nghiên cứu tính kháng một số thuốc hoá học trị liệu của vi khuẩn e.coli phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN TRUNG PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG MỘT SỐ THUỐC HOÁ HỌC TRỊ LIỆU CỦA VI KHUẨN E.COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN CON ỈA PHÂN T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TRUNG PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG MỘT SỐ THUỐC

HOÁ HỌC TRỊ LIỆU CỦA VI KHUẨN E.COLI

PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN CON ỈA PHÂN TRẮNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: THÚ Y

Mã số: 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS BÙI THỊ THO

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Trung Phương

LỜI CẢM ƠN

ðể hồn thành đề tài này, ngồi sự cố gắng của bản thân, tơi luơn nhận được sự quan tâm sâu sắc, tận tình tỉ mỉ và chu đáo của cơ giáo PGS.TS Bùi Thị Tho

Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể các thầy giáo, cơ giáo, các cán bộ nhân viên Khoa Sau đại học, Khoa Thú Y, bộ mơn Nội - Chẩn - Dược - ðộc chất đã quan tâm chỉ bảo và luơn tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tơi cĩ nhiều cơ hội nâng cao kiến thức về mọi mặt

Tơi xin chân thành cảm ơn tới tồn thể cán bộ, nhân viên phịng vi trùng - Trung tâm chẩn đốn thú y Quốc gia

Tơi cũng xin chân thành cảm ơn Ban quản lý và tồn thể cơng nhân trại chăn nuơi Liên Hiệp - Hưng Yên, trại Hồng Liễn - Thái Bình và trại Thành ðồng - Vĩnh Phúc đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt quá trình nghiên cứu tại trại ðặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bố mẹ, anh chị em và bạn

bè đã động viên, ủng hộ, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập

Tơi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Trung Phương

trong phân lợn con theo mẹ bình thường và phân lợn con phân trắng 37

4.1.1 Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có trong

trắng tại các trại chăn nuôi khác nhau với một thuốc hoá học trị liệu 59

4.4 Kết quả ñiều trị thử nghiệm bệnh lợn con phân trắng với một số

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

4.1 Tỷ lệ, số lượng một số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con

4.4 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn

4.5 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn

4.6 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn

4.7 Kết quả so sánh tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn

con phân trắng ở các trại khác nhau với các thuốc hoá học trị

4.8 Kết quả kiểm tra tính ñơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.9 Kết quả kiểm tra tính ñơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.10 Kết quả kiểm tra tính ñơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.11 Kết quả so sánh tính ñơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.12 Kết quả kiểm tra tính ña kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.13 Kết quả kiểm tra tính ña kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.14 Kết quả kiểm tra tính ña kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.15 So sánh tính ña kháng thuốc của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.16 Kết quả ñiều trị bệnh lợn con phân trắng tại trại Liên Hiệp - Hưng

4.17 Kết quả ñiều trị lợn con phân trắng bằng các thuốc kháng sinh

4.18 Kết quả ñiều trị lợn con phân trắng bằng các thuốc kháng sinh

DANH MỤC BIỂU ðỒ

4.1 Sự biến động về số l−ợng các vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn

4.2 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.3 Kết quả kiểm tra độ mẫn cảm của vi khuẩn E.coli phân lập từ phân

4.4 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.5 Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.6 Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn

4.7 Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.8 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.9 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.10 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của E.coli phân lập từ phân lợn con

4.11 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh lợn con phân trắng tại trại Liên Hiệp -

4.12 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh lợn con phân trắng bằng các kháng sinh và

4.13 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh lợn con phân trắng bằng các kháng sinh và

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Vi khuẩn kháng thuốc ñã và ñang làm ô nhiễm môi trường sống, làm tăng tính nguy kịch của nhiều loài bệnh tật Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn cùng với AIDS ñã và ñang ñược coi là bạn ñồng hành mà ngành y tế phải ñương ñầu Chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của cộng ñồng và môi sinh (W.H.O)

Trong các loại vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc, nhóm vi khuẩn ñường

ruột ñược thấy nhiều hơn cả, ñặc biệt là E.coli ðây là một vi khuẩn thường

trực trong ñường tiêu hoá của người và gia súc, ngay cả khi khoẻ mạnh Khi sức ñề kháng của cơ thể giảm sút, chúng lập tức tăng nhanh về số lượng và ñộc lực ñể gây bệnh

Trong chăn nuôi lợn hiện nay, hội chứng tiêu chảy với ñặc ñiểm và diễn biến bệnh hết sức phức tạp Bệnh xảy ra với tất cả các giống lợn, nhưng bệnh thường nặng hơn ở lợn giống ngoại nhập và lợn lai Bệnh do nhiều nguyên nhân, tất cả các ñộ tuổi ñều mắc nhưng gây hậu quả nghiêm trọng nhất là ở lợn con theo mẹ từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi và thường ñược gọi là bệnh lợn con phân

trắng Trong số các nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy, E.coli và Salmonella

việc sử dụng thuốc ñiều trị thiếu hiểu biết, không tuân theo nguyên tắc ñã dẫn ñến sự tăng nhanh tính kháng thuốc của vi khuẩn Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, số lượng các chủng vi khuẩn kháng thuốc ñang tăng lên nhanh chóng, ñặc biệt ñã xuất hiện các chủng vi khuẩn ña kháng thuốc

ðể có cơ sở cho việc phòng trị bệnh lợn con phân trắng ở lợn con theo

mẹ và hạn chế hiện tượng kháng thuốc ñang ngày càng gia tăng, chúng tôi tiến

hành làm ñề tài: “Nghiên cứu tính kháng một số thuốc hoá học trị liệu

của vi khuẩn E.coli phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng.”

1.2 ðịa điểm nghiên cứu

ðề tài được thực hiện tại Bộ mơn Nội - Chẩn - Dược - ðộc chất, Khoa Thú y - Trường ðai học Nơng nghiệp Hà Nội; Phịng vi khuẩn - Trung tâm chẩn đốn Thú y Quốc gia và các trại lợn Liên Hiệp -Văn Giang -Hưng Yên; Trại lợn Thành ðồng - Mê Linh - Vĩnh Phúc; Trại lợn Hồng Liễn - Vũ Thư

- Thái Bình

1.3 Mục đích nghiên cứu

-Xác định được tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi khuẩn E.coli

phân lập được từ phân lợn con phân trắng tại các trại chăn nuơi lợn siêu nạc (lợn ngoại nhập)

-Xác định được các loại kháng sinh cịn tác dụng mạnh với E.coli gây

bệnh lợn con phân trắng tại các trại chăn nuơi lợn siêu nạc

-Xây dựng phác đồ điều trị bệnh lợn con phân trắng tại các trại chăn nuơi lợn siêu nạc bằng thuốc kháng sinh và thảo dược

-Trên cơ sở đĩ, đề xuất hướng nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi hơn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh lợn con phân trắng

2.1.1 Một số ñặc ñiểm sinh lý lợn con

Cũng như các gia súc non khác, lợn con có một số ñặc ñiểm khác so với lợn trưởng thành

Hệ thần kinh phát triển chưa hoàn thiện, lớp mỡ dưới da mỏng, diện tích

bề mặt lớn so với khối lượng cơ thể nên khả năng ñiều tiết thân nhiệt kém, dễ

bị mất nhiệt, ñặc biệt là sau khi sinh, khi trời lạnh Vì vậy, lợn con rất mẫn cảm với sự thay ñổi của thời tiết, nhiệt ñộ, ñộ ẩm của chuồng nuôi

Bộ máy tiêu hoá phát triển nhanh nhưng chưa hoàn thiện Trong thời kì

bú sữa, dung tích dạ dày tăng 50 - 60 lần, chiều dài ruột non tăng 5 ñến 6 lần, diện tích tăng 50 ñến 60 lần Chưa thành lập phản xạ tiết dịch có ñiều kiện, sau

20 ñến 25 ngày mới hoàn thiện chức năng này

Chức năng của bộ máy tiêu hoá dần hoàn thiện, trước 1 tháng chưa có axit HCl tự do trong dạ dày Nên khả năng tiêu hoá protein và diệt khuẩn của dịch vị kém, hoạt tính của các men thấp

Lợn con mới sinh, trong máu hầu như không có kháng thể, khả năng miễn dịch hoàn toàn thụ ñộng, phụ thuộc lượng kháng thể từ sữa mẹ, khả năng hấp thu kháng thể giảm theo giờ ðến tuần thứ ba, lợn con mới tự tổng hợp ñược kháng thể Cho nên cần cho lợn con bú sữa ñầu càng sớm càng tốt

Lợn con mọc răng sớm, sau khi sinh từ 6 ñến 10 ngày ñã mọc răng nên hay gặm, cắn lung tung Vì vậy, một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường dễ dàng xâm nhập vào ñường tiêu hoá

Lợn con sinh trưởng nhanh nên nhu cầu dinh dưỡng cao, thức ăn chủ yếu là sữa mẹ nhưng hàm lượng sắt trong sữa thấp Lợn con cần khoảng 7 mg Fe/ngày, sữa mẹ chỉ cung cấp khoảng 1 mg Fe/ngày, nên cần bổ sung sắt cho

lợn con sau khi sinh ñược 4 ngày tuổi (ñặc biệt là lợn siêu nạc)

2.1.2 Bệnh lợn con phân trắng

Bệnh lợn con phân trắng xảy ra rất phổ biến ở nước ta Xuất phát từ nguyên nhân, triệu chứng, thời gian bị bệnh, ñặc ñiểm, tính chất bệnh mà nó có nhiều tên gọi khác nhau:

Tên chung: dyspepsia - chứng tiêu chảy

Milk - scours: bệnh phân sữa

Three weeks interitis: bệnh viêm ruột ở ba tuần tuổi của lợn con

Colibacillosis: bệnh do vi khuẩn E.coli (Bùi Thi Tho, 1996 [26])

Bệnh thường gặp ở lợn con từ sơ sinh ñến 45 ngày tuổi nhưng phổ biến

và nghiêm trọng hơn là ở lợn con theo mẹ từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi Bệnh xảy ra trên mọi giống lợn nhưng trên lợn con siêu nạc theo mẹ thường bị nặng hơn, ñặc biệt là kiểu chuồng nền trong các hộ chăn nuôi cá thể (Tô Thị

Phượng, 2006) [19]

2.1.3 Nguyên nhân gây bệnh

Có nhiều nguyên nhân gây bệnh lợn con phân trắng, việc xác ñịnh nguyên nhân chính rất khó và chỉ mang tính tương ñối Các nguyên nhân gây bệnh chính là:

+ Do ñiều kiện ngoại cảnh, chăm sóc nuôi dưỡng: lợn con giai ñoạn 1-

21 ngày tuổi khả năng phòng vệ của cơ thể chưa hoàn thiện Vì vậy ñiều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng rất lớn ñến sức khoẻ của lợn con Trong thực tế, lợn con thường bị tiêu chảy vào những ngày mưa nhiều, ñộ ẩm cao, trời lạnh, gió mùa (Sử An Ninh, 1993) [16] Ngoài ra, ñối với lợn siêu nạc nếu trước khi ñẻ nếu chuồng ñẻ không ñược vệ sinh (rửa, phun thuốc sát trùng ) thì khi lợn con sinh ra cũng rất dễ bị bệnh từ môi trường chuồng nuôi bị ô nhiễm

+ Chế ñộ dinh dưỡng, chăm sóc, phương pháp tập ăn cho lợn con cũng ảnh hưởng không nhỏ ñến tỷ lệ mắc tiêu chảy Thức ăn, thiếu khoáng, vitamin,

Fe,… cùng phương thức chăn nuôi không phù hợp làm giảm sức ñề kháng của

cơ thể tạo ñiều kiện cho vi khuẩn ñường tiêu hoá phát triển và gây bệnh

+ Do chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng lợn mẹ: Với lợn siêu nạc, lợn mẹ trước khi ñẻ 3- 5 ngày cần có chế ñộ ăn ñặc biệt, nếu không tuân thủ thì sau khi ñẻ lợn mẹ dễ mắc hội chứng viêm tử cung, viêm vú, mất sữa (M.M.A) và dẫn ñến lợn con bị ỉa chảy khi không ñược bú ñủ lượng sữa có chất lượng Trước khi ñẻ một tuần lợn mẹ cần ñược tắm, rửa sạch sẽ ñể tránh mang mầm bệnh cho lợn con khi sinh

+ Do virus: các vi rut thường gây tiêu chảy ở lợn như vi rut Dịch tả Lợn,

Pavovirus, Enterovirus, Rotavirrus, Adenovirus, …

+ Do vi khuẩn: vi khuẩn là nguyên nhân gây bệnh phổ biến, quan trọng nhất và ñược chú ý nhiều nhất Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi khuẩn

gây tiêu chảy lợn chủ yếu do một số loại như: E.coli, Salmonella sp.,

perfringens,… Trong ñó thường gặp nhất là E.coli, Salmonella sp và số lượng

tăng lên một cách bội nhiễm khi lợn mắc tiêu chảy

Vi sinh vật tồn tại trong ñường ruột dưới dạng một hệ sinh thái, nó ở trạng thái cân bằng và có lợi cho cơ thể vật chủ Dưới tác ñộng của các yếu tố gây bệnh, trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật ñường ruột bị phá vỡ, dẫn ñến tình trạng loạn khuẩn, hậu quả là lợn bị tiêu chảy

Radostits O.M và cộng sự (1994) [45] cho rằng E.coli gây bệnh cho lợn

là các chủng có kháng nguyên pili và sản sinh ñộc tố ñường ruột ñóng vai trò quan trọng và phổ biến trong quá trình tiêu chảy

Hội chứng tiêu chảy ở lợn con thường diễn ra theo hai quá trình, ban ñầu là rối loạn tiêu hoá sau ñó là quá trình nhiễm trùng Các tác nhân stress có hại tác ñộng làm rối loạn cơ năng tiêu hoá ở ruột, thức ăn không tiêu ñược bị lên men, các

chất hữu cơ bị phân giải, sinh ra các sản phẩm ñộc như Indol, Scatol, H2S,

niêm mạc ñường tiêu hoá ðồng thời, vi khuẩn ñường ruột có ñiều kiện thuận lợi phát triển tăng nhanh về số lượng, phá vỡ trạng thái cân bằng ñộng hệ vi khuẩn ñường ruột Vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh làm tình trạng bệnh lý trầm trọng hơn

2.2 Các vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong ñường ruột

Tất cả các vi sinh vật có mặt ở ống tiêu hóa ñược gọi bằng cụm từ "vi khuẩn chí ñường ruột" (Vũ Văn Ngữ, 1979) [15] Trong ñường tiêu hóa của ñộng vật có nhiều loại vi khuẩn Mật ñộ vi khuẩn trong ruột non và dạ dày thấp do chịu ảnh hưởng của acid dạ dày và dịch mật Mật ñộ vi khuẩn tăng dần theo chiều dài ống tiêu hóa Tổng số vi khuẩn trong tá tràng dao ñộng từ 102- 103 vi khuẩn/ 1gam chất chứa và tăng lên ñến 105-107 vi khuẩn/1gam chất chứa ở hồi tràng Ở ruột già số lượng vi khuẩn tăng lên ñáng kể khoảng 1010- 1011 vi khuẩn/1gram chất chứa, trong ñó vi khuẩn hiếu khí chiếm trên 90% Số lượng vi khuẩn ở ống tiêu hóa thường ổn ñịnh, không bị tăng lên sau khi ăn Nhưng khi hàng rào bảo vệ bị tổn thương số lượng vi khuẩn sẽ tăng lên, ở ruột non có quá nhiều acid trung hòa và trở ngại quá trình tiết dịch mật hay tăng tiết dịch mật cũng làm cho số lượng vi khuẩn tăng lên

2.2.1 E.coli

Trong các vi khuẩn ñường ruột, E.coli là loại phổ biến nhất Theo Nguyễn Như Thanh (1974) [24], bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột,

ít khi có mặt ở dạ dày hay phía trước của ruột non Chỉ khi nào sức ñề kháng

của vật chủ yếu ñi, E.coli mới phát triển mạnh về số lượng và tăng cường ñộc

lực, gây bệnh cho vật chủ

2.2.1.1 ðặc tính sinh vật học

E.coli là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai ñầu tròn, có lông, di ñộng

ñược, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-) thường thẫm ở 2 ñầu, ở giữa nhạt Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng rẽ, ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn

2.2.1.2 ðặc tính nuôi cấy

E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ tiện, dễ dàng nuôi cấy ở các

Nhưng vẫn phát triển ñược trong môi trường pH 5,5- 8

- Môi trường nước thịt: E.coli phát triển rất nhanh, môi trường ñục ñều,

có cặn lắng xuống ñáy, màu tro nhạt, trên mặt có màng mỏng màu ghi nhạt dính vào thành ống nghiệm, canh trùng có mùi phân thối

khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi, ñường kính khuẩn lạc khoảng 2 - 3 mm

- Môi trường MacConkey: E.coli hình thành những khuẩn lạc dạng S,

màu hồng cánh sen

- Môi trường Birilliant Green Agar: khuẩn lạc E.coli dạng S, màu vàng chanh

- Môi trường thạch máu: vi khuẩn E.coli có thể gây dung huyết

2.2.1.3 ðặc tính sinh hoá

Các chủng E.coli ñều lên men sinh hơi mạnh các loại ñường glucose, galactose, fructose, levulose Tất cả các E.coli ñều lên men ñường lactose

nhanh và sinh hơi, ñó là một ñặc ñiểm quan trọng, dựa vào ñó ñể phân biệt

E.coli và Salmonella sp Có thể lên men không sinh hơi: Saccaroza, Rafinoza,

Xanixin, Glyxezol ít khi lên men: Inulin, Pectin, Adonid, không lên men

Dextrin, Glycogen, Xenlobioza

Các phản ứng sinh hoá: Indol (+), MR (+); VP(+), phản ứng sinh khí

H2S (- ), hoàn nguyên nitrat thành nitrit

2.2.1.4 C ấu trúc kháng nguyên

E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng nguyên

thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K, kháng nguyên bám dính F Ngày nay, người ta phát hiện một cách nhanh chóng số lượng các kháng nguyên F Chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng nhầy của ñường tiêu hoá) hay còn gọi là bám dính Phần lớn các kháng nguyên bám dính ñều sản sinh ñộc tố (Vũ Khắc Hùng, 2005) [9]

2.2.1.5 ðặc tính gây bệnh

E.coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là ñộc tố và có yếu

tố không phải là ñộc tố Bao gồm:

- Khả năng bám dính:

Bám dính là một khái niệm chỉ mối quan hệ của sự liên hệ vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào vật chủ Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính ñược gọi là yếu tố bám dính (Jones G.W, 1981) [41]

ðây là yếu tố gây bệnh ñặc biệt quan trọng, nó giúp vi khuẩn thực hiện bước ñầu tiên của quá trình gây bệnh là bám dính lên niêm mạc ruột nhờ 1 hay

nhiều yếu tố bám dính E.coli có 4 loại yếu tố bám dính, ñặc biệt quan trọng là

- Khả năng xâm nhập:

Là khả năng của vi khuẩn qua ñược hàng rào bảo vệ lớp mucosa trên bề mặt niêm mạc ruột non và tế bào biểu mô, ñồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này, tránh các tế bào ñại thực bào

- Khả năng gây dung huyết:

Khả năng sản sinh ra Haemolysin của E.coli có thể ñược coi như là một

yếu tố ñộc lực quan trọng, nhằm mục ñích dung giải hồng cầu giải phóng sắt trong nhân Hem và tranferin ñể cung cấp cho quá trình trao ñổi chất của vi

khuẩn Có 4 kiểu dung huyết tố nhưng quan trọng nhất là 2 kiểu α và β

- Khả năng tạo Colicin V:

Trong quá trình phát triển, E.coli thường xuyên sản sinh ra Colicin V khi

tồn tại cộng sinh với các loại vi khuẩn khác và trở nên chiếm ưu thế trong ựường ruột Colicin V là một loại chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc

tiêu diệt các loại vi khuẩn khác E.coli sản sinh Colicin V thông qua plasmid

col Colicin V ựược coi là một bacteriocin, chất này chỉ có tác dụng ựộc với

các vi khuẩn trong họ Enterobacteriacea Có khoảng 40% số chủng E.coli của

người và ựộng vật có khả năng sản sinh Colicingenic Nếu Colicin V ựược sản

sinh ra từ các chủng E.coli cường ựộc ký sinh trong cơ thể vật chủ thì trong

trường hợp này có thể coi Colicin V là một yếu tố gây bệnh đào Trọng đạt và

cs (1996) [4], Brown V (1981) [36] trong hầu hết các chủng E.coli gây bệnh

ựều có Colicin V

- Tắnh kháng kháng sinh:

Yếu tố quy ựịnh khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong

plasmid Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn ựường ruột

nói chung và E.coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa

các chủng vi khuẩn Do vậy nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo

rắc tắnh kháng thuốc Sử dụng một loại thuốc hoá học trị liệu nào ựiều trị E.coli

trong một thời gian dài dẫn ựến khả năng kháng không chỉ thuốc ựó còn kháng

cả các thuốc khác nữa (Bùi Thị Tho, 1996) [26], Phạm Khắc Hiếu (1998) [7]

cho biết 5% số chủng E.coli kháng lại 7 loại kháng sinh, 25% kháng lại 4 loại

đồng thời, tác giả cũng ựã chứng minh khả năng truyền tắnh kháng kháng sinh

của E.coli cho nhiều loại vi khuẩn khác

- Khả năng sản sinh ựộc tố:

Sản sinh ựộc tố ựược xem như là một khả năng ựặc biệt quan trọng của

E.coli Cũng như khả năng bám dắnh, khả năng sản sinh ựộc tố là một nhân tố

gây bệnh quan trọng của vi khuẩn E.coli

Theo Lê Thanh Hoà (2006) [5], có hai loại ựộc tố, ựó là loại kém chịu nhiệt (heat - labile toxin [LT]) và loại chịu nhiệt bền vững hay còn gọi là bền nhiệt (heat - stable toxin [ST]) Cả hai loại ựộc tố kém chịu nhiệt LT và bền

nhiệt ST ựều do các nhóm vi khuẩn E.coli ựộc lực có tên gọi là ETEC sản xuất (ETEC = Enterotoxigenic E.coli) Thực chất, yếu tố ựộc lực mà ETEC thừa

hưởng ựược chắnh là nhờ sự hỗ trợ tương tác cộng sinh của nhiều loại plasmid

có các gen sản xuất cả hai loại ựộc tố nói trên

Loại LT ựược nghiên cứu khá ựầy ựủ đó là một loại Protein có hai nhóm phụ: nhóm phụ A có phân tử lượng 25,5 kDa; và nhóm phụ B có phân

tử lượng 11 kDa Mỗi một nhóm phụ A liên kết với 4 hoặc 5 nhóm phụ B và

có sự hợp nhất với một phần toxin do vi khuẩn tả Vibrio cholerae sản xuất Huyết thanh kháng ựộc tố vi khuẩn tả có khả năng trung hoà ựộc tố LT của

E.coli Giữa ựộc tố của vi khuẩn tả và LT toxin của E.coli có mối quan hệ cấu

trúc, và có nguồn gốc từ cùng một tổ tiên, tuy rằng trật tự ADN trong mỗi gen sản xuất chúng có nhiều sự khác biệt độc tố vi khuẩn tả do gen có trên hệ

gen vi khuẩn tả sản xuất, còn sản xuất ựộc tố LT ở vi khuẩn E.coli do plasmid

chịu trách nhiệm

Cả hai loại ựộc tố, LT của E.coli và ựộc tố của vi khuẩn tả ựều có cùng

một cách tác ựộng lên tế bào mẫn cảm của ựộng vật và người Nhóm phụ B của ựộc tố LT bám vào thụ thể glycolipit, có tên gọi là gangliosid GM1, có trên màng tế bào Nhóm phụ A xuyên qua màng và hoạt hoá enzym adenylat cyclase Sự hoạt hoá này có liên quan ựến sự adenosin diphosphat (ADP) - ribosyl hoá một loại Protein có mặt ở ngay mặt trong của màng tế bào Nicotinamid adenosin diphosphat (NAD) cũng là một yếu tố ựồng tác dụng tham gia phản ứng Dưới sự kắch thắch của enzym adenylat cyclase, nồng ựộ của adenosin monophosphat mạch vòng (AMP mạch vòng) ựược tăng cường

và do vậy, kắch thắch quá trình bài xuất nước và chất ựiện giải vào khoang ruột, gây nên hiện tượng tiêu chảy

Loại ñộc tố chịu nhiệt ST lại không liên quan mật thiết ñến ñộc tố LT ðộc tố ST là một loại Protein có phân tử lượng nhỏ, khoảng 5 kDa, và có tính kháng nguyên rất yếu, xét về góc ñộ miễn dịch Cơ chế tác ñộng lên tế bào của

ST cũng khác LT ST kích thích enzym guanylat cyclase Có thể dùng môi trường nuôi cấy tế bào ñể phát hiện và chuẩn ñộ ñộc tố LT thông qua phản ứng miễn dịch tại chỗ với kháng nguyên là ñộc tố và kháng thể là kháng ñộc tố, vì chúng có thể làm biến hình tế bào, làm cho tế bào co tròn lại Ngược lại, ST không ñược phát hiện và chuẩn ñộ theo phương pháp này Người ta thường căn

cứ vào ñộ tích tụ dịch bài xuất trong khoang ruột của chuột con ñể chuẩn ñộ ñộc tố ST, sau khi tiêm ñộc tố này vào dạ dày của chuột thí nghiệm

Gen sản xuất ñộc tố ST là một phần của một loại tiểu phần chuyển vị

(transposon) ñược phát hiện ñịnh vị trên một loại plasmid của E.coli, ñó là

transposon kí hiệu Tn1681 Tn1681 có ñộ dài khoảng 2040 Nucleotid bao gồm

3 phần, ở giữa là gen chịu trách nhiệm sản xuất ñộc tố ST, nằm ở hai ñầu là hai tiểu phần gài - lắp kí hiệu là IS1, mỗi một tiểu phần có ñộ dài 768 Nucleotid và

có cấu trúc ñối xứng ngược

Gen sản xuất ñộc tố LT còn phát hiện có trên hệ gen của một loại phage

ôn hoà Phage này sau khi nhập gen vào một chủng E.coli ñã làm thay ñổi vi

khuẩn chủ và chuyển chúng thành chủng sản xuất ñộc tố

quy ñịnh nằm trên plasmid Vai trò của ñộc tố này ñến nay vẫn chưa ñược biết

Các chủng ETEC gây bệnh bằng cách bám dính và xâm nhập vào các tế bào biểu mô niêm mạc ruột của vật chủ rồi sản xuất ñộc tố ñường ruột Bao

gồm ñộc tố chịu nhiệt (STa và STb), ñộc tố không chịu nhiệt (LT) Các ñộc tố này làm thay ñổi cân bằng nước và ñiện giải ở tế bào niêm mạc ruột của vật chủ gây nên tiêu chảy (Vũ Khắc Hùng, 2005) [9]

huỷ các mạch máu ở nhiều cơ quan khác nhau ðộc tố gây dung huyết ñường niệu ở người và gây chứng phù ñầu ở lợn con

Fairbother J.M và cs (1992) [37] cho biết: ñộc tố ñường ruột Enterotoxin

do E.coli tạo ra (ETEC) gây ỉa chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1- 4 ngày tuổi

2.2.2 Salmonella sp

Salmonella sp là vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn ñường ruột Theo tổ chức y

tế thế giới, người ta ñã phân lập ñược trên 2000 chủng Salmonella sp nhưng

thực tế chỉ có khoảng 5% trong số ñó gây bệnh cho người và ñộng vật Những

chủng chủ yếu gây bệnh cho người và ñộng vật là S.cholerasuis, S.arizonea,

S.enteritidis, S.typhimurium Người ta gọi các bệnh do Salmonella sp gây ra ở

ñộng vật với tên chung là Salmonellosis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [18], ðoàn Băng Tâm (1987) [23], Nguyễn Như Thanh (1990) [25]

2.2.2.1 ðặc ñiểm hình thái

Salmonella sp. là những trực khuẩn ngắn, gram (-), hai ñầu tròn Vi khuẩn

có từ 7 - 12 lông xung quanh thân nên chúng có khả năng di ñộng mạnh, trừ

Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum gây bệnh cho gia cầm không có

lông Salmonella sp không hình thành nha bào và giáp mô

2.2.2.2 ðặc tính nuôi cấy

Salmonella sp. là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện Nhiệt ñộ

Salmonella sp dễ dàng phát triển ở các môi trường dinh dưỡng thông thường

cặn, không có màng

- Môi trường thạch thường: sau 24h nuôi cấy, hình thành những khuẩn lạc dạng S, tròn, ướt, có thể trong sáng, hoặc xám, mặt lồi, nhẵn bóng, nhỏ hơn

khuẩn lạc của E.coli

mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng, hơi lồi ở giữa

- Môi trường thạch Birilliant Green Agar, vi khuẩn Salmonella sp hình

thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt

2.2.2.3 ðặc tính sinh hoá

Salmonella sp lên men sinh hơi glucose, không lên men lactose,

hoàn nguyên citrate thành citrite

2.2.2.4 C ấu trúc kháng nguyên

Salmonella sp. có ba loại kháng nguyên là: kháng nguyên O , H, K Kháng nguyên O là thành phần của lớp màng liposaccarid - thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngoài tế bào ðây là yếu tố ñộc lực của vi khuẩn gram (-) nói

chung và Salmonella sp nói riêng (ðỗ Trung Cứ, 2003) [2] Nó giúp vi khuẩn

chống lại mọi khả năng phòng vệ của vật chủ Kháng nguyên K lại có 2 nhiệm

vụ chính là hỗ trợ phản ứng ngưng kết cùng kháng nguyên O và tạo hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại ngoại cảnh và hiện tượng thực bào Kháng nguyên H không có vai trò trong việc tạo ñộc lực cho vi khuẩn

2.2.2.5 Y ếu tố bám dính (Fimbriae)

Sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh trên nhung mao của niêm mạc ruột (tế bào Epitel) là bước ñầu tiên và cơ bản cho việc gây bệnh ở phần lớn các loài vi khuẩn gây bệnh, nó giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật chủ và gây bệnh Những vi khuẩn có ñộc lực cao có khả năng bám dính tốt hơn là vi khuẩn có ñộc lực thấp

2.2.2.6 Kh ả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella sp tác ñộng làm

biến ñổi bề mặt màng tế bào bằng cách thay ñổi hình dạng các sợi actin dẫn tới hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Cơ chế làm biến dạng các sợi actin màng tế bào vật chủ là do tác ñộng

depolimerizing enzymes dẫn tới sắp xếp lại cấu trúc sợi actin Sau khi hoàn

thành các không bào chứa vi khuẩn, Salmonella sp ñược hấp thu vào trong tế

bào dưới hình thức hấp thu nội bào Ở trong tế bào, vi khuẩn tiếp tục tồn tại trong không bào sẽ nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ

2.2.2.7 Kh ả năng sản sinh ñộc tố

Ngoài các yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella sp bám dính, xâm

nhập tế bào, chúng còn sản sinh ra ít nhất ba loại ñộc tố chính ñó là ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin), nội ñộc tố (Endotoxin) và ñộc tố tế bào (Cytoxin)

- Enterotoxins

Là loại ñộc tố thường xuyên ñược vi khuẩn tiết vào môi trường Các

Enterotoxin của Salmonella sp có cấu trúc giống Enterotoxin do E.coli sản

sinh Gen quy ñịnh khả năng sản sinh Enterotoxin nằm trên plasmid, di truyền

bằng tiếp hợp, có thể truyền từ Salmonella typhimurium sang cho Eschrichia

tố Enterotoxin của vi khuẩn có hai thành phần chính là ñộc tố thẩm xuất nhanh (RPF) và ñộc tố thẩm xuất chậm (DPF)

ðộc tố thẩm xuất chậm có thành phần cấu trúc giống ñộc tố không chịu

nhiệt của E.coli, nên ñược gọi là ñộc tố không chịu nhiệt của Salmonella sp

ðộc tố thẩm xuất nhanh có thành phần cấu trúc giống với ñộc tố chịu

nhiệt của E.coli, nên ñược gọi là ñộc tố chịu nhiệt của Salmonella sp (Heat -

1 - 2h, có thể kéo dài tới 48h

- Cytotoxins

Thành phần của cytotoxin không phải là lipopolysaccaride (Non - LPS)

nằm ở màng ngoài vi khuẩn Salmonella sp ðặc tính chung của cytotoxin là khả

năng ức chế tổng hợp protein của tế bào eukaryotic, ñặc tính quan trọng là làm

tổn thương tế bào biểu mô ða phần ñộc tính của chúng bị phá huỷ bởi nhiệt

- Endotoxins

Thành phần chủ yếu của endotoxins là lipopolysaccaride - LPS là một

thành phần cơ bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn Salmonella sp , giữ vai

trò là một yếu tố ñộc lực quan trọng của chúng Endotoxins ñược giải phóng từ

tế bào vi khuẩn trong quá trình phát triển hoặc do tế bào vi khuẩn bị phân giải

Trước khi thể hiện ñộc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các thụ thể tế bào (các receptors bề mặt tế bào) Trên bề mặt tế bào mẫn cảm với LPS như tế bào lympho B, lympho T, tế bào ñại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan, lách,… tồn tại các receptors liên kết với LPS

Staphylococcus aureus (tụ cầu) là loại cầu khuẩn, bắt màu gram (+),

không di ñộng, không sinh nha bào và thường không có vỏ, hay xếp thành ñám như hình chùm nho

2.2.3.2 ðặc tính nuôi cấy

pH thích hợp 7,2 - 7,6, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường

lắng ở ñáy ống, cặn có màu trắng hay màu vàng nhạt, không hình thành màng

- Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành khuẩn lạc tương ñối lớn ñường kính khoảng 2 - 4 mm, dạng S, mặt khuẩn lạc ướt, bờ ñều nhẵn, khuẩn lạc có màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng chanh Căn cứ vào màu

sắc khuẩn lạc, Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [17] cho rằng chỉ có

Staphylococcus aureus là có ñộc lực và có khả năng gây bệnh cho ñộng vật, còn khuẩn lạc màu vàng chanh hoặc màu trắng không có ñộc lực và không gây bệnh

- Môi trường thạch máu: vi khuẩn mọc rất tốt, sau 24 giờ, hình thành những khuẩn lạc dạng S Nếu là loại gây bệnh sẽ gây dung huyết

- Môi trường thạch Chapman: ñây là môi trường chuyên dụng ñể phân lập

và xác ñịnh ñộc lực của tụ cầu Nếu tụ cầu gây bệnh sẽ lên men ñường mannit làm pH thay ñổi (pH 6,8), môi trường trở nên vàng Nếu tụ cầu không gây bệnh

sẽ không lên men ñường mannit (pH 8,4), môi trường Chapman có màu ñỏ

2.2.3.3 ðặc tính sinh hoá

Staphylococcus sp lên men sinh hơi ñường glucoza, mannit, mantoza, lactoza, không lên men ñường galactoza

2.2.3.4 Các ñộc tố do Staphylococcus tiết ra

- ðộc tố dung huyết: Staphylococcus có 4 loại dung huyết: alpha (α),

beta (β), delta (δ), gamma (γ) Trong các dung huyết tố trên thì dung huyết tố alpha là ñặc ñiểm cần thiết của các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh

- Nhân tố diệt bạch cầu (leucocidin): dưới tác ñộng của nhân tố này, bạch cầu mất tính di ñộng, mất hạt và nhân bị phá huỷ Nó giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu

- ðộc tố ruột (Enterotoxin): ñộc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết

ra, gây bệnh ñường tiêu hoá: nhiễm ñộc do thức ăn, viêm ruột cấp ðây là những ngoại ñộc tố, bền với nhiệt ñộ, không bị phá huỷ bởi dịch vị ðộc tố ruột có 4 loại, trong ñó có 2 loại ñã biết: ñộc tố ruột A tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm ñộc thức ăn; ñộc tố ruột B tạo ra do một chủng phân lập trong các bệnh nhân viêm ruột

2.2.4 Streptococcus

Streptococcus (liên cầu khuẩn) có ở khắp mọi nơi trong tự nhiên: ñất,

nước, không khí, trong cơ thể ñộng vật và người Một số chủng Streptococcus

thường kí sinh ở da, niêm mạc, ñường tiêu hoá, hô hấp và không gây bệnh, một

số lại có khả năng gây bệnh

- Môi trường thạch máu: dựa vào tính chất dung huyết thấy liên cầu có

24h, Streptococcus hình thành những khuẩn lạc nhỏ, nhạt màu

2.3 Những hiểu biết về thuốc kháng sinh

2.3.1 Khái niệm

Kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật, ñộng vật và thực vật hay do người tổng hợp ra, có tác dụng tiêu diệt, ức chế vi sinh vật với nồng

ñộ rất thấp mà không gây ñộc cho người và vật chủ (Bùi Thị Tho, 2003) [27]

Một số thuốc hoá học trị liệu (các Sulfamid, dẫn xuất 5 - Nitrofurantoin, nhóm Quinolon…) cũng có tác dụng chống vi khuẩn, theo cơ chế "bắt chước" kiểu tác dụng của thuốc kháng sinh Sự khác nhau ở chỗ: kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn ở liều nhỏ hơn rất nhiều so với các thuốc hoá học trị liệu

2.3.2 Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh

2.3.2.1 Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn

Chất kháng sinh ức chế tổng hợp mucopeptid ở vách tế bào vi khuẩn Thuộc nhóm này gồm có các β - Lactamin, Cephalosporin… Penicillin và các dẫn xuất β - Lactamin có cấu trúc giống như các chuỗi peptit do vi khuẩn tổng hợp nên ñể tạo màng tế bào Do vậy, khi tổng hợp màng tế bào vi khuẩn, vi khuẩn tạo phức hợp nhầm với các chất ñó, phức hợp này bền vững và không hồi phục Phản ứng xuyên mạch tạo màng bị cản trở

Một số kháng sinh lại có tác dụng vào việc vận chuyển, trùng hợp mucopeptid Chúng có tác dụng phá hoại chức năng màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn Thuộc nhóm này có 30 chất, trong ñó có: Polymycin B, Colistin, Baccitracin, Anbomycin, Vancomycin, Ristomycin

2.3.2.2 Kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

- Kháng sinh làm tổng hợp protein bất thường

ðại diện nhóm này là Streptomycin, nó gây ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosom Thuốc gắn vào tiểu phần 30s của ribosom Qua

ñó làm ñọc sai mã di truyền, dẫn ñến việc tổng hợp tích luỹ những polypeptid sai lạc Thuốc có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn

- Kháng sinh phong bế tổng hợp protein

ðại diện của nhóm này là Chloramphenicol, thuốc gắn vào tiểu phần 50s, 70s của ribosom trong tế bào, ngăn cản mạch peptid kéo dài Chloramphenicol làm quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bị ñình trệ ngay Các thuốc thuộc nhóm Tetracyclin lại gây ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách ngăn cản cả hai tiểu phần 30s, 50s của ribosom

2.3.2.3 Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp nucleotid

Hiện nay, có khoảng 30 chất có tác dụng phá huỷ sự trao ñổi RNA và khoảng 20 chất có tác dụng phá huỷ sự trao ñổi chất DNA như Actinomycin, Mitomycin, Novobiocin,… Các kháng sinh này tạo phức không hoà tan với acid nucleic Các acid nucleic là thành phần chung của mọi tế bào vi khuẩn, người và ñộng vật Kháng sinh thuộc nhóm này rất ñộc, chỉ dùng khi thật cần thiết

2.4 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn

Các nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ lợn , mèo Luca Guardabassi (2004) [43] cho biết: các nghiêm cứu ñã chỉ ra nhiều vi

khuẩn phân lập từ lợn (như: E.coli, Staphylococcus intermedius, Enterococci,

Salmonella typhimurium) xuất hiện sự ña kháng với nhiều lọai thuốc kháng sinh thường ñược sử dụng Nhóm Flouroquinolon mới ñược sử dụng rộng rãi ở những năm gần ñây nhưng cũng ñã xuất hiện nhiều vi khuẩn có xu hướng

kháng với thuốc như: Pseudomonas, Staphylococcus intermedius, E.coli,

Streptococcus phân lập từ lợn bị viêm ñường tiết niệu và bị viêm ruột Việc sử dụng rộng rãi các loại kháng sinh ñiều trị, kích thích sinh trưởng, bảo quản thực vật, xử lí môi trường nước,… ñã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid có chứa gen kháng thuốc sống rất lâu trong ñộng vật cũng như trong môi trường sống Ngày nay, mọi thuốc kháng sinh ñi vào thị trường ñều nhanh chóng bị kháng lại bởi những gen ñề kháng mới mà chúng xuất hiện ngẫu nhiên do những ñột biến ở vi khuẩn (Nguyễn

Phước Tương, 2002) [31]

2.4.1 Khái niệm

Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới ñã công nhận rằng hiện tượng kháng thuốc cũng là một trong những ñộc lực gây bệnh quan trọng của vi khuẩn Các plasmid ñộc có tính di truyền cũng như khả năng truyền ngang các yếu tố này

của E.coli Trong ñó, ông có nói nhiều ñến các plasmid kháng thuốc Các yếu tố

kháng thuốc ñược tạo ra dưới ảnh hưởng của thiên nhiên có bàn tay con người tác ñộng Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [17], một cá thể hoặc một loài vi khuẩn thuộc một loài nhất ñịnh, ñược gọi là ñề kháng nếu có thể sống và sinh sản trong môi trường có nồng ñộ kháng sinh cao hơn nồng ñộ ức chế sự sinh sản của phần lớn những cá thể khác trong cùng một canh khuẩn hoặc những nòi khác cùng loài

2.4.2 Phân loại hiện tượng kháng thuốc

Dựa vào nguồn gốc chia hiện tượng kháng thuốc làm hai loại:

2.4.2.1 Kháng thu ốc tự nhiên

Là hiện tượng kháng thuốc của bản thân vi khuẩn vốn bình thường ñã có sẵn một chất nào ñó có khả năng chống lại tác dụng của chất kháng sinh Ví dụ

như E.coli kháng lại Penicillin

2.4.2.2 Kháng thu ốc thu ñược

Là hiện tượng kháng thuốc phát sinh do sự tiếp xúc nhiều lần với chất kháng sinh hoặc lây truyền từ vi khuẩn ñề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm Bao gồm:

ðột biến kháng: là sự ñột biến xuất hiện dưới ảnh hưởng của tác nhân

chọn lọc Ở ñây tác nhân gây ñột biến là các thuốc hoá học trị liệu Các tác nhân này ñã gây nên những biến ñổi ở bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn

Kháng thuốc lây lan: hiện tượng kháng thuốc này do các ñơn vị di

truyền plasmid tạo nên Các plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể, trong tế bào chất và có thể truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

2.4.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn có ñược do các biến ñổi ở hệ gen của

chúng, ñó là sự gia tăng về tần số gen kháng thuốc gây ra, do chọn lọc rồi truyền theo chiều dọc (vertical transfer) từ bố mẹ di truyền cho con cái Trong thực tế

sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu lại do khả năng truyền các gen kháng thuốc theo chiều ngang (horizontal transfer) giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ, hoặc giữa các loài vi khuẩn khác họ với nhau

Sự thay ñổi này cụ thể là thay ñổi trình tự xắp sếp các bazơ nitơ trong phân tử ADN ñã dẫn ñến hàng loạt các sự kiện khác nhau (ðỗ Trung Cứ, 2003) [2] ñó là:

- Làm thành tế bào có khả năng giữ lại chất kháng sinh ngoài tế bào vi khuẩn, không cho chúng xâm nhập vào trong tế bào

- Làm tăng cường tổng hợp các men phân huỷ chất kháng sinh, kháng sinh không kịp tác ñộng lên vi khuẩn gây bệnh

Sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn là rất nhanh và ở diện rộng Trước ñây, ñiều này chỉ ñược giải thích bằng một cơ chế là sự gia tăng về tần số gen kháng thuốc do chọn lọc rồi truyền theo chiều dọc (vertical transfer)

từ bố mẹ cho con cái Trong thực tế, sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu là do khả năng truyền các gen kháng thuốc theo chiều ngang (horizontal transfer) giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ, hoặc giữa các loài vi khuẩn khác họ với nhau Có 3 phương thức giúp cho vi khuẩn

có thể truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang:

Tải nạp (transformation): sự truyền ñạt một ñoạn ADN từ tế bào sang

cho tế bào nhận, thông qua một thực khuẩn thể (Bacteriophage)

Sự biến nạp (transdution): là hiện tượng một ñoạn ADN trần từ tế bào cho

ñược một tế bào khác nhận thông qua các lỗ hổng trên màng tế bào vi khuẩn

Sự tiếp hợp (conjugation): sự truyền ñạt một ñoạn ADN từ tế bào này

sang tế bào khác do sự liên kết của hai tế bào vi khuẩn

Có hai ñặc trưng của plasmid kháng thuốc ñã giúp chúng hình thành sự kháng thuốc và gieo rắc sự kháng thuốc trong tự nhiên: khả năng tiếp hợp của

plasmid và sự có mặt của transposoms (các nhân tố chuyển hoán) trong bộ gen của plasmid [27] Nhân tố chuyển hoán là một mảng ADN có thể di chuyển từ

vị trắ này sang vị trắ khác bên trong nhiễm sắc thể cũng như giữa các nhiễm sắc thể với nhau Nó có thể di chuyển bên trong tế bào, giữa các plasmid hay giữa các nhiễm sắc thể của tế bào Ngoài ra, nó cũng có thể tự chèn vào bên trong ADN của thể thực khuẩn và tự di chuyển ra khỏi ADN của thể thực khuẩn Trong ba phương thức kể trên thì phương thức sinh sản tiếp hợp là quan trọng nhất Quá trình này bao gồm quá trình truyền các phiên bản của plasmid

từ tế bào này sang tế bào khác Vai trò quan trọng của sự sinh sản tiếp hợp là ở chỗ có nhiều gen quan trọng tham gia vào quá trình kháng thuốc kháng sinh nằm trong plasmid Các gen kháng thuốc nằm trên các plasmid hay các nhân tố chuyển hoán làm lan rộng các gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn Theo Luca Guardabassi (2004) [43], sự kháng thuốc của vi khuẩn có thể ựược truyền từ vật chủ này sang một vật chủ khác chỉ bởi một lượng nhỏ vi khuẩn đôi khi chỉ một tế bào vi khuẩn cũng có thể truyền tắnh kháng thuốc cho hệ vi khuẩn ựường ruột của vật chủ khác

