nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh dịch tả lợn và ứng dụng kỹ thuật hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry) trong chẩn đoán bệnh

Tính cấp thiết của đề tài Dịch tả lợn pestis suum là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus thuộc nhĩm pestisvirus - họ Flaviridae gây ra trên lợn.. Bệnh xuất hiện ở mọi lứa tuổi của

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học nông nghiệp Hà Nội



Nguyễn phương nhung

NGHIấN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH Lí CHỦ YẾU CỦA BỆNH DỊCH TẢ LỢN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HOÁ Mễ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ðOÁN BỆNH

Lời cam đoan Lời cam đoan

- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực và ch−a từng đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã

Lời cảm ơn Lời cảm ơn

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng cảm

ơn sâu sắc đến TS Bùi Trần Anh Đào, Thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Bộ môn Bệnh lý; các thầy cô giáo trong Khoa Thú y; các thầy cô giáo Viện sau

Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo đã giảng dạy tôi trong thời gian học Cao học ở nhà trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn bệnh lý khoa Thú y đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại phòng thí nghiệm bệnh lý, phòng thí nghiệm trung tâm của khoa

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 06 tháng 9 năm 2009

Tác giả

Nguyễn Phương Nhung

2.1 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả lợn trên thế giới và việt nam 3

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

3.3 Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu 28

4.1 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh dịch tả 38 4.2 Các tổn thương ñại thể ở lợn mắc bệnh dịch tả 40

4.3 Các tổn thương vi thể ở một số cơ quan của lợn mắc bệnh

4.5 Kết quả ứng dụng kỹ thuật hố mơ miễn dịch vào chẩn đốn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

cDNA Complementary Deoxyribonucleic

Acid

DAB 2,3- Diaminobenzidin

DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent

Assay

Phản ứng miễn dịch ñánh dấu enzyme

KD Kilo Dalton

OIE Organisation of International

Epidemiology

Tổ chức Dịch tễ học Thế giới

PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen

RT-PCR Revese transcription polymerase

chain reaction

Phản ứng PCR ngược

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh dịch tả 39

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát tổn thương đại thể ở lợn mắc bệnh dịch tả 42

Bảng 4.3 Tổn thương vi thể ở một số cơ quan của lợn mắc bệnh dịch tả 47

Bảng 4.4 Các chỉ số hồng cầu ở lợn mắc bệnh dịch tả (12 tuần tuổi) 52

Bảng 4.5 Các chỉ số bạch cầu ở lợn mắc bệnh dịch tả (12 tuần tuổi) 59

Bảng 4.6 Hàm lượng protein huyết thanh của lợn mắc bệnh dịch tả

Bảng 4.9 So sánh kết quả chẩn đốn bệnh DTL bằng kỹ thuật hố mơ

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ðỒ

Trang

Hình (1 - 12): Một số hình ảnh về triệu chứng lâm sàng và bệnh

tích ñại thể của lợn mắc bệnh dịch tả 44 Hình ( 13 - 24): Một số hình ảnh minh hoạ tổn thương vi thể của lợn

Hình (25 - 36): Hình ảnh về sự phân bố Virus DTL trong một số

mô của lợn mắc bệnh khi nhuộm hoá mô miễn

Biểu ñồ 4.1 Số lượng hồng cầu của lợn mắc bệnh dịch tả 53 Biểu ñồ 4.2 Hàm lượng hemoglobin của lợn mắc bệnh dịch tả 54 biểu ñồ 4.3 Tỷ khối huyết cầu của lợn mắc bệnh dịch tả 55

Biểu ñồ 4.4 Thể tích bình quân của hồng cầu ở lợn mắc bệnh

Biểu ñồ 4.5 Nồng ñộ huyết sắc tố của lợn mắc bệnh dịch tả 57

Biểu ñồ 4.6 Lượng huyết sắc tố bình quân trong một hồng cầu

Biểu ñồ 4.7 Số lượng bạch cầu của lợn mắc bệnh dịch tả 60 Biều ñồ 4.8 Công thức bạch cầu của lợn mắc bệnh dịch tả 61 Biểu ñồ 4.9 Tỷ lệ các tiểu phần protein của lợn mắc bệnh dịch tả 63

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Dịch tả lợn (pestis suum) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus thuộc nhĩm pestisvirus - họ Flaviridae gây ra trên lợn Bệnh xuất hiện ở mọi

lứa tuổi của lợn với tốc độ lây lan nhanh và mạnh, ở thể cấp tính bệnh gây chết nhiều lợn với tỷ lệ tử vong cao từ 90- 100%, ở các thể khác tỷ lệ tử vong tuy thấp hơn nhưng cũng khiến lợn sụt cân, gầy mịn và là nguồn phát tán dịch bệnh ra ngồi mơi trường

Bệnh cĩ ở khắp nơi trên thế giới và được biết đến lần đầu tiên ở Bắc

Mỹ vào năm 1833 Cho đến nay, bệnh vẫn cịn tồn tại và phát triển mạnh ở nhiều khu vực trên thế giới Từ khi xuất hiện tới nay bệnh đã gây khơng ít thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuơi lợn của thế giới

Ở Việt Nam, bệnh dịch tả lợn được phát hiện vào các năm 1923 - 1924 bởi Houdenner [10], và đến nay bệnh vẫn là một trong "4 bệnh đỏ" gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuơi lợn ở nước ta Tuy khơng phải là bệnh mới, song trong thực tế hiện nay bệnh vẫn xảy ra và diễn biến khá phức tạp với nhiều biến thể ðặc biệt trong thể ẩn tính, lợn khơng biểu hiện rõ triệu chứng nhưng lại là nguồn lây lan mầm bệnh rất nguy hiểm

Cho tới nay, ở nước ta đã cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh dịch tả lợn nhưng vẫn chưa cĩ cơng trình nào nghiên cứu sâu về các biến đổi bệnh lý của lợn bị dịch tả Vì vậy, để gĩp phần trong cơng tác chẩn đốn bệnh nhanh, chính xác thì việc tiếp tục nghiên cứu sâu về các biến đổi bệnh lý của lợn mắc bệnh dịch tả vẫn là vấn đề cấp thiết hiện nay

Ngồi ra nghiên cứu này cịn là cơ sở để xây dựng một quy trình chẩn đốn dựa trên kỹ thuật hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) - một phương pháp chẩn đốn tương đối nhanh, chính xác và cịn rất mới ở nước ta hiện nay

Xuất phát từ thực tế đĩ chúng tơi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh dịch tả lợn và ứng dụng kỹ thuật hố

mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đốn bệnh"

1.2 Mục đích nghiên cứu của đề tài

Xác định triệu chứng lâm sàng, khảo sát một số chỉ tiêu huyết học và nghiên cứu các biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể của bệnh Dịch tả lợn nhằm gĩp phần hồn thiện hơn những thơng tin về bệnh, cung cấp các thơng tin cần thiết

để xây dựng quy trình chẩn đốn bệnh

Ứng dụng kỹ thuật hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) vào chẩn đốn bệnh dịch tả lợn

2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả lợn trên thế giới và Việt nam

2.1.1 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả lợn trên thế giới

Bệnh DTL ñã xuất hiện trên thế giới cách ñây hơn một trăm năm Nhưng cho ñến nay nguồn gốc của bệnh chưa ñược xác minh chính xác, hiện vẫn còn hai quan ñiểm song song tồn tại:

Theo Hanson R P (trích theo Nguyễn Như Thanh [27]), những mô tả ñầu tiên giống bệnh DTL là ở Tenessee vào năm 1810, sau ñó những vụ dịch này xảy ra ở bang Ohio (Mỹ) vào năm 1830 Rồi sau ñó bệnh lan sang các nước châu Âu, châu Á, châu Phi, Nam và Trung Mỹ: năm 1862 ở Anh, 1887

ở Thụy ðiển và ðan Mạch, năm 1889 ở Nam Mỹ, năm 1900 ở Nam Phi

Theo Fuchs F (1968), bệnh DTL lần ñầu tiên xuất hiện ở nước Anh năm 1862, sau ñó lây sang các nước châu Âu khác là ðan Mạch, Thụy ðiển vào năm 1887, rồi bệnh lan sang khắp các nước trên thế giới [41]

Hiện nay bệnh lan tràn khắp thế giới và ñược coi là bệnh gây nhiều thiệt hại nhất cho ngành chăn nuôi lợn Ở Mỹ, chương trình thanh toán bệnh DTL bắt ñầu năm 1962 và kết thúc sau ñó 14 năm, tiêu tốn hết 140 triệu USD [58]

Ở châu Âu, bệnh DTL ñã ñược khống chế một cách chặt chẽ thông qua

tiêm phòng vào những năm của thập kỷ 60 - 70 trong thế kỷ XX, sau ñó

người ta ngừng tiêm phòng ñể phát hiện và loại thải lợn mang trùng thông qua việc theo dõi huyết thanh của lợn Sau 16 năm nỗ lực tiêu diệt, bệnh DTL ñược xóa bỏ ở Mỹ năm 1978 Anh và Bắc Ailen là quốc gia sạch bệnh DTL

từ năm 1965 nhưng bệnh trở lại Anh Quốc năm 1986, cả thảy có 7781 con lợn

bị tiêu huỷ từ 26 ổ dịch, tiêu tốn lên tới ₤450101 [61] Chương trình tiêu diệt bệnh DTL là bắt buộc ở các quốc gia trong EU, tuy nhiên bệnh vẫn còn lác ñác xảy ra Năm 1994 có 52 ổ dịch nổ ra ở Bỉ, bắt buộc quốc gia này phải tiêu diệt 90000 con lợn [46]

Bệnh gây thiệt hại ở tất cả các quốc gia, kể cả những nước cĩ tiềm lực kinh tế rất mạnh, từng cho là đã được thanh tốn bệnh DTL hay các quốc gia được coi là sau mấy chục năm khơng cĩ bệnh DTL

Năm 1997, đã mang đậm một dấu ấn đối với những cán bộ thú y và những người hoạt động trong nghề chăn nuơi lợn: 5 nước EU đã phải chịu thiệt hại do bệnh DTL bùng phát: ðức, Hà Lan, Ý, Tây Ban Nha, Bỉ; tính đến ngày 31/12/1997 cĩ 424 ổ dịch DTL tại Hà Lan xuất hiện trong một năm [20] Tại Cộng hịa Liên bang ðức, bệnh DTL xảy ra liên tục từ tháng 11/1982 đến tháng 9/1984 cĩ 395000 lợn đã bị tiêu huỷ, bệnh DTL xảy ra liên tục từ 1993 đến tháng 5/1999 ở đất nước này, làm tổng số lợn tiêu hủy lên tới 11 triệu con [40] Năm 1997: ở Ý cĩ 55 ổ dịch bệnh DTL, Tây Ban Nha cĩ 78 ổ dịch, Bỉ

cĩ 8 ổ dịch và Hà Lan cĩ 424 ổ dịch [40] Chiến dịch thanh tốn bệnh DTL ở

Ý tiến hành từ năm 1995 - 2003 và trong năm 2003, sau 8 lần giám sát huyết

thanh học đối với virus DTL, nước Ý cĩ cơng bố hết dịch [58]

Nhiều tài liệu cho chúng ta thấy bài học qua ổ đại dịch này ở châu Âu:

- Nguồn gốc dịch chủ yếu trực tiếp từ lợn rừng (46% số ổ dịch) và từ

thức ăn thừa (19% ổ dịch) trong đĩ cĩ thịt lợn rừng

- Phân tích thơng tin di truyền RNA của virus DTL của các ổ dịch

người ta thấy do cùng một loại virus Sự lây lan dịch là do sự can thiệp chậm trễ của chính quyền

- Chẩn đốn xác định bệnh chậm, che dấu thơng tin về dịch bệnh và

bán chạy lợn bệnh

Bài học ở châu Âu cịn cho chúng ta thấy rằng sau nhiều năm khơng tiêm phịng, đàn lợn trở nên mẫn cảm hơn với virus, mặc dù chủng virus gây

ra ổ dịch khơng phải là loại cường độc

Ở châu Á, cĩ lẽ bệnh DTL xuất hiện và được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1895 ở Malaysia [34] Ngoại trừ Nhật Bản, bệnh DTL ngày nay được xem

là phổ biến và cĩ tính chất địa phương ở hầu hết các quốc gia châu Á [40]

Nhật Bản ñược coi là quốc gia không có bệnh DTL trong thời ñiểm hiện nay Kết quả này là nhờ vào sự nỗ lực và quyết tâm thanh toán bệnh DTL một cách triệt ñể của cường quốc châu Á này: Nhật Bản ñã rất lo lắng với bệnh DTL gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn trong

vòng 70 năm, bệnh DTL nổ ra giảm dần trong khoảng thời gian 1970 - 1980

do việc sử dụng vaccine nhược ñộc DTL chủng GPE Cuối năm 1990, chiến dịch thanh toán bệnh ñược thực hiện và giám sát chặt chẽ trong vòng 5 năm Năm 2001, Nhật Bản bắt ñầu ngừng tiêm vaccine DTL cho ñàn lợn và công

bố là quốc gia sạch bệnh [57]

Trận dịch tả lợn bùng phát ở Hàn Quốc năm 2003 cũng là một sự cảnh báo về tính chất nghiêm trọng của bệnh DTL Những trận dịch xuất hiện ở các quốc gia châu Á có xu hướng xảy ra sau những thiếu sót trong tiêm phòng, thay ñổi chương trình tiêm phòng hoặc sau những biến ñộng về lượng lợn trong ñàn [40]

2.1.2 Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả lợn ở Việt Nam

Bệnh DTL ñược phát hiện và mô tả lần ñầu tiên ở Việt Nam vào năm 1923 bởi Houdenner [10], và cho ñến nay bệnh vẫn luôn là mối ñe dọa nghiêm trọng ñối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta

Năm 1968 là năm có số ổ dịch xảy ra nhiều nhất ở Miền Bắc, có tới

481 ổ dịch nổ ra ñược thống kê [13] Năm 1972 - 1973, dịch phát ra ở Nghệ

An và Hà Tĩnh Cũng trong năm 1973, dịch xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh

Sài Gòn Năm 1976 - 1978, dịch xảy ra tương ñối rộng ở một số tỉnh Trung

Trung Bộ: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch và năm 1978 có

18 ổ dịch [2] Năm 1981, 15 tỉnh thuộc Nam Bộ có dịch làm chết 145078 con lợn [10]

Theo ñiều tra dịch tễ học từ 1995 - 1997, tại các tỉnh Ninh Thuận,

Khánh Hoà, Phú Yên, Bình ðịnh, Quảng Ngãi, Quảng Nam ñều xuất hiện lợn bị bệnh dịch tả với số lượng không nhiều nhưng lẻ tẻ, thường xuyên và

có ở khắp nơi trong tỉnh [9] Theo các báo cáo tại hội nghị toàn quốc bệnh

dịch tả lợn năm 2003 tại Hà Nội, bệnh DTL xuất hiện liên tục từ 1998 -

tháng 9/2003 ở hầu hết các tỉnh phía Bắc, phía Nam nước ta Bệnh xuất hiện

lẻ tẻ tại các cơ sở chăn nuôi, không thành ổ dịch lớn

Theo báo cáo tháng 10/2006 của cơ quan thú y vùng IV, tại các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên: tháng 5/2005 ở Khánh Hoà với 24 xã của 2 huyện có dịch, số lợn bị huỷ là 161 con, tháng 10/2006 ở Quảng Ngãi có 16 xã có dịch, số lợn bị chết 169 con Tại Quảng Nam có 5 xã có dịch, số lợn chết là 277 con Gia Lai có 6 xã có dịch, số lợn chết là 521 con Tại báo cáo số 01/TTV-BC ngày 15/01/2007 và báo cáo số 11/TYV-BC, ngày 15/02/2007 của cơ quan thú y vùng IV: tại Quảng Ngãi và Bình ðịnh có 20 xã có dịch, số lợn chết là 196 con

Như vậy, bệnh DTL hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam tồn tại dưới hai dạng: mãn tính và bẩm sinh [7] Hiện nay DTL ở nước ta tuy không xảy ra các ổ dịch lớn và gây thiệt hại như những năm 1960-1970 nhưng vẫn là mối ñe dọa cho ngành chăn nuôi lợn

2.2 Virus dịch tả lợn

2.2.1 Nguồn gốc virus Dịch tả lợn

Theo Salmon và Smith, bệnh gây ra bởi một loại vi khuẩn, hai ông ñặt

tên là Bacillus cholerae suis (tức Salmonella suis) Nhưng ñến năm 1903,

Schweinitz và Dorset ñã xác ñịnh tác nhân gây bệnh DTL là một loài virus

còn vi khuẩn Bacillus cholerae suis chỉ ñóng vai trò phụ [24] Năm 1947 Holmes ñặt tên cho virus gây bệnh DTL là Tortor virus Trước ñây, người ta coi virus gây bệnh DTL là thành viên của họ Togavirideae, giống Pestisvirus cùng với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine Viral Diarrhea Virus - BVDV) và virus gây bệnh Border ở cừu (Border Diseease Virus - BDV) Nhưng gần ñây, qua những nghiên cứu về cấu trúc phân tử của Pestisvirus

cho thấy bộ gen của chúng (genome) tương ứng với virus thuộc họ

Flavivirideae [31], nên giống Pestisvirus ñược xếp vào họ Flavivirideae

2.2.2 Hình thái cấu trúc của virus

Virus DTL thuộc loại RNA virus, có vỏ bọc là Lipoprotein Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, virus có dạng cấu trúc hình cầu với nucleocapside ñối xứng hình khối bao bọc bởi lớp màng ngoài Virion có ñường kính 40 -

50 nm, ñường kính của một khối nucleocapsit là 29 nm, là lớp vỏ bao bọc sợi RNA của virus Bề mặt của virion có những gai lồi 6 - 8 nm, là thành phần có tính chất bảo vệ hạt virus Bộ gen của virus là một chuỗi ñơn RNA

có ñộ dài 12KD [27] Virus có 2 glycoprotein E155 và E146 KD ở trên bề mặt và một nucleocapsit protein 36KD Hệ số sa lắng là 140s - 180s

2.2.3 Phân loại virus

Năm 1939, Geiger ñã kết luận: không có sự khác nhau cơ bản nào về tính kháng nguyên (KN) ñể sắp xếp các chủng virus DTL vào nhiều type virus khác nhau [23] Nhưng từ những năm 1950, một số tác giả ñã phát hiện ñược hiện tượng biến chủng của virus DTL và cũng nhận thấy ñộc lực của

virus biến chủng thấp hơn ñộc lực của virus ban ñầu [30]

Theo Van Oirchot J.T, các chủng virus DTL ñược chia làm hai nhóm: Nhóm 1: Gồm các chủng vius cường ñộc Alfort, chủng C, chủng Thiveval Nhóm 2: Gồm các chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập ñược từ những lợn mắc bệnh mãn tính [60]

Nghiên cứu mới ñây của Ken Inui và Nguyễn Tiến Dũng về dịch tễ học phân tử ñã cho thấy virus DTL có 3 nhóm chính:

Nhóm I: hầu hết là các chủng phân lập ñược từ trước thập kỉ 70 ở châu

lập thuộc nhóm này tăng lên từ năm 1997 [7]

Trước ñây, người ta cho rằng kháng nguyên (KN) virus DTL ñồng nhất Ngày nay, với kỹ thuật kháng thể ñơn dòng, người ta có thể phân biệt virus DTL thành một số nhóm kháng nguyên [39]

Như vậy, trong tự nhiên ñã tồn tại những chủng virus có ñộc lực khác nhau Những chủng có ñộc lực cao thường gây bệnh ở thể cấp tính với

tỉ lệ chết cao, chủng có ñộc lực trung bình gây bệnh ở thể á cấp tính hoặc mãn tính Còn các chủng có ñộc lực thấp thường gây chết ñối với bào thai

Theo Wensvoort G., không có mối liên quan giữa sự khác nhau của tính kháng nguyên với ñộc lực của virus DTL Nhưng tính ñộc của vius DTL sẽ bị giảm nhanh chóng bởi sự có mặt của kháng thể tiêu chảy ở bò (Bovine viral Diarrhea Virus - BVDV) hơn là kháng thể kháng virus DTL [62]

Theo Bùi Quang Anh, ñộc lực của virus thường không ổn ñịnh, việc tăng cường ñộc lực có thể ñược tiến hành sau một hoặc nhiều lần tiêm truyền qua lợn [2]

Ngày nay, nhờ sử dụng các phương pháp làm giảm ñộc lực của virus, người ta ñã sản xuất ñược một số chủng virus nhược ñộc sử dụng làm vaccin như virus DTL chủng C, chủng IFFA, chủng GPE, chủng Thiveval

Theo Dunn H.V, có thể phân biệt ñộc lực của virus DTL theo bảng dưới ñây [38]

Bảng 2.1 Phân loại ñộc lực của virus DTL

Dạng ñộc lực của virus Chỉ tiêu theo dõi

Nhiệt ñộ nuôi cấy 39 - 40oC 35 - 38 oC 33 - 34 oC

Nuôi trong môi

trường tế bào PK 15

Nhân lên nhanh, ñiểm huỳnh quang lớn, rõ

Nhân lên chậm, ñiểm huỳnh quang yếu

Trong cơ thể ñộng

vật

Nồng ñộ virus trong máu cao, thời gian tồn tại lâu Thường nhiễm vào tế bào biểu mô, tế bào lưới, ñại thực bào

và hạch amygdale

Thường giới hạn ở các tế bào biểu mô mạch quản

2.2.5 ðặc tính nuôi cấy

Khi tiêm truyền qua cơ thể lợn, các chủng virus DTL vẫn giữ nguyên các ñặc tính gây bệnh và miễn dịch Sự thích nghi của virus ñối với các loài ñộng vật khác nhau thường thay ñổi tính gây bệnh của virus ñối với lợn Trong các loài ñộng vật thì thỏ ñược chú ý nhất, ñặc biệt là ñể tạo ra những chủng virus vaccin nhược ñộc

Năm 1941, Tenbroek thông báo về việc nuôi cấy thành công virus DTL trên môi trường tế bào dịch hoàn lợn trong dung dịch Tyrode Năm 1950

Coronel và Albis ñã thực hiện thí nghiệm tiêm truyền virus DTL cho phôi vịt

và ñã thích ứng ñược virus DTL trên phôi vịt Sau ñời thứ 8 cấy truyền qua phôi vịt virus ñã mất ñộc lực với lợn nhưng vẫn gây ñược miễn dịch cho lợn [2] Fonanelli và cộng sự ñã thử nghiệm tiêm cho phôi gà nhưng không thành công (trích theo Nguyễn Lương, [19])

Ngoài những tế bào có nguồn gốc từ lợn, virus DTL có thể nhân lên trên các tế bào ñộng vật khác Các chủng virus DTL cường ñộc thường không gây bệnh tích tế bào (CPE) khi chúng nhân lên trong môi trường tế bào

Có thể nuôi cấy virus trong tổ chức sống của lợn như: tuỷ xương, hạch lâm ba, phổi, bạch cầu, thận, dịch hoàn, lách, óc, thai lợn… Trong ñó virus nhân lên tốt trong môi trường tế bào thận lợn, môi trường này thường ñược sử dụng ñể nuôi cấy virus Khi nuôi cấy, virus nhân lên ở nguyên sinh chất, không gây bệnh tích tế bào, sau khi gây nhiễm ñược 5-6 giờ thế hệ ñầu tiên của virus ñược giải phóng khỏi tế bào, virus lan rộng từ tế bào này sang tế bào bên cạnh nhờ các cầu nối tế bào chất và virus có thể tồn tại lâu bên trong môi trường tế bào [27]

2.2.6 Sự nhân lên và phương thức lây lan của virus

Virus DTL nhân lên trong nguyên sinh chất của tế bào và không gây bệnh tích tế bào Thế hệ ñầu tiên của virus ñược giải phóng ra khỏi tế bào khoảng 5 - 6h sau khi gây nhiễm

Theo Saatkamp H.W và cs, trong môi trường tế bào virus lây lan sang tế bào bên cạnh và từ tế bào mẹ sang tế bào con qua cầu nối nguyên sinh chất, ñiều này dẫn ñến không có khả năng phát hiện ra kháng nguyên virus trên bề mặt tế bào nhiễm [54]

Lợn là loài vật chủ duy nhất mang mầm bệnh và lây lan, sự tiếp xúc giữa lợn bệnh với lợn mẫn cảm là phương thức lây truyền chính của virus DTL Virus truyền từ ñàn này sang ñàn khác có thể qua nhiều ñường khác nhau, trong ñó sự du nhập của những con lợn mang trùng vào trong ñàn là

phổ biến nhất Bệnh có thể lan truyền từ các trại chăn nuôi, các phương tiện vận chuyển bị nhiễm virus Virus có thể truyền ñi rất xa theo thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt hoặc truyền bởi người chăn nuôi, nhân viên thú y, các dụng cụ, trang thiết bị thú y Virus ít có khả năng lây từ ñàn nọ sang ñàn kia theo con ñường không khí

