tương với mức độ không đáng kể, thuốc phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch, cả vào trong hồng cầu

- Chuyển hóa: Metformin không bị chuyển hóa ở gan

- Thải trừ: Metformin chủ yếu được thải trừ qua ống thận (90%), không thải trừ qua mật

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tổng hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin Quá trình tổng hợp được được tiến hành qua 3 bước [2]:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid

Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản ứng Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC

- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC

Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ

70 oC trong khoảng thời gian 30 phút Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng 1-Cyanoguanidine được tổng hợp từ nguyên liệu rẻ như CaO và ure rất có ý nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý nghĩa thực tiễn

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride

Mặc dù phương pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền như: CaO, ure và dimethylamin nhưng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy

mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide)

1.2.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tính hạ đường huyết

và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được

FDA cho phép lưu hành để chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 ở Mỹ [5]

Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide

hydrochloride) được tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [12] bằng cách cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ

140oC (sơ đồ 1.4) Bằng con đường này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp được hàng trăm dẫn chất biguanid Các dẫn chất này đã được nghiên cứu hoạt tính

H3C

H3C N

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro

Năm 2008, Anvar Shalmashi [13] đã đưa ra phương pháp mới để tổng hợp metformin hydrochloride Phản ứng điều chế metformin được thực hiện trên bản mỏng điều chế và được đặt trong thiết bị microwave ở bước sóng 540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%

H3C

H3C N

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi

Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đường Kristiina và các cộng sự [8] đã tổng hợp được một số tiền chất của metformin như mô tả trong sơ đồ 1.6 và sơ đồ 1.7 Các chất này có khả năng tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột

NH

NH2

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin

N-Br O

O

N-S-R O

O

NH N

NH2N H

S R +

R=cyclohexan R=Ph

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin

Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự

đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni Các phức này đã được nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [11]

Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro (metformin) platin (IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư P388 tương

tự như Cis-platin [4]

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 rất hiệu quả

mà cũng có khả năng chống ung thư tuyến tụy, ung thư vú [3,6,7,9,10,14,15]

Từ các tư liệu đã có có thể thấy rằng con đường tổng hợp metformin từ dicyano diamide là khả thi Tổng hợp theo con đường này chỉ có một bước phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực hiện được ở quy mô pilot

1.2.4 Các phương pháp nghiên cứu

1.2.4.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng

Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường sản phẩm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy

ra, kết thúc phản ứng

Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silicagel 60F254, aluminum oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một vệt là sản phản phản ứng khoảng 1cm từ dưới lên Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtOAc được đặt trong bình triển khai Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí Các chất với Rf khác nhau dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí Đối với những chất có UV ta kiểm tra UV có thể nhận được các vết khác nhau Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị Rf tương ứng ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đầu còn hay hết

Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn hợp dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi cần để tinh chế các chất

Có thể sử dụng một hỗn hợp hai dung môi Trong hai dung môi đó một dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại hoặc ít tan Hỗn hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một dung dịch đồng nhất trong suốt

Thông thường một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học gần gũi Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat Các

hidrocacbon dễ tan trong benzen, ete, dầu, n-hexan Thường dung môi có nhiệt độ sôi từ 600C - 800C là thích hợp

1.2.4.2 Chiết

Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước) Như vậy

ta có quá trình chiết lỏng

Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác

Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh Các thiết bị chiết đơn giản chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gì thêm Chọn được dung môi (dung môi chiết CH2Cl2) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người

ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi hỗn hợp bất kì Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang

1.2.4.3 Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp

Dùng máy cất quay chân không Sau khi loại bỏ dung môi để thu được chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất

1.2.4.4 Sắc kí cột

Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra Nhưng trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc kí cột Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh

Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí Cột

có thể là những ống hình trụ dài 30 – 100cm, đường kính từ 1 – 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính

1.2.4.5 Phương pháp nhồi cột huyền phù

Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn

Đổ lượng Al2O3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định

1.2.4.6 Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí Chọn chất hấp phụ

Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion

Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí

Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:

 Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp

 Chuẩn bị 4÷6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau

 Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc thử Với đơn dung môi sẽ

dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp Từ kết quả đó tìm được hệ dung

môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví

dụ n–hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí

 Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực

Chú ý:

 Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau

 Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí

 Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH

Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì

tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần)

Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí

Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1

Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát

Cách nạp silicagel vào cột

Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường Silicagel được nạp vào cột theo hai cách

Nạp silicagen ở dạng sệt

Cố định cột trên giá Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì

ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa) Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều

Lưu ý:

 Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất

 Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng

 Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng để rót trở lại đầu cột)

 Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột

 Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột được đồng nhất

thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ

từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng

 Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột

Nạp silicagen ở dạng khô

 Cột được giữ thẳng đứng trên giá Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột

 Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa

gõ nhẹ thành cột Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột)

 Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào

 Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt

thấm ướt mẫu khô cho vào) Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh

Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy để

hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm

Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet) Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột Sau

đó, mở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều)

1.3 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ

Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất

mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao

1.3.1 Điểm nóng chảy (Mp)

Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan trọng Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử

Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh