nghiên cứu đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin phòng bệnh phù đầu lợn con tại hà tây

coli từ cộng sinh thường trực trong ñường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh vì trong quá trình sống cá thể vi khuẩn tiếp nhận ñược các yếu tố gây bệnh là các yếu tố gây dung huyết Hly, y

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ

Người hướng dẫn khoa học: TS ðỗ Ngọc Thuý

HÀ NỘI - 2007

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ ðỗ Ngọc Thuý, ñã tận

tình hướng dẫn tôi làm ñề tài nghiên cứu ñánh giá hiệu quả sử dụng vacxin của Viện thú y

trong việc phòng bệnh phù ñầu lợn tại tỉnh Hà Tây và giúp ñỡ các ñiều kiện ñể luận văn

này có thể hoàn thành

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành ñến các cô, chú, anh, chị em thuộc tổ bộ môn

vi trùng, Viện Thú y Quốc gia Việt Nam và các bạn bè ñồng nghiệp, ñặc biệt là tới Tiến sĩ

Cù Hữu Phú, tổ bộ môn vi trùng Viện Thú y ñã nhiệt tình giúp ñỡ, góp ý cho tôi trong quá

trình thực hiện những thí nghiệm liên quan ñến luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ñề tài hợp tác Chi cục thú y, các trạm thú y, các trại

chăn nuôi, các hộ chăn nuôi tại tỉnh Hà Tây ñã tạo ñiều kiện hỗ trợ ñể tôi hoàn thành luận

văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia ñình, anh em, bạn bè ñã ñộng viên,

ủng hộ và khích lệ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Xin trân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2007

Tác giả

Lê Công Hùng

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ

Tác giả

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh phù ñầu ở lợn 4

1.2 Bệnh phù ñầu ở lợn do vi khuẩn E coli 13

Chương 2 - NỘI DUNG - ðỊA ðIỂM – NGUYÊN LIỆU VÀ

2.4 Phương pháp nghiên cứu 30

2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh và xác ựịnh các yếu tố gây bệnh

2.4.3 Phương pháp kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên ựộng vật thắ nghiệm 30 2.4.4 Phương pháp tiêm thử nghiệm trên lợn ựể ựánh giá hiệu lực phòng bệnh

2.4.5 Phương pháp xác ựịnh hàm lượng kháng thể trong máu của lợn bằng phản

2.4.6 Phương pháp ựánh giá ựộ an toàn và hiệu quả của vacxin phòng bệnh phù

ựầu tại 1 số trại chăn nuôi thuộc tỉnh Hà Tây 33

3.1.4 Kết quả kiểm tra trong phòng thắ nghiệm ựối với một số mẫu bệnh phẩm từ

3.2 đánh giá ựộ an toàn và hiệu lực của vacxin trên ựộng vật thắ nghiệm 47 3.3 Kết quả xác ựịnh hiệu giá kháng thể hình thành ở lợn sau khi tiêm vacxin 50 3.4 Kết quả thử nghiệm vacxin tại một số trại chăn nuôi thuộc tỉnh Hà Tây 55 3.5 đề xuất quy trình tiêm phòng vacxin E coli phòng bệnh phù ựầu cho lợn tại

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AEEC Adhenniccia Enterophathogenic Escherichia coli

DNA Deoxyribonucleic acid

E coli Escherichia coli

EDP ðộc tố gây phù

ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli

EPEC Enterophathogenic Escherichia coli

F18 Fimbriae 18

Hly Heamolysin (yếu tố gây dung huyết)

JICA Japan International cooperation Agency (Tổ chức hợp tác quốc tế

Nhật Bản) LD50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm)

VTEC Verotoxigenic Escherichia coli

VT2e Verotoxin 2e

SLT Shiga-like toxin

PCR Polymerase chain Reaction (phản ứng nhân gen)

µg Microgram (10 -6 g)

DANH MỤC BẢNG

1.1 Các chủng E coli trên lợn mang các yếu tố gây bệnh 9,10 3.1 Tỷ lệ ốm và chết nghi bệnh phù ñầu lợn năm 2006 tại Hà Tây 37 3.2 Tỷ lệ lợn mắc phù ñầu theo lứa tuổi năm 2006 tại Hà Tây 40 3.3 Các bệnh tích ñặc trưng của lợn mắc bệnh phù ñầu tại Hà Tây 44 3.4 Kết quả kiểm tra trong phòng thí nghiệm ñối với một số mẫu bệnh phẩm

thu thập từ các lợn nghi mắc phù ñầu tại Hà Tây 46 3.5a Kết quả ñánh giá ñộ an toàn của vacxin trên chuột bạch 48 3.5b Kết quả ñánh giá hiệu lực của vacxin trên chuột bạch 49 3.6 Lịch tiêm vacxin và lấy mẫu của các lợn thuộc lô tiêm vacxin và ñối

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề:

Hà Tây thuộc vùng bán trung du Bắc bộ, có 12 huyện, 1 thành phố, 1 thị xã với 295 xã và 27 phường, thị trấn, tổng diện tích ñất là 2196,3 km2 với dân số là 2.543.496 người, mật ñộ dân số 1158 người/km2 Hà Tây nằm trong vùng nhiệt ñới gió mùa, có 2 mùa rõ rệt: Mùa mưa và mùa khô Mùa mưa kéo dài từ tháng 9 ñến tháng 12 và mùa khô kéo dài từ tháng 1 ñến tháng 8 Nhiệt

ñộ trung bình năm là 23,9oC, cao nhất 29,3oC, thấp nhất 17,6oC Số giờ nắng trung bình trong năm là 1356,3 giờ, cao nhất là 182,4 giờ, thấp nhất là 26,1 giờ Lượng mưa trung bình trong năm là 1314,4 mm, cao nhất là 383,8 mm, thấp nhất là 1,7 mm ðộ ẩm trung bình trong năm là 84%, cao nhất là 91%, thấp nhất là 79% Nhìn chung, Hà Tây có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, chế ñộ nhiệt và bức xạ dồi dào, ổn ñịnh trong năm, rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển các loại cây trồng nhiệt ñới và vật nuôi

Tổng ñàn các loài vật nuôi chính ở tỉnh Hà Tây tính ñến năm 2006 gồm có: 18.300 con trâu, 161.700 con bò, 1.134.200 con lợn (trong ñó 90% là lợn lai kinh tế) và 100.070.000 con gia cầm

ðể phấn ñấu ñạt ñược mục tiêu trên, ngoài việc ñầu tư về con giống, thức ăn công nghiệp, củng cố ñịnh hình và phát triển mô hình chăn nuôi, công tác thú y cũng ñược tăng cường ở các cấp tỉnh, huyện và ngay tại các xã, phường Công tác nghiên cứu về dịch tễ học của những bệnh chủ yếu và các giải pháp phòng chống dịch bệnh, nhằm hạn chế sự thiệt hại do bệnh gây ra cũng ñặc biệt ñược quan tâm, ñáp ứng những nhu cầu cấp thiết của sản xuất Trong sản xuất chăn nuôi lợn, tỉnh Hà Tây về cơ bản ñã khống chế ñược các

bệnh ñỏ nguy hiểm bằng tiêm phòng ñịnh kỳ vacxin 2 lần mỗi năm Tuy nhiên, trong những năm gần ñây, bệnh phù ñầu vẫn xảy ra rầm rộ tại nhiều huyện trong tỉnh, gây thiệt hại ñáng kể cho ngành chăn nuôi lợn của Hà Tây

Bệnh phù ñầu ở lợn ñược phát hiện ở nước ta lần ñầu tiên ở các tỉnh ñồng bằng sông Cửu Long với tỷ lệ số ñàn bị bệnh chiếm tới 58,78%, lợn mắc bệnh chết ñến 53,54%, có nơi tỷ lệ chết ñến 90% (Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo, 1996) [7] Bệnh phát triển rầm rộ ở các tỉnh phía Bắc và các tỉnh miền Trung những năm sau ñó Nguyên nhân gây bệnh ñã ñược xác ñịnh là do vi

khuẩn E coli gây ra Bệnh xảy ra chủ yếu ở lợn, giai ñoạn sau cai sữa Lợn

mắc bệnh có các biểu hiện triệu chứng như thần kinh, sưng phù mí mắt, làm con vật chết rất nhanh, kết quả ñiều trị bằng kháng sinh không ñem lại hiệu quả, tỷ lệ chết cao, tốn kém, lợn khỏi bệnh còi cọc, chậm lớn, tiêu tốn nhiều thức ăn Hiện tại, ñã có một số vacxin thương phẩm trên thế giới có thể dùng

ñể phòng bệnh, nhưng giá thành của vacxin quá cao, không phù hợp với hình thức chăn nuôi nông hộ ở tỉnh Hà Tây Các vacxin trong nước ñang còn ở giai ñoạn nghiên cứu phát triển và hiện vẫn chưa có 1 loại vacxin phòng bệnh phù ñầu cho lợn trong toàn quốc

Gần ñây, một loại vacxin phòng bệnh phù ñầu chung cho lợn trong cả nước do Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y chế tạo cũng ñã ñược ñưa vào thử nghiệm tại 1 số trại chăn nuôi lợn thuộc tỉnh Hà Tây, nhưng cho ñến thời ñiểm này, vẫn chưa có 1 nghiên cứu nào ñánh giá ñầy ñủ về hiệu lực của vacxin ñối với việc phòng bệnh phù ñầu của lợn tại ñịa phương này Xuất phát từ tình hình ñó, chúng tôi ñã ñặt vấn ñề thực hiện ñề tài:

“Nghiên cứu ñánh giá hiệu quả sử dụng vacxin phòng bệnh phù ñầu lợn

con tại Hà Tây”

2 Mục tiêu của ñề tài:

Mục tiêu của ñề tài là ñánh giá ñược hiệu quả của vacxin phòng bệnh trong ñiều kiện chăn nuôi thực tế tại tỉnh Hà Tây, từ ñó xây dựng mô hình phòng chống bệnh thích hợp, giảm thiệt hại do bệnh gây ra và làm cho người nuôi lợn yên tâm phát triển chăn nuôi

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về bệnh phù ñầu ở lợn:

1.1.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài:

Các nhà khoa học trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về vi

khuẩn E coli và bệnh do chúng gây ra

Vi khuẩn E coli lần ñầu tiên ñược Theobald Escherich phát hiện vào

năm 1885 và ñược coi là một vi khuẩn vô hại sống trong ruột già người và ñộng vật ðến năm 1955, Schofield và Davis [58] mới chứng minh ñược vai

trò gây bệnh ñường ruột của E coli ở lợn con

Theo Sokol (1981) [67], vi khuẩn E coli từ cộng sinh thường trực trong

ñường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh vì trong quá trình sống cá thể vi khuẩn tiếp nhận ñược các yếu tố gây bệnh là các yếu tố gây dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv) và yếu tố bám dính nằm ở Pili Có 5 loại kháng nguyên bám dính ñã ñược công nhận là yếu tố kết dính trên cấu trúc Pili của

vi khuẩn E coli gồm K88ac (Stirm và cộng sự, 1967) [68], K88ab (Hohmann

và Wilson, 1975) [32], K88ad (hay còn gọi chung là F4), K99 (F5) (Smith và Ligood, 1972) [64] và 987P (F6) (Nagy và cộng sự, 1977) Ba kháng nguyên ñầu cho vi khuẩn khả năng kết dính vào tế bào thượng bì toàn bộ ruột non Kháng nguyên K99 và 987P chỉ kết dính ở tế bào thượng bì phần giữa và

phần sau của ruột non Các kháng nguyên K88 và 987P chỉ có ở vi khuẩn E coli gây bệnh trên lợn, K99 tìm thấy chủ yếu ở E coli gây bệnh trên bê Các

yếu tố gây bệnh này không ñược di truyền bằng DNA của nhiễm sắc thể mà

di truyền bằng DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể, ñược gọi là plasmid Qua hiện tượng trao ñổi di truyền bằng tiếp hợp, chính những yếu tố gây bệnh này ñã

giúp cho vi khuẩn bám dính vào ñược tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột Từ ñây, vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh là sản sinh ñộc

tố, phá huỷ tế bào niêm mạc ruột, gây dung huyết, nhiễm ñộc huyết

Smith, H.W (1963a) [61] ñã thông báo có hai loại ñộc tố là thành phần

chính của Enterotoxin ñược tìm thấy ở các vi khuẩn E coli gây bệnh Sự khác

biệt của hai loại ñộc tố này là khả năng chịu nhiệt: ðộc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST) và ñộc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT)

Những nghiên cứu về khả năng gây dung huyết của vi khuẩn E coli

cho thấy ñây là yếu tố ñộc lực quan trọng của vi khuẩn Người ta ñã phân lập ñược vi khuẩn E coli ngoài ñường ruột có tỷ lệ dung huyết cao hơn E coli phân lập ở trong ñường ruột Minshew (1978) [47] ñã phát hiện 48% số

chủng E coli phân lập ở ngoài ñường ruột có khả năng gây dung huyết, trong khi E coli phân lập từ phân chỉ có từ 8-10% các chủng gây dung huyết Evans (1973) [24] cũng cho thấy: 42% số chủng E coli phân lập từ ñường tiết niệu, 29% số chủng E coli phân lập từ máu có khả năng gây dung huyết Căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng E coli phân lập

ñược từ các thể bệnh khác nhau, Fairbrother (Fairbrother và cộng sự, 1992)

[25] ñã ñặt tên các chủng vi khuẩn E coli theo những yếu tố gây bệnh mà

chúng có khả năng sản sinh ra như: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC),

Enterophathogenic E coli (EPEC), Verotoxigenic E coli (VTEC), Adhennicia Enteropathogenic E coli (AEEC)

* Một số yếu tố gây bệnh quan trọng của vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu lợn:

1.1.1.1 Yếu tố bám dính:

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh ñều sản sinh ra 1 hoặc nhiều loại

năng này (Cater, G.R, 1995) [19]

Kháng nguyên bám dính của E coli nằm trên cấu trúc pili (fimbriae), là

một cấu trúc ngắn, thẳng, xuất phát từ một ñĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, có bản chất là protein, với số lượng khoảng 10 - 40 fimbriae/1 tế bào vi khuẩn

Có 2 loại kháng nguyên có chức năng bám dính ñặc trưng cho các

chủng vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu là F4 và F18

- F4 (K88): F4 hay còn gọi là K88 lần ñầu tiên ñược mô tả bởi Orskov

và cộng sự (1964) [55] ðây là một kháng nguyên không chịu nhiệt, không ñược sản sinh ở nhiệt ñộ 18oC

Kháng nguyên F4 giúp cho vi khuẩn bám ñược vào receptor tương ứng trên riềm bàn chải lông nhung ruột non của lợn, từ ñó vi khuẩn có thể phát triển, nhân lên ở ruột non và tiết ra các loại ñộc tố gây bệnh

- F18: Năm 1978, Bertchinger ñã phát hiện ra 1 loại fimbriae bám dính

ở các chủng E coli gây bệnh phù ñầu thuộc nhóm O139 Fimbriae này (trước kia ñược gọi là F107 hay 8813) không gây ngưng kết hồng cầu, rất ít ñược tạo

ra khi vi khuẩn ñược nuôi trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo thông thường (Bertschinger và cộng sự, 1978 [14], 1990 [16]) F18 thường gắn liền với sự sản sinh ñộc tố SLT-IIe ở các chủng VTEC

F18 không bám vào riềm bàn chải của ruột lợn sơ sinh trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cộng sự, 1992) [50] và cũng không tập trung ở lớp mucoza của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cộng sự, 1992) [20], chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột (ñiều này khác hoàn toàn với với fimbriae F5 và F6)

Sự thiếu hụt các receptor của F18 ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý

do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC ở lợn sau cai sữa (Nagy và Fekete, 1999) [52]

Khả năng bám dắnh của vi khuẩn ựường ruột là yếu tố gây bệnh vô cùng quan trọng ựể thực hiện bước ựầu tiên của quá trình gây bệnh đó là một quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt vi khuẩn với bề mặt tế bào vật chủ (Jones, 1972) [36] Hiện tượng bám dắnh của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tắnh chất lý hoá học, vừa mang tắnh chất sinh học và ựược thực hiện theo 3 bước sau:

+ Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, ựể thực hiện quá trình này, ựòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ựộng (Jones 1972) [36]

+ Bước 2: là quá trình hấp thụ Quá trình này phụ thuộc vào ựặc tắnh bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dắnh, thực hiện theo hướng thuận nghịch dưới tác ựộng của những lực tương hỗ khác nhau (Feter, 1981) [26]

+ Bước 3: là quá trình tác ựộng tương tác giữa yếu tố bám dắnh của vi khuẩn với các ựiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào vật chủ

1.1.1.2 độc tố:

Sự sản sinh ra ựộc tố ựược xem là một khả năng gây bệnh ựặc biệt quan

trọng của vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra nhiều loại

ựộc tố như: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin, trong ựó loại ựộc tố quan

trọng nhất của vi khuẩn E coli gây bệnh phù ựầu là Verotoxin

Timoney (1950) [71] ựã chứng minh rằng lợn ựược gây bệnh thực nghiệm bằng tiêm vào tĩnh mạch dịch phù nổi ựược lấy từ các chất chứa trong ruột lợn con bị bệnh phù ựầu cũng có các triệu chứng lâm sàng và bệnh tắch của bệnh phù ựầu đây là yếu tố ựộc lực không chịu nhiệt và có khả năng

trung hoà kháng thể Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn về ñộc tố này ñã bị trì hoãn trong vòng 3 thập kỷ tiếp theo do trở ngại về phương pháp nghiên cứu trên lợn và do quá trình tinh khiết ñộc tố gặp nhiều khó khăn Yếu tố ñộc lực này ñã lần lượt ñược ñặt các tên như ñộc tố gây bệnh phù ñầu, ñộc tố thần kinh Tên gọi “ñộc tố hướng thần kinh” là do tác giả Gregogy (1960) [29] ñặt ra khi phát hiện thấy sự tương tự giữa ñộc tố gây bệnh phù ñầu và ñộc tố

hướng thần kinh của loài vi khuẩn Shigella (nên còn gọi là ñộc tố tương tự

Shiga)

Tác ñộng phá huỷ tế bào do chất phù nổi của các chủng vi khuẩn E coli

gây bệnh phù ñầu trên tế bào vero ñã ñược Konowalchuck và cộng sự mô tả lần ñầu tiên (1977) [40] và sau ñó ñược Kashiwzaki và cộng sự (1981) [37], Dobrescu (1983) [23] và một số tác giả khác xác nhận lại Các chất phá huỷ tế

bào tương tự cũng ñược xác ñịnh trong các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh

từ các loài ñộng vật khác và người ðộc tố phá huỷ tế bào lần ñầu tiên ñược ñặt tên là verotoxin (VT) do tính ñộc của nó với tế bào dòng Vero, nhưng sau

ñó ñược gọi là Shiga - like toxin (SLTs) do mối quan hệ gần gũi của chúng với ñộc tố Shiga Marques và cộng sự (1987) [43] ñã so sánh ñộc tố sản sinh

ra do các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu ở lợn với các chủng sản

sinh SLTI và SLTII gây bệnh ở người và ñã kết luận rằng yếu tố ñộc lực này

là một biến chủng của SLTII nên sau ñó ñược ký hiệu là IIv hay

SLT-IIe Các chủng E coli có chứa các thông tin di truyền mã hoá cho quá trình

tổng hợp SLT - IIv giống hệt nhau với ñộ chính xác cao khi nghiên cứu bằng phương pháp PCR

Gannon và cộng sự (1990) [28] ñã cho rằng, một loại kháng nguyên của ñộc tố này cũng ñược tìm thấy trong rất nhiều chủng loại và nhóm huyết thanh, ñó là SLT-IIv Trái ngược với các loại SLT khác, SLT-IIv có tính ñộc

tố ñường ruột yếu và chỉ có 1% gây ra tích tụ các chất dịch trong ñoạn ruột non ñược thắt của thỏ thí nghiệm Các chất tiết ra của ñộc tố có tác dụng phá hủy trực tiếp các tế bào nội mô huyết quản Ngoài SLT-IIv, các SLT khác rất hiếm khi xác ñịnh ñược ở các chủng vi khuẩn của lợn không mắc bệnh phù ñầu

Một số chủng loại E coli gây bệnh phù ñầu, không chỉ sản sinh

SLT-IIv mà còn sản sinh cả STa, STb và LT Lợn bị nhiễm các chủng vi khuẩn có sản sinh SLT-IIv và LT thường chết do tiêu chảy mất nước Trong khi lợn

nhiễm các chủng E coli sản sinh SLT-IIv và STa, STb có thể chết với các dấu

hiệu khác hoặc tiêu chảy chết bất thình lình hoặc phù ñầu (Gannon và cộng

sự 1988) [27]

Có thể tóm tắt sự liên quan giữa serotyp, các yếu tố gây bệnh và các thể

bệnh do vi khuẩn E coli gây ra ở lợn như sau:

Bảng 1.1: Các chủng E coli trên lợn mang các yếu tố gây bệnh

(Fairbrother, 1992) [25]

Các yếu tố gây bệnh Serotyp Thể bệnh

Loại vi khuẩn

E coli STa STb LT VT

F4 (K88)

F5 (K99)

sơ sinh, lợn con, xuất

ETEC

O149: K91 huyết ựường

VTEC, AEEC

1.1.2 Những nghiên cứu trong nước:

Bệnh phù ựầu lợn con do vi khuẩn E coli gây ra ựã ựược rất nhiều nhà

khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu

Tô Minh Châu và Nguyễn Ngọc Hải (1999) [1] ựã bước ựầu phân lập

và ựịnh danh vi khuẩn E coli từ lợn con bị bệnh phù ựầu ở các tỉnh miền

đông Nam Bộ Các tác giả cho biết: có 2 serotype vi khuẩn E coli chủ yếu phân lập ựược từ bệnh phẩm lợn phù ựầu gồm O138: K81, O139: K82 và có tới 46,52% số chủng không xác ựịnh ựược serotype Các tác giả cũng tìm thấy 25,58% số chủng vi khuẩn phân lập ựược mang kháng nguyên K88, 30,23%

số chủng có khả năng dung huyết và tất cả các chủng này ựều có khả năng kháng kháng sinh

Nguyễn Khả Ngự (2000) [5] ựã nghiên cứu về ựặc tắnh sinh hoá học

của các chủng E coli gây bệnh phù ựầu lợn con ở ựồng bằng sông Cửu Long

cho kết quả: 90,84% số chủng ngưng kết với kháng huyết thanh K88 và 40%

số chủng phân lập ựược có khả năng gây dung huyết mạnh trên thạch máu Các chủng này ựều có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh thông thường

dùng ñiều trị bệnh do vi khuẩn ñường ruột ở nồng ñộ kháng sinh cao

Nguyễn Khả Ngự và cộng sự (2000) [6] cũng cho biết 88,33% số chủng

E coli phân lập từ lợn con mắc bệnh phù ñầu (ở ñồng bằng sông Cửu Long)

có sản sinh ñộc tố chịu nhiệt, 56,66% số chủng sản sinh ñộc tố không chịu nhiệt và 50% số chủng sản sinh cả ñộc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt trong

số 30 chủng ñược xác ñịnh ñộc tố ñường ruột

Nguyễn Ngọc Hải và Amilon (2001) [2] ñã ứng dụng thành công kỹ

thuật PCR trong nghiên cứu vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu lợn sau cai sữa Tác giả cho rằng, các chủng E coli gây phù ở lợn sau cai sữa có khả

năng tạo ñộc tố verotoxin, một số chủng còn sản sinh ñộc tố ñường ruột ST,

LT và chỉ gặp ở các chủng E coli thuộc nhóm kháng nguyên O141, không có

hoặc rất ít ở các chủng thuộc nhóm kháng nguyên O139 và O138 Tác giả còn

cho biết mặc dù 31 gốc vi khuẩn E coli ñược nghiên cứu ñều thuộc các type

kháng nguyên gây bệnh trên lợn sau cai sữa (O138, O139, O141), nhưng không phải tất cả các chủng ñều có khả năng gây bệnh này do không có các gen qui ñịnh các yếu tố ñộc lực chính gây nên sưng phù (VT2e và F18) ở lợn sau cai sữa

Phan Trọng Hổ và cộng sự (2001) [3] ñã phân lập và xác ñịnh một số ñặc tính sinh vật hoá học, các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli trong bệnh

phù ñầu lợn con tại Bình ðịnh Kết quả phân lập E coli từ bệnh phẩm có tỷ lệ khá cao, chiếm 73,83% Các chủng vi khuẩn E coli phân lập ñược có 60,16%

số chủng gây dung huyết kiểu α và β, trong ñó dung huyết kiểu α chiếm tỷ lệ 35,94% Các chủng sản sinh ñộc tố chịu nhiệt (ST) là 60%, ñộc tố không chịu nhiệt (LT) là 48% và có 44% số chủng sản sinh cả ñộc tố chịu nhiệt (ST) và ñộc tố không chịu nhiệt (LT) Số chủng có kháng nguyên bám dính K88

chiếm tỷ lệ cao: 82,86% Vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu lợn tại Bình ðịnh

thuộc 7 serotype với tỷ lệ khác nhau, cao nhất là O149 (20%), tiếp theo là O139 (17,5%), O138 (12,5%), O147 (10%), O9 (2,5%), O8 (5%) và