2.2.7 Sức ñề kháng của virus DTL

Virus DTL có sức ñề kháng yếu và tuỳ thuộc vào trạng thái vật lí của chất chứa virus Trong dịch nuôi cấy tế bào, virus bị vô hoạt ỏ 600C trong 10 phút; ở máu ñã khử fibrin lại không bị vô hoạt ở 680C trong 30 phút Virus có khả năng tồn tại ở pH từ 5 - 10 Vì vỏ virus có chứa lipid nên các dung môi của mỡ như ether, cloroform, dioxyclolate làm bất hoạt virus nhanh chóng [27]

Virus, sống lâu trong các sản phẩm là thịt Trong thịt xông khói virus sống ñược 37 ngày, thịt ñể trong tủ lạnh virus tồn tại 33 ngày, trong thịt ướp ñông virus tồn tại 95 ngày Thịt lợn ñông lạnh là nguồn gieo rắc mầm bệnh rất nguy hiểm Không phát hiện ra virus trong các sản phẩm thịt ñã ñược chế biến, thịt hôp từ thịt của những lợn bị bệnh

Trong thịt, nước tiểu, xác ñộng vật chết thối virus bị chết sau 2-3 ngày Trong phân, rác, virus bị mất hoạt tính trong vòng 24h [30]

2.3 Một số ñặc ñiểm dịch tễ của bệnh DTL

2.3.1 ðộng vật cảm nhiễm

Trong tự nhiên chỉ có loài lợn (cả lợn rừng và lợn nhà) mọi lứa tuổi ñều mắc bệnh DTL [23] Bệnh có thể lây từ lợn nhà sang lợn rừng, từ lợn rừng sang lợn nhà, người và ñộng vật khác không mắc bệnh này [19]

Trong phòng thí nghiệm, tiêm virus cho thỏ, chuột lang thì bệnh thường ở thể ẩn tính, có thể tái phân lập virus sau vài ngày Tiêm truyền cho thỏ liên tục qua nhiều ñời (150 ñời) sẽ tạo ra một chủng virus nhược ñộc, không ñộc với lợn nhưng vẫn giữ ñược ñặc tính KN dùng ñể chế vaccin nhược ñộc DTL [27]

2.3.2 Chất chứa virus

Trong cơ thể, virus hấp phụ mạnh trên bạch cầu nên máu có ựộc lực sớm nhất Các chất bài xuất như nước mắt, nước mũi, nước tiểu, phân và các phủ tạng ựều chứa virus Hạch lâm ba và lách chứa nhiều virus nhất (OIE)

Những lợn nhiễm bệnh có thể thải virus trước khi phát bệnh và tiếp tục thải virus trong quá trình bệnh, sự thải virus chỉ dừng lại khi KT thể ựược sinh

ra Vì vậy, những con lợn nhiễm virus có ựộc lực cao có thể bài virus với số lượng lớn trong thời gian 10 - 20 ngày, những lợn bị thể mãn tắnh bài virus liên tục hoặc từng ựợt cho ựến lúc chết

2.3.3 Mùa vụ và lứa tuổi mắc bệnh

2.3.3.1 Mùa v ụ mắc bệnh

Theo đào Trọng đạt, Trần Thị Tố Liên, bệnh DTL phát ra quanh năm, nhưng do biến ựộng của ựàn lợn nên bệnh có lúc tăng lúc giảm [11] Theo thống kê của Lê độ, ở các tỉnh miền Bắc có tới 80% số ổ dịch diễn ra trong thời gian từ tháng 11 năm trước ựến tháng 2 năm sau, các tháng còn lại số ổ dịch chỉ chiếm 20% [13]

Theo thống kê của Cục thú y, những năm gần ựây dịch xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm nhưng vẫn có sự chênh lệch ựáng kể giữa các tháng của

vụ đông Ờ xuân và Hè Ờ thu Ngoài ra tình hình dịch cũng còn ảnh hưởng của nhiều yếu tố như tỷ lệ tiêm phòng, số lợn ựã bị giết thịt, số lợn con ra ựời chưa ựược tiêm phòng làm cho số lượng cá thể mẫn cảm với bệnh DTL trong khu vực tăng lên

2.3.3.2 L ứa tuổi mắc bệnh

Các nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy bệnh DTL xảy ra ở mọi lứa tuổi

[30], nhưng tập trung nhiều nhất ở lợn con theo mẹ và lợn mới cai sữa [10]

Theo đào Trọng đạt, Trần Thị Tố Liên, do ựàn lợn ựã ựược tiêm vaccin nhiều năm nên tuổi mắc bệnh phụ thuộc vào sức ựề kháng và tình trạng miễn dịch của ựàn lợn [11] Tuy nhiên, ở các tỉnh miền núi thuộc các tỉnh Bắc trung

bộ, do công tác tiêm phòng không ñược thực hiện triệt ñể nên bệnh DTL vẫn xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi (Báo cáo của cơ quan Thú y vùng III – 1998)

Theo Bùi Quang Anh, lợn từ 2 – 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ: 19,24%, lợn trên 6 tháng tuổi: 12,08%, lợn nái và lợn ñực có tỷ lệ mắc bệnh rất thấp (0,21 – 2,46%) nhưng lại là nguồn lây lan dịch bệnh [2]

Theo Nguyễn Xuân Bình, mặc dù quy trình tiêm phòng ñã khép kín nhưng bệnh DTL vẫn xảy ra với lợn con và lợn thịt giai ñoạn 30-90 ngày tuổi với tỷ lệ 1-1,5% tổng ñàn [3] Như vậy, tỷ lệ mắc bệnh DTL tuỳ thuộc vào tỷ

lệ tiêm phòng của ñàn lợn, hàm lượng KT trong cơ thể lợn ñã ñược tiêm và hàm lượng KT thụ ñộng trong cơ thể lợn con ñược nhận từ mẹ qua sữa ñầu Ở những vùng có tỷ lệ tiêm phòng thấp hoặc không ñược tiêm phòng thì bệnh xảy ra có tỷ lệ chết cao và xảy ra ở mọi lứa tuổi

- Cho lợn ăn ñồ thừa nhà bếp có những mẩu thịt lợn bị bệnh DTL

- Qua các vector truyền bệnh cơ học: người chăn nuôi (quần áo, giầy dép có dính virus) dụng cụ chăn nuôi, các phương tiện vận chuyển lợn từ trại này sang trại khác hay các lò mổ cũng làm lây lan dịch bệnh

- Qua bơm kim tiêm: trong quá trình tiêm phòng và chữa trị bệnh cho gia súc

- Qua sự tiếp xúc trực tiếp do vận chyển lợn ốm vào nuôi cùng với lợn

ở trại [8]

2.3.5 Sinh bệnh học

Trong ñiều kiện tự nhiên, virus vào trong cơ thể lợn qua ñường tiêu hoá, niêm mạc mắt, niên mạc mũi, ñường sinh dục, virus cũng có thể xâm nhập vào cơ thể lợn qua ñường hô hấp hay các vết thương trên da; virus có thể ñi qua nhau thai Mọi phương pháp tiêm truyền trong phòng thí nghiệm ñều có kết quả [19] Có thể tóm tắt cơ chế sinh bệnh của virus theo sơ ñồ sau:

Lá lách (tăng sinh tại ñây)

Vòng tuần hoàn bạch huyết

(Nhiễm trùng huyết lần 2) Các cơ quan ( não, hô hấp, tiêu hoá, sinh sản…)

Virus tăng sinh trong bạch cầu

Bài xuất qua ñường mũi miệng

Virus

(Từ môi trường)

Mũi, miệng

Lợn nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng virus có ñộc lực cao ñược ñặc trưng bởi các pha: Nhiễm virus ở hạch, máu và nhiễm virus ở phủ tạng Từ tế bào thượng bì trong các hạch lâm ba, hạch amygdale, virus xâm nhập vào các lớp mô lympho và từ ñó virus theo ñường bạch huyết ñến các hạch lympho vùng Ở ñó chúng ñược nhân lên nhanh chóng; một lượng lớn virus ñược tạo ra