2.4.4 Khả năng loại trừ tắnh kháng thuốc của vi khuẩn

Người ựầu tiên nghiên cứu vấn ựề này là Hirota (1976) (12), ông ựã làm thắ nghiệm về khả năng loại trừ Episom bằng thuốc nhuộm Acridin, và ựã nêu lên hiệu quả tác dụng khác nhau của Acridin, Acriflovin ở các ựiều kiện pH và nồng ựộ khác nhau Ông thấy rằng: Tốc ựộ loại trừ tắnh kháng thuốc có liên quan chủ yếu với giá trị dinh dưỡng của môi trường, với nhiệt ựộ và cả nhịp ựộ sinh trưởng của tế bào Watanabe Furasawa sau khi nghiên cứu ựộ mẫn cảm của nhân tố R ựối với Acridin ựã cho biết : Khác với hiệu quả tác dụng lên nhân tố F, ựối với nhân tố R, Acriflovin có hoạt tắnh mạnh hơn Acridin, tốc ựộ loại trừ chung thì thấp hơn nhưng lớn hơn nhiều sau khi sơ bộ chiếu tia tử ngoại lên các tế bào thể cho Vậy tia tử ngoại cũng có ảnh hưởng trong việc loại trừ các nhân tố kháng thuốc của vi khuẩn Cũng có nhiều tài liệu nói ựến

việc loại trừ thành công các nhân tố ñề kháng ngoài nhiễm sắc thể, khi cho thuốc nhuộm Acridin tác ñộng lên tụ cầu khuẩn kháng Penicillin

ðặc biệt ngày nay, nhờ thành tựu của vi sinh vật học phân tử, người ta ñã tìm thấy men Restrietaza có vai trò quan trọng trong việc thay ñổi các gen mang tính kháng thuốc nằm trên Plasmid hoặc nằm trên nhiễm sắc thể Ngoài

ra, có những chỉ dẫn còn cho thấy nhân tố R có thể bị mất ñi sau khi chiếu tia

tử ngoại, khi nuôi cấy trong ñiều kiện nhiệt ñộ cao và thiếu Timidin

Theo Bùi Thị Tho (1996) (26), khi dùng cao mật lợn bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn ñã có tác dụng làm chậm quá trình hình thành tính

kháng thuốc của E.coli, ñồng thời cũng thúc ñẩy nhanh quá trình làm mất

tính kháng

2.4.5 Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn E.coli

Yếu tố quy ñịnh khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong plasmid

Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn ñường ruột nói chung

và E.coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng

vi khuẩn Do vậy, nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo rắc tính kháng

thuốc Sử dụng một loại thuốc hóa học trị liệu nào ñiều trị E.coli trong một thời

gian dài thì vi khuẩn ñó sẽ có khả năng kháng không chỉ thuốc ñó mà cả các thuốc khác nữa (Bùi Thị Tho, 2003) [27] Theo Susan Sanchez (2002), phân lập

các chủng E.coli từ vết thương nhiễm trùng ở lợn, thấy xuất hiện chủng E.coli

ña kháng với 12 loại thuốc kháng sinh kiểm tra Các gen quy ñịnh tính kháng

gen flo kháng với nhóm Flofenicol, gen dfA17 kháng với Trimethoprim, gen

aadA5 kháng với Spectinomycin Việc sử dụng kết hợp nhiều lọai kháng sinh và

sử dụng các kháng sinh hoạt phổ rộng dẫn tới ngày càng xuất hiện các chủng

E.coli ña kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh, ñặc biệt là ở các bệnh viện thú

y Ngoài ra, chúng còn có khả năng truyền kháng cho nhiều loại vi khuẩn khác

như: Salmonella sp., Klebsiella pneumonia, Proteus

Johnson A.P và cs 1994 [42], cho biết ñã tìm thấy 27 % E.coli và

Klebsiella Pneumoniae kháng lại Gentamycin và Apramycin gây bệnh ở

người do E.coli gây bệnh của gia súc truyền sang

2.5.2 Tác dụng và ứng dụng

Trong sinh lý, Dịch mật có tác dụng rất quan trọng trong việc tiêu hoá

mỡ, trung hoà a xit HCl từ dạ dày xuống ruột, giúp cơ thể hấp thu Vitamin hoà tan trong dầu và làm tăng nhu ñộng ruột Theo Phó Dương Thuần (1976) [28],

Y học sử dụng các a xit mật và muối mật ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau : Làm thuốc thông mật, chữa viêm dạ dày, trị chứng viêm loét, nhiễm trùng ñường tiêu hoá Trên thế giới cũng như trong nước, mật Gấu ñược nổi lên hàng ñầu Người ta ñã dùng nó trong nhiều trường hợp với mục ñích như một thuốc kháng sinh vạn năng, ñặc biệt trong các bệnh về xương, khớp Viện Y học cổ truyền còn sử dụng nhiều mật ñộng vật khác ñể chữa bệnh Mật Rắn trị thấp khớp, hen Mật Trăn trị viêm họng, thấp khớp và chứng rối loạn trao ñổi Canxi, Photpho Mật Cóc có tác dụng chống viêm

Theo ðỗ Tất Lợi, mật Bò chữa ñau bụng, ñau dạ dày, suy gan, vàng da, rối loạn tiêu hoá, táo bón, bệnh về mắt, khát nước, trẻ em cam tích, lở loét Mật lợn, mật bò có thể dùng tươi, nhưng vì khó uống và không ñể ñược lâu nên thường ñược cô thành dạng cao ñặc hay cao khô hoặc ñem tinh chế

thành cao mật tinh chế

Từ những hiểu biết trên ñây về mật ñộng vật mà trong ñề tài này chúng tôi tiến hành ñiều trị thử nghiệm lợn con tiêu chảy phân trắng bằng cao mật bò cô ñặc

2.6 Cây Bồ Công Anh

Theo ðỗ Tất Lợi (1999) [11], Cây Bồ công anh còn ñược gọi là cây Bồ cóc, Diếp hoang, Diếp dại, Mót mét, Mũi mác, Diếp trời, Dau mũi cày Tên khoa học là : Lactuca indica L, thuộc họ Cúc Asteraceae

Bồ công anh dại (Diếp dại) mọc hoang tại nhiều tỉnh miền Bắc nước ta Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với loại Bồ công anh này

2.6.1 Mô tả cây

Bồ công anh là một loài cây nhỏ, cao 0,6 - 1m, có thể cao tới 3m Thân mọc thẳng, nhẵn, không cành hoặc rất ít cành Lá có nhiều hình dạng, lá phía dưới dài 30 cm, rộng 5 - 6 cm Gần như không cuống, chia thành nhiều thuỳ hay răng cưa to thô, lá phía trên ngắn hơn, không chia thuỳ, mép có răng cưa thưa Bấm lá và thân ñều thấy tiết ra nhũ dịch màu trắng, ñục như sữa, vị hơi ñắng Cụm hoa hình ñầu, màu vàng, có loại tím Có người gọi cây hoa vàng là cây Hoàng hoa ñịa ñinh và hoa tím là Tử hoa ñịa ñinh (tử là màu tím) Cả hai loại ñều ñược dùng làm thuốc