O157(7,5%) Các tác giả cũng cho biết vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu

phân lập ñược ñều kháng lại các loại kháng sinh như: Chloramphenicol, Penicillin, Ampicillin với tỷ lệ cao, từ 83,02 - 86,70% Một số loại kháng sinh

mà vi khuẩn E coli mẫn cảm mạnh là Neomycin (88,68%), Polymicin B

(86,79%), Furazolidon (84,91%) Nhưng dùng kháng sinh mẫn cảm ñể diều trị bệnh phù ñầu có hiệu quả thấp, tỷ lệ khỏi bình quân là 24,23%

Cù Hữu Phú và cộng sự (2004) [8] ñã nghiên cứu về bệnh phù ñầu do

vi khuẩn E coli ở Bình ðịnh và Hà Tây cho biết: trong số 197 chủng phân lập

ñược có 67 chủng dung huyết kiểu β, chiếm tỷ lệ 34,01%; 71 chủng gây dung huyết kiểu α , chiếm tỷ lệ 36,04%; 59 chủng không gây dung huyết chiếm tỷ

lệ 29,95% Các tác giả cũng cho biết các chủng E coli phân lập ñược sản sinh

ñộc tố chịu nhiệt nhiều hơn ñộc tố không chịu nhiệt, các chủng phân lập ñược mang yếu tố gây bệnh ñiển hình K88 và kháng nguyên O chủ yếu thuộc 2 serotype: O26 và O149 Từ kết quả nghiên cứu này, các tác giả ñã chọn 5

chủng vi khuẩn E coli phân lập từ lợn con mắc bệnh phù ñầu, mang ñầy ñủ

các yếu tố gây bệnh ñiển hình (K88, dung huyết, Enterotoxin, Verotoxin), có ñộc lực cao trên chuột và có khả năng gây bệnh cho lợn khoẻ ñể chế tạo 1 loại Autovacxin phòng bệnh Vacxin sản xuất ra an toàn tuyệt ñối với lợn và có hiệu lực bảo hộ cao cho lợn (>70%), thử vacxin trên diện rộng cho kết quả an toàn và hiệu lực tốt

Lê Thanh Nghị và cộng sự (2005) [4] nghiên cứu một số ñặc ñiểm dịch

tễ học của bệnh phù ñầu lợn con từ 21 - 90 ngày tuổi tại huyện Sóc Sơn, Hà Nội cho biết: lợn thường mắc bệnh vào mùa hè, chiếm 24,23% và mùa ñông, chiếm 19,27% Thời gian cai sữa cho lợn cũng ảnh hưởng ñến tỷ lệ mắc bệnh

Cai sữa cho lợn con vào lúc 45 ngày tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất (22,97%)

và cai sữa lúc 21 ngày tuổi có tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất (12,65%) Tỷ lệ mắc bệnh ở lợn ngoại cao nhất, chiếm 29,97% và lợn nội có tỷ lệ mắc bệnh thấp

nhất, chiếm 19,27% Tỷ lệ phân lập ñược vi khuẩn E coli từ bệnh phẩm lợn

mắc bệnh phù ñầu là khá cao (72,76%), trong ñó có 60% số chủng gây dung

huyết α và β Các chủng vi khuẩn E coli phân lập ñược tại Sóc Sơn mẫn cảm

cao với thuốc kháng sinh Enrofloxacin (90,47%), Oxytetracyclin (80,95%) và Norfloxaxin (71,42%) Dùng kháng sinh mẫn cảm cao ñể ñiều trị lợn mắc bệnh phù ñầu có hiệu quả 51,22%

Như vậy, trong thời gian qua, ở nước ta ñã có rất nhiều công trình

nghiên cứu về bệnh phù ñầu do vi khuẩn E coli gây ra Các tác giả ñã xác

ñịnh ñược nguyên nhân, cơ chế gây bệnh, một số ñặc tính sinh vật hoá học,

một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli và tính kháng thuốc của bệnh do

E coli gây ra Từ ñó ñề ra một số biện pháp phòng trừ như: tạo ra các loại

vacxin phòng bệnh do E coli gây ra một cách có hiệu quả cao, ñem lại lợi ích

cho người chăn nuôi nói riêng và ngành chăn nuôi lợn nói chung

1.2 Bệnh phù ñầu ở lợn do vi khuẩn E coli:

Bệnh phù ñầu (Edema Disease - ED) là một bệnh nhiễm ñộc huyết

truyền nhiễm gây ra bởi ñộc tố của một số chủng E coli trong ñường ruột

Các tên gọi như bệnh phù “Edema Disease”, sưng phù bụng “Bowel disease”, sưng phù ruột “Bowel Edema”, “Gut Edema” bắt ñầu từ chứng phù xuất hiện

ở lớp dưới niêm mạc dạ dày và màng treo kết tràng Lần ñầu tiên vào năm

1949, Timoney ñã tạo ra hội chứng phù bằng cách tiêm vào ñộng vật thí nghiệm dịch ruột của lợn chết vì bệnh này Từ ñó, tên gọi “nhiễm ñộc huyết ñộc tố ruột” ñược ñề nghị sử dụng cho sát nghĩa hơn (Schofield, 1955) [58] và ñến nay bệnh ñược gọi là bệnh sưng phù ñầu ở lợn Theo Marques và cộng sự

(1987) [43], sưng phù ñầu, hay còn ñược gọi là “bệnh phù thũng” hoặc “bệnh phù ruột” là sự tích ñọng nhiều nước dịch tại các tổ chức trong cơ thể, dịch tích ñọng ở thành dạ dày, thành ruột hoặc dưới mi mắt và ở nhiều bộ phận khác của cơ thể, song ở não là quan trọng nhất, nó gây ra các triệu chứng thần kinh

Bệnh phù ñầu ñược Shanks mô tả lần ñầu tiên vào năm 1938 [60], dựa vào các quan sát của ông qua nhiều năm ở Ireland Sau ñó, bệnh phù ñầu ñược xác ñịnh ở nhiều nước khác trên thế giới Schofield và cộng sự (1955) [58] cho biết, trước ñó bệnh ñã ñược biết ñến với tên gọi bệnh là “bệnh lảo ñảo ở lợn”, và theo dõi thấy rằng ñối với lợn ñược nuôi dưỡng bằng khẩu phần ăn hoàn chỉnh thì số lượng bị mắc bệnh tăng lên

Scholfield và cộng sự (1955) [58], lần ñầu tiên thông báo về sự xuất

hiện số lượng lớn vi khuẩn E coli dung huyết trong ruột lợn con chết vì bệnh

sưng phù ñầu Sau này, bệnh ñược Timoney (1950) [71] khẳng ñịnh lại bằng cách tiêm vào máu dịch chiết không tế bào từ môi trường nuôi cấy các chủng

E coli này Sojka (1965) [66] cũng ñã có công trình nghiên cứu chi tiết hoá ñầu tiên về bệnh này

Ngày nay, bệnh vẫn tiếp tục xảy ra ở nhiều nước trên thế giới, trong ñó

có Việt Nam, vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tất cả các giống lợn, vì vậy

có thể nói bệnh có khả năng lan rộng Hiện cũng ñã có những nghiên cứu sâu hơn về bệnh học, ñộc tố và sản xuất vacxin phòng bệnh

1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh:

Bệnh phù ñầu ở lợn là 1 bệnh truyền nhiễm Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở lợn từ 21 – 90 ngày tuổi với các triệu chứng ñiển hình là gây chết ñột ngột, thủy thũng, sưng phù ở mặt mí mắt, màng treo ruột và gây triệu chứng

thần kinh, do lợn bị cảm nhiễm bởi những serotyp E coli có khả năng sản

sinh ñộc tố Các chủng vi khuẩn E coli có khả năng tiết ra những loại ñộc tố

khác nhau và gây nên những dạng bệnh ñặc trưng cho từng typ vi khuẩn ðộc

tố Vero tiết ra bởi những chủng E coli gây phù là nguyên nhân gây nên

những triệu chứng và bệnh tích trên lợn bệnh Bằng thực nghiệm các nhà nghiên cứu ñã chứng minh ñược rằng, khi tiêm ñộc tố VT2e vào bắp thịt của lợn sau cai sữa thì ñã xuất hiện những triệu chứng và bệnh tích giống như lợn

bị mắc bệnh phù ñầu tự nhiên (Macleod và cộng sự 1991) [42]

Những chủng E coli, ngoài việc tạo ra ñộc tố Verotoxin gây sưng phù

còn mang yếu tố gây bệnh khác như là yếu tố bám dính F18, yếu tố này hoàn

toàn khác với các yếu tố bám dính ñược phát hiện trước ñây ở các chủng E coli gây bệnh cho lợn trong thời kỳ còn ñang theo mẹ (Bertschinger và 1990) [16] Yếu tố bám dính F18 có khả năng bám dính trên các tế bào nhung mao ruột (Nagy và cộng sự 1997) [51] Yếu tố này cũng có thể phát hiện ở những

chủng E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa (Wittig và cộng sự 1995) [75] Tuy nhiên, F18 lại rất ít tìm thấy ñược ở những chủng E coli gây tiêu chảy lợn sơ sinh, vì những chủng E coli có mang yếu tố F18 chỉ kết bám vào

các tế bào biểu mô ruột ở những lợn sau cai sữa, không thể kết bám lên các tế bào biểu mô ruột của những lợn sơ sinh (Nagy và cộng sự 1997) [51] ðây là

một trong những lý do giải thích tại sao bệnh phù do E coli thường chỉ thấy ở

trên lợn sau cai sữa

Bệnh sưng phù ñầu do sự phát triển của vi khuẩn E coli trong ruột non

với những chủng gây bệnh nhất ñịnh Khi tiến hành xác ñịnh serotyp của các

chủng E coli phân lập ñược từ lợn bị bệnh phù ñầu thì thấy phần lớn chúng

thuộc các nhóm O138: K81, O139: K82 và O141: K85 (Sojka và cộng sự 1957) [65], ñôi khi thấy nhóm O98 Riêng nhóm O139: K82 không thường xuyên sản sinh ra ñộc tố ñường ruột nên tiêu chảy không là triệu chứng ñặc

trưng Ngoài ra, còn 1 số chủng thuộc các serotyp kháng nguyên O gây ra các thể bệnh không ñặc trưng của bệnh phù ñầu như O1, O8, O121, O147, O149, O157 và O141: K87 (Sojka và cộng sự 1957) [65] Các serotyp O8 và O149 thường gây phù ñầu ở thể kết hợp với tiêu chảy hoặc chứng viêm dạ dày ruột truyền nhiễm trong thời gian lợn ñã cai sữa Trong vài trường hợp bệnh cấp tính hoặc ác tính có những triệu chứng, bệnh tích của sốc nội ñộc tố do vi

khuẩn E coli gây ra, những chủng gây bệnh thể này thường ñược xác ñịnh là

có yếu tố bám dính tạo ñiều kiện chiếm giữ ruột non (Moon và cộng sự 1980) [48]

Các serotyp E coli gây dung huyết thường gặp trong quần thể lợn bệnh

(Sojka và cộng sự 1957) [65], chỉ một số nhỏ tìm thấy ở các lợn thông thường Sự tác ñộng của các nhân tố như cai sữa hay thay ñổi khẩu phần thức

ăn có thể làm quần thể E coli gây bệnh trong ruột tăng lên, môi trường acid trong ruột thay ñổi là ñiều kiện cho bệnh dễ xảy ra

1.2.2 Dịch tễ học:

Bệnh phù ñầu có một số ñặc ñiểm giống với bệnh tiêu chảy ở lợn con vì trong cả 2 bệnh này, các yếu tố thuận lợi cho sự cảm nhiễm và ñịnh vị ở ruột

của E coli biểu hiện khá giống nhau Bệnh thường xuất hiện ở lợn 1- 2 tuần

tuổi trước và sau cai sữa, tuổi cảm nhiễm nhất là từ 4- 12 tuần tuổi, tuy nhiên cũng có khi bệnh xảy ra ở lợn con 4 ngày tuổi và lợn thịt, lợn nái sinh sản (Shanks 1938) [60] Tỷ lệ chết do bệnh là khá cao, từ 50-90%, có thể ñến 100% Tỷ lệ mắc bệnh biến ñộng theo từng khu vực khác nhau, có ñàn lên ñến 80%, trung bình là 30-40% (Timoney, 1950 [71], Sweeney, 1976 [69]) Thường ở những nơi nuôi lợn thực hiện cai sữa sớm cho lợn con thì tỷ lệ mắc bệnh sưng phù ñầu sẽ giảm (Wilson và cộng sự., 1986) [74] Diễn biến bệnh kéo dài trong khoảng thời gian từ 4-14 ngày Trong ñàn cùng lứa ñẻ, bệnh

thường không quá 3 ngày Lợn nái có thể mang trùng và bội nhiễm khi ñẻ lần

thứ hai (Kyriakis và cộng sự 1997) [39] Lợn con mẫn cẩm với các chủng E coli gây bệnh nhiều hơn ở lợn lớn, nếu vệ sinh chuồng trại tốt thì sẽ làm giảm