ở lách, hạch lâm ba nội tạng, tuỷ xương và ñường tiêu hoá Vì vậy nồng ñộ virus trong máu cao chúng lại xâm nhập vào các cơ quan khác như hệ hô hấp, hệ thần kinh trung ương Tại cơ quan virus bị thực bào bởi các bạch cầu Sự nhân lên của virus trong bạch cầu và các tế bào lưới nội bì dẫn ñến giảm bạch cầu, lợn

dễ nhiễm khuẩn kế phát Các chủng virus ñộc lực cao có thời gian phát tán ra tất

cả các cơ quan khác trong vòng 5 - 6 ngày kể từ khi xâm nhiễm [30]

Virus tác ñộng làm thoái hoá tế bào nội bì và biểu bì thành mạch quản, gây giảm tiểu cầu và rối loạn sự tổng hợp sợi fibrin, làm hình thành các cục máu ñông nhỏ làm tắc nghẽn tuần hoàn gây xuất huyết lấm tấm

Cách lây nhiễm với các chủng virus có ñộc lực trung bình cũng giống với các chủng có ñộc lực cao nhưng tiến triển chậm hơn Các chủng virus ñộc lực thấp chủ yếu hạn chế ở các biến ñổi ở hạch bạch huyết và tuần hoàn cục bộ Virus có thể ñi qua nhau thai ở tất cả các giai ñoạn phát triển của thai Virus thường lan truyền theo ñường máu và phát triển ở một vài nơi dọc theo nhau thai và lan truyền từ bào thai này sang bào thai khác Trong các bào thai virus cũng phân bố trong các cơ quan nội tạng và ñường máu giống như ở lợn nhiễm bệnh với chủng có ñộc tính sau khi sinh Tuỳ thuộc vào tuổi thai bị lây nhiễm và ñộc lực của virus xâm nhập mà hậu quả khác nhau Những bào thai

bị nhiễm trong giai ñoạn 45 ngày ñầu của thai kì có khuynh hướng chết trước khi sinh hoặc phát sinh hiện tượng lây nhiễm dai dẳng và có ñáp ứng miễn dịch cao hơn các bào thai bị nhiễm lúc 65 ngày hoặc muộn hơn Những bào thai bị nhiễm bởi những chủng virus có ñộc tính trung bình, lúc 45 ngày cuối của thời kì mang thai thường biểu hiện triệu chứng bệnh khi sinh hoặc một

thời gian ngắn sau khi sinh hoặc thải virus trong trường hợp lây nhiễm với những chủng virus có ñộc lực thấp [60]

Do tổn thương mạch quản dẫn ñến các bệnh tích ñặc trưng của bệnh DTL như sung huyết, xuất huyết, nhồi huyết và hoại tử, viêm não - màng não và thoái hoá các tế bào nội bì, nghẽn mạch, thâm nhiễm lymphocyte qua mạch thường thấy ở 70 - 90% các trường hợp lợn chết Virus gây hình thành mụn loét ở niêm mạc ruột già sau khi gây hoại tử ở những nang lâm

ba riêng biệt và làm ñông sợi huyết tạo thành những nốt loét hình cúc áo ở ruột già [23]

2.3.6 Thể bệnh

Thể bệnh của bệnh DTL ngày nay có nhiều thay ñổi, tùy thuộc vào lứa tuổi lợn, phương thức chăn nuôi, chủng virus, thời ñiểm nhiễm bệnh… nhưng các thể bệnh chủ yếu thường gặp là: thể quá cấp tính, thể cấp tính, thể mãn tính và thể tiềm ẩn (thể không ñiển hình)

2.3.6.1 Th ể quá cấp tính

Hay còn gọi là thể siêu cấp tính: xuất hiện ñột ngột không có triệu chứng ban ñầu, sốt cao, kết hợp với trạng thái thương hàn Lợn bệnh có thể tử

vong trong vòng 24 - 48 giờ Thể bệnh này chưa xuất hiện những triệu chứng

bệnh tích ñiển hình Thể này còn gọi là bệnh DTL lợn khô [24]

2.3.6.2 Th ể cấp tính

Thời gian nung bệnh từ 3-4 ngày, ở thể này lợn bệnh có triệu chứng ñiển hình là sốt cao từ 41 – 420C, lợn biểu hiện mệt lả ít vận ñộng (lợn bỏ ăn,

nằm chất ñống) Sau 24 - 48 giờ, mắt sưng húp và viêm kết mạc với các triệu

chứng ngoài da (vết chàm tím, xuất huyết hoặc tụ huyết màu ñỏ tại các vùng

da mỏng như tai, mõm, bụng, chân, bẹn, bao dương vật…), lợn tiêu chảy thối khắm với mùi ñặc trưng, lợn có thể có triệu chứng hô hấp (ho) và triệu chứng thần kinh (liệt nhẹ các chi sau, ñi loạng choạng, run cơ bắp), tử vong trong

thời gian 6 - 20 ngày sau khi phát bệnh

2.3.6.3 Th ể á cấp tính hoặc mãn tính

Thể bệnh này diễn ra trong ba giai ñoạn:

- Giai ñoạn ñầu kéo dài trong thời gian 10 - 15 ngày, toàn bộ ñàn lợn phát

bệnh, các triệu chứng cục bộ giống như thể cấp tính nhưng với mức ñộ nhẹ

- Giai ñoạn hai là giai ñoạn thuyên giảm

- Giai ñoạn ba với các mầm bệnh bội nhiễm và sự phát bệnh toàn thân

kèm với các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu chảy kết hợp (viêm phổi

và viêm ruột thông thường do Salmonella) Bệnh súc gầy mòn dần, sau ñó tử

vong trong vòng 1 - 3 tháng

2.3.6.4 Th ể không ñiển hình

Thể bệnh này biểu thị dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn sinh sản hay bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rảy bẩm sinh, rối loạn vận ñộng, chết yểu…), chậm lớn, chết rải rác Hơn nữa trong các trường hợp không ñiển hình, virus DTL có thể lưu hành một cách không

rõ ràng nhất là ở lợn sinh sản với các trường hợp lâm sàng lẻ tẻ nổ ra khi có các ñiều kiện không thuận lợi [20]

Theo Nguyễn Lương, ñây là thể khó phân biệt của DTL vì bệnh kéo dài

và không có các thời kỳ rõ rệt Thể bệnh nhẹ hơn bình thường và thường chỉ một loại phủ tạng có bệnh tích: chẳng hạn chỉ ở phổi, ruột hay thần kinh ñặc biệt bị bệnh [19]

Nguyên nhân của thể không ñiển hình có thể có nhiều: ñộc tố của virus gây bệnh, các nhiễm trùng thứ phát, sức ñề kháng bẩm sinh của giống nòi, thức ăn, cách nuôi dưỡng, chăm sóc Triệu chứng sẽ dễ dàng quan sát ở những con lợn trong trạng thái có sức khỏe kém Lợn chậm phát triển và suy dinh dưỡng; các triệu chứng, bệnh tích không giống bệnh DTL thông thường

ở lợn con), có thể bị liệt hai chân sau Quá trình diễn biến của bệnh thường từ 5-7 ngày, nếu chậm thì từ 7-10 ngày con vật sẽ chết

Ở thể mãn tắnh bệnh thường kéo dài 1-3 tháng, giai ựoạn ựầu triệu chứng cũng giống như ở thể cấp tắnh nhưng với mức ựộ nhẹ hơn sau ựến giai ựoạn bệnh thuyên giảm và có bội nhiễm kế phát đặc trưng của thể bệnh này

là lợn ăn rất ắt hay bỏ ăn, sốt, ỉa chảy kéo dài hoặc ngắt quãng, bạch cầu giảm Thể này kéo dài vài tháng bệnh súc trong tình trạng gày mòn suy kiệt rồi cuối cùng chết [30]

Trong quá trình nghiên cứu đào Trọng đạt, Trần Thị Tố Liên, ựã quan sát ựược triệu chứng lâm sàng của lợn bị Bệnh DTL ở các lứa tuổi khác nhau như sau:

- Ở lợn con theo mẹ dưới một tháng tuổi: gày yếu, run rẩy, sốt cao 41,50C, phân trắng không tiêu, mắt có dử và chảy nước mắt, có con ỉa phân loãng màu vàng, co giật Lợn trong ựàn chết dần trong vòng 10-15 ngày; con nào sống sót thì còi cọc chậm lớn Tình trạng này thường thấy ở những ựàn lợn sau tiêm phòng 1-5 ngày

- Ở lợn từ 1-2 tháng tuổi: tai, mũi, cổ, chân bầm tắm như bị thiếu ô xy, phân loãng, vàng hoặc trắng như vôi, bỏ ăn, về sau xuất hiện những nốt xuất huyết như muỗi ựốt

