Nghiên cứu chiết xuất, đánh giá tính an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của glycosid toàn phần lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La

[30] nghiên cứu tác dụng của Vimang vàmangiferin, C-glucosylxanthone được phân lập từ dịch chiết của cây xoài trònđến các thông số khác nhau của phản ứng dị ứng thấy Vimang và mangiferin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, thuốc phòng vàđiều trị bệnh ngày càng phong phú, bao gồm thuốc có nguồn gốc tự nhiên vàtổng hợp Trong đó nguồn nguyên liệu tự nhiên là nguồn quan trọng đểnghiên cứu phát triển thuốc mới và sản xuất trong công nghiệp dược đối vớithuốc có nguồn gốc thảo dược

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều, địa hình

đa dạng rất thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển nhiều loại cây thuốc quý.Cùng với kinh nghiệm dân gian sử dụng cây thuốc để phòng và chữa bệnh, rấtnhiều cây thuốc quý được sử dụng trong công nghiệp dược làm thuốc

Một trong những tỉnh miền núi phía Bắc nước ta có sự đa dạng sinh họccao đó là tỉnh Sơn La Sơn La là tỉnh miền núi cao nằm ở phía tây bắc ViệtNam, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đông lạnh khô, mùa hè nóng ẩm,mưa nhiều Do địa hình bị chia cắt sâu và mạnh nên hình thành nhiều tiểuvùng khí hậu, cho phép phát triển một nền sản xuất nông - lâm nghiệp phongphú Vùng cao nguyên Mộc Châu phù hợp với cây trồng và vật nuôi vùng ônđới Vùng dọc sông Đà phù hợp với cây rừng nhiệt đới xanh quanh năm.Trong tổng số diện tích đất sản xuất nông nghiệp (247.684 ha), diện tích trồng

cây ăn quả chiếm gần 10% (24.016 ha) Trong đó, xoài tròn (Mangifera indica L.) là một đặc sản của tỉnh Sơn La, trồng tập trung chủ yếu tại huyện

Yên châu với diện tích chừng 500 hecta, hàng năm nhân dân chỉ thu hoạchquả, còn cành lá chặt tỉa hàng năm đều bị đốt bỏ

Nhiều nghiên cứu cho biết trong cây xoài có nhiều hợp chất có tác dụngchữa bệnh, đặc biệt là mangiferin, một glycosid có tác dụng diệt virut, khángviêm v.v Để có thể tận dụng nguồn lá xoài làm nguyên liệu sản xuất thuốc,đồng thời tạo thu nhập góp phần xóa đói, giảm nghèo ở các tỉnh vùng sâu,

vùng xa, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu chiết xuất, đánh giá tính an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của glycosid toàn phần lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La”.Với ba mục tiêu

chính: một là: nghiên cứu xây dựng qui trình chiết xuất và xây dựng tiêu chuẩn

cơ sở của glycosid toàn phần lá xoài tròn, hai là: nghiên cứu xác định tính antoàn của glycosid toàn phần lá xoài tròn, ba là: xác định tác dụng hỗ trợ điều trịviêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của glycosid lá xoài tròn

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

1 Xây dựng qui trình chiết xuất và tiêu chuẩn cơ sở của glycosid toàn phần lá xoài tròn.

2 Nghiên cứu xác định tính an toàn của glycosid toàn phần lá xoài tròn

3 Nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của glycosid lá xoài tròn

Chương 1TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY XOÀI (Mangifera indica L).

1.1.1 Đặc điểm thực vật của cây xoài chi Mangifera L.

1.1.1.1 Vị trí, phân loại của cây xoài chi Mangifera L.

Cây xoài có tên khoa học là Mangifera indica L., thuộc họ đào lộn hột

(Anacardiaceae).

Theo hệ thống phân loại của Takhatajan (1987, 2009) [6], [46], họ Đào

lộn hột và chi Mangifera L có vị trí như sau :

Ngành Ngọc lan (Mangiphylata)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Liên bộ Cam (Rutanae)

Bộ Cam (Rutales)

Họ Đào lộn hột (Anacardiaceae Lindl 1830)

Phân họ Anacardioideae (Anacardioideae)

Chi Mangifera (Mangifera Linnaeus, 1753)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của chi Mangifera L.

Đặc điểm hình thái chung của chi Mangifera L.: Cây gỗ thường xanh,

có kích thước lớn Lá đơn mọc so le, có cuống, phiến lá nguyên, dai Cụm hoahình chùy ở ngọn cành Hoa nhỏ, mẫu 4 hay mẫu 5, tiền khai hoa lợp Cánhhoa đôi khi hàn liền ở gốc Cánh hoa có 1-5 sống nổi bật 5 nhị hoa rời hoặcdính liền với đĩa mật, thường có 1 hoặc 2 nhị lớn hơn Đĩa mật tạo thành từ 5tuyến riêng biệt ở ngoài nhị Bầu nhẵn một ô, 1 noãn, 1 vòi nhụy ở đỉnh bầu.Quả có hột cứng, vỏ quả giữa có xơ, vỏ quả trong dày, cứng, chắc Hạt có 1hoặc đa phôi [28]

Theo Koster mans và Bompard 1993, chi Mangifera L gồm 69 loài

phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới của châu Á như: Ấn Độ, Miến Điện, Sri

Lanka, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia, Nam Trung Quốc, Malaysia,

Indonesia, Papua New Guinea, Philippin, quần đảo Solomon, một vài loài

trong quần đảo Thái Bình Dương (Hawai)… [37]

Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam có 12 loài thuộc chi Mangifera L [8] Tuy nhiên hai loài M camptosperma Pierre, và M reba Pierre được Kosterman và Bompard (1993) xếp vào một loài chung là M gedebe Miq [37]

Theo Võ Văn Chi và Nguyễn Tiến Bân ở Việt Nam có 11 loài (bảng

1.1) gồm các loài như Phạm Hoàng Hộ đã mô tả trừ loài M cassia [1], [6]

Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Mangifera L và phân bố tại Việt Nam.

2 M odorata Griff. Xoài thơm Miền Nam

5 M dongnaiense

Pierre Xoài Đồng Nai

Lâm Đồng, Đà Lạt, BìnhDương, Đồng Nai

6 M duperreana

Lâm Đồng, Ninh Thuận, TâyNinh, Bình Dương, Tp HồChí Minh, Kiên Giang

8 M foetida Lour. Xoài hôi, muỗm,

xoài cà lăm Quảng Trị và nhiều nơi khác

9 M flava Evr. Xoài vàng Quảng Nam, Lâm Đồng,

Theo các tác giả của chỉ dẫn địa lý thì Sơn La có một số loài khác đó là :xoài tròn hay còn gọi là muồng kẻo (tên địa phương Sơn La), xoài hôi haycòn gọi là muồng khíu (tên địa phương Sơn La), mắc chai (tên địa phươngSơn La), trong đó người dân địa phương trồng chủ yếu là xoài tròn, vì choquả đặc biệt thơm ngon Như vậy giống xoài tròn này không được nhắc đến

trong bảng phân loại của các tác giả trên (Đỗ Tất Lợi?)

Cây có thể cao 40 m, nhưng thông thường khoảng 10-15m, có tán lớn

và có thể sống đến 100 năm Lá nguyên, mọc so le, đơn, thuôn dài, nhẵn,bóng, dài 15-30 cm, rộng 5-7 cm Hoa nhỏ, màu vàng nhạt, thành chùy ở đầucành Quả hạch khá to, hạch dẹt, hình thận, cứng, trên có những thớ sợi khinẩy mầm thì hơi mở ra Hột xoài có vỏ cứng, bên trong chứa 2 tử điệp và phôimầm Các giống xoài ở Việt Nam thường đa phôi, có từ 2-12 phôi vô tính và

có thể có từ 1 hoặc không có phôi hữu tính Do vậy, hột xoài khi gieo có thểcho từ 1-5 cây con vô tính giữ nguyên đặc điểm di truyền từ cây mẹ Nếu cócây con hữu tính thì cây mọc yếu ớt, dễ bị lấn át

Rễ có thể mọc sâu đến 9m ở vùng đất cao hay đồi núi, nơi vùng đấtthấp rễ mọc đến mực thuỷ cấp Xoài trồng từ hột, sau 6-8 năm sẽ cho trái

Xoài có thể chịu đựng được trong khoảng nhiệt độ từ 4oC – 46oC,nhưng nhiệt độ thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển tốt là vào khoảng24oC – 27oC

Yên Châu là một huyện miền núi biên giới của tỉnh Sơn La; nằm dọctrục quốc lộ 6, trung tâm huyện lị cách thị xã Sơn La 64 km, cách thủ đô HàNội 240 km; có 47 km đường biên giới với nước Cộng hòa Dân chủ Nhân dânLào Có toạ độ địa lí: 104º 10’ - 104º 40’ kinh đông; 21º 07’ - 21º 14’ vĩ độ bắc

Do có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đặc trưng nên thích hợp cho sự sinhtrưởng và phát triển tốt của cây xoài

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Mangifera L.

Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các

loài thuộc chi Mangifera L Trong đó loài M indica L là loài phổ biến và

được nghiên cứu nhiều nhất Thành phần hóa học đáng chú ý gồm có: Cáchợp chất phenol và acid benzoic, coumarin, flavonoid, xanthonoid, tinh dầu(monoterpen, sesquiterpen), steroid, triterpen và vitamin Đặc biệt mangiferin,một xanthon glycoside được nghiên cứu nhiều nhất và là thành phần có nhiềuhoạt tính sinh học

1.1.2.1 Nhóm các hợp chất của phenol và acid benzoic

Các hợp chất thuộc nhóm này gồm có: acid gallic [40], [43], và các dẫnchất của nó : methyl galate, n-propylga late [43] Chúng chủ yếu được tìm

thấy ở hoa, lá và vỏ thân của các loài thuộc chi Mangifera L.

Hình 1.1 Acid gallic và các dẫn chất của nó phân lập từ chi Mangifera L.

Ngoài ra còn có các dẫn chất acid benzoic và acid 3,4-dihydroxy

benzoic, propyl benzoate [43], 5-[2(Z)-heptadecyl] resorcinol [24],

5-(12Cis-heptadecencyl) resorcinol và 5-pentadecyl resorcinol được tìm thấy trong vỏthân xoài [26]

1.1.2.2 Coumarin

Hai hợp chất thuộc nhóm coumarin đã được tìm thấy vỏ thân, vỏ rễ của

loài M indica: acid ellagic (I) [40], mangcoumarin (II) [39].

1.1.2.3 Flavonoid

Flavonoid là một trong những thành phần hóa học chính của chi

Mangifera L., chúng được tìm thấy trong lá, quả và hạt của cây Các flavonoid được tìm thấy trong các loài của chi Mangifera L chủ yếu thuộc các nhóm: Anthocyanidin:]7-O-methylcyanidin 3-O-β -D-galactopyranoside, 7-O- methylcyanidin [25]; Flavan-3-ol : catechin, epicatechin [43]; Flavonol

có quercetin, [16], [30], quercetin 3-O- diglycosid, quercetin 3-O- galactosid, quercetin 3-O- glucoside, quercetin 3-O- xyloside, quercetin 3-O- arabinopyranoside, quercetin 3-O- arabinofuranosid, quercetin 3-O- rhamnoside, kemferol-3- glucoside [16], myrcetin [30]; Biflavon có: I-4’, II-

4’, I-5, I-5, I-7, II-7-hexahydroxy-[I-3’,II-8]-biflavon [34]

O

OH OH HO

O-glactoside OH

OMe OH

Cl

Biflavon Anthocyanidin (paeonidin-3-galactoside)

Hình 1.3 Một số chất thuộc nhóm flavonoid phân lập từ Mangifera L 1.1.2.4 Xanthon

Đây là nhóm hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Mangifera L Cấu

trúc hóa học chung của nhóm là một bộ khung xanthon có gắn nhiều nhóm OH,nhóm OH có thể được thay bằng liên kết O-glycosid hoặc C-glycosid với 1phân tử đường Các hợp chất thuộc nhóm này gồm có: mangiferin [16], [30],

[32], [33], homomangiferin [32]; euxanthon; 1,3,5,6,7-pentamethoxyxanthon;

1,3,6,7,8-penta hydroxyxanthon [30], mangiferin-6’-O-galate [16] Trong đó

mangiferin là hoạt chất có hàm lượng khá cao và cũng là chất có nhiều tácdụng sinh học: kháng virut, đái tháo đường, chống viêm, điều hòa miễn dịch

HO

OH Glu OH

Công thức chung của các hợp chất xanthon Mangiferin

Hình 1.4 Các hợp chất nhóm xanthon phân lập từ chi Mangifera L 1.1.2.5 Tinh dầu và các hợp chất thơm

Các hợp chất monoterpen và sesquitecpen chính là các thành phần tạo

nên mùi thơm đặc trưng chi Mangifera L Các thành phần này chủ yếu được

tìm thấy trong hoa, vỏ quả, một số được tìm thấy ở lá cây

 Monoterpen

Camphren ∆2-Caren ∆3-Caren α-Pinen

β-Pinen β- Myrecen Carveol

HO

i - Pr

CH

O

OH

ρ-Cymene ρ-Geranial Linalol

Hình 1.5 Một số hợp chất monoterpen có trong chi Mangifera L.

Các monoterpen tìm thấy trong các loài của chi này chủ yếu thuộcnhóm các dẫn chất không chứa oxy như: ∆2- và∆3-caren, camphren, limonen,

β-myrecen, α- và β-phellandren, α- và β-pinen, β-ocimen, Cis-ocimen

caryophylen, α-terpinolen, α- và γ-terpinen, α-thujen,… Ngoài ra, còn có cácdẫn chất chứa oxy gồm có: p-cymen, carveol, ρ-linalol ,…[14], [38], [39],[44], [47].

Theo một nghiên cứu về tinh dầu chiết xuất từ vỏ quả xoài M indica L.

ở Nigeria, cho thấy hàm lượng các monoterpen cao (83,2%) trong đó thành

phần chủ yếu là: ∆3-caren (58,2%), α-pinen (13,0%) [15]

 Sesquiterpen

Các hợp chất sesquiterpen đã tìm thấy ở chi Mangifera L đều là các

hợp chất có cấu tạo hai vòng như: δ-cadinen, α-cubeben, caryophyllen, bulnesen, β-elemene, γ-gurjunen, α-guainen, α-humulen, γ-murolene, β-selinen, valenecen,… hoặc ba vòng như α-copaen [14], [38], [39], [47]

β-i - Pr

δ-Cadinen β- Caryophyllen α- Guainen

i - PR

α- Copaene β-Bulnesen Cadalene

Hình 1.6 Một số hợp chất sesquiterpen từ chi Mangifera L

 Các hợp chất khác

Trong thành phần của tinh dầu xoài còn có các hợp chất khác như:acetaldehyde, 2-hexenal, nonanal, 2-nonenal, ethyl butanolate, hexenol,methyl hexanooate, methyl beoate, [14, [39], [44], [47]

1.1.2.6 Triterpen

Cho đến nay đã tìm thấy khoảng 60 hợp chất triterpen từ các loài thuộc

chi Mangifera L bao gồm các triterpen pentacyclic và triterpen tetracyclic.

Các hơp chất triterpen pentacyclic gồm có các nhóm như: olean, ursan, [17],

[20], [22], [36], fridelan [17], [18], [22], [29], [30]; lupan [19], [35], [36];hopan [31]; taraxastan [20], [21], [22], [23] và cycloartan [17], [18], [19],[20], [21], [22], [27] Trong đó nhóm cycloartan chiếm số lượng lớn nhất.Công thức chung của nhóm bao gồm bộ khung cycloartan với một nối đôi ởcác vị trí khác nhau (vị trí C số 23, 24, 25) trên mạch nhánh, các nhóm thếgồm có: một nhóm OH hoặc O gắn vào các vị trí C số 3, một nhóm OH gắnvào một trong các vị trí 22, 24, 25; nguyên tử carbon số 26, 27 có thể bị oxyhóa thành COOH hoặc CHO, CH2OH Các hợp chất này chủ yếu được tìmthấy ở vỏ cây.

COOH

OH OH

Acid hydroxy mangiferolic 3β,24,25-Triol-cycloartane

Hình 1.7 Cấu trúc một số dẫn chất cycloartan phân lập từ chi Mangifera L

Anjaneyulu và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất teriterpentetracyclic nhóm damaran là 3β,20(S)-diol-dermar-24-en (III) [17] [19] và 3-

oxo-dammar-24-en-20S,26a-diol (IV) [20] từ một số thứ của loài M indica

L của Ấn Độ

R2HO

1.1.2.7 Steroid

Cho đến nay đã tìm thấy khoảng 9 steroid có trong các loài M indica,

M persiciformis, M sylvatica Các steroid đã được tìm thấy thuộc hai nhóm

khung cơ bản là pregnan và stigmastan

Nhóm Pregnan: năm 1992, Anjaneyulu và cộng sự đã phân lập đượchai hợp chất pregnenolon và progesteron từ hoa xoài [19]

Hình 1.9 Khung pregnan, pregnenolon, progesteron.

Nhóm stigmastan gồm có: β-sitosterol [20], [23], [29], [32],stigmasterol, stigmas-7en-3β-ol [29], daucosterol, 6β-hydroxy stigmast-4-en-3one [23], mangdesisterol Trong đó β-sitosterol được tìm thấy trong hầu hếtcác bộ phận của cây Xoài Các hợp chất còn lại chủ yếu được tìm thấy tronghoa, quả và hạt

Stigmastan β-Sitosterol Stigmasterol

Hình 1.10 Khung stigmastan và một số dẫn chất stigmastan trong xoài.

