Đánh giá khả năng tạo CHHBMSH do các chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng phân huỷ dầu

Công nghiệp dầu khí là một trong những ngành công nghiệp quan trọng, đem lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân.

MỞ ĐẦU

Công nghiệp dầu khí là một trong những ngành công nghiệp quan trọng,

đem lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân Nguồn nguyên liệu dầu

khí tạo ra rất nhiều sản phẩm phục vụ cho hầu hết các lĩnh vực công nghiệp,

nông nghiệp, đời sống xã hội, an ninh quốc phòng… Bất kì một nước nào sở

hữu nguồn tài nguyên quý giá này đều có tiềm năng phát triển kinh tế vượt trội,

vì vậy nó không ngừng được tìm kiếm, khai thác và với quy mô ngày càng tăng

Đặc biệt với một nước đang phát triển như nước ta thì vai trò của nó lại càng

quan trọng

Hiện Việt Nam là nước khai thác dầu đứng thứ 3 Đông Nam Á, tấn dầu đầu

tiên được khai thác vào năm 1986 tại Vũng Tàu, tính đến năm 2004 đã khai thác

được tấn dầu thứ 140 triệu tấn, hàng năm đem lại một phần ba nguồn ngân sách

quốc gia Hoạt động thăm dò khai thác dầu khí diễn ra hết sức sôi nổi ở thềm lục

địa phía Nam và đang có xu hướng chuyển sang miền Bắc như ở Thái Bình, Hải

Phòng

Bên cạnh những mặt tích cực đó, hoạt động khai thác càng mạnh mẽ cũng

đồng nghĩa với việc thải ra môi trường càng nhiều phế thải và tình trạng ô nhiễm

lại trầm trọng thêm Trong ngành công nghiệp dầu khí, mùn khoan là một nguồn

chất thải vô cùng lớn và có nguy cơ gây ô nhiễm rất cao, đặc biệt là khi sử dụng

các dung dịch khoan gốc dầu Nó được tạo ra khi tiến hành khoan thăm dò và

phát triển mỏ, gồm hỗn hợp đất đá cùng với các hoá chất trong dung dịch khoan

lẫn vào Khi quá trình khoan sử dụng dung dịch gốc dầu thì tình trạng ô nhiễm

càng lớn Về nguyên tắc nguồn phế thải này phải được đem vào bờ xử lí, tuy

nhiên việc xử lí chúng rất khó khăn và tốn kém nên các nhà thầu thường sao

lãng Hiện tại trong ngành công nghiệp dầu khí nước ta chỉ mới áp dụng các

biện pháp hoá lí thông thường để làm giảm tác hại, mà không xử lí triệt để rồi

thải vào môi trường

Vấn đề đặt ra cho các nhà môi trường là phải xử lí chúng, phương án giải

quyết phải đảm bảo sao cho vừa hiệu quả, đơn giản mà lại kinh tế Do đó mà

phương pháp sinh học đang được chú ý bởi các ưu điểm vượt trội của nó so với

các phương pháp hoá lí như: an toàn với môi trường, đơn giản, xử lí triệt để mà

giá thành lại rẻ Một trong các phương pháp xử lí sinh học đem lại hiệu quả cao

đó là sử dụng các chất hoạt hoá bề mặt do các vi sinh vật tạo ra Chất hoạt hoá

bề mặt sinh học là một hợp chất lưỡng cực cho phép hoà tan các chất không tan

vào trong nước, chúng dễ bị phân huỷ sinh học lại không độc thêm vào đó nó có

thể sản xuất từ các nguồn cơ chất phế thải của các ngành công nghiệp khác giá

thành hạ lại giải quyết được tình trạng ô nhiễm do các nguồn phế thải này sinh

ra Để xử lí mùn khoan, CHHBM tỏ ra rất có triển vọng

Ở Việt Nam, mới chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu vế chất hoạt

hoá bề mặt sinh học, hướng nghiên cứu và ứng dụng chúng còn rất mới mẻ

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế đặt ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài: “Đánh giá khả năng tạo CHHBMSH do các chủng vi khuẩn phân lập

từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng

phân huỷ dầu”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG DUNG DỊCH KHOAN VÀ VẤN ĐỀ XỬ LÍ MÙN

KHOAN DẦU KHÍ HIỆN NAY

1.1 Tình hình sử dụng dung dịch khoan

Trong ngành công nghiệp khai thác dầu khí, khi tiến hành khoan mỏ để bôi

trơn mũi khoan, vận chuyển mùn khoan từ đáy giếng lên trên bề mặt, giữ áp suất

vỉa ổn định để ngăn hiện tượng phun trào, bảo vệ thành giếng khỏi sạt lở, bôi

trơn chòng khoan, cần khoan người ta luôn phải sử dụng dung dịch khoan

(DDK)

DDK là một hệ dung dịch bao gồm hỗn hợp các chất điều chỉnh độ nhớt,

chất tạo nhũ, chất phân tán, chất diệt khuẩn, chất phụ gia, NaCl, CaCl2, vôi, sét,

BaSO4, chất chống mất nước nhằm tạo các đặc tính mong muốn cho DDK

Khi chúng được pha với nước gọi là DDK gốc nước, hoặc pha với dầu gọi là

DDK gốc dầu Hàm lượng dầu gốc trong DDK thường chứa trên 70%

So với DDK gốc nước thì DDK gốc dầu đắt và độc hại hơn, nhưng chúng

có những đặc tính hơn hẳn như: ổn định được nhiệt độ cao, chống sạt lở tốt, khả

năng giữ dung dịch tốt Khi tiến hành khoan sâu, khoan nghiêng để đảm bảo

thành công người ta luôn sử dung dịch khoan gốc dầu

Dầu gốc của các dung dịch khoan đầu tiên thường là dầu diezen hay dầu

thô Do gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường mà hiện nay xu hướng sử

dụng các loại dầu gốc có độ độc thấp như dầu khoáng, dầu thực vật hay dầu tổng

hợp có độ độc thấp

Dầu khoáng được sản xuất từ dầu thô đã được loại bỏ các hợp chất độc hại

như các hợp chất thơm, dị vòng nên độ độc thấp hơn dầu thô

Dầu thực vật có độ nhớt cao nên thường sử dụng các dẫn xuất của nó có độ

nhớt thấp hơn, ưu điểm của nó là có khả năng phân huỷ sinh học tốt hơn dầu thô

nên ít ảnh hưởng tới môi trường hơn

Dầu tổng hợp có độ độc thấp, dễ phân huỷ sinh học, giá thành lại rẻ hơn

dầu thực vật nên được sử dụng rộng dãi [5]

Hiện nay ở trên thế giới và ở Việt Nam, một số nhà thầu đã sử dụng DDK

gốc dầu tổng hợp saraline có độ độc thấp Saraline được sản xuất từ dầu khoáng

loại bỏ các hợp chất thơm dị vòng độc hại, nó không chứa các hợp chất thơm đa

vòng vốn là một hợp chất rất độc hại cho môi trường, thành phần chính của nó là

các ankan mạch thẳng từ C12 đếnC25

Tuy các dầu gốc đã được xử lí loại bỏ các thành phần độc hại, chúng vẫn

gây tác động lớn tới môi trường sinh thái và sức khoẻ con người Các dầu gốc

chứa các thành phần hydrocacbon, các thành phần này nếu tích tụ ở nồng độ cao

sẽ ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của sinh vật Trong môi trường nước nó

tạo lớp váng trên bề mặt ngăn cản sự hoà tan oxy vào trong nước, sự trao đổi

nhiệt giữa khí quyển và thuỷ quyển, không cho ánh sáng đi vào nước từ đó ảnh

hưởng tới nguồn thức ăn, dinh dưỡng, hô hấp của sinh vật, tới các loại ấu

trùng Đối với môi trường đất, dầu đẩy nước và không khí ra ngoài làm cho đất

mất khả năng hấp thụ và trao đổi, ngăn cản quá trình trao đổi chất của hệ vi sinh

vật trong đất Đối với con người, nó ảnh hưởng thông qua môi trường nước,

không khí, nó đi vào trong lưới thức ăn, gây tác động tới hệ tiêu hoá, hệ bài tiết,

hệ hô hấp, hệ thần kinh

Cụ thể như dầu saraline, đã có những công bố về tác hại gây bệnh viêm

phổi của loại dầu này [21]

1.2 Vấn đề xử lí mùn khoan dầu khí hiện nay

1.2.1 Mùn khoan

Mùn khoan là sản phẩm phế thải của ngành công nghiệp dầu khí, gồm hỗn

hợp của các loại đất đá bị vỡ vụn ra khi tiếp xúc với mũi khoan và được vận

chuyển lên trên mặt đất thông qua quá trình tuần hoàn của dung dịch khoan Hệ

dung dịch khoan được bơm vào bên trong ống khoan, độ nhớt và vận tốc tuần

hoàn duy trì mùn khoan ở trạng thái huyền phù, thông qua không gian giữa

thành ống khoan và thành lỗ khoan nó vận chuyển mùn khoan lên trên mặt, tại

đó nó tách khỏi mùn khoan và lại tuần hoàn trở lại giếng khoan Do đó, ngoài

đất đá, mùn khoan còn lẫn các hoá chất trong DDK Đối với quá trình sử dụng

DDK gốc dầu thì mùn khoan thấm đầy dầu

Mùn khoan được tạo ra từ hoạt động khoan thăm dò và phát triển mỏ Khối

lượng mùn khoan phụ thuộc vào đường kính giếng, tốc độ khoan và chiều dài

của mỗi công đoạn khoan

Trong quá trình khoan thăm dò, lượng mùn khoan tạo ra ít, khi đưa lên mặt

đất, mùn khoan được rửa sạch, một phần giữ lại nghiên cứu, theo quy chế mùn

khoan loại bỏ phải đưa vào bờ chôn, nước rửa mùn khoan phải được xử lí sạch

Tuy nhiên, các quy định này rất khó thực hiện đồng thời gây tốn kém nên các

nhà thầu thường trốn tránh trách nhiệm

Giai đoạn khoan phát triển mỏ, số lượng giếng khoan nhiều cộng với lượng

mùn khoan ở mỗi giếng rất lớn, khoan khai thác thường không lấy mẫu nên

lượng mùn lại vô cùng lớn Chỉ tính riêng ở mỏ Bạch Hổ, trung bình khoan một

giếng sâu 4000m tạo ra khoảng 350 m3 (900 tấn) mùn khoan Nếu duy trì tỉ lệ

dầu 70% trong DDK gốc dầu thì mùn khoan thải ra có hàm lượng dầu vô cùng

lớn

1.2.2 Tác hại của mùn khoan nhiễm dầu

Với đặc thù là một sản phẩm phế thải nhiễm dầu, có số lượng rất lớn, mùn

khoan đã và đang gây những tác hại không nhỏ

Khi thải ra ngoài biển mùn khoan nhiễm dầu làm thay đổi môi trường sống

của các sinh vật đáy, riêng các chất độc hại trong mùn khoan sẽ xâm nhập vào

trong thức ăn, tác động tới quá trình trao đổi chất, có thể giết chết hoặc gây biến

dạng giống loài, làm thay đổi hệ sinh thái biển, ảnh hưởng ô nhiễm dễ lan rộng

đặc biệt là ở khu vực có dòng hải lưu

Tại đất liền việc chất đống mùn khoan hay làm vật liệu chôn lấp hố, ao hồ

chiếm diện tích lớn, làm thay đổi địa hình và sau đó khi cần dùng diện tích thì

phải tốn kém chi phí bốc dỡ, không những thế nó còn làm ô nhiễm nguồn nước,

không khí qua đó ảnh hưởng tới sức khoẻ của con người [5]

1.2.3 Tình hình xử lí mùn khoan nhiễm dầu

Hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên thế giới, việc xử lí mùn khoan chỉ

mới áp dụng các biện pháp hoá lí nhằm giảm thiểu lượng dầu bám dính trên mùn

khoan trước khi thải xuống biển, hoặc vận chuyển vào bờ để lấp các địa điểm

tạo bề mặt xây dung hay xử lí thành các nguyên vật liệu xây dựng như ở Thái

Lan, Malayxia, Tây Âu Các nước phát triển ở trình độ thấp thì chưa quan tâm

tới môi trường thường chấp nhận một khoản phí bồi thường rồi cho phép đổ tuỳ

tiện các chất thải [5]

Nước ta hiện này cũng áp dụng một số các biện pháp để giảm tác động của

mùn khoan đối với nguồn lợi thuỷ hải sản và môi trường biển:

- Sử dụng sàng rung lưới và các thiết bị li tâm hiệu quả cao trên giàn khoan

để giảm thiểu tối đa hàm lượng dầu bám dính trên mùn khoan đến dưới 10%

- Thực hiện chương trình giám sát môi trường tại các khu vực lân cận của

giếng khoan để đánh giá tình trạng thay đổi môi trường

- Nghiên cứu độ độc của các loại dầu tổng hợp đối với sinh vật

Tuy nhiên, các biện pháp trên không giải quyết được vấn đề triệt để, môi

trường sinh thái vẫn bị tác động lớn

2 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TRONG XỬ LÍ Ô NHIỄM DẦU

2.1 Vai trò của vi sinh vật trong xử lí ô nhiễm dầu

2.1.1 Hệ vi sinh vật trong mùn khoan dầu khí

Như đã nói ở trên, mùn khoan là hỗn hợp các loại đất đá ở trong lòng đất

chuyển lên Mùn khoan chứa một phần các phụ gia trong dung dịch khoan, phần

dầu (đối với DDK gốc dầu), nước trong lòng đất và khu hệ vi sinh vật ở trong

giếng khoan Các chất thường sử dụng trong dung dịch khoan là: tinh bột,

cacbonoxymetylcellulo, lignosulfonat, các loại gum tự nhiên, dầu nhũ hoá, dầu

gốc [23] Các chất này đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là có khả năng

bị phân huỷ bởi các vi sinh vật: Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., các vi khuẩn

khử sunphat như Desulfovibrio desulfuricans [15] Mặc dù trong mùn khoan

thường bổ sung các chất diệt khuẩn nhưng khả năng bị tấn công bởi vi sinh vật

của các chất kể trên vẫn rất cao Việc có mặt nước ở trong mùn khoan càng làm

tăng khả năng phân huỷ dầu của vi sinh vật Smirnova đã chứng minh có nhiều

loại vi khuẩn bao gồm cả các loại oxy hoá hydrocacbon có mặt trong DDK [15]

Do mỗi vùng địa lí có khu hệ vi sinh vật khác nhau nên các mẫu mùn

khoan lấy ở các địa điểm khác nhau có khu hệ vi sinh vật đặc trưng cũng khác

nhau

Hệ vi sinh vật trong mùn khoan là cơ sở cho các biện pháp xử lí dầu bằng

biện pháp sinh học

2.1.2 Cơ chế phân huỷ các hydrocacbon

Cơ chế phân huỷ các hydrocacbon của vi sinh vật đã được các nhà khoa

học trong và ngoài nước nghiên cứu Vi sinh vật sử dụng hydrocacbon làm

nguồn dinh dưỡng và năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển Việc sử dụng

các hydrocacbon của vi sinh vật có thể xảy ra theo hai hướng:

- Đối với một số các hydrocacbon tan trong nước, vi sinh vật có thể hấp thụ

trực tiếp

Với các hydrocacbon khó tan mà có thể tan dưới dạng nhũ tương dầu

-nước thì quá trình phân huỷ vi sinh theo trình tự các bước: đầu tiên là hoà tan

các hydrocacbon dưới dạng nhũ tương dầu nước bằng cách tiết ra các chất hoạt

hoá bề mặt sinh học, sau đó vi sinh vật tiếp xúc với dầu, cuối cùng nó tiết ra các

enzyme để chuyển hoá các hydrocacbon thành các chất mà nó có thể sử dụng

được

Nhìn chung các hydrocacbon khác nhau bị phân huỷ bởi nhiều loại vi

khuẩn và bằng nhiều con đường khác nhau

2.1.2.1 Cơ chế phân huỷ các ankan

Khả năng phân huỷ của các ankan phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của

chúng Thông thường các hydrocacbon bậc 1 và bậc 2 dễ phân huỷ hơn các

hydrocacbon bậc 3 và 4

a Cơ chế phân huỷ các n-ankan:

Quá trình phân huỷ ankan được khơi mào nhờ enzym mono-oxygenaza và

di-oxygenaza Quá trình này đòi hỏi có sự tham gia của một phân tử oxy và chất

cho điện tử NADPH2

Các giai đoạn oxy hoá ankan:

* Giai đoạn 1: Tạo thành rượu, xảy ra qua 2 bước

Tạo thành hợp chất peoxyt

R- CH2- CH3 + O2 —> R- CH2- CH2- OOH

Hợp chất peoxyt không bền dưới tác dụng của NADPH2 tạo thành rượu và

nước:

R- CH2- CH2- OOH + NADPH2 —> RCH2- CH2- OH + H2O + NADP (2)

Từ ankan chuyển thành rượu có hai khả năng xảy ra:

Tạo thành rượu bậc 1: xảy ra khi nhóm OH gắn vào C bậc 1 (2)

Tạo thành rượu bậc hai: khi nhóm OH gắn với C bậc 2:

R-CH2-CH2 - OOH + O2 + NADPH2 —> R- CH- CH2 + H2O + NADP

Rượu bậc 2 tạo thành xeton:

R - CH - CH3 + 1/2 O2 —> R – CH - CH3 +H2O

| ||

OH O

* Giai đoạn 3: tạo thành axit béo:

- Các xeton bị oxy hoá tạo thành este, liên kết este bị phá vỡ tạo ra một axit

và rượu bậc một, rượu bậc 1 lại bị oxy hoá thành andehit rồi axit béo:

* Giai đoạn 4: các axit béo bị oxy hoá tiếp nhờ tru trình õ - oxy hoá

Axit béo mạch dài dưới tác dụng của một loại enzym chuyển sang dạng

acetyl coenzym A và chuyển hoá tiếp dưới tác dụng của nhiều enzym khác Kết

quả là sau mỗi chu kì chuyển hoá, một nhóm acetyl CoA bị cắt ra và phân tử

axit béo bị cắt đi hai nguyên tử cacbon Sản phẩm cuối cùng của chu trình õ –

oxy hoá là CO2 và nước

b Cơ chế phân huỷ các alkan mạch nhánh:

Do cản trở về mặt không gian nên khả năng phân huỷ của chúng kém hơn

n-ankan Theo Atlas, các vi sinh vật phân huỷ ưu tiên C bậc1 và bậc 2, còn C

bậc 3 và 4 thì khó phân huỷ hơn

Ankan có nhóm metyl ở dầu mạch khó phân huỷ hơn ở giữa mạch

Ankan có mạch nhánh dài dễ bị phân huỷ hơn ankan có mạch nhánh ngắn

Trong quá trình nghiên cứu sự phân huỷ các ankan mạch nhánh, người ta

đề xuất biến dạng của chu trình TCA là chu trình Metylcitrat, thay vào vị trí của

axit citric là metylcitrat

c Cơ chế phân huỷ các cycloankan:

Cycloankan là cấu tử chính của dầu thô Khơi mào cho sự phân huỷ

cycloankan cũng là các enzym monooxygenaza và oxygenaza Dưới tác dụng

của các enzym này, các cycloankan bị phân huỷ thành các cycloankanol

Theo các tác giả, khả năng phân huỷ của cyclohexan là mạnh nhất trong

dãy đồng đẳng cycloankan Cùng vòng cycloankan chất nào có mạch nhánh dài

hơn thì sẽ dễ phân huỷ hơn

Khi phân huỷ cyclohexan, quá trình hydroxyl hoá được xúc tác bởi enzym

oxydaza chức năng tạo ra một rượu mạch vòng Rượu mạch vòng sẽ bị dehydro

hoá để tạo ra xeton, xeton bị oxy hoá tiếp thành lacton Lacton sẽ bị thuỷ phân,

nhóm hydroxyl bị oxy hoá thành một nhóm andehit và một nhóm cacboxyl Kết

quả là axit dicacboxylic bị biến đổi tiếp nhờ chu trình õ - oxy hoá

Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên cyclohexan phải thực hiện tất cả

các phản ứng trên Tuy nhiên ta thường gặp hơn các vi sinh vật có khả năng

chuyển cyclohexan thành rượu mạch vòng nhưng không có khả năng lacton hoá

và mỏ mạch vòng Do vậy cơ chế cộng sinh và cùng trao đổi chất (co-

metabolism) đóng một vai trò rất quan trọng trong phân huỷ sinh học các hợp

chất hydrocacbon mạch vòng

2.1.2.2 Cơ chế phân huỷ hydrocacbon thơm

a Benzen

Xúc tác ban đầu cho quá trình oxy hoá benzen là enzym dioxygenaza, tức

là phân tử oxy sẽ gắn trực tiếp vào cacbon của vòng thơm

b Naphtalen

Xúc tác đầu tiên là enzym oxygenaza, gắn phân tử oxy vào phân tử

naphtalen để tạo thành cis-1,2 dihydroxyl 1,2 dihydro naphtalen, sau đó tách

nước để thành 1,2-dihydroxynaphtalen Tại đây, vòng bị cắt để tạo thành

cis-o-hdroxyl benzan pyruvic axit, sau đó tiếp tục bị oxy hoá tạo thành salicyandehyd,

salicylic axít và catechol, tiếp đó cắt các vòng khác theo hướng octhor hay

-metha phụ thuộc vào chủng vi khuẩn

Cũng có trường hợp xúc tác để oxy hoá naphtanen là enzym

monooxygenaza, tức là một nguyên tử của phân tử oxy sẽ gẵn vào vòng

naphthalen và cuối cùng cho ta cis-1,2-dihydroxyl 1,2 -dihydronaphtalen Nấm

mốc là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế về chủng loại có khả năng phân huỷ

naphtalen

Như vậy, naphtalen dần dần sẽ bị chuyển hoá thành phân tử có khối lượng

bé hơn nhờ vi sinh vật, làm cho dầu nặng trở thành dầu nhẹ hơn, và độ nhớt của

dầu sẽ giảm đi

2.2 Cỏc yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phõn huỷ dầu của vi sinh vật

Sự phỏt triển của vi sinh vật phõn huỷ dầu phụ thuộc rất lớn vào cỏc nguồn

cơ chất và cỏc điều kiện của mụi trường sống: nhiệt độ, pH, ỏp suất

Trong tự nhiờn, sự tồn tại của cỏc vi sinh vật cú khả năng sử dụng

hydrocacbon rất đa dạng Chỳng cú thể sống được ở những nơi cú điều kiện rất

khắc nghiệt như trong giếng khoan cú độ sõu hàng nghỡn một với ỏp suất từ 200

– 400 atm và nhiệt độ lớn hơn 1000C Mặt khỏc chỳng cú thể sống ở cỏc vựng

ven biển, nơi mà hàng giờ cú sự thay đổi lớn về độ muối và nhiệt độ do tỏc động

của súng và thuỷ triều Do đú sự tồn tại và phỏt triển của vi sinh vật cú khả năng

sử dụng hydrocacbon trong dải nhiệt độ và ỏp suất khỏ lớn Đa số cỏc vi sinh

vật phự hợp với nhiệt độ từ 25 – 300C và ỏp suất 1 atm [4]

Một nhõn tố mụi trường nữa tỏc động tới sự phõn bố và phỏt triển của vi

sinh vật là pH Đa số cỏc vi sinh vật sống ở mụi trường cú pH trung tớnh hoặc

kiềm yếu

Khớ hậu cũng ảnh hưởng lớn đến sự phỏt triển của vi sinh vật Nước ta cú

khớ hậu nhiệt đới giú mựa Mựa hố, nhiệt độ cao và độ ẩm lớn tạo điều kiện tối

ưu cho vi sinh vật phỏt triển Mựa đụng, nhiệt độ và độ ẩm giảm thỡ khả năng

phỏt triển của vi sinh vật cũng yếu đi

Bờn cạnh đú, sự phỏt triển của vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào thành phần

muối khoỏng trong mụi trường Sự phỏt triển của vi sinh vật sử dụng dầu ở vựng

thềm lục địa phong phỳ và đa dạng hơn ở đại dương Trong cỏc nguyờn tố dinh

dưỡng khoỏng N và P là hai nguyờn tố chớnh ảnh hưởng tới khả năng sử dụng

hydrocacbon của vi sinh vật Tại nhiều vựng ụ nhiễm dầu, người ta đó dựng

nhiều phõn vụ cơ tổng hợp N, P, K rải xuống nơi ụ nhiễm nhằm kớch thớch sự

phỏt triển của vi sinh vật [4]