E coli gây bệnh trong ñường ruột của lợn Bệnh sưng phù ñầu phát triển rất nhanh, nhất là ở những lợn khoẻ mạnh trong cùng lứa tuổi (Shanks 1938) [60] Trong chăn nuôi lợn, nếu sử dụng khẩu phần ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ làm tăng số lượng và ñộc lực của vi khuẩn ñường ruột nói

chung và vi khuẩn E coli nói riêng Ngoài ra, E coli gây dung huyết còn có

khả năng sử dụng ñường Succrose ñể sinh trưởng và phát triển, cho nên, khi lợn bị bệnh, nếu cho ăn thức ăn chứa nhiều glucid sẽ làm số lượng vi khuẩn ở trong ñường ruột tăng lên

Môi trường chuồng trại là nguồn lây nhiễm quan trọng nhất Lợn con

sơ sinh có thể nhiễm bệnh từ trong chuồng lợn ñẻ và mang mầm bệnh sang chuồng nuôi cai sữa Một số biện pháp vệ sinh, sát trùng, tẩy uế chuồng trại không ñủ ñể cắt ñứt chu kỳ lây bệnh (Hampson và cộng sự, 1987) [33] Tuy nhiên, thực tế trong chăn nuôi thực nghiệm, có thể ngăn ngừa lây bệnh bằng các biện pháp vệ sinh triệt ñể (Smith và Hall, 1968) [63] Theo Wathes và cộng sự (1989), trong thực nghiệm bệnh có thể lây qua không khí là rất phổ biến với các chủng có mang yếu tố bám dính F4

Sự mẫn cảm của lợn ñối với bệnh có liên quan ñến di truyền Vi khuẩn

E coli gây bệnh trong ñường ruột bằng cơ chế bám dính và ñộc tố gây phù (EDP) tác ñộng có hại lên ñộng mạch và tiểu ñộng mạch Nhân tố di truyền của lợn ñóng một vai trò quan trọng trong khả năng mẫn cảm Sellwood và cộng sự (1975) [59] ñã giải thích cơ chế này là có hoặc không có sự hiện diện của ñiểm tiếp nhận trên tế bào nhung mao ruột, làm cho kháng nguyên F4

bám dính của E coli gây bệnh ñược kiểm soát bởi các nhân tố di truyền Tác

giả tách nhân tố di truyền thành hai kiểu hình ở lợn là: “dính” và “không dính”, khi nó chấp nhận hoặc không chấp nhận việc kết dính của các chủng vi khuẩn có yếu tố bám dính trên niêm mạc ruột Các kiểu hình là sản phẩm của hai gen alene cùng trên một locus ñơn, di truyền bằng một cách thức ñơn giản theo quy luật Mendel và dính là tính trội

Một số theo dõi cho thấy khả năng mẫn cảm ñược xác ñịnh trên một số dòng lợn Khả năng mẫn cảm với ñộc tố gây phù ñóng một vai trò quan trọng trong dịch tễ học của bệnh Một số lợn lớn (khoảng 40kg) và lợn sơ sinh cũng mẫn cảm với EDP Vì vậy, ñã có những nghiên cứu về sự xuất hiện bệnh trên những con lợn còn rất nhỏ và lợn trưởng thành Từ những nghiên cứu này cho thấy, tính mẫn cảm với EDP có thể tồn tại trong một khoảng tuổi rộng hơn rất nhiều so với bệnh xảy ra trong tự nhiên Các yếu tố stress trong thời gian cai sữa cũng có liên quan ñến mức ñộ bệnh phù ñầu (Timoney 1950) [71] Sự kết hợp của EDP trong thời kỳ cai sữa với yếu tố stress là ñiểm nổi bật trong dịch

tễ học của bệnh và làm rõ sự cư trú, sinh sản của các chủng E coli gây bệnh

trong ruột lợn mẫn cảm Những yếu tố stress liên quan ñến nuôi dưỡng, chăm sóc trong thời kỳ cai sữa như: vận chuyển, thay ñổi khẩu phần thức ăn và thời tiết v.v ñã ảnh hưởng khả năng phát bệnh Nếu lợn bị nhiễm lạnh sẽ làm

giảm sự nhu ñộng của ruột, gia tăng sự sinh sản của vi khuẩn ñường ruột E coli ñến những mức ñộ trầm trọng (Swords và cộng sự 1993) [70] Lợn con

có bố mẹ từ ñàn mắc bệnh phù ñầu có thể mẫn cảm với bệnh nhiều hơn (Sweeney và cộng sự 1976) [69] Sự cảm nhiễm bệnh ở các lứa ñẻ cũng khác nhau, một số lứa có số con mắc bệnh cao, những lứa khác thấp hoặc không

có

1.2.3 Sinh bệnh học:

1.2.3.1 Sự lây nhiễm:

Sự lây nhiễm của lợn mẫn cảm có thể thực hiện thông qua việc ăn thức

ăn qua ñường miệng Thông thường, môi trường acid của dạ dày là không

thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn E coli ðộ pH trong

dạ dày ñược ở lợn con ñã cai sữa giai ñoạn 5- 6 tuần tuổi thường tăng cao hơn

so với những lợn con ñang bú sữa Chính việc này ñã làm cho số lượng E coli

có trong thức ăn ñi qua môi trường acid của dạ dày vào trong ruột ñược nhiều hơn ðiều này ñã giải thích tại sao lợn cai sữa mẫn cảm ñặc biệt với trực