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây xoài

1.1.3.1 Ngoài nước

Một số nước trên thế giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm

từ cây xoài là Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, ấn độ, Cu Ba Trên thị trườngCuba hiện có chế phẩm Vimang® (dịch chiết toàn phần từ vỏ thân, lá xoài)

được sử dụng như một thực phẩm chức năng để hỗ trợ điều trị một số bệnhmiễn dịch, dị ứng, chống oxy hóa, hỗ trợ trong điều trị HIV.

Các nghiên cứu cho thấy quả xoài có thành phần dinh dưỡng, hóa họcphong phú: glucose, protein, cellulose, flavine, acid folic, calci, phosphor, sắt,beta caroten, vitamin B1, B2 và các acid, saponin, saponin trong xoài có tácdụng khử đàm trị ho và ngăn ngừa ung thư Quả chưa chín ức chế vi khuẩnStaphylococus, escherichia coli, Mangiferin có tác động kháng virus đối vớinhóm virus Herpes, ức chế trên giai đoạn đầu của quá trình tái sinh virusHerpes Mangiferin có tác dụng kích thích miễn dịch trên cả 2 loại miễn dịch

Garrido G và cs [21] và nhiều nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ cây

xoài tròn (Mangifera indica L.) là một chế phẩm tự nhiên có tác dụng kháng

khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, giảm đau và điều hòa miễn dịch [14],[22], [23], [24], [25], [32], [33], [34]

Makare N và cs [27] đã chiết suất bằng cồn từ vỏ gốc của cây xoài

tròn (Mangifera indica Linn) được dịch chiết chứa 2,6% mangiferin và đánh

giá tác dụng lên hệ thống miễn dịch trung gian tế bào và miễn dịch dịch thểcủa chuột Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết có tác dụng làm tăng khángthể dịch thể và làm trì hoãn phản ứng quá mẫn ở chuột Vì vậy, có thể kếtluận rằng dịch chiết xuất là một loại thuốc có đặc tính kích thích miễn dịch

García D và cs [18] nghiên cứu tác dụng của Vimang (dịch chiết xuất

bằng nước của Mangiferia indica L.) và mangiferin (có chứa

C-glucosylxanthone) lên chức năng đại thực bào ở chuột thấy Vimang vàmangiferin có tác dụng ức chế hoạt động của đại thực bào:

- Với liều tiêm phúc mạc 50- 250 mg/kg đã làm giảm đáng kể số lượngđại thực bào trong dịch rỉ viêm phúc mạc sau khi tiêm thioglycollate vào phúcmạc 5 ngày trước đó (nhưng không có tác dụng đáng kể đến tỷ lệ đại thực bàotrong quần thể các tế bào của dịch rỉ phúc mạc);

- Trên in vitro với nồng độ 0,1-100 microg/ml làm giảm hoạt động thựcbào của các tế bào nấm men ở phúc mạc và đại thực bào do thioglycollate;

- Trên in vitro với nồng độ 1-50 microg/ml làm giảm nồng độ oxitnitric (NO) sản xuất bởi đại thực bào do thioglycollate khi kích thích vớilipopolysaccharide (LPS) và IFNgamma;

- Trên in vitro với nồng độ của 1-50 microg/ml làm giảm chế tiết cácsản phẩm oxy hóa (reactive oxygen species: ROS) của đại thực bào dothioglycollate khi kích thích bằng phorbol myristate acetate (PMA)

Những kết quả này cho thấy rằng trong thành phần của Vimang, chứamangiferin polyphenol, có tác dụng ức chế hoạt động thực bào và ức chế bàitiết các sản phẩm oxy hóa ở các đại thực bào của chuột Do đó, chế phẩm này

có thể có giá trị trong điều trị các bệnh có nguồn gốc miễn dịch, đặc trưng bởi

sự tăng hoạt tính thực bào của các tế bào chẳng hạn như rối loạn tự miễn dịch

Ngoài ra, bạch cầu ái toan ở tủy xương và máu ở chuột nhiễm bệnhcũng bị ức chế khi điều trị bằng Vimang Sự giảm bạch cầu ái toan có liênquan với sự ức chế sản sinh IL-5 trong huyết thanh và eotaxin trong hệ thốngnội môi ở phổi Tác dụng của Vimang có tính chất chọn lọc hơn so vớidexamethasone Hơn nữa, Vimang không độc với các loài động vật, biểu hiệnbằng sự tăng trọng lượng cơ thể trong quá trình nhiễm trùng

Điều này chứng tỏ tác dụng chống viêm mạnh của Vimang và có thể sửdụng hỗ trợ để điều trị các rối loạn do bạch cầu ái toan như các bệnh dị ứng

và liên quan đến dị ứng- miễn dịch

Nghiên cứu của Garrido G và cs [20] cho thấy dịch chiết của câyMangifera indica L có tác dụng ức chế sớm và muộn hoạt tính của tế bào T,bao gồm sự biểu lộ bề mặt của tế bào CD25, biểu hiện giai đoạn S của chu kỳ

tế bào và làm tăng sự đáp ứng với thụ thể tế bào T (T cell receptor: TCR).Ngoài ra, dịch chiết còn ngăn cản sự sản sinh TNFalpha do suy giảm

IkappaBalpha và sự gắn kết của NF-kappaB với DNA Nghiên cứu này là cơ

sở để giải thích một số hoạt tính sinh học của dung dịch nước chiết xuất từ cây M indica (Vimang)

Rivera D G và cs [30] nghiên cứu tác dụng của Vimang vàmangiferin, C-glucosylxanthone được phân lập từ dịch chiết của cây xoài trònđến các thông số khác nhau của phản ứng dị ứng thấy Vimang và mangiferin

có tác dụng ức chế sự sản xuất IgE và phản ứng phản vệ ở chuột, làm giảmtính thấm thành mạch gây ra histamine, làm giảm giải phóng histamine vàphản ứng tăng sinh của tế bào lympho với bằng chứng là làm giảm số lượng

tế bào lympho B và T có khả năng đóng góp cho phản ứng dị ứng

García-Rivera D và cs [19] đánh giá tác dụng kháng u củaglucosylxanthone mangiferin và acid indanone gallic acid trong dịch chiếtVimang thấy tác dụng đến sự tiến triển và di căn của các tế bào ung thư vútype MDA-MB231 Ở mức độ phân tử, mangiferin và acid galic ức chế hoạttính của NFκB thông qua IKKα/β kinase, làm giảm sự thoái hóa IκB, sự dichuyển NFκB và sự gắn kết NFκB/DNA Ngược lại với mangiferin xanthone,axid galic còn hỗ trợ ức chế con đường NFκB liên quan đến sự tồn tại của tếbào ung thư và kháng điều trị như MEK1, JNK1 / 2, MSK1 và p90RSK Kếtquả này là do axid galic ức chế tổng hợp các hoạt tính của NFκB có liên quanđến viêm, di căn, tự hủy diệt và tăng sinh mạch máu, chẳng hạn như IL-6, IL-

8, COX2, CXCR4, XIAP, bcl2, VEGF

Garrido G và cs [21] nghiên cứu độc tính cấp ở chuột nhắt và chuộtcống với các đường uống, tiêm dưới da và tiêm phúc mạc Kết quả nghiêncứu cho thấy dịch chiết không gây chết với liều lượng tối đa là 2.000 mg/kgtrọng lượng cơ thể và không thấy có tác dụng phụ với đường uống và tiêmdưới da Chế phẩm có thể gây chết với liều 200 mg/kg chuột khi tiêm màngbụng Nghiên cứu trên thỏ còn cho thấy dịch chiết không gây kích ứng da,

niêm mạc mắt hoặc niêm mạc trực tràng, nhưng có thể gây kích ứng nhẹ khi

sử dụng bằng đường âm đạo

1.1.3.2.Trong nước:

Trên thực tế, trong dân gian Việt Nam từ lâu cũng đã sử dụng nước sắc

lá xoài để chữa một số bệnh như: đau bụng, giời leo, dị ứng, ho có đờm…theo

Đỗ Tất Lợi và một số tác giả: quả có vị ngọt, chua, tính bình, tác dụng lý khíkiện tỳ, trị ho Hột có vị ngọt, đắng, tính bình, tác dụng hành khí giảm đau.Dùng điều trị các chứng như miệng khát họng khô, tiểu tiện không thông ;phòng ngừa ung thư kết tràng và bệnh do thiếu chất thô trong thức ăn

Tuy nhiên tại Việt Nam chưa có nghiên cứu chiết xuất glycosid lá xoàitròn để tận dụng tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm hay giảm ho, điều hòamiễn dịch v.v.của nó

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có Mangopherpin chiết xuất từ lá cây

xoài miền nam (Mangifera indica L), của Công ty liên doanh BV Pharma

(British-Vietnamese J.V Company) Thuốc được dùng để điều trị các dạngbệnh cấp tính và tái phát do virus Herpes gây ra bao gồm Herpes miệng vàHerpes sinh dục, bệnh thủy đậu (trái rạ ), Zona (giời leo ) Thuốc được sảnxuất theo bản quyền của một nghiên cứu nước ngoài: công ty British, Anhliên doanh với Việt Nam sản xuất [5]

Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu ngoài nước nói trên về cây xoài chothấy dịch chiết từ các bộ phận của cây xoài như: lá, rễ, vỏ, hạt, quả có tácdụng kháng viêm, giảm đau, kháng virus, kháng khuẩn, kháng u, điều hòamiễn dịch [8], [9], [10] Đặc biệt tác dụng kháng viêm mạnh dẫn tới giảmtriệu chứng ho, khả năng tác động ức chế tế bào bạch cầu ái toan xâm nhậpvào phế nang và phúc mạc, ức chế tế bào lymphoT dẫn tới hạn chế cơn co thắtphế quản do dị ứng trong khi độc tính của nó hầu như không có hoặc rất thấp[11], cho thấy dịch chiết của cây xoài có thể có tác dụng tốt đối với các bệnh

về hô hấp mãn tính như viêm phế quản, hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽnmãn tính [6], [11], [13], [14] trên cơ sở đó chúng tôi hướng tới lựa chọnnghiên cứu tác dụng của glycosid lá xoài tròn đối với điều trị các triệu chứngcủa bệnh viêm phế quản mãn tính (VPQMT), một căn bệnh gây tử vong cao vàđang ngày càng gia tăng, hy vọng tìm ra được một thuốc y học cổ truyền mớihiệu quả, ít tác dụng phụ, giá thành hợp lý để hỗ trợ điều trị các bệnh về hôhấp nói chung, bệnh VPQMT nói riêng, góp phần khai thác, phát huy tiềmnăng vô cùng phong phú và đa dạng của nguồn tài nguyên thiên nhiên nước ta.

1.1.4.Tổng quan về bệnh viêm phế quản mãn tính

1.1.4.1 Định nghĩa:

Theo Tổ chức Y tế thế giới, VPQMT là tình trạng tăng tiết dịch nhầycủa niêm mạc phế quản gây ho và khạc đờm liên tục hoặc tái phát từng đợt(khoảng 3 tuần lễ), ít nhất là 3 tháng trong một năm và ít nhất là 2 năm liền

Có ba dạng bệnh VPQMT:

- VPQMT đơn thuần: chỉ ho và khạc đờm, chưa có rối loạn thông khíphổi, có thể điều trị khỏi

- VPQMT tắc nghẽn: triệu chứng chính là khó thở, do tắc nghẽn lanrộng và thường xuyên của phế quản Còn gọi là bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính(COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease)

- VPQMT nhầy mủ: (Brochit chronic mucopurulence) ho và khạc đờmnhầy từng đợt kịch phát hoặc liên tục

Laenac (1986) xếp bệnh VPQMT vào nhóm bệnh phổi không đặc hiệu.Ngày nay, các tác giả Mỹ thay thế bệnh danh VPQMT bằng bệnh phổi tắcnghẽn mạn tính (chronic obstructive pulmonary disease (COPD)), chính bởiCOPD là chứng bệnh có tỷ lệ cao nhất, dẫn tới tử vong nhiều nhất của VPQMT,ngoài ra VPQMT còn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tâm phế mạn

(Cũng do vậy tại báo cáo này, chúng tôi dùng COPD (hay bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính) thay cho bệnh VPQMT).

1.1.4.2 Nguyên nhân và bệnh sinh:

 Nguyên nhân

- Thiếu hụt men AAT: là một rối loạn di truyền hiếm gặp, chiếm

khoảng 1% COPD Ở những người thiếu hụt α1 – antitrypsine (AAT) bẩmsinh, khi bị COPD, thường tiến triển sớm đến khí thũng phổi toàn tuyến nang

và chức năng phổi giảm nhanh chóng

Bình thường chức năng phổi hoạt động nhờ các sợi chun bao quanhđường thở và thành phế nang Sợi chun gồm một protein có tên là elastin Mộtenzyme có tên là elastase hiện diện ở phổi bình thường (và tăng lên ở nhữngngười hút thuốc) có thể phá vỡ elastin và phá hủy đường dẫn khí cùng phếnang Loại protein khác có tên là alpha-1 antitrypsin (AAT) (được gan sảnxuất và giải phóng vào máu) hiện diện trong phổi bình thường có thể ngănchặn tác dụng tổn thương của elastase trên elastin Sự sản xuất AAT của ganđược kiểm soát bởi các gen có đoạn DNA chứa chromosome di truyền Ngườithừa hưởng 2 gen AAT khiếm khuyết (mỗi chiếc từ bố và mẹ) có cả lượngAAT thấp trong máu hay AAT khiếm khuyết chức năng Ảnh hưởng giảmAAT ở những người này cho phép elastase tiếp tục phá hủy mô phổi Thiếumen này gây ra khí phế thũng ở tuổi 30 hay 40

Hút thuốc là yếu tố thúc đẩy sự phá hủy mà kết quả là làm khởi phátCOPD sớm hơn Những người có một gen AAT bình thường và một gen AATkhiếm khuyết có mức độ AAT thấp hơn bình thường nhưng cao hơn những ngườikhiếm khuyết hai gen Những người này không tăng nguy cơ COPD nếu khônghút thuốc, tuy nhiên nếu hút thuốc nguy cơ COPD sẽ cao hơn bình thường

- Tăng đáp ứng đường thở: là yếu tố nguy cơ góp phần phát triển

COPD Tuy nhiên, tăng đáp ứng đường thở dẫn đến sự tiến triển thành COPDnhư thế nào còn chưa rõ, một số tác giả cho rằng có liên quan đến cơ địa mẫncảm, dị ứng, gai kích thích đường thở

- Khuyết tật của phổi : trong quá trình phát triển của thai nhi, trong lúc

mang thai, cân nặng của trẻ khi đẻ, phơi nhiễm các yếu tố độc hại trong quátrình sống của trẻ em, nhất là nhiễm khuẩn hô hấp trong thời kỳ đầu phát triểncủa trẻ cũng là những yếu tố nguy cơ

- Giới tính: cũng là một yếu tố nguy cơ nhưng chưa rõ ràng Trước đây

đa số nghiên cứu thấy tỷ lệ mắc COPD ở nam nhiều hơn nữ, nhưng gần đây cácnghiên cứu cho thấy tỷ lệ này ngang nhau Nguyên nhân được cho rằng hiệnnay, tỷ lệ phụ nữ hút thuốc lá ngày càng tăng, do vậy tỷ lệ nữ mắc cũng tăng

- Hút thuốc lá chủ động và thụ động:

Số người mắc COPD tăng tỷ lệ với số lượng điếu thuốc lá được hút trênngày, số gói trên năm và khi hút thuốc được bắt đầu ở tuổi trẻ Người hútthuốc lá > 20 gói / năm có nguy cơ cao dẫn đến COPD

Khói thuốc lá là yếu tố nguy cơ chính gây ra COPD Hầu hết bệnh nhânCOPD đều có tiền sử hút thuốc lá, thuốc lào Trẻ em trong gia đình có ngườihút thuốc bị các bệnh đường hô hấp tỷ lệ cao hơn trẻ em trong gia đình không

có người hút thuốc

Hút thuốc chịu trách nhiệm gây 90% COPD tại Hoa Kỳ Tuy nhiên,không phải tất cả những người hút thuốc lá đều mắc và tiến triển thànhCOPD, có khoảng 15- 20% số người hút thuốc lá bị mắc, điều đó chứng tỏ sựnhạy cảm, đáp ứng của cơ thể đối với khói thuốc lá khác nhau của mỗi cá thể.Các nghiên cứu thấy rằng: trên những người bệnh COPD, tỷ lệ TCD4/TCD8

và tỷ lệ lympho bào thấp ở máu ngoại vi dẫn đến nhạy cảm với khói thuốc láhơn người khác

Hút thuốc lá thụ động cũng như hút thuốc lá khi có thai có thể là yếu tốnguy cơ phát triển thành COPD sau này cho thai nhi, vì khói thuốc lá ảnhhưởng đến sự tăng trưởng phổi của thai nhi và gây rối loạn hệ thống miễndịch của thai nhi Ở những người không hút thuốc, bình thường thông khí

phổi (FEV1) giảm hàng năm khoảng 30ml còn ở người hút thuốc lá giảmnhanh gấp đôi: nguyên nhân do, tác động kích thích của thuốc lá thu hút các

tế bào đến phổi làm tăng phản ứng viêm

Hút thuốc lá cũng kích thích các tế bào viêm giải phóng elastase, mộtenzyme phá vỡ các sợi chun trong mô phổi, làm mất tính đàn hồi mô phổi,khói thuốc lá làm co thắt cơ trơn phế quản, làm giảm vận động tế bào có lôngcủa niêm mạc phế quản, ức chế chức năng đại thực bào phế nang, làm phì đại

và quá sản các tuyến tiết nhầy, làm bạch cầu đa nhân giải phóng men tiêuProtein, các độc tố của khói thuốc lá làm dày thành mạch máu phổi, gây biếnđổi mạch máu phổi, tăng áp lực mạch phổi, một nguyên nhân dẫn tới tâm phếmạn, gây tử vong…

- Bụi và chất hoá học nghề nghiệp: những bụi và chất hoá học nghề

nghiệp (hơi nước, chất kích thích, khói) có thể gây nên COPD, độc lập với hútthuốc lá

- Ô nhiễm môi trường trong và ngoài nhà: Vai trò của ô nhiễm không

khí ngoài nhà gây COPD không rõ Ô nhiễm môi trường trong nhà như chấtđốt, chất đốt cháy từ nấu ăn và hơi nóng là những yếu tố gây nên COPD

- Nhiễm khuẩn: vi khuẩn, virut, những ổ viêm nhiễm ở đường hô hấp

trên và viêm phế quản cấp là cơ sở thuận lợi cho bệnh phát triển Những nhiễmtrùng hô hấp ở thời kỳ thiếu niên có thể gây COPD ở thời kỳ trưởng thành

 Cơ chế bệnh sinh:

Đặc điểm bệnh sinh của COPD là quá trình viêm nhiễm thường xuyêntoàn bộ đường dẫn khí và nhu mô Xâm nhập đại thực bào, tế bào lympho T (chủyếu là CD8) và bạch cầu đa nhân trung tính Các tế bào viêm giải phóng ra rấtnhiều chất trung gian hoạt mạch, gồm: leucotrien B4(LTB4), interleukine 8 (IL-

8, yếu tố hoại tử uα (TNF- α) và các chất khác có khả năng phá hủy cấu trúc củaphổi và/hoặc duy trì tình trạng viêm tăng bạch cầu trung tính

Hít phải khói bụi và các chất độc, khói thuốc có thể gây ra tình trạngviêm cũng như phá hủy cấu trúc phế quản, phổi Tình trạng viêm này sẽ dẫnđến tắc nghẽn phổi mãn tính (COPD).

COPD là hậu quả của sự biến đổi nội môi của tế bào niêm mạc đườngthở và phế nang do tình trạng viêm, gồm 3 quá trình:

+ Biến đổi chất gian bào: Sự liên quan giữa hút thuốc lá và viêm đã

được nghiên cứu rất nhiều Thuốc lá kích hoạt đại thực bào và tế bào thượng

bì sản xuất ra TNFa và một số chất trung gian gây viêm như IL8 và ILB4.

+ Mất cân bằng giữa Protêaza và kháng Proteaza:

Thiếu a1 antitrypsine là một chất ức chế một số proteine thuyết thanh nhưneutrophile elastase làm gia tăng nguy cơ gây khí phế thũng; elastin là mộtthành phần chính của thành phế bào bị huỷ bởi neutrophile elastase Sự mấtquân bình giữa proteinase và antiproteinase nội sinh có thể gây nên sự phá huỷphổi và có thể xảy ra do sự suy giảm hoạt tính của antiproteinase do stress oxyhoá, do thuốc lá và có thể do những yếu tố nguy cơ khác của COPD

+ Mất cân bằng giữa hệ thống chống oxy hoá và chất oxy hoá:

Trong COPD có một sự mất quân bình rõ ràng giữa chất oxy hóa vàchất chống oxy hóa, trong đó chủ yếu là các chất oxy hóa, đó là hydrogenperoxide (H2O2) và nitric oxide (NO) Những stress oxy hóa ngoài việc gâytổn thương trực tiếp phổi còn góp phần vào sự mất quân bình proteinase -antiproteinase Những chất oxy hóa cũng xúc tiến viêm Cuối cùng nhữngstress oxy hóa có thể góp phần làm hẹp đường hô hấp

Trong COPD, quá trình viêm mãn tính mà thực chất là rối loạn các quátrình nhắc đến ở trên tái diễn nhiều lần, âm ỉ, hậu quả là gây ra biến đổi vềgiải phẫu bệnh ở phổi, từ đó lại dẫn đến biến đổi sinh lý tương ứng của bệnh(vòng xoắn bệnh lý): gồm tăng tiết nhầy, rối loạn chức năng nhung mao, căng

giãn phổi, hẹp đường thở làm giảm lưu lượng thở, rối loạn trao đổi khí, cao ápđộng mạch phổi và tâm phế mạn.

- Glucocorticoid: thường dùng đường tiêm truyền hoặc đường uống, cóthể kết hợp với glucocorticoid đường tại chỗ Liều lượng: 40mg đường uống/ngày trong 10 ngày

- Thuốc long đờm: hay sử dụng nhóm có hoạt chất N-acetylcystein

- Thuốc kích thích hô hấp, thuốc giãn động mạch phổi, điều trị suy tim…

 Điều trị không dùng thuốc

- Liệu pháp điều trị oxy: thở oxi để duy trì PaCO2 ở mức > 8,0 kPahoặc SaO2 > 90% Khi có tâm phế mạn tính hoặc khi có suy tim ứ trệ

- Thông khí cơ học xâm nhập hoặc không xâm nhập Hiện nay có xuhướng dùng thông khí áp lực dương không xâm nhập áp dụng khi có suy hôhấp cấp, nhược cơ hô hấp

 Biện pháp khác

- Phẫu thuật giảm thể tích phổi

- Ghép phổi

1.1.5 Tính cấp thiết và thực tiễn của đề tài

COPD là loại nặng nhất trong ba loại của bệnh VPQMT, chiếm tỷ lệ cao(88% các bệnh phổi), là nguyên nhân chính của các bệnh mạn tính và tử vongtrên toàn thế giới Hiện nay COPD là nguyên nhân tử vong xếp hàng thứ 4trên thế giới, người ta dự đoán trong vài thập kỷ tới tỉ lệ bị bệnh và tỉ lệ tửvong do bệnh này sẽ tăng lên Tại Việt Nam, Ngô Quý Châu và cộng sự(2006) nghiên cứu tỷ lệ mắc trong dân cư một số tỉnh thành phố phía bắc chothấy COPD trong đối tượng dân trên 40 tuổi ở nội thành Hà Nội là 2,0% vàtrong dân cư thành phố Hải Phòng là 6,8% Như vậy, nếu tính trung bìnhkhoảng 5% dân trên 40 tuổi ở Việt Nam mắc COPD, trên cả nước ta sẽ cókhoảng 1,5 triệu người mắc COPD [4], [6]

COPD là một bệnh diễn biến lâu ngày, gây tổn thương không hồi phụctại phế quản và phế nang, tại đây quá trình viêm, phá hủy tế bào và quá trìnhhồi phục, tái tạo tế bào diễn ra cùng lúc nên dẫn đến các triệu chứng chính củabệnh như ho, khạc đờm, khó thở, suy hô hấp, tâm phế mãn, tử vong…cácnghiên cứu về căn bệnh đã chỉ ra rằng: nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnhCOPD là sự xâm nhập của vi khuẩn và sự suy giảm khả năng đề kháng của cơthể Trong khi yếu tố thuận lợi chính làm suy giảm sức chống đỡ của niêmmạc là khói thuốc lá và không khí ô nhiễm, là hai yếu tố mà, muốn khắc phụcđược đòi hỏi phải có sự nỗ lực của người bệnh, gia đình, xã hội, môi trường[4], [6]

Điều trị COPD, chủ yếu là điều trị triệu chứng và loại bỏ các nguyênnhân gây bệnh, tuy nhiên thường không mấy khả quan, do bệnh mắc đã lâungày và không loại bỏ được nguyên nhân Trong khi các bệnh nhân mắc bệnhmãn tính, trong đó có COPD thường có thể trạng suy kiệt, sức đề kháng giảmcùng với tổn thương chính là tổn thương chức năng của hệ hô hấp, tuần hoàn;

đó cũng là nguyên nhân tạo ra vòng xoắn bệnh lý khiến bệnh ngày một nặng

lên, nếu không có sự can thiệp của các biện pháp điều trị thích hợp, kịp thời.Thúc đẩy hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng cũng là một biện pháp tác độngquan trọng đến kết quả điều trị bệnh.

Như chúng tôi đã nêu ở phần trên, nhiều nghiên cứu ngoài nước đãchứng minh glycosid chiết suất từ lá, vỏ cây xoài có các tác dụng giảm đau,chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, tăng cường miễn dịch[6], [7], [9], [11], [12].v.v.vì thế chúng tôi lựa chọn nghiên cứu chất glycosid

từ lá xoài tròn, là một nguyên liệu sẵn có tại huyện Yên Châu, tỉnh Sơn la, từlâu vẫn bỏ đi, để tiến hành nghiên cứu trên thực nghiệm các tác dụng dược lýcũng như tính an toàn của nó trong hỗ trợ điều trị bệnh COPD, một căn bệnhchiếm tỷ lệ mắc và

tỷ lệ tử vong khá cao trong dân số, đặc biệt ở người già

COPD là căn bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong đang ngày càng tăng, hàngnăm y tế các nước và người bệnh phải chịu gánh nặng chi phí điều trị rất lớn.Việc nghiên cứu ứng dụng hoạt chất Glycosid lá xoài vào hỗ trợ điều trị bệnhCOPD tại thời điểm hiện nay có ý nghĩa thực tiễn cao, vì sẽ có thêm mộtthuốc YHCT mới, có thể ít tác dụng phụ và có nhiều tác dụng như: chốngviêm, chống virus, giảm ho, điều hòa miễn dịch, giảm co thắt phế quản…,mặt khác, do là thuốc có nguyên liệu dồi dào tại địa phương, hy vọng thuốc sẽ

có giá thành hợp lý, phù hợp với nhiều người bệnh, góp phần tích cực trongviệc nâng cao chất lượng sống cho người bệnh

Chương 2ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La.

Địa điểm thu mẫu: bản Poong, xã Chiềng Pằn, huyện Yên Châu, tỉnh

Sơn La

Thời gian thu mẫu: tháng 3 năm 2012 và tháng 1 năm 2013.

Mẫu nghiên cứu gồm có: lá già, lá bánh tẻ và lá non.

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị:

 Nghiên cứu hóa học:

Các mẫu lá cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La sau khi thu háiđược sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, nghiền thành bột thô, bảo quảntrong túi nilon kín, ở nơi khô ráo

 Nghiên cứu tác dụng sinh học:

Glycosid toàn phần lá xoài tròn Yên Châu ở dạng cao lỏng tỷ lệ 4:1 (4

gam dược liệu trong 1 ml) (còn gọi là cao lỏng LXT Yên Châu 4:1) Qui trình

chiết xuất được thực hiện tại Bộ môn Dược liệu, trường đại học Dược Hà Nội.Thuốc thử đạt tiêu chuẩn cơ sở (có qui trình riêng do TS.Đỗ Quyên xây dựng)

 Với nghiên cứu độc tính bán trường diễn của cao lỏng lá xoài tròn:

Sử dụng thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, trọng lượng 1,8-2,5

kg do Trung tâm chăn nuôi Viện Kiểm nghiệm cung cấp Súc vật được nuôitrong phòng thí nghiệm 3 - 5 ngày trước khi nghiên cứu bằng thức ăn chuẩndành riêng (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN sản xuất), uống nước tựdo

 Với nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao lỏng lá xoài tròn:

Sử dụng một số chủng vi sinh vật như: các chủng vi khuẩn: S aureus,

Enterococci, E coli, P aeruginosa, Streptococcus pneumonia, Streptococcus tan máu β; chủng nấm: C albicans,

 Với nghiên cứu tác dụng giảm ho

 Với nghiên cứu tác dụng giãn phế quản

 Với nghiên cứu tác dụng lên chức năng miễn dịch

2.1.2.2 Hóa chất, thiết bị khác:

 Nghiên cứu đặc điểm thực vật và hóa học của lá xoài tròn

Dung môi: Acetonitril, CH3COOH băng, CHCl3, EtOAc, EtOH,MeOH, HCOOH, H2O, HCl đặc.….

- Các thuốc thử định tính thường dùng: Bouchardat, Baljet, Diazo,Dragendorff, Fehling, FeCl3 5%, Gelatin 1%, Lugol, Mayer, Nynhidrin, KI10%,…

- Các hóa chất: anhydride acid acetic, NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4 đặc,NaOH, Na2CO3, Mg, …

- Bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF 254

- Kính lúp soi nổi Leica E24, kính hiển vi Leica; Máy ảnh kĩ thuật sốCanon A2300, Canon A3200; Bếp hồng ngoại, nồi cách thủy; Tủ sấy; Đèn tửngoại Vibez lourmat; Cân phân tích Presica, cân kĩ thuật Sartorius, MettlerToledo; Cột sắc kí BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Máy đo phổ cộnghưởng từ hạt nhân 1H-NMR và phổ 13C-NMR BRUKER AVANCE AM500FT-NMR - Viện Hóa học

 Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao lỏng lá xoài tròn

 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống viêm của CLLXT:

Sử dụng các thuốc thử, dung môi và thiết bị sau:

- Aspirin biệt dược Aspégic (DL-lysine Acetylsalicylate) gói bột100mg của hãng Sanofi aventis, Pháp Dung dịch carragenin 1% Phù kếPlethysmometer No7250 của hãng Ugo-Basile (Italy) Kit định lượng proteincủa hãng Hospitex Diagnostics (Italy) Dung dịch xét nghiệm máu ABXMinidil LBlood Counter và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng thínghiệm Bộ môn Dược lý, đại học Y Hà Nội

 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của CLLXT

- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu : ALT(alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toànphần, albumin, cholesterol, creatinin và glucose của hãng HospitexDiagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máyScreen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).

Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX Diagnostics, định lượng trên máy Vet abcTM Animal Blood Counter

Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học

 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của CLLXT

- Thạch máu, thạch Uri select, thạch thường, thạch sabouraud

- Ống tube vô trùng, nước muối sinh lý vô trùng, Pipet nhựa vô trùng,que cấy, đèn cồn, găng tay, lam kính

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu thực vật

2.2.1.1 Khảo sát trữ lượng lá xoài tròn làm nguyên liệu:

Thu thập, xử lý hai nguồn số liệu:

- Thông tin thứ cấp: sử dụng số liệu trong Báo cáo kết quả thực hiện dự

án “Xây dựng chỉ dẫn địa lý “Yên Châu” cho sản phẩm quả xoài Yên Châu, tỉnh Sơn La, năm 2010, của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Sơn la;

Báo cáo Kinh tế xã hội năm 2011 của Ủy ban nhân dân huyện Yên Châu

- Thông tin sơ cấp: khảo sát trực tiếp vườn nhà của các hộ dân ngẫunhiên tại một số bản, thị trấn, hỏi, quan sát, thống kê, ghi chép, lấy mẫu, ghihình ảnh…

2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn la

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích câythuốc [4], [5] Làm tiêu bản khô và lưu mẫu tiêu bản tại Phòng tiêu bản thựcvật, bộ môn thực vật trường Đại học Dược Hà Nội Dựa trên cơ sở các kết quả

phân tích đặc điểm thực vật kết hợp với các tài liệu để xác định tên khoa họccủa cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La.

2.2.1.3 Nghiên cứu vi phẫu:

2.2.2 Các nghiên cứu hóa học

2.2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hóa học của lá xoài tròn Yên Châu

 Định tính các nhóm chất hữu cơ:

Định tính bằng phản ứng hóa học

Các phản ứng hóa học được tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và địnhtính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3]

Tiến hành: Cân 0,5g dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 15ml

cồn 90o đun trực tiếp 10 phút Lọc nóng qua bông, dịch lọc thu được dùng đểlàm các phản ứng:

Dung dịch thử (T): cân 0,5g bột lá xoài cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm

10ml methanol, đun sôi trực tiếp trong 10 phút Lọc nóng vào bình định mức10ml, bổ xung methanol cho đủ thể tích Dung dịch thu được dùng để chấmsắc kí

Dung dịch chuẩn (C): Cân 2,5mg mangiferin chuẩn vào bình định

mức10ml, hòa tan bằng methanol nóng, bổ sung đủ thể tích Dung dịch thuđược dùng làm dịch chấm sắc kí

- Điều kiện sắc kí:

Bản mỏng silicagel GF 254 hoạt hóa ở 110 oC trong 30 phút

Dịch chấm sắc kí được chiết bằng dung môi MeOH

Đưa lên bản mỏng 5µL dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Hệ dung môi khai triển: (1) CHCl3-EtOAc-HCOOH [4:8:1,5] (2) EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1]

- Phương pháp phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng thường, UV 254,

UV 365, hiện màu bằng hơi ammoniac dưới ánh sáng thường [48]

 Định lượng mangiferin bằng phương pháp HPLC

Chuẩn bị mẫu:

Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch M1, M2, M3 là các mẫu dịch chiết lá xoài giàvới dung môi ethanol ở 3 nồng độ 90o,70o, 50o theo qui trình chiết xuất mô tảsau đây Các mẫu thu được tiến hành phân tích HPLC trong cùng điều kiệnkhi xây dựng đường chuẩn

Tính diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính ta tính được nồng độ vàhàm lượng mangiferin

Tiến hành chiết xuất

Cân chính xác khoảng 1,00g bột lá xoài đã xác định độ ẩm cho vàobình chiết hồi lưu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1.Thêm tiếp 20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch

chiết lần 2 Tiến hành tương tự chiết lần thứ 3 Gộp dịch chiết 3 lần vào bìnhđịnh mức 100ml bổ sung bằng dung môi chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch1) Sau đó lấy 1ml dịch chiết cho vào bình định mức dung tích 50ml bổ sungbằng dung mối chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 2) Lấy 1ml dung dịch 2cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm pha động đến vạch (dung dịch3) Dung dịch 3 được phân tích bằng HPLC.