Cỏc vi sinh vật khỏc nhau sử dụng các hyrocacbon khác nhau Trong cỏc

hydrocacbon, hydrocacbon no và hydrocacbon thơm bị phân huỷ nhiều nhất tốt

nhất

Các đặc tính của mùn khoan có ảnh hưởng tới khả năng phân huỷ của vi

sinh vật Mùn khoan là một chất thấm đậm DDK - là một dung dịch kiềm tính

cao, cho nên mùn khoan thường rất kiềm Mùn khoan là một hỗn hợp rắn, chứa

các chất kìm hãm vi sinh cho nên lượng O2 trong mùn khoan rất ít và khả năng

sinh sống của vi sinh vật trong đó không thuận lợi Điều này đã gây nên những

khó khăn nhất định trong việc xử lí chúng Vì vậy hướng sử dụng chính vi sinh

vật phân lập từ mùn khoan và việc dùng CHHBMSH để kích hoạt quá trình

phân huỷ của chính tập đoàn vi sinh vật trong mùn khoan đảm bảo khả năng

thành công

2.3 Các phương thức xử lí sinh học

* Đánh giá mức độ ô nhiễm dầu: trong tự nhiên ô nhiễm dầu được giảm đi

bằng nhiều cách như sự bay hơi của các phân đoạn nhẹ hay sự tự oxy hoá và

quang hoá nhưng cơ chế chủ yếu của sự phân huỷ dầu là nhờ vi sinh vật Điều

này là cơ sở cho các nhà vi sinh vật dùng các chế phẩm sinh để hỗ trợ các kỹ

thuật làm sạch hoá lí khác [12]

* Các phương thức xử lí ô nhiễm dầu bằng biện pháp phân huỷ sinh học:

Khái niệm phân huỷ sinh học hay còn gọi là cứu chữa sinh học

(bioremediation) đưa ra để mô tả quá trình sử dụng các vi sinh vật sống xử lí các

hệ thống bị ô nhiễm Trong các vi sinh vật thì vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất,

tuy nhiên nấm và các thực vật bậc cao cũng góp phần xử lí ô nhiễm

Bản chất của quá trình phục hồi sinh học là cố gắng thúc đẩy sự phân huỷ

sinh học trong tự nhiên Khi trong môi trường bị ô nhiễm dầu, các vi sinh vật có

khả năng sử dụng dầu làm thức ăn lập tức phát triển Tuy nhiên sự thành công

của việc ứng dụng chúng để xử lí ô nhiễm dầu phụ thuộc vào khả năng tối ưu

hoá các điều kiện khác nhau về sinh học, hoá học, địa chất… giúp cho vi sinh

vật sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ nhất có thể, với thời gian nhanh nhất

Có hai phương thức xử lí ô nhiễm dầu trong đất:

1 Bioaugmentation là phương thức xử lí mà trong đó ngoài việc tối ưu hoá

các điều kiện dinh dưỡng, người ta đưa vào một số vi sinh vật chọn lọc có khả

năng phân huỷ cao, bổ sung cùng với quần xã sinh vật bản địa trong môi trường

bị ô nhiễm để tăng cường khả năng phân huỷ dầu

2 Biostimulation là phương thức xử lí lấy quần xã sinh vật bản địa làm

trung tâm, các đặc điểm sinh học, sinh thái của quần xã vi sinh vật được nghiên

cứu kỹ qua đó đưa các chất dinh dưỡng hữu cơ, vô cơ, cùng các chế phẩm sinh

học với một tỉ lệ thích hợp nhằm kích hoạt tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân

huỷ dầu bản địa làm sạch môi trường

Trên thế giới cả hai phương thức này cũng đã được đem ra áp dụng nhưng

theo các tài liệu thì phương thức thứ nhất dường như ít hiệu quả hơn khi xử lí

dầu trong môi trường mở Trong các thử nghiệm thực tế, việc cho thêm các vi

vinh vật cho thấy không có gì hiệu quả hơn so với chỉ thêm các chất dinh dưỡng

Nguyên nhân có thể là do khi đưa một lượng vi sinh vật mới vào môi trường,

chúng phải mất thời gian để thích nghi với môi trường sinh thái mới, và thường

mất đi khả năng phân huỷ mạnh như vốn có do có các tác nhân kìm hãm nào đó

trong môi trường ô nhiễm, nhiều khi chúng chuyển sang sử dụng nguồn cơ chất

mới không phải là dầu Điều này thật bất lợi, thậm chí cản trở quá trình phân

huỷ tự nhiên do chúng lấn át hệ vi sinh bản địa, sử dụng hết nguồn oxy vốn là

một nhân tố giới hạn cực kì nhạy cảm của quá trình phân huỷ Kết quả là vừa

tốn kém mà hiệu quả lại không cao Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng

phương thức Bioaugmentation có tiềm năng trong việc xử lí các hợp chất dầu

đặc biệt hoặc là ở những vùng mà vi sinh vật bản địa làm việc không hiệu quả

như các vùng đất đá sỏi, đất cát Ở Nga đã sử dụng chế phẩm Devoroie gồm hỗn

hợp các vi khuẩn Rhodoccocus và Candida làm sạch ô nhiễm dầu ở vùng đất

cát

Biostimulation đã được chứng minh là một công cụ hứu hẹn để xử lí triệt

để các bờ biển bị ô nhiễm dầu theo phương pháp hiếu khí Một nhân tố chủ chốt

tạo nên sự thành công của phương thức này là duy trì mức độ dinh dưỡng tối ưu

Các yếu tố kìm hãm phải được khảo sát kỹ làm cơ sở cho quyết định hàm lượng

dinh dưỡng được đưa vào Trong trường hợp hàm lượng dầu cao thì chúng ta có

thể bổ sung vi khuẩn và một số chế phẩm khác như chất hoạt hóa bề mặt để tăng

tốc độ phân huỷ sinh học… Các chủng vi khuẩn được bổ sung ở đây phải là các

chủng được phân lập từ chính môi trường bị ô nhiễm được nhân giống và bổ

sung dưới dạng chế phẩm

Các chế phẩm khác nhau khi đưa vào xử lí ô nhiễm đã cho các kết quả khác

nhau phụ thuộc vào đặc tính của dầu, hàm lượng dinh dưỡng tự nhiên sẵn có của

vùng bị ô nhiễm, đặc điểm của môi trường bị ô nhiễm Dựa trên các thí nghiệm

thất bại trong thực tế nói chung các chế phẩm thương mại có hiệu quả hơn các

loại phân bón nông nghiệp trong việc thúc đẩy sự phân huỷ dầu

Hiện nay nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, sự phát triển của

phân loại học, các nhà khoa học có thể giám sát quá trình phân huỷ sinh học

thông qua sự biến động số lượng của quần thể vi sinh vật chiếm ưu thế trong

môi trường bị ô nhiễm, nhờ đó phương án phục hồi sinh học môi trường bị ô

nhiễm dầu trở nên hấp dẫn các nhà quản lí nhờ giá rẻ, an toàn, độ tin cậy cao

3 VAI TRÒ CỦA CHẤT HOẠT HOÁ BỀ MẶT SINH HỌC

(BIO-SURFACTANT HAY MICROBIAL SURFACE ACTIVE AGENT)

3.1 Bản chất của chất hoạt hoá bề mặt sinh học

Chất hoạt hoá bề mặt sinh học (CHHBMSH) được tạo ra từ con đường lên

men vi sinh vật Nó là một hợp chất lưỡng tính gồm hai phần phần kị nước

(hydrophobic moiety) và phần ưa nước (hydrophilic moiety), có khả năng làm

giảm sức căng bề mặtgiữa các phân tử

Phần ưa nước thường là các nhóm: axit amin, peptit, sacarit đơn, đôi,

polysacarit

Phần kị nước là các axit béo, axit no, không no [30]

Các CHHBMSH có cấu tạo rất khác nhau về cấu trúc hoá học lẫn kích

thước phân tử từ rất đơn giản như các axit béo đến phức tạp như các hợp chất

polymer

Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các

chất glucolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic-lipoprotein,

hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật [30]

Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có đặc tính kháng sinh

như chất gramicidin S hay polymicin [30]

Các CHHBMSH được tạo ra cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn

tan trong nước [16,30] Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường

không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không hoà

tan trong nước [16]

Các CHHBMSH do các gen trên nhiễm sắc thể lẫn các gen ở plasmid tổng

hợp và điều khiển Các gen này dễ mất đi chức năng qua một thời gian dài do bị

đột biến và chọn lọc nếu gặp môi trường không thuận lợi cho chúng biểu hiện

[16] Điều này giải thích vì sao chúng ta bắt gặp các loài có khả năng sử dụng

dầu ở cả những nơi không bị ô nhiễm dầu và khi đó hoạt tính tạo CHHBM rất

thấp

Các CHHBMSH tạo ra trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật, sản

lượng và hoạt tính về sau có thể bị giảm do môi trường hết nguồn cơ chất dinh

dưỡng, vi vinh vật sử dụng chúng làm nguồn thức ăn hay các vi sinh vật chết đi

* Rhamnolipid: do một hoặc hai phân tử rhamnoza liên kết với một hoặc

hai phân tử axit hydroxydecacnoic, gồm có 4 loại: 2 phân tử đường liên kết với

2 phân tử axit, 2 phân tử rhamnose liên kết với 1 phân tử axit, 1 phân tử đường

liên kiết 2 phân tử axit, và 1 phân tử đường liên kết với 1 phân tử axit

Vi sinh vật sản suất là Pseudomonas aeruginosa

Công thức cấu tạo:

O OH

H O

(CH 2)6 3

CH

CH 3 O H HO

CH 2

3 CH (CH 2)6

CH O O

HO

Rhamnolipid 2

Rhamnolipid 1

* Trehaloselipid: do một phân tử đường đôi trehalose liên kết ở vị trí C6 và

C6’ với các phân tử axit mycolic

Axit mycolic là một axit béo mạch dài có phân nhánh Các loài vi sinh vật

khác nhau tạo ra các chất có mạch hydrocacbon có chiều dài và số liên kết đôi

cũng khác nhau [30]

Các vi sinh vật như nhiều thành viên của chi Mycobacterium tạo ra các este

trehalose trên bề mặt tế bào [7] Các loài thuộc các chi Mycobacteria, Nocardia,

Brevibacteria tạo ra các trehaloselipid khác nhau về cấu trúc và kích cỡ [9]

* Sophorolipid

Do 1 phân tử đường sophorose liên kết với một axit béo mạch dài

Phân tử đường do hai phân tử glucose liên kết với nhau, nhóm OH ở vị trí

C6 và C6’ bị acetyl hoá

Chúng do nhiều chủng nấm men thuộc chi Torulopsis sản xuất: T

bombicola, T petrophilum, T apicola và loài Candida bogoriensis

Sophorolipid có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nhưng nó không phải là

chất nhũ hoá hiệu quả [9,24]

3.2.2 Các axit béo: được tạo ra do các vi sinh vật oxy hoá ankan, gồm có

các axit béo mạch thẳng và các axit béo phức hợp chứa nhóm OH và nhánh

ankyl Cân bằng dầu và nước (hydrophilic-lipophilic balance) phụ thuộc vào

chiều dài của mạch cacbon [36]

Chúng do một số vi khuẩn và một số nấm men sản xuất

3.2.3 Phospholipid

Do một số vi khuẩn và nấm men sản xuất, nó là thành phần chính của màng

vi sinh, khi vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất là ankan thì hàm lượng

phospholipid tăng mạnh Chủng Acinetobater sp., Thiobacillus thioxydans,

Athrobacter AK-19, Pseudomonas, Aeruginosa 44T1, Aspergillus spp có khả

năng sản xuất phospholipid

3.2.4 Các lipid trung tính

3.2.5 Các lipopetid và các lipoprotein

Các chất vừa có đặc tính kháng sinh vừa có hoạt tính bề mặt như

gramicidin S do Bacillus brevis, polimicin do Brevibacterium polymixa

tổnghợp.[28]

Các lipid chứa ornithine do Peudomonas rubescen, Thiobacillus

thioxydans, các lipid chứa lysin do Agrobacterium tumefaciens IFO tạo ra

Loài Seratia marcescens sản xuất ra một loại aminolipid có hoạt tính bề

mặt

Chủng Bacllus subtilis ATCC21332 đã xác định có khả năng tạo ra một

loại lipopeptid có hoạt tính cao

3.2.6 Polymer

Hầu hết các CHHBMSH thuộc nhóm polymer là hỗn hợp của polysacarit

với protein, chúng là những chất có hoạt tính bề mặt có khối lượng rất lớn và

cấu trúc phức tạp Các chất tốt nhất là emulsan, liposan, manoprotein và một số

phức hợp của polysacarit-protein khác

Emulsan do Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 tạo ra, đơn phân của nó

chứa một trisacarit liên kết với hai axit béo, nó có khả năng nhũ hoá cao các

hydrocacbon trong nước thậm chí với nồng độ rất thấp [10]

Liposan tạo ra từ Candida lipolytica, là một chất nhũ hoá ngoại bào, hoà

tan trong nước, trong cấu trúc của nó chứa 17% protein và 73% hydrocacbon,

các hydrocacbon trong liposan gồm có glucose, galactose, galactosamin, axit

galactorunic [12]

Manoprotein do Sacharomyces cerevisiae tạo ra chứa 44% manose và 17%

protein

Candida tropicalis đã sản xuất ra một loại phức hợp manan-axit béo trên

môi trường chứa ankan [25]

P aeruginosa P-20 tạo ra một peptidoglycolipid chứa 52 axit amin, 11 axit

béo, 1 đường [16]

Cyanobacterium phormidium J-1 tạo các chất CHHBM là biofloculan và

emulcyan [16]

3.2.7 Các CHHBMSH đặc biệt

Một số loài tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocacbon thành từng

phần nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các hydrocacbon vào

trong tế bào Các túi do chủng Acinetobacter HO1-N có đường kính 20-50 nm

chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharid, chứa 5 phần phopholipid,

khoảng 350 phần polysaccharid [26]

Hầu hết các vi khuẩn phân huỷ hydrocacbon và gây độc có chứa các

CHHBMSH là các thành trên bề mặt tế bào, chúng bao gồm các cấu trúc như là

M protein

3.3 Khái quát quá trình tạo CHHBMSH của vi sinh vật

Để có thể biết rõ được cơ chế rõ ràng quá trình tạo chất hoạt động bề mặt

sinh học ta phải theo dõi được sản phẩm của từng giai đoạn trao đổi chất của vi

sinh vật Nhưng trong phạm vi của bản khoá luận này chỉ xin được mô tả một

cách sơ lược về quá trình tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học của vi sinh vật

Nhìn chung, mỗi một loài vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt

sinh học lại có một cơ chế chuyển hoá riêng Bởi vậy nếu nói một cách cụ thể thì

phạm vi sẽ là quá rộng Ta sẽ xét cơ chế của quá trình tạo chất hoạt động bề mặt

sinh học của vi khuẩn hiếu khí

Với loại vi khuẩn hiếu khí, con đường chung là trình tự oxy hoá các

hydrocacbon thành rượu, sau đó đến andehit, các axit béo, rồi đến axetyl-CoA

hoặc axit pyruvic Từ đây tiếp tục con đường chuyển hoá trong chuỗi hô hấp của

vi sinh vật (chu trình TCA), tạo ra các axit sản phẩm có nhóm chức ưa nước

(nhóm OH hoặc C=O) Các sản phẩm của chu trình TCA sau đó kết hợp với các

thành phần của dầu thô tạo lên sản phẩm là các axit amin hoặc các lipid chung

tính gồm có một đầu ưa nước (OH hoặc C=O) và một đầu ưa dầu (-CH 2 )

Chính các cấu tử này là các chất hoạt động bề mặt sinh học

3.4 Cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH

Trong tự nhiờn cú rất nhiều cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH

Sự tạo thành CHHBMSH và chức năng của cỏc chất này thường cú liờn quan tới

sự phõn huỷ cỏc hydrocacbon Vỡ vậy, cỏc chất này chủ yếu là do cỏc vi sinh

vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon sinh ra Tuy nhiờn, một số vi sinh vật

khỏc lại sử dụng cỏc nguồn cơ chất là cỏc hợp chất hữu cơ tan trong nước

(glucoz, glycerol, etanol…) cũng cú khả năng sinh ra CHHBMSH Một số vi

sinh vật dường như tạo ra chất này nhằm thớch nghi với cỏc điều kiện mụi

trường sống đặc biệt của chỳng, chẳng hạn như: trong cỏc bể chứa dầu, trong

đất, trong đại dương…

Người ta đó phõn lập được chủng Pseudomonas aeruginosa trong nước

bơm ộp vào giếng khoan dầu thụ ở Venuezuela [19] Chủng này cú khả năng

thớch nghi với cỏc điều kiện khắc nghiệt trong bể chứa dầu và hơn nữa, cỏc

CHHBMSH (rhamnolipit) do chủng này sinh ra lại khụng bị cỏc điều kiện đặc

biệt trong giếng khoan (pH, nhiệt độ, độ mặn, Ca2+ và Mg2+) làm mất hoạt tớnh

Chủng Bacillus SP018 cú khả năng tạo CHHBMSH ngay trong điều kiện kị khớ

ở 500C và chịu được nồng độ NaCl đến 10% Chủng Bacillus AB-2 và Y12-B

được phõn lập từ cỏt nhiễm dầu cú khả năng sinh trưởng trong mụi trường cú

chứa hydrocacbon ở nhiệt độ 500C

Từ cỏc mẫu đất nhiễm dầu đó phõn lập được một số chủng vi sinh vật khỏc

như Rhodococcus, Bacillus pumilus [27], Arthrobacter sp MIS 38 [33] Từ cỏc

vựng ụ nhiễm nhiờn liệu đó phõn lập được cỏc chủng như Ochrobacchum

anthropii, hay từ cỏc vựng biển bị tràn dầu phõn lập được Pseudomonas

aeruginosa Cỏc chủng này khụng những cú khả năng phõn huỷ dầu mà cũn cú

khả năng tạo CHHBMSH cao

Jeneman và cộng sự đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis JF-2

trong một giếng khoan dầu ở vựng Carter, Oklahoma Chủng này cú khả năng

phỏt triển trong mụi trường kị khớ và làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường

cũn 30mN/m Chủng này cũng cú thể sinh trưởng trong mụi trường cú nồng độ

NaCl lờn tới 10%, nhiệt độ nuụi cấy là 500C và pH dao động trong khoảng từ

4,6 đến 9,0 Hơn thế nữa, chỳng khụng bị ức chế bởi sự cú mặt của dầu thụ Vỡ

vậy, chủng này cú tiềm năng để sử dụng trong phương phỏp tăng cường thu hồi

dầu nhờ vi sinh vật

Người ta ước tớnh, trong cỏc giếng dầu ở Mỹ, khoảng 50-70% cỏc vi sinh

vật cú thể sinh trưởng được ở pH từ 4-8, nhiệt độ dưới 750C, nồng độ NaCl

khoảng 10% và cú thể sinh trưởng được cả trong điều kiện kị khớ hoặc vi hiếu

khớ [19]

CHHBMSH do vi sinh vật sinh ra cú thể là chất ngoại bào hay chớnh bản

thõn tế bào, trong một số trường hợp cỏc chất này cú tớnh khỏng sinh, do đú

chỳng cú thể phõn huỷ màng tế bào của một số vi sinh vật cạnh tranh nguồn

cacbon với chỳng Cooper phỏt hiện chủng Clostridium pasteurianum sinh một

loại mỡ chung tớnh ngoại bào, chất này cú thể làm giảm sức căng bề mặt của

mụi trường từ 72mN/m xuống cũn 55mN/m Yakimov và cộng sự [38] đó phõn

lập được chủng Bacillus licheniformis BAS50, chủng này cú thể sinh trưởng kị

khớ trờn mụi trường cú bổ sung đường glucoz và 0.1% NaCl và sinh

CHHBMSH cú tờn là lichenysin Kinsinger và cộng sự [21] đó phỏt hiện một

chủng Bacillus subtilis cú khả năng sinh CHHBMSH ngoại bào cú bản chất là

surfactin, chất này cú khả năng khỏng vi nấm

Cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau cú thể tạo ra cỏc loại CHHBMSH cú bản

chất hoỏ học và trọng lượng phõn tử khỏc nhau Người ta đó tỏch chiết và mụ tả

được bản chất hoỏ học của một số CHHBMSH do một số chủng vi sinh vật tạo

ra Banat đó tổng kết được một số vi sinh vật cú khả năng sinh CHHBMSH và

Tên vi sinh vật Tên CHHBMSH được tạo thành

Arthrobacter RAG-1 Heteropolysaccarit

Arthrobacter MIS38 Lipopeptit

Arthrobacter Trechaloz, xaccaroz, fructoz

Bacillus licheniformis JF-2 Lipopeptit

Bacillus pumilus A1 Surfactin

Bacillus sp C-14 Hiđrocacbon-lipit - protein

Candida antarctica Mannosylethritol lipit

Candida bombicola Sophoroz lipit

Candida lipolytica Y-917 Sophoroz lipit

Clostridium pasteuriannum Lipit chung tính

Corynebacterium hiđrocarbolastus Protein-lipit-cacbohiđrat

Corynebacterium insidiosum Photpholipit

Corynebacterium lepus Axit béo

Chủng MM1 Glucoz, lipit, và axit hiđroxidecanoic

Nocardia erythropolis Mỡ chung tính

Ochrobacchum anthropii Protein

Penicillum spiculisporum Axit spiculosporic

Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipit

Pseudomonas fluorescens Lipopeptit

Phaffia rhodozyma Cacbohiđrat-lipit

3.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản xuất CHHBMSH

a Nguồn cacbon

Chất HHBMSH được sản xuất bởi nhiều các sinh vật khác nhau và chúng

cũng có những cấu trúc rất khác nhau, tuy nhiên có một số các hiện tượng chung

liên quan tới việc tổng hợp chúng:

Thứ nhất là việc sản xuất CHHBMSH có thể do các hydrocacbon hoặc các

cơ chất không tan trong nước Hiện tượng này được nhắc đến bởi nhiều tác giả

với nhiều CHBMSH [30,16]

Hiện tượng dễ thấy khác là sự kìm hãm tổng hợp CHHBMSM bởi gluco và

một số các chất trao đổi khác [16] Trong trường hợp của Athrobacter

paraffineus I, CHHBMSH không được tạo ra khi thay thế hexan bằng gluco

[22] Một chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa đã sản xuất ra một chất

giống protein trên nguồn hydrocacbon nhưng không tạo ra trên gluco, glycerol,

axit palmitic [22] Loài Torulopsis petrophilum không tạo ra bất cứ một

glucolipid nào khi nuôi trên môi trường đồng pha chứa bất cứ nguồn cacbon hoà

tan trong nước nào Đối với chủng P aeruginosa khác khi nuôi trên môi trường

chứa glycerol nếu thêm gluco, acetat, succinat, citrat thì sản lượng rhamnolipid

giảm mạnh

Nhiều loài vi sinh vật đã được biết là sẽ tổng hợp nhiều loại CHHBM khác

nhau khi nuôi trên vài nguồn cacbon [32]

Có nhiều ví dụ về việc sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan

trong nước như ở Pseudomonas sp đã sản xuất CHHBMSH trên các nguồn

cacbon hoà tan trong nước như glycerol, gluco, manitol, ethanol [30]

Nhiều tác giả đã chứng minh rằng sản lượng CHHBMSH tạo ra ít khi nuôi

vi sinh vật trên các nguồn cacbon nào đó trong môi trường, chỉ khi nào nguồn

cacbon này hết, khi đưa vào nguồn cacbon không hoà tan trong nước sẽ thúc đẩy

tạo CHHBMSH [8] Việc tạo glucolipid bởi Torulospos bombiloca được kích

thích khi thêm dầu ăn vào trong môi trường nuôi cấy chứa 10% D – gluco [16]

Davis cùng các cộng sự đã chứng minh khi thêm ethyl este của một loại axit béo

vào môi trường chứa gluco thì sản lượng sopholipid ở chủng C bombicola

CBS6009 tăng Khi sản xuất glucolipid ở chủng T apicola TMET73747, Stuwer

cùng các cộng sự đã thu được sản lượng lên tới 90g/l trên môi trường chứa gluco

và dầu hướng dương [16]

b Nguồn nitơ

Nguồn nitơ là một yếu tố quan trọng điều khiển sinh tổng hợp CHHBMSH

Athrobacter paraffineus ATCC 19558, nguồn ure cũng làm tăng sản lượng

CHHBMSH Nguồn NO3 tạo ra sản lượng lớn CHHBMSH ở P aeruginosa và

Rhodoccocus sp [16]