- Ở lợn 2-3 tháng tuổi: ngoài các triệu chứng trên còn bị gày yếu rất nhanh, lông xù lên rất rõ

- Ở lợn thịt: sốt cao, phần lớn bị táo bón, một số ắt bị ỉa chảy, mắt có dử, chảy nước mắt, bỏ ăn; do diễn biến cấp tắnh nên bề ngoài vẫn béo, ắt giảm cân

- Ở lợn nái mang thai ựã ựược tiêm phòng trong vùng có dịch: bỏ ăn, sốt nhẹ và sau ựó trở lại bình thường, nhưng có khi bị sảy thai, thai gỗ, ựẻ non, lợn con ựẻ ra sống sót cũng chỉ ựược vài ngày, nhưng lợn mẹ vẫn sống khoẻ mạnh

Ở những lợn nái nhiễm những chủng virus có ựộc lực trung bình hoặc ựộc lực thấp có thể trở thành những con vật mang trùng (ựiều này gây rất nhiều khó khăn cho công tác phòng chống và thanh toán bệnh DTL) đa số lợn con bị nhiễm bệnh từ trong bụng mẹ sẽ chết sau khi sinh hoặc chết lưu trong tử cung lợn mẹ, nhưng ựôi khi vẫn có con sinh ra khoẻ mạnh nhưng ựã

mang trùng và gây bệnh DTL muộn [11]

2.4.2 Bệnh tắch ựại thể

Theo đào Trọng đạt và Trần Thị Tố Liên, bệnh DTL là bệnh dịch tễ ựàn, do vậy khi quan sát lâm sàng và bệnh tắch phải quan sát từ 3 - 5 con trở lên [11] Nhưng tìm ra ựầy ựủ các bệnh tắch ựiển hình của bệnh DTL trong thời gian gần ựây là rất khó

Thể cấp tắnh và mãn tắnh có thể quan sát thấy xuất huyết lấm tấm ở da, kắch thước khác nhau do hoại tử, thoái hoá tế bào nội bì và máu khó ựông Xuất huyết thường thấy ở hạch lâm ba, thận, ắt hơn ở tim, màng thanh dịch, bóng ựái, niêm mạc ruột, thanh quản, da và dưới da Hạch lâm ba xuất huyết nhiều ở các xoang ngoại biên làm cho mặt cắt giống như ựá hoa vân Thận xuất huyết lấm tấm như trứng quốc Lách có kắch thước bình thường, thường

thấy nhồi huyết dọc theo rìa làm cho lách cĩ hình răng cưa [24] Niêm mạc ruột già, đặc biệt là van hồi manh tràng cĩ nốt loét hình cúc áo, bề mặt cĩ phủ bựa Ngồi ra cĩ thể quan sát thấy hiện tượng cĩ nước nhầy, lắng đọng sợi fibrin, xuất huyết cục bộ màng nhầy đường tiêu hố, đường hơ hấp, phổi, cuối cùng nhiễm bệnh kế phát xảy ra [58] Tuỳ theo từng ổ dịch, độc lực của virus, sức đề kháng của con vật và thời gian cảm nhiễm mà bệnh tích ở từng con khơng giống nhau

Theo Nguyễn Tiến Dũng, các bệnh tích đại thể cần chú ý trong chẩn đốn bệnh DTL là:

- Lách bị nhồi huyết, bên rìa lách cĩ các đám tụ máu đen sậm Trong chẩn

đốn nếu xảy ra 25 - 65% các trường hợp này được coi như là một bệnh tích chỉ định cho bệnh DTL [7] Cùng nhận định này cịn cĩ Van Oirschot J.T., [58]

- Loét niêm mạc vùng van hồi manh tràng: phần nối giữa ruột già và ruột

non cĩ các đám loét bựa bên trong, cĩ các đám loét cĩ hình trịn như cúc áo

- Loét amygdale, cuống lưỡi, xuất huyết amygdale, tiểu thiệt

- Phổi xuất huyết kèm theo viêm

- Xuất huyết lấm chấm ở phủ tạng, thận, bàng quang, túi mật, niêm mạc

dạ dày, ruột và ở ngồi da

- Các hạch ruột xuất huyết màu đỏ xen với màu trắng (gọi là đá hoa vân)

Ngồi ra ở thể bệnh mãn tính và thể bệnh phát muộn (late onset) thường thấy teo tuyến Thymus và sưng khớp của xương sườn ở lợn con [58]

Trong trường hợp bệnh DTL xảy ra ở lợn con thường ghép với Phĩ thương hàn, E.coli gây những nốt loét tràn lan ở ruột, viêm phổi làm lu

huyết, nhồi huyết (thường thấy ở lách, hạch lympho, thận và đường tiêu hố), hoại tử, viêm não, viêm màng não, đặc trưng bởi sưng và thối hố các tế bào nội bì, nghẽn mạch, thâm nhiễm lymphocyte qua mạch

Theo Van Oirschot J.T., sự gia tăng về số lượng các đại thực bào và sự suy yếu của hệ đơn bào ở giữa hạch bạch huyết, lách, hạch amygdale và

những đám hạch ruột xảy ra trong trường hợp bệnh mãn tính [60]

2.5 Các phương pháp chẩn đốn

2.5.1 Chẩn đốn dựa vào triệu chứng, bệnh tích

Trong thực tế sản xuất tại các địa phương, việc dựa vào các triệu chứng bệnh tích để chẩn đốn bệnh DTL là chủ yếu, tuy nhiên kết quả của phương pháp này cĩ độ chính xác khơng cao; nhưng rất cần thiết để cĩ kết quả sơ chẩn ban đầu trước khi tiến hành các phương pháp trong phịng thí nghiệm

+ Kiểm tra bệnh phẩm trên kính hiển vi để tìm các vi khuẩn kế phát Nếu khơng thấy vi khuẩn cĩ thể nghi đĩ là bệnh DTL thuần tuý sau khi đã cĩ kết quả chẩn đốn lâm sàng (các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của DTL); trường hợp cĩ vi khuẩn cĩ thể nghi ghép với bệnh đã tìm thấy vi khuẩn [19] + Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm: Phương pháp phát hiện bệnh DTL cổ điển, chính xác nhất là tiêm cho lợn Phương pháp này cĩ nhược điểm là tốn thời gian và tiền của Nĩ thường được dùng khi các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích khơng đủ để kết luận bệnh hoặc để cĩ cơ sở pháp lí cơng bố dịch

+ Phương pháp làm tăng cường độc lực của virus Newcastle: Người ta dùng mơi trường tế bào dịch hồn lợn một lớp để cấy bệnh phẩm nghi cĩ virus DTL, sau 5 ngày tiếp tục cấy virus Newcastle, thấy virus Newcastle nhân lên mạnh và gây bệnh tích tế bào, chứng tỏ bệnh phẩm cĩ chứa virus DTL [27] Vì virus DTL cĩ tác dụng làm tăng độc lực của virus Newcastle, nếu mơi trường tế bào dịch hồn lợn chỉ cấy virus Newcastle thì virus khơng gây được bệnh tích tế bào

2.5.3 Chẩn đốn huyết thanh học

Hiện nay, ở Việt Nam thường dùng một số phản ứng huyết thanh học sau

để nghiên cứu, chẩn đốn và giám sát bệnh DTL như: thí nghiệm trung hồ trên thỏ, phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch, phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (ELISA), hố mơ miễn dịch (IHC)

2.5.3.1 Ph ản ứng trung hồ trên thỏ

Nguyên lý: virus DTL cường độc và virus nhược độc cĩ tính gây bệnh khác nhau cho thỏ và cho lợn, nhưng cĩ tính kháng nguyên (KN) giống nhau

Cĩ thể dùng virus DTL cường độc tiêm cho thỏ để gây miễn dịch Sau đĩ chứng minh tính miễn dịch của thỏ đối với virus DTL bằng cách tiêm virus DTL nhược độc [27]

2.5.3.2 Ph ương pháp miễn dịch khuếch tán trên thạch

Nguyên lý: Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch là phản ứng kết hợp đặc hiệu giữa KN – KT xảy ra trong mơi trường thạch Trong thạch KN, KT cách nhau một khoảng, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau Khi KN, KT gặp nhau ở nồng độ tương ứng thích hợp, hiện tượng kết tủa xảy ra Kết tủa tạo thành một vạch màu trắng trên mơi trường thạch, cĩ thể nhận biết bằng mắt thường Mặc dù đây là phản ứng cĩ tính đặc hiệu cao song do độ nhạy quá thấp nên khơng thích hợp trong chẩn đốn bệnh cũng như nghiên cứu dịch tễ học