Điều kiện sắc kí: Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động:

Acetonitril - Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút;

Bộ phân phát hiện: Detector UV- VIS Bước sóng: 257nm Thể tích tiêm mẫu20µl

Phương pháp xử lí số liệu: Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm

Microsoft Ofice Excel 2007:

Dựng đường chuẩn mangiferin:

Chuẩn bị dung môi pha mẫu (DMPM): EtOH 96%-dung dịch HCl 2% (7:1)

Cách pha 1000ml dung dịch HCl 2%: lấy 48ml dung dịch HCl 38%) cho vào bình chứa 500ml nước, lắc đều, thêm nước vừa đủ 100ml Lắc kĩ

đặc(36-Dung dịch HCl 2M:

Cách pha 1000ml dung dịch HCl 2M: Lấy 170ml dung dịch HCl đặc(36-38%) cho vào bình chứa 500ml nước, lắc đều Thêm nước vừa đủ1000ml Lắc kĩ

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn:

Cân 25,28mg mangiferin chuẩn hòa tan nóng trong 30ml DMPM, chovào bình định mức 50ml có nút mài, bổ sung đủ thể tích thu được dung dịch 1

có nồng độ 0,5056mg/ml Lấy 1ml dung dịch 1 cho vào bình định mức dungtích 50ml, bổ xung DMPM cho đủ thể tích thu được dung dịch 2 Lấy 1mldung dịch 2 cho vào bình định mức 50ml, thêm DMPM cho đủ thể tích thuđược dung dịch 3 Lấy 1ml dung dịch 3 thêm pha động đến vạch, lọc qua

màng lọc 0,45µm, thu được dung dịch 4 có nồng độ 4,0448µg/ml Lấy 25mldung dịch 4 pha loãng 4 lần bằng pha động trong bình định mức 100ml, lọcqua màng 0,45µm thu được dung dịch 5 có nồng độ 1,0112µg/ml Lấy 25mldung dịch 5 pha loãng bằng pha động trong bình định mức 50ml thu đượcdung dịch 6 có nồng độ 0,5056µg/ml.

Dung dịch 4, 5, 6 được phân tích bằng HPLC để xây dựng đường chuẩn

Tính hàm lượng mangiferin:

Nồng độ mangiferin (C) trong dịch chiết được tính theo đường chuẩnmangifeirn

Lượng Mangiferin /1ml dung dịch 1: m mangiferin = C h 2 h 3 = 500.C

Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2

h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3

Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức:

6.100.10

.100

Mangiferin Dl

m





M Dl: khối lượng dược liệu (g).

HA: hàm ẩm của dược liệu

Từ diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính ở trên ta tính đượcnồng độ và hàm lượng mangiferin trong các mẫu

 Khảo sát hàm lượng mangiferin trong các mẫu lá xoài

Chuẩn bị 2 dung dịch M4 và M5 theo thứ tự là các mẫu dịch chiết láxoài bánh tẻ và lá xoài non với dung môi EtOH 70o theo qui trình chiết xuấtnhư mục trên Các mẫu thu được đem phân tích bằng HPLC ở cùng điều kiệnkhi xây dựng đường chuẩn Từ diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính

để tính được nồng độ và hàm lượng mangiferin (phụ lục, CĐ 6-tr.17-19)

 Chiết xuất, phân lập mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu Chiết xuất: Cân 100g lá xoài già đã sấy khô, nghiền nhỏ (độ ẩm

9,87%) cho vào bình chiết hồi lưu với 500ml ethanol 70o, trong 2h Lọc nónggiữ lại bã thu được dịch chiết lần 1 Thêm tiếp 300ml ethanol 70oC, chiết hồilưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2 Tiếp tục làm như vậy với lần thứ

3, thu dịch chiết lần 3 Gộp dịch chiết, cô đặc về 500ml, để ở nhiệt độ phòngqua đêm cho mangiferin tủa xuống Lọc lấy tủa thô, thu được 2,4979g tủa thô

Phân lập: Rửa tủa nhiều lần bằng n-hexan đến khi dịch n-hexan không

màu Cắn thu được để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ thường sau đó phân tánvào 50ml ethanol 50o, lắc với 100ml chloroform x 4 lần, gan bỏ lớpchloroform Pha ethanol-nước đem cô cách thủy ở 80oC đến cắn, thu được1,6836g cắn Hòa tan cắn vào một lượng tối thiểu ethanol 70o, lọc qua giấylọc, để lạnh qua đêm ở 4-8oC để mangiferin kết tinh lại, lọc lấy tinh thể, rửabằng cồn lạnh Kết tinh lại 2 lần sẽ thu được 0,9327g chất tinh khiết gọi là M

Kiểm tra độ tinh khiết và sơ bộ nhận dạng M bằng sắc kí lớp mỏng:

Chất M được hòa tan trong methanol tuyệt đối chấm SKLM so sánh với dungdịch mangiferin chuẩn 0,25mg/ml trong methanol

Điều kiện sắc kí:

Bản mỏng GF 254 đã hoạt hóa ở 100oC trong 1h

Hệ dung môi: (1) Et2O-HCOOH-H2O [2:0,1:0,05]

Tính chất vật lí: Tan được trong hỗn hợp cồn- nước, methanol-nước,

tan nhẹ trong methanol, ethanol

Nhận dạng bằng phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR

 Xác định các đặc điểm tiêu chuẩn cơ sở khác

Xác định hàm ẩm

- Chuẩn bị: bột lá xoài già, máy đo hàm ẩm

- Tiến hành: Khởi động máy đo hàm ẩm Cho chính xác khoảng 5g bột

lá xoài vào đĩa cân của máy xác định độ ẩm, đặt nhiệt độ là 1000C Đậy nắplại và đợi sau khi máy báo kết thúc thì đọc kết quả

Xác định độ tro toàn phần

Tro là chất còn lại sau khi đốt cháy hoàn toàn dược liệu

- Chuẩn bị: 5 chén sứ rửa sạch, sấy khô, cân bì; bột lá xoài tròn, cân 5mẫu làm thực nghiệm

- Tiến hành: Cân chính xác 2g bột lá xoài tròn cho vào chén ở trên Đặtchén sứ vào thiết bị nung ở nhiệt độ 4500C trong 2 giờ Để thiết bị hạ nhiệt độrồi lấy ra cân Nếu tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóngcho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọckhông tro Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc.Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắnghoặc gần như trắng Cho dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đếnkhô rồi nung ở nhiệt độ 4500C đến khi khối lượng không đổi

Tính tỷ lệ % của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí

Xác định phần trăm tạp chất trong dược liệu (hỏi lại TS Quyên, có cần ko?

Vì đây là bột?)

- Tiến hành: Cân bột lá xoài tròn, dàn mỏng lên tờ giấy, quan sát bằngmắt thường, loại những phần không phải là dược liệu, cân phần tạp và tínhphần trăm theo công thức:

X (%) = m a x 100

Trong đó:

X: Phần trăm tạp chất có trong dược liệu (%)

a : Khối lượng tạp chất (g)

 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu của lá xoài tròn

Dựa trên các kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật, hóa học, khảosát hàm lượng, chiết xuất, phân lập mangiferin trên, đưa ra đề xuất tiêu chuẩn

cơ sở của lá xoài tròn làm nguyên liệu, sao cho lượng glycosid hay mangiferinthu được cao nhất

 Nghiên cứu qui trình chiết xuất glycosid toàn phần dạng cao lỏng

Dựa trên kết quả khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin của EtOHbằng sắc kí lớp mỏng và khảo sát hàm lượng mangiferin trong các mẫu láxoài, từ đó xây dựng qui trình chiết xuất glycosid, sao cho lượng glycosid thu

được cao nhất trong cùng một điều kiện (phụ lục, CĐ 9-Tr.16)

 Nghiên cứu đặc điểm hóa học của glycosid toàn phần dạng cao lỏng

Định tính các chất hữu cơ trong cao lỏng 4:1 bằng sắc kí lớp mỏng

Các phản ứng hóa học được tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và

định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học (phụ lục, CĐ 8-tr 23-27) Các mẫu thuốc thử theo định hướng định tính glycosid

Định lượng mangifrin trong cao lỏng 4:1 bằng phương pháp HPLC

Qui trình:

Cân chính xác 0,1 g cao lỏng lá xoài đã xác định độ ẩm cho vào bìnhchiết hồi lưu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1 Thêm tiếp20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2.Tiến hành tương tự chiết lần thứ 3

Gộp dịch chiết 3 lần vào bình định mức 100ml bổ sung bằng dung môichiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 1) Sau đó lấy 1ml dịch chiết cho vàobình định mức dung tích 50ml bổ sung bằng dung mối chiết xuất cho đủ thểtích (dung dịch 2)

Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm pha độngđến vạch (dung dịch 3) Dung dịch 3 được phân tích bằng HPLC.