Sản lượng CHHBM tăng ở A paraffineus khi thêm các axit amin như: axit

glutaric, axit asparagin, hay glycin vào môi trường

Cấu trúc của surfactin cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ L- aa tạo ra surfactin

Val-7 hay Leu-7 [16]

Với chủng B lichenniformis BAS50 sản lượng lichennysin A tăng gấp hai

đến bốn lần khi thêm L-glutaric và L-asparagin vào môi trường

Robert cùng các cộng sự đã chứng minh rằng NO3 là nguồn nitơ tốt nhất

cho việc sản xuất CHHBMSH ở chủng Pseudomonas 44TL và Rhodococus

ST-5 sinh trưởng trên dầu ôliu và paraffin

Sản lượng CHHBM cũng tăng bằng việc giới hạn nguồn nitơ;

P aeruginosa, Norcardia, C tropicalis đã tăng sản lượng CHHBM cùng

với hoạt động tổng hợp glutamic khi chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chậm

lại, lúc mà môi trường hết nguồn nitơ

Syldatle cùng các cộng sự đã chứng minh rằng việc giới hạn nguồn nitơ

không chỉ làm tăng sản lượng CHHBMSH mà còn làm thay đổi thành phần của

CHHBMSH

Guerra-Santos cùng các cộng sự chỉ ra rằng việc tạo rhamnolipit là cực đại

khi tỉ lệ C: N là 16:1 đến 18:1, không tạo ra khi tỉ lệ này là 11:1 [20]

c Các yếu tố khác

Một sự thay đổi trong môi trường nuôi cấy cũng làm tăng sản lượng

CHHBMSH

Kiểu loại, sản lượng và hoạt tính CHHBMSH cũng bị ảnh hưởng không chỉ

bởi các nguồn cacbon khác nhau mà còn bởi nồng độ, nguồn nitơ, photpho, các

ion Mg, Fe trong môi trường, điều kiện nuôi cấy, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc và tỉ lệ

pha loãng các chất trong môi trường [21]

Trong một số trường hợp, khi thêm các ion đa hoá trị vào môi trường ảnh

hưởng dương tính tới sản lượng CHHBM

Một số các chất như etabutol, penicillin, cloramphenicol, EDTA cũng ảnh

hưởng tới việc tạo thành CHHBM Đó là do các yếu tố này ảnh hưởng tới độ

hoà tan của các nguồn cacbon [35]

Một số trường hợp quá trình tổng hợp CHHBM lại bị ảnh hưởng bởi nhiệt

độ, pH thông qua sự tác động của các yếu tố này tới hoạt động sinh trưởng của

tế bào

pH đóng vai trò quan trọng trong việc tạo rhamnolipit ở Pseudomonas sp.,

CHHBMSH tạo ra cực đại ở pH = 6 đến 6,5 và giảm mạnh khi pH =7 [19]

Khả năng tạo cellobioselipit ở Ustilago maydis [18] và tạo sophorolipit ở

Torulospos bombicola bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi yếu tố pH [13]

Trong trường hợp chủng Athrobacter paraffineus ATCC19558,

Rhodotorula erythropolis, Pseudomonas sp DSM2874 nhiệt độ lại đóng vai trò

quan trọng Loài Bacillus chịu nhiệt cao chỉ tạo CHHBM khi nhiệt độ trên 40oC

Tốc độ lắc cũng ảnh hưởng tới sản lượng CHHBM, ở chủng Norcardia

erythropolis, sản lượng CHHBM giảm khi tăng tốc độ lắc do nó tác động tới

hoạt động phân chia tế bào, còn ở nấm men sản lượng lại tăng khi tốc độ lắc và

mức độ kị khí tăng [29]

Nồng độ muối cũng ảnh hưởng nhiều tới quá trình sản xuất CHHBM do

ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào Đa số các trường hợp khi nồng độ muối

tăng thì khả năng tạo CHHBM giảm Tuy nhiên trong một số trường hợp sản

lượng CHHHBM không bị ảnh hưởng khi nồng độ muối lên tới 10% mặc dù

nồng độ mixen tối thiểu giảm nhẹ [6]

3.6 Một số ứng dụng của CHHBMSH

* Ưu điểm của CHHBMSH so với CHHBMHH

CHHBMSH tạo ra từ con đường lên men sinh học, cấu tạo của chúng rất

khác so với các CHHBMHH, tuy nhiên chúng cũng gồm hai đầu kị nước và ưa

nước và hoạt tính của chúng cũng không kém CHHBMHH Nhưng CHHBMSH

lại có những ưu điểm mà CHHBMHH không thể sánh kịp, quyết định khả năng

ứng dụng của nó trong rất nhiều ngành công nghiệp, và đang có xu hướng thay

thế dần các CHHBMHH Đó là các đặc điểm:

- Dễ phân huỷ sinh học: CHHBMHH khi bổ sung vào trong mỏ khó bị

phân huỷ trong điều kiện vỉa, gây ô nhiễm môi trường dầu khí do lẫn các cấu tử

không mong muốn làm giảm chất lượng dầu CHHBMSH tạo ra từ nguồn vi

sinh vật nên độ tinh khiết cao, hoạt tính của chúng lại không kém các

CHHBMHH Ví dụ điển hình cho trường hợp này là ảnh hưởng của CHHBMSH

được nghiên cứu bởi Marar và Rockne: khi thêm một số CHHBMHH vào có thể

kìm hãm sự phân huỷ các hợp chất thơm do có ảnh hưởng gây độc, kích thích vi

sinh vật phân huỷ CHHBMHH hay cô lập các hydrocacbon trong mạch micxen

CHHBM, còn CHHBMSH cho thấy có những ảnh hưởng tốt như CHHBMHH

nhưng chúng có thể bị phân huỷ, không độc và nhiều CHHBMSH không tạo cấu

trúc micxen do đó rất thuận lợi cho việc kết hợp các hợp chất thơm với vi khuẩn

[34]

- Các chất HHBMSH có thể sản xuất từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, sẵn có,

với số lượng lớn Nguồn cacbon có thể là các hydrocacbon, lipit, các nguồn cơ

chất phế thải của các ngành công nghiệp khác như rỉ đường, dầu cặn do đó nó

mang lại hiệu quả kinh tế cao mà lại xử lí được ô nhiễm do các phế thải này gây

ra với môi trường [31]

- Việc sản xuất CHHBMSH đơn giản hơn nhiều CHHBMHH Chúng được

tạo ra bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật cho nên thiết bị đơn giản, đỡ tốn

kém mà lại không sử dụng các hoá chất độc hại như sản xuất CHHBMHH

Do không độc, dễ dàng bị phân huỷ, giá thành sản xuất rẻ nên chúng được

ứng dụng trong xử lí môi trường mà CHHBMHH không thể xử lí triệt để: xử lí

dầu tràn, tăng cường khả năng phân huỷ các hợp chất độc hại cho môi trường,

chuyển chúng thành các yếu tố tích cực cho môi trường như sản xuất phân bón

từ mùn khoan phế thải, các hợp chất thơm

Với những đặc tính không độc hại, dễ bị phân huỷ, dễ tiêu hoá mà

CHHBMSH được sử dụng trong các ngành công nghiệp đặc biệt khác như mĩ

phẩm, dược phẩm, thực phẩm mà CHHBMHH khó có thể bì kịp

* Một số ứng dụng của CHHBMSH

CHHBMSH là một nhóm đa cấu trúc, chúng có những đặc tính hơn hẳn các

CHHBMHH như đã nói ở trên cho nên chúng được ứng dụng trong rất nhiều

ngành công nghiệp khác nhau Công nghiệp dầu mỏ là một ngành ứng dụng

rộng rãi các chất hoạt hoá bề mặt trong khai thác cũng như là xử lí môi trường,

CHHBMSH đã tỏ ra có ưu thế và tiềm năng trong ngành công nghiệp này Sau

đây chúng tôi xin trình bày một số các ứng dụng quan trọng của nó

a Nâng cao hiệu suất khai thác dầu (MEOR)

Đây là một ứng dụng quan trọng nhất của nó trong ngành công nghiệp dầu

mỏ

Cơ chế của phương pháp MEOR bao gồm:

1 Tạo axit hoà tan phần đá bao bọc dầu, tăng độ rỗng và tính thấm của vỉa,

tạo khí, do đó làm giảm độ nhớt của dầu và tăng áp suất vỉa

2 Tạo các axit hữu cơ hay các chất HHBM, biopolyme làm giảm sức căng

bề mặt giữa dầu và nước dẫn đến làm tăng độ linh động của dầu

CHHBMSH có thể được sản xuất từ ngoài (ex situ) rồi bổ sung vào trong

mỏ hay tạo ra ngay trong mỏ (in situ) Trong cả hai trường hợp, CHHBMSH đều

làm tăng lượng dầu khai thác từ mỏ lên tới 60 đến 70% mà bằng phương pháp

bơm ép thông thường chỉ khai thác được khoảng 30% nguồn dầu trong mỏ Sự

có mặt của CHHBM làm giảm sức căng bề mặt giữa vùng dầu nước do đó kích

thích dòng dầu chảy

Để sản xuất CHHBM từ ngoài, CHHBM được tiến hành lên men, thu

CHHBM hay đơn giản là cô đặc dịch nuôi cấy và sau đó là bơm xuống giếng

Quá trình sản xuất ex situ phải được tiến hành với số lượng lớn, dưới điều kiện

tối ưu, cung cấp đầy đủ không khí cho quá trình lên men Quá trình này có thể

sử dụng các cơ chất rẻ tiền như các phế thải của các ngành công nghiệp nên vừa

hạ giá thành sản phẩm vừa giảm ô nhiễm cho môi trường [31]

Một áp dụng hợp lí và hấp dẫn hơn là sản xuất CHHBMSH ngay trong mỏ

(in situ) bằng cách cung cấp chất dinh dưỡng cho quần thể vi sinh vật nội tại

trong mỏ hay nuôi giống từ bên ngoài trộn cùng với môi trường dinh dưỡng rồi

bơm vào trong giếng Tuy nhiên khi sản xuất theo cách thức này thường gặp

những khó khăn nhất định ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi sinh vật thậm chí

kìm hãm sinh trưởng và sinh tổng hợp CHHBM như: nhiệt độ mỏ quá cao, áp

suất lớn, pH, độ mặn và kim loại nặng, khó khăn lớn nhất là thiếu oxy và việc

luân chuyển chất dinh dưỡng trong mỏ Do đó, để phương pháp MEOR này

thành công thì phải lựa chọn được các chủng có khả năng chịu đựng được các

điều kiện khó khăn trong mỏ

Phương pháp MEOR đã được nhiều nước áp dụng thành công

Clark cùng các cộng sự đã xác định có khoảng 27% mỏ dầu ở Mĩ thích hợp

cho vi sinh vật phát triển và ứng dụng phương pháp MEOR Phương pháp

MEOR cũng đã được thông báo thành công trong nhiều nghiên cứu ở Nga, Cộng

hoà Séc, Rumani, Mĩ, Hungary, Balan, Hà Lan, Nam Tư

Nước ta hiện đã ứng dụng phương pháp này, năm 1998 Lại Thuý Hiền

cùng các cộng sự đã thử nghiệm phương pháp MEOR trên hiện trường khu vực

mỏ dầu Bạch Hổ- Vũng Tàu và thu được kết quả tốt, số lượng vi khuẩn khử

sunphat giảm đi, năng suất khai thác dầu tăng lên có giếng tăng tới 200%

b Phân huỷ các hydrocacbon

Một ứng dụng quan trọng khác của CHHBMSH đó là trong xử lí môi

trường ô nhiễm hydrocacbon

- Phân huỷ các hydrocacbon trong đất:

Các nghiên cứu về quá trình phân huỷ hydrocacbon trong đất đã được

thông báo rộng dãi Khả năng phân huỷ phụ thuộc vào sự có mặt của các vi sinh

vật phân huỷ, thành phần hydrocacbon, O2, nhiệt độ, pH, nước, các chất dinh

dưỡng và trạng thái vật lí của các hydrocacbon Khi thêm CHHBM sinh học hay

tổng hợp vào trong môi trường sẽ làm tăng tính lưu biến và độ hoà tan của các

hydrocacbon, điều này rất cần cho quá trình phân huỷ

Các thử nghiệm khi bổ sung CHHBMSH để phân huỷ các hydrocacbon đã

đem lại nhiều thành công:

Lindley và Heydeman nuôi nấm Cladosporium resinae trên hỗn hợp ankan,

chủng này có khả năng sản xuất ra một loại CHHBM gồm các axit béo,

phospholipid, nhưng chủ yếu là axit dodecacnoic và phosphatidylcloline Khi bổ

sung phosphatidylcloline vào môi trường nuôi cấy chứa hỗn hợp các ankan này

đã làm tăng tốc độ phân huỷ ankan lên 30%

Foght cùng các cộng sự đã chứng minh chất emulsan kích thích quá trình

phân huỷ của dịch chứa đơn chủng vi khuẩn nhưng lại kìm hãm khi môi trường

chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn

Oberbremer và Muller-Harting sử dụng quần thể vi sinh đất để đánh giá

khả năng phân huỷ dầu thô, trong đó naphthalen bị phân huỷ đầu tiên, các thành

phần khác chỉ bị phân huỷ khi các CHHBM được tạo ra làm giảm sức căng bề

mặt giữa dầu và nước

Khi thêm CHHBM như một số sophorolipit vào môi trường chứa hỗn hợp

các hydrocacbon thì sẽ làm tăng phân huỷ cả số loại lẫn số lượng các

hydrocacbon

Một vài chủng vi khuẩn kị khí cũng sản xuất CHHBMSH nhưng khả năng

làm giảm sức căng bề mặt không bằng các vi khuẩn hiếu khí

Bergetal đã sử dụng CHHBMSH do chủng P aeruginosa UG2 làm tăng độ

hoà tan của hexachlorobiphenyl lên 31% gấp 3 lần khi sử dụng CHHBM hoá

học là 9,3% Khi cả hai chất này cùng sử dụng thì hiệu quả hoà tan tăng lên

41,5%

Chủng Pseudomonas cepacia AC1100 tạo ra một loại chất nhũ hoá có khả

năng tạo thể huyền phù với 2,4,5-T và cũng nhũ hoá một số các clorophenol, do

đó CHHBM này được sử dụng để tăng cường khả năng phân huỷ của các chất

hữu cơ chứa clo [30]

- Phân huỷ các hydrocacbon trong môi trường nước:

Khi dầu bị tràn ở môi trường nước, các thành phần HRCB nhẹ bay hơi còn

các HRCB không phân cực thì không hoà tan trong nước Do có độ hoà tan thấp

(<1ppm) và tỉ trọng nhỏ hơn nước nên hầu hết các thành phần HRCB tồn tại trên

bề mặt nước Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ HRCB đã được phân lập

trong môi trường nước, các vi sinh vật này bị kích thích hoạt động nhũ hoá khi

môi trường nhiễm dầu

Chakrabartu đã thông báo rằng chất nhũ hoá do P aeruginosa SB30 làm

tăng khả năng thu gom dầu, rất có ích để xử lí các bờ biển bị nhiễm dầu

CHHBM từ vi khuẩn còn được ứng dụng để làm sạch các thùng, kho chứa

dầu và nhiều ứng dụng khác CHHBM emulsan do chủng Acinetobacter

calcoaceticus RAG-1 sinh ra sử dụng trong công nghiệp dầu khí làm giảm cặn

dầu trong thùng chứa, giảm độ nhớt của dầu nặng, tạo chất nhũ hoá phục vụ

nhiều lĩnh vực khác [30]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Nguyên liệu

Mùn khoan lấy từ mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu

Các chủng vi khuẩn nhận từ phòng vi sinh vật dầu mỏ

1.2 Hoá chất và môi trường nuôi cấy

1.2.1 Môi trường hiếu khí tổng số 1% (g/l)

Thạch

KH2PO4 NaCl KCl MgCl2

NH4 NO3 Glucoza Pepton Cao thịt Cao men Nước máy

pH

20

1

10 0,25 1,2

2

1

5

3 0,2

1 lít 7-7,2

Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Nga Đức Đức

1.2.2 Môi trường khoáng Gost cho vi khuẩn (g/l):

3 0,4

1 lít

pH và nồng độ NaCl chỉnh theo từng thí nghiệm

Các loại dầu: DO, saralin, dầu thô, parafin, dầu oliu

Các môi trường được khử trùng riêng với các loại dầu ở 1 atm trong thời

gian 30 phút