2.6.2 Thành phần hoá học

Theo ðỗ Huy Bích và cs (2004) [1], Bồ công anh chứa 91,8 % là nước, 3,4% Protid, 1,1% Glucid, 2,9% xơ, 1,2 % tro, 3,4 mg% Caroten, 25 mg% Vitamin C Ngoài ra, còn có β - Amyrin, taraxasterol germanicol

uống kém tiêu

Liều dùng hàng ngày : 20 - 40 g lá tươi hoặc 10 - 15 g lá khô, hay cành và

lá khô Dùng riêng hoặc dùng phối hợp với các vị thuốc khác, thường dùng dưới dạng thuốc sắc có thêm ñường cho dễ uống, Dùng giã nát ñắp ngoài không kể liều lượng

Trong ñề tài này chúng tôi dùng cao ñặc Bồ công anh ñể ñiều trị thử nghiệm cho lợn con theo mẹ bị bệnh lợn con phân trắng

3 ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ðối tượng nghiên cứu

ðối tượng nghiên cứu của đề tài là lợn con theo mẹ bị ỉa chảy phân trắng

từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi tại trại lợn nái siêu nạc, bao gồm các giống lợn ngoại nhập: Yorkshire, Landrace, Duroc, Pietrain

Lợn thí nghiệm được chia làm 3 nhĩm tuổi khác nhau:

+ Nhĩm I: Lợn con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi;

+ Nhĩm II: Lợn con từ 8 đến 14 ngày tuổi;

+ Nhĩm III: Lợn con từ 15 đến 21 ngày tuổi

Lợn thí nghiệm đều được chọn từ những lợn mẹ đã được tiêm các loại vac xin phịng bệnh do virus gây ra theo quy trình chuẩn

3.2 ðịa điểm

- Các trại lợn giống siêu nạc: Trại lợn Liên Hiệp - Văn Giang - Hưng Yên; Trại lợn Hồng Liễn - Vũ Thư - Thái Bình; Trại lợn Thành ðồng - Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc

- Phịng thí nghiệm bộ mơn Nội - Chẩn - Dược, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

- Phịng Vi khuẩn, Trung tâm chẩn đốn Thú y Quốc gia

3.3 Nguyên liệu

3.3.1 Mơi trường nuơi cấy

Các mơi trường phổ thơng tự chế trong phịng thí nghiệm dùng để nuơi cấy mẫu nghiên cứu bao gồm: nước thịt, thạch thường…

Các mơi trường chuyên dụng để phân lập và giám định vi khuẩn do hãng Oxoid của Anh sản xuất: MacConkey Agar, Brilliant Green Agar (BGA), Chapman agar, Edwards medium, thạch máu, thạch kháng sinh

3.3.2 Giấy tẩm kháng sinh

Do hãng Oxoid sản xuất bao gồm các loại: Enrofloxacin, Norfloxacin, Gentamycin, Tetracyclin, Colistin, Neomycin, Kanamycin, Penicillin, Amoxicillin/Clavulanic acid (AMC), Sulfamethoxazol - Trimethoprim (SXT)

3.3.3 Cao mật Bò

Chúng tôi tiến hành chế cao ựặc mật Bò theo phương pháp ựược giới thiệu tại sách Bào chế đông dược (đại học Y Hà Nội, 2002) [34], Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc (đại học Y Dược, 2004) [35]

Mật bò ựược lấy tại lò mổ Vụ Hồng - đông Anh - Hà Nội Lấy mật của những bò khoẻ mạnh, không mắc bệnh truyền nhiễm Mật sau khi lấy ựược bảo quản trong phắch hoặc tủ lạnh dương ựưa về phòng thắ nghiệm, rửa sạch, cắt bỏ

cắt lấy dịch mật cho vào ống ựong, tiến hành chế cao ựặc

Trung bình mỗi chiếc mật nặng 200 g và cho khoảng 160 ml dịch mật Dịch mật ựược lọc qua hai lớp vải gạc và một lớp bông ở giữa Thu dịch sau lọc vào bát thuỷ tinh chịu nhiệt cô cách thuỷ thành dạng cao mềm (nghiêng

lượng không ựổi, ta ựược cao ựặc dùng ựể thắ nghiệm (1000 ml dịch mật cho khoảng 71 gam cao mật ựặc)

*Chế dung dịch cao mật Bò

- để có dung dịch Cao mật Bò 20%, chúng tôi pha chế theo công thức sau:

+ Cao ựặc mật Bò 20 g

+ Nước cất vô trùng vừa ựủ 100 ml

Cho nước cất từ từ vào bình tam giác vừa cho vừa lắc cho ựến khi cao tan hết thì ựổ nước cất cho vừa ựủ 100 ml

3.3.4 Cao bồ công anh

Chúng tôi tiến hành chế cao ựặc Bồ công anh theo phương pháp ựược giới thiệu tại sách Bào chế đông dược (đại học Y Hà Nội, 2002) [34], Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc (đại học Y Dược, 2004) [35]

- Dược liệu ựược loại bỏ lá khô, lá úa, rửa sạch ựể ráo nước, cho vào nồi nhôm dầy Cứ một kg dược liệu thêm vào 5 lit nước, sắc trên bếp ựiện, chú ý không ựể dịch trào ra ngoài hoặc cháy dược liệu Dùng lửa nhỏ, sắc chậm, thường xuyên ựảo dược liệu cho ựều, ựun ựến khi còn khoảng 1 lit nước chắt

ra, chờ nguội, lọc qua hai lớp vải gạc có thêm một lớp bông ở giữa đem dịch

trọng lượng không ựổi thì ta ựược cao ựặc Thường cứ 1 kg Bồ công anh tươi chế ựược khoảng 6,8 gam cao ựặc

để có dung dịch cao Bồ công anh 10% chúng tôi pha chế theo công thức sau:

+ Cao ựặc Bồ công anh 10 gam

+ Nước cất vô trùng vừa ựủ 100 ml

Cho nước cất từ từ vào bình tam giác vừa cho vừa lắc cho ựến khi cao tan hết, thêm nước cất vào vừa ựủ 100 ml

3.4 Nội dung nghiên cứu

1 Xác ựịnh sự biến ựộng về số lượng vi khuẩn hiếu khắ trong phân lợn con theo mẹ phân trắng và bình thường

2 Xác ựịnh tắnh mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con

phân trắng với các thuốc thắ nghiệm

3 Xác ñịnh tính kháng thuốc của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn

con phân trắng với các thuốc thí nghiệm

4 ðiều trị thử nghiệm lợn con phân trắng bằng một số thuốc sau khi làm kháng sinh ñồ cùng với Cao mật Bò và Cao Bồ công anh

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Tất cả các mẫu phân ñược lấy trực tiếp trong trực tràng hoặc lấy ngay sau khi lợn mới thải phân Mẫu phân lấy ñược chứa trong syringe vô trùng (trường hợp mẫu phân loãng có nhiều nước) và bằng lọ thủy tinh vô trùng có nút bông (trường hợp mẫu phân bình thường và phân có nhiều dịch nhầy khó hút) Mẫu

3.5.2 Phương pháp xác ñịnh số loại và số lượng vi khuẩn trong phân lợn

3.5.2.1 Xác ñịnh số lượng vi khuẩn

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn:

Trộn ñều mẫu phân, cân 1gam phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát

nhiều lần Sau ñó, hút 1ml dung dịch này sang ống thứ 2 ñựng 9 ml nước sinh lí

Cách nuôi cấy: dùng syringe vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng ở các nồng ñộ ñã chọn vào một ñĩa môi trường Mỗi nồng ñộ ở mỗi môi trường cấy trên ba ñĩa lồng Cấy bằng phương pháp láng ñều dịch pha loãng trên bề mặt

Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: cấy vi khuẩn trong môi trường thạch cứng rồi ñếm số lượng khuẩn lạc (CFU) Số lượng CFU tương ñương với

số lượng vi khuẩn

3.5.2.2 Tính k ết quả