Điều kiện sắc kí:

Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động: Acetonitril Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút; Bộ phân pháthiện: Detector UV- VIS Bước sóng: 257nm Thể tích tiêm mẫu 20µl

Lượng Mangiferin/1ml dung dịch 1: m mangiferin = C h 2 h 3 = 500.C

Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2

h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3

Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức:

6.100.10

2.2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

 Nghiên cứu tính an toàn của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

Nghiên cứu độc tính cấp

Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của cao lỏng lá xoài tròn

Yên Châu trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp

Litchfield – Wilcoxon và theo hướng dẫn của WHO [5]

 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Thiết kế:

Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng một chuồng

Lô chứng: uống nước cất 3ml/kg/ngày

Lô trị 1: uống cao lỏng 4:1 liều 1,8g dược liệu/kg/ngày (liều có tácdụng tương đương trên người, tính theo hệ số 3)

Lô trị 2: uống cao lỏng 4:1 liều 9g dược liệu/kg/ngày (gấp 5 lần lô trị 1)Thỏ được uống nước hoặc thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày mộtlần vào buổi sáng

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

Tình trạng chung, thể trọng của thỏ

Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tíchtrung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu,công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu

Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chấtchuyển hoá trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, protein và cholesterol

Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh.Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 2tuần uống thuốc, sau 4 tuần uống thuốc

Xử lý số liệu:

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-testStudent

Số liệu được biểu diễn dưới dạng : X ± SD

Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05

2.2.2.3 Tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.

Kỹ thuật tiến hành:

Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thử:

- Dùng que cấy lấy 1 lượng dung dịch cần thử cấy lên môi trườngthạch máu, uri select Ủ ở 370 C/18-24h

- Định danh vi khuẩn, nấm nếu mọc Chỉ thực hiện các bước tiếp theonếu không mọc trong số những chủng thử nghiệm

Xác định hoạt tính kháng khuẩn:

- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch thử nghiệm vào ống tube vô trùng

- Pha loãng bậc 2 các dung dịch thử nghiệm vào các ống tube (1, 2, 4,

8, 16…) bằng nước muối sinh lý vô trùng, đánh dấu từng ống tube với mỗi độpha loãng

- 1 ống chứng là ống chỉ có nước muối sinh lý

- Chuẩn bị huyền dịch:

Đối với vi khuẩn :

Chủng vi khuẩn cần thử được nuôi cấy thuần, qua đêm

Dùng que cấy lấy 3-5 khuẩn lạc hòa tan vào ống tube đựng nước muốisinh lý vô trùng 9 %, điều chỉnh để đạt huyền dịch có nồng độ 0,5 MacFarland (tương đương 108 CFU/1ml)

Trong vòng 15 phút sau, tiếp tục pha loãng huyền dịch trên bằng canhthang Muller-Hinton vô trùng (MHB) (đối với vi khuẩn dễ mọc) hoặc canh

thang Muller-Hinton có 2,5 -5 % máu cừu (đối với S pneumoniae và S agalactiae), để đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml (pha loãng 1:100 để đạt nồng độ

106 CFU/1ml, sau đó tiếp tục pha loãng 1:2 để đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml)

Đối với nấm men:

Chủng nấm cần thử được nuôi cấy thuần, 24h

Dùng que cấy lấy 5 khuẩn lạc đường kính khoảng 1mm hòa tan vàoống tube đựng nước muối dinh lý vô trùng 9 %, điều chỉnh để đạt huyền dịch

có nồng độ 0,5 Mac Farland (tương đương 1-5 x 106 tế bào/1ml)

Huyền dịch được pha loãng tiếp 1:100 sau đó 1:2 bằng canh thangRPMI 1640 để đạt nồng độ 5 x 103 - 2,5 x 104 tế bào/ 1ml

Dùng pipet hút 1ml huyền dịch sau khi pha loãng ở bước cuối cùng chovào ống chứng, tiếp đến là từng ống tube chứa dung dịch thử nghiệm đã phaloãng từ nồng độ thấp đến nồng độ cao Như vậy, mỗi ống sẽ chứa 2 ml, nồng

độ tác nhân cần thử và nồng độ vi khuẩn/nấm đều là 1:2

Ủ các ống tube ở 350 C/18-24 h đối với vi khuẩn hoặc 46-50 h đối với nấm.Sau thời gian ủ ấm trên, dùng que cấy lấy một lượng dịch ở mỗi tubecấy vào từng đĩa thạch máu, đánh dấu các đĩa thạch tương ứng với từng nồng

độ pha loãng Ủ các đĩa thạch ở 370 C/18-24 h, có hoặc không có CO2 tùythuộc vào chủng vi khuẩn cần thử

Kiểm tra các đĩa thạch máu xem sự mọc của vi khuẩn/nấm: đạt khi ởđĩa chứng, vi khuẩn/nấm mọc tốt và ở tất cả các đĩa vi khuẩn/nấm mọc thuầnnhất, khi đó mới tìm nồng độ ức chế tối thiểu: là nồng độ mà tương ứng tại đó

vi khuẩn không mọc hoặc mọc < 10 % so với đĩa chứng (bị ức chế >90 %)

Trong nghiên cứu với mỗi chủng vi khuẩn đều pha loãng 5 nồng độ:1/1, ½, ¼, 1/8, 1/16 so với dung dịch gốc Mỗi nồng độ ít nhất n=5 cho mỗichủng vi khuẩn và nấm

Nhận định kết quả:

Tìm được nồng độ thấp nhất có tác dụng ức chế sự phát triển của vikhuẩn

2.2.2.4 Tác dụng chống viêm của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

 Hình viêm cấp gây phù viêm chân chuột bằng carragenin trên chuột cống trắng [2]

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con

Lô 1: uống dung môi pha thuốc 2ml/100g thể trọng/ ngày

Lô 2: uống aspirin liều 200 mg/kg/ ngày

Lô 3: uống cao lỏng 4:1 liều 8g dược liệu/kg/ngày

Lô 4: uống cao lỏng 4:1 liều 16g dược liệu/kg/ngày

Lô 5: uống cao lỏng 4:1 liều 32g dược liệu/kg/ngày

Chuột được uống thuốc hoặc dung môi trong 4 ngày liên tục trước khigây viêm Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêmcarragenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,05ml/chuột vào dưới da ganbàn chân sau bên phải của chuột Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân)bằng dụng cụ chuyên biệt (phù kế Plethysmometer No7250 của hãng Ugo-Basile) vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0), sau khi gây viêm 2 giờ(V2), 4 giờ (V4), 6 giờ (V6) và 24 giờ (V24)

 Mô hình gây tràn dịch màng bụng trên chuột cống trắng [2]

Chuột cống trắng được bố trí thí nghiệm như trên Chuột được uốngthuốc hoặc dung môi trong 4 ngày liên tục trước khi gây viêm Ngày thứ 4,sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm màng bụng bằng dung dịch carragenin0,05g pha với formaldehyd 1,4 ml, pha trong nước muối sinh lý 0,9% vừa đủ100ml Tiêm vào khoang màng bụng với thể tích 2ml/ chuột Sau 24 giờ gâyviêm , mổ ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm Đo thể tích và đếm số lượng bạchcầu/ml dịch rỉ viêm, định lượng protein trong dịch rỉ viêm

 Mô hình gây viêm mạn tính bằng gây u hạt thực nghiệm amiant trên chuột nhắt trắng [2]

Theo phương pháp Ducrot, Julou và cộng sự Chuột nhắt trắng, đượcchia ngẫu nhiên thành 5 lô :

- Lô 1 : (đối chứng): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10 g/ngày.

- Lô 2: uống methylprednisolon liều 8mg/kg/ngày.

- Lô 3: uống cao lỏng 4:1 liều 6g dược liệu/kg/ngày

- Lô 4: uống cao lỏng 4:1 liều 12g dược liệu /kg/ngày

- Lô 5: uống cao lỏng 4:1 liều 24g dược liệu /kg/ngày

Gây viêm mạn tính bằng cách cấy sợi amian trọng lượng 6 mg tiệt trùng(sấy 120oC trong 1 giờ) đã được tẩm carrageenin 1%, ở da gáy của mỗi chuột

Sau khi cấy u hạt, các chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tụctrong 10 ngày Ngày thứ 11 tiến hành giết chuột bằng clorofoc, bóc tách khối

u hạt, sau đó khối u hạt được sấy khô ở nhiệt độ 56oC trong 16 giờ Cân trọnglượng u hạt sau khi đã được sấy khô So sánh trọng lượng trung bình của khối

u hạt (đã trừ trọng lượng amiant) giữa các lô uống thuốc và lô chứng Tácdụng chống viêm được đánh giá bằng tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u

Xử lý số liệu:

Các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng X ± SD Các số liệuđược xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student Sự khác biệt có ýnghĩa thống kê khi p<0,05

2.2.2.5 Tác dụng giãn phế quản của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1 2.2.2.6 Tác dụng giảm ho của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

2.2.2.7 Tác dụng long đờm của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1

2.2.2.8 Tác dụng tăng cường miễn dịch của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1