khuẩn E coli gây bệnh ñường ruột

1.2.3.2 Nguyên lý gây bệnh:

Nhiều tác giả cho rằng ñộc tố chính gây nên bệnh phù ñầu là một loại nội ñộc tố Trong thực nghiệm, khi tiêm dịch ruột lấy từ các lợn bị bệnh phù ñầu ngoài tự nhiên cho lợn thì thấy lợn bị chết từ 18- 72 giờ sau khi tiêm (Timoney 1950) [71] Những vi khuẩn có khả năng gây bệnh ñược xem là có chứa EDP, thường có chứa nội ñộc tố, nó có thể nhận ra bởi các tác ñộng tức thời trên lợn ñược nhiễm bệnh Chứng huyết áp cao cấp tính phát triển vào khoảng 40 giờ sau khi gây bệnh Áp lực máu tăng lên nhanh chóng, ñến 200 mmHg, các triệu chứng mất thăng bằng xuất hiện, vì thế chứng huyết áp cao

là nguyên nhân gây thương tổn thần kinh và chết ở bệnh phù ñầu Triệu chứng

ở não xuất hiện cùng chứng huyết áp cao cấp tính ở các con vật thí nghiệm,

do làm mất cơ chế tự ñiều chỉnh của luồng máu trong não, kết quả là “Sự tăng kết nối” và sự sưng phù, gây nên tổn thương trong mô não (Skinhoj và Strandgaard, 1973)

Sưng phù mí mắt có thể quan sát ñược từ 24- 30 giờ sau khi tiêm EDP trước sự xuất hiện của chứng huyết áp cao và các dấu hiệu về thần kinh Sưng phù có thể là một biểu hiện của bệnh ñộng mạch, nhưng cơ chế chính xác của

sự hình thành này vẫn chưa ñược xác ñịnh 1 cách rõ ràng

Hình 2.1 Sinh bệnh tổng quát của bệnh phù ñầu lợn do VTEC gây ra

(Theo Trần Thanh Phong, (1996) [9])

Ngoại ñộc tố (SLT-IIv)

Yếu tố kết dính (F107) Nội ñộc tố

Sốc nội ñộc tố

Xuất huyết

Bệnh tích nội mạc mao mạch

Không có tác ñộng ñộc tố ñường ruột

Thẩm thấu mạch máu

E coli nhân lên ở ruột

Thủy thũng não

Triệu chứng thần kinh Thủy thũng ngoại vi

1.2.4 Triệu chứng lâm sàng:

Lợn bệnh thường bị chết trước khi có những dấu hiệu về triệu chứng lâm sàng Một số lợn bệnh khác thì có biểu hiện rối loạn về vận ñộng hoặc nằm dài, ñạp chân liên tục Lợn bệnh có thể biểu hiện kêu khản tiếng hay thay ñổi tiếng kêu do thanh quản bị phù Những biểu hiện triệu chứng này cũng có thể quan sát thấy ở các lợn ñược gây bệnh thực nghiệm

Smith và Hall (1968) [63] gây bệnh cho lợn theo con ñường uống bằng

chủng vi khuẩn E coli 0141: K85ac Các biểu hiện ñầu tiên là lợn biếng ăn,

xuất hiện khi số lượng vi khuẩn trong phân khoảng 109 vi khuẩn/g vào ngày thứ 3 sau khi gây bệnh Những triệu chứng này xuất hiện ở 20/21 lợn gây bệnh thực nghiệm Triệu chứng kém ăn xuất hiện ở 19 lợn cho ñến khi chết ðến ngày thứ 4, sau khi gây bệnh thực nghiệm, xuất hiện hiện tượng tiêu chảy trong thời gian ngắn với tỷ lệ tử vong là 1/17 lợn tiêu chảy ðến ngày thứ 6 thì triệu chứng thần kinh xuất hiện và hiện tượng tiêu chảy mất hẳn, biểu hiện là sưng mí mắt, rối loạn vận ñộng triệu chứng này ngày càng nặng, thậm chí con vật liệt hoàn toàn và khó thở ðến ngày thứ 7 thì lợn chết, nhưng nhiệt ñộ ở trực tràng vẫn luôn giữ ở mức bình thường

Bệnh thường gây chết ñột ngột 1 hay nhiều lợn trong ñộ tuổi mẫn cảm (Smith 1963b) [62] Xuất hiện các triệu chứng lâm sàng trên hệ thần kinh và

hệ thống vận ñộng Dấu hiệu ñặc trưng nhất là hệ thống mạch máu thiếu kết hợp nhịp nhàng, làm cho dáng ñi lảo ñảo (Timoney, 1950) [71], thể hiện ở hai chi sau, hai chi trước, hoặc tứ chi, khớp của các cổ chân hai chi trước Các quá trình hoạt ñộng thiếu kết hợp dẫn ñến hoàn toàn mất cân bằng, liệt và nằm

tư thế tựa Lợn mất cân bằng thường xuất hiện các ñợt run rẩy, chạy loạng choạng hay những chuyển ñộng chèo qua lại giữa các chân Timoney và cộng

sự (1980) [72] cho rằng biểu hiện các triệu chứng có thể tăng hoặc giảm ở

các ca bệnh cụ thể, lợn có thể chết trong vài phút hay thoi thóp vài ngày sau khi có các dấu hiệu về thần kinh Kiểm tra lâm sàng thấy sưng phù mắ mắt trước khi mắc phải các dấu hiệu thần kinh, sưng dưới da (có thể mở rộng từ

mắ mắt cho ựến xương trán), xung huyết kết mạc Trong ựiều kiện gây bệnh thắ nghiệm, sưng phù mắ mắt có thể tìm thấy từ 12- 36 giờ trước khi các biểu hiện về thần kinh xuất hiện đôi khi sưng phù còn biểu hiện ở mô dưới da trong hàm dưới, ngực, bụng hay vùng âm hộ, có thể thấy cả xuất huyết trên

da Lợn thường kêu khàn giọng do sưng thanh quản Khó thở là triệu chứng nổi bật của lợn sắp chết

Thân nhiệt của lợn nhiễm bệnh thường ở mức bình thường khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng, nhưng ựôi khi có sốt nhẹ trong thời kỳ ựầu của bệnh (Timoney, 1950) [71] Triệu chứng tiêu chảy có thể xảy ra trước các dấu hiệu sưng phù ựầu 1- 2 ngày (Smith và cộng sự 1968) [63] Các dấu hiệu sốc nội ựộc tố làm cho các triệu chứng về lâm sàng càng phức tạp thêm Trong

những trường hợp như vậy, các chủng E coli thường có khả năng sản sinh cả