2.5.3.3 Ph ản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu

Bình thường virus DTL không hấp thụ ñược trên bề mặt hồng cầu, vì vậy phải xử lí hồng cầu bằng axit tanic 1%, chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu một nhóm chức khác gắn với virus DTL; khi ñó virus dễ dàng hấp thụ trên bề mặt hồng cầu cừu, thỏ, chuột lang nhưng không gây ngưng kết hồng cầu Khi gặp kháng thể (KT) tương ứng, virus DTL sẽ kết hợp với KT

ñó, hồng cầu dính lại qua cầu nối KT gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu

2.5.3.4 Ph ản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Nguyên lý: Dùng KT ñã ñược nhuộm màu huỳnh quang cho tác dụng với KN là bệnh phẩm nghi có chứa virus DTL (hạch, lách lợn bệnh) ñã cố ñịnh trên tiêu bản Nếu trong bệnh phẩm có virus DTL, phức hợp KN - KT ñược hình thành Phức hợp này ñược giữ chặt trên tiêu bản không bị nước rửa trôi Khi soi trên kính hiển vi huỳnh quang, phức hợp KN - KT sẽ phát sáng (phản ứng dương tính) Nếu trong bệnh phẩm không có virus, phức hợp KN - KT sẽ không ñược hình thành KT nhuộm màu huỳnh quang sẽ bị rửa trôi Khi soi dưới kính hiển vi huỳnh, tiêu bản sẽ không phát sáng - phản ứng âm tính

2.5.3.5 Ph ản ứng miễn dịch ñánh ñấu enzym (ELISA)

Phản ứng ELISA có ñộ chính xác rất cao và tiết kiệm ñược thời gian (chỉ trong vòng 24h)

Hiện nay thường dùng bộ kit Ceditest CSFV cho phản ứng ELISA trực tiếp ñể phát hiện virus DTL có trong máu lợn [6]

Nguyên lý: Dùng bộ kit Ceditest CSFV ñể phát hiện kháng thể trong máu lợn Bộ kit này sử dụng hai kháng thể ñơn dòng (MAbs), những kháng thể này nhận biết các Epitop khác nhau của kháng nguyên E2 nằm trên lớp vỏ của virus

Bộ kit này dùng ñể phát hiện KT kháng virus DTL trong huyết thanh lợn KT ñơn dòng thứ nhất (MAb3) ñược gắn lên ñáy của các giếng trên ñĩa phản ứng KT ñơn dòng thứ 2 ñược gắn men horseradish peroxydase và ñược dùng như conjugate

Mẫu huyết thanh, conjugate, KN chuẩn được cho vào các giếng trên đìa phản ứng và ủ ở nhiêt độ phịng Sau đĩ đĩa phản ứng được rửa để loại bỏ các thành phần thừa Cơ chất được bổ sung vào tất cả các giếng Sau khi ủ ở nhiệt

độ phịng, dung dịch dừng phản ứng được bổ sung vào tất cả các giếng để dừng phản ứng sinh màu Nếu trong mẫu huyết thanh cĩ KT kháng virus DTL thì KT này sẽ phản ứng với KN chuẩn Conjugate sẽ khơng được giữ lại trên đĩa phản ứng, phản ứng sinh màu khơng xảy ra (phản ứng dương tính) Nếu trong huyết thanh khơng cĩ KT, KN chuẩn sẽ phản ứng với cả hai KT đơn dịng (conjugate được giữ lại trên đĩa phản ứng) phản ứng sinh màu sẽ xảy ra (phản ứng âm tính)

2.5.3.6 Hố mơ mi ễn dịch (IHC)

Hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) là sự kết hợp giữa 2 ngành

mơ bệnh học và miễn dịch học Kỹ thuật IHC được dùng khơng những chỉ để xác dịnh một mơ cĩ hoặc khơng cĩ KN đặc hiệu mà cịn dùng để xác định tính trạng KN của những tế bào đặc hiệu trong mơ và vị trí của KN trong tế bào Nhờ đĩ cĩ thể xác định được dịng tế bào xác định rõ tính chất sinh học của quần thể tế bào trong cùng một dịng, và chức năng khác nhau của các loại tế bào, thậm chí cịn cĩ thể xác định được tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn Chìa khố chính trong HMMD là phản ứng đặc hiệu của KN với KT Mặc dù áp dụng rộng rãi với nhiều nguyên lý khác nhau trong nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh, HMMD cĩ tác dụng rất lớn và sâu sắc trong việc chẩn đốn giải phẫu bệnh

Mặc dù đã cĩ nhiều tiêu chuẩn mơ bệnh học "cơ bản" dùng cho chẩn đốn, song trong thực tế, sự trùng lặp và giống nhau của các tổn thương, cũng như cĩ những tổn thương khơng điển hình làm cho chẩn đốn mơ bệnh học gặp nhiều khĩ khăn, khĩ đi đến chẩn đốn xác định hoặc khĩ thống nhất giữa các nhà giải phẫu bệnh với nhau Vì thế, đã từ lâu các nhà giải phẫu bệnh trên thế giới cố gắng tìm ra nhiều phương pháp giúp chẩn đốn phân biệt như hố mơ học (histochemistry), mơ-enzym học (histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang

(Immunoflourescence), hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry), lai tại chỗ (hybridation in situ) Hố mơ miễn dịch là kỹ thuật hiện đại mới được áp dụng tương đối rộng rãi ở các nước tiên tiến trên thế giới vì cĩ độ chính xác cao

2.5.4 Chẩn đốn bằng phản ứng RT-PCR

ðây là phương pháp In vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp một số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzym polymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA từ khuơn mẫu Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi là những đoạn ngắn cĩ khả năng bắt cặp với một đầu của mạch khuơn ðoạn mồi này sau đĩ được kéo dài ra là nhờ hoạt động của enzym DNA polymerase để hồn thành một mạch mới hồn chỉnh

Phương pháp RT-PCR là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược

và phương pháp PCR Phương pháp này cĩ thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khơng thể phát hiện bằng phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong bước PCR khơng hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase (RT), sau đĩ cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phẩm được nhận biết qua điện di trên gel agarose

2.6 Phịng chống bệnh DTL

Bệnh DTL là bệnh nguy hiểm cho nghành chăn nuơi lợn Nếu dịch xảy

ra thì thiệt hại rất lớn về kinh tế nên việc phịng chống bệnh cĩ ý nghĩa vơ cùng quan trọng

2.6.1 Trên thế giới

Với các nước đã thanh tốn được bệnh DTL, để ngăn chặn bệnh DTL nhập từ nước ngồi vào người ta áp dụng biện pháp cấm nhập khẩu lợn sống, thịt lợn hoặc các sản phẩm chưa xử lý nhiệt Những thức ăn thừa của hành

khách nhập cảnh từ máy bay, tàu thuỷ đều phải huỷ bỏ để tránh mầm bệnh mang từ nước ngồi vào

Một số nước, khi cĩ bệnh DTL xảy ra, tất cả lợn nghi nhiễm trong đàn đều

bị giết huỷ cùng với việc áp dụng các biện pháp vệ sinh để tiêu diệt mầm bệnh Theo quy định của EC, chỉ những lợn và sản phẩm từ lợn từ những nước hoặc vùng an tồn bệnh DTL mới được buơn bán tự do trong phạm vi cộng đồng châu Âu [51]

Một số nước thanh tốn bệnh DTL bằng các biện pháp sau đây:

- Nghiên cứu và áp dụng các phương pháp chẩn đốn nhanh, nhạy tại hiện trường cũng như trong phịng thí nghiệm

- Củng cố giám sát dịch bệnh và hệ thống thơng tin để kịp phát hiện mức

- Một số nước áp dụng biện pháp tiêm phịng vaccine; kinh nghiệm ở châu

Âu là cĩ thể thanh tốn bệnh DTL bằng chương trình tiêm phịng vaccin một cách nghiêm ngặt trong khoảng thời gian nhất định Chương trình này phải kết hợp với việc vệ sinh gia súc chu đáo ðể cĩ hiệu quả, chương trình tiêm phịng vaccin phải bắt buộc đồng thời phải quy đinh rõ thời gian, độ tuổi tiêm phịng

2.6.2 Phịng chống bệnh ở Việt Nam

Bệnh DTL tại Việt Nam đã được bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn quy định là bệnh phải tiêm phịng bắt buộc và khi dịch xảy ra thì phải cơng bố dịch

Hiện nay, chúng ta phịng bệnh bằng cách tiêm phịng vaccin DTL định

kì hàng năm mỗi năm 2 lần), tiêm bổ sung cho ựàn lợn mới sinh ra và mới nhập về Chắnh việc tiêm phòng này ựã hạn chế rất nhiều các ổ dịch trên ựịa bàn cả nước Tuy nhiên, còn nhiều lắ do khác nhau mà bệnh DTL vẫn là mối

ựe doạ cho ngành chăn nuôi lợn nước ta, ựặc biệt ở vùng sâu, vùng xa, vùng

có kinh tế khó khăn, vùng ựồng bào dân tộc ắt người

Việc xác ựịnh thời gian, tháng tuổi tiêm phòng vaccin ựối với lợn con là quan trọng, tránh ảnh hưởng của miễn dịch thụ ựộng và ựảm bảo cho lợn con

có miễn dịch sớm nhất Theo đào Trọng đạt và Nguyễn Tiến Dũng: từ 30 -

45 ngày tuổi là thời kì chuyển tiếp từ bảo hộ do miễn dịch thụ ựộng sang bảo

hộ bằng miễn dịch chủ ựộng Do vậy việc tiêm phòng vaccin DTL chủng C phải ựược tiến hành trong thời gian này

Theo Trần đình Từ (1990), thời gian tiêm phòng vaccin như sau:

- đối với lợn nái: tiêm phòng trước khi phối giống 3 tuần tuổi hoặc trước khi ựẻ 1 tháng ựể tạo kháng thể cao truyền sang cho con qua sữa ựầu

- đối với lợn con: Nếu lợn mẹ chưa tiêm phòng thì nên tiêm phòng vaccine sớm vào lúc 10 - 15 ngày tuổi sau ựó nhắc lại trước khi cai sữa Trường hợp lợn mẹ ựã ựược tiêm phòng thì tiêm phòng cho lợn con vào lúc

30 ngày tuổi và tiêm nhắc lại và lúc 60 ngày tuổi

- Lợn ựực giống tiêm phòng 1 - 2 lần/năm [30]

Tuy nhiên, việc tiêm phòng không phải là biện pháp duy nhất ựể thanh toán bệnh dịch tả lợn tại Việt Nam Bên cạnh việc phòng còn áp dụng biện pháp tiêu diệt mầm bệnh bằng cách giết huỷ những con ốm bị bệnh DTL, làm sạch mầm bệnh trong ựàn lợn, áp dụng những biện pháp chẩn ựoán ựể phát hiện những con mang trùng loại thải kịp thời Biện pháp này ựã ựược áp dụng

ựể khống chế bệnh DTL tại Long An và thành phố Hồ Chắ Minh [3]

Khi cần thiết thì hạn chế hoặc cấm vận chuyển lợn giữa các vùng; tăng cường công tác kiểm dịch, kiểm soát giết mổ ựộng vật; giết huỷ những con lợn bệnh

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu: Lợn bị mắc bệnh dịch tả

- ðịa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Bệnh lý, Phịng thí nghiệm

Trung tâm, Khoa Thú Y, Trường ðHNN Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh dịch tả

- Xác định biến đổi bệnh lý đại thể chủ yếu của lợn mắc bệnh dịch tả

- Nghiên cứu các tổn thương vi thể của: não, gan, thận, lách, tim, phổi, hạch lympho, hạch amygdale, ruột, của lợn mắc bệnh dịch tả

- Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học cơ bản của lợn bệnh

- Ứng dụng kỹ thuật Hố mơ miễn dịch để chẩn đốn bệnh dịch tả lợn

3.3 Nguyên liệu, thiết bị và hĩa chất dùng trong nghiên cứu

3.3.2 Thiết bị, máy mĩc

Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động, máy đúc block, máy cắt microtocom, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, tủ sấy, tủ lạnh, tủ âm bảo quản mẫu, kính hiển vi quang học

- Hĩa chất dùng trong quá trình làm tiêu bản vi thể gồm: cồn etylic 600,

960, 1000; xylen; paraffin; hematoxylin; eosin

- Hĩa chất dùng trong quá trình nhuộm hĩa miễn dịch tổ chức: PBS (Phosphat buffer saline), H2O2 30%, dung dịch Tris 0,05M, dung dịch DAB (50ml Tris + 17µl H2O2 + 0.23g Diamino benzidin), nước cất, Methanol

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp xác định lợn bệnh

Việc xác định lợn bị bệnh là vơ cùng quan trọng, vì đây là bước khởi đầu cho các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu ðể xác định lợn bị bệnh chúng tơi dựa vào những đặc điểm dịch tễ, quan sát những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh

Tại thời điểm nghiên cứu, các đàn lợn nghi mắc dịch tả được lấy mẫu gửi đến Trung tâm chẩn đốn Thú Y trung ương để xác định dương tính với DTL bằng phản ứng RT-PCR

3.4.2 Phương pháp mổ khám

Sử dụng phương pháp mổ khám tiêu chuẩn của Cục Thú Y (Cục Thú y, 2007) để tiến hành nghiên cứu các tổn thương đại thể và lấy mẫu làm tiêu bản bệnh lý Bao gồm các bước sau:

1 - Kiểm tra bên ngồi: thể trạng, lơng, da, các vết thương, mụn loét, các

lỗ tự nhiên Chụp ảnh trước khi mổ khám

2 - Mổ khám và kiểm tra các cơ quan bên trong Chú ý: khám lần lượt từ ngồi vào trong, từ trên xuống dưới, tránh bỏ sĩt các cơ quan

Cùng với việc mổ khám, phải tiến hành ghi biên bản mổ khám và chụp ảnh các bệnh tích

3 - Lấy mẫu: các mẫu thu nhận là lách, hạch lympho, hạch amygdale, ruột, dạ dày, não, thận, tim, gan, phổi Mỗi cơ quan tổ chức lấy 2 phần, một phần ngâm trong formol 10% ñể làm tiêu bản vi thể, một phần bảo quản lạnh

ở -800C ñể phân lập virus và chạy PCR

3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể

Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tấm ñúc bằng Paraffin theo Robert (1969), Burn (1974), cắt dán mảnh bằng Microtom Leika 2030,

nhuộm Hematoxylin - Eosin

Mỗi lợn bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi ñúc thành hai block Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra bốn tiêu bản ñẹp, sau ñó tiến hành soi dưới kính hiển vi ñể ñọc kết quả bệnh tích vi thể

Phương pháp bao gồm các bước sau:

Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất: lọ chứa Formol 10%, dao, kéo, panh kẹp,

cốc ñựng hoá chất, phiến kính, máy ñúc block, khuôn ñúc, tủ ấm 370C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 - 520C, Xylen, Paraffin, thuốc nhuộm

Haematoxilin, Eosin…

- Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là lách, hạch lympho, hạch amygdale, ruột,

dạ dày, não, thận, tim, gan, phổi

- Cố ñịnh bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong Formol)

- Vùi bệnh phẩm bao gồm các bước sau:

+ Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 – 5mm cho vào khuôn ñúc bằng nhựa ðem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ñể rửa sạch Formol

+ Chạy mẫu: ñưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng trong

18 tiếng (bảng 3.1) Lấy mẫu ra và tiến hành ñúc block

Bảng 3.1 Qui trình chuyển ñúc mẫu tự ñộng

- Cắt và tãi mảnh:

+ Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 - 520C, phiến kính, panh kẹp + Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với ñộ dầy mảnh cắt khoảng 3-5µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức

+ Tãi mảnh: dùng panh kẹp mảnh cắt ñặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt ñều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước

ấm 48 - 520C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau

ñó ñể tủ ấm 370C ñến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin

- Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau:

+ Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc:

+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5 - 10 phút

+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Haematoxilin ngập tiêu bản ðể trong khoảng 3-5 phút sau ñó ñổ thuốc nhuộm ñi, rửa qua nước Lau sạch nước xung quanh tiêu bản Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là ñược

Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây)

Nếu ñậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giây + Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất

+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3-5 phút, tuỳ theo thực tế màu Eosin Sau ñó rửa nước chảy 5 - 10 phút cho hết Eosin thừa

+ Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt ñối, mỗi lọ 1 phút

+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản ñi qua hai lọ Xylen, mỗi lọ 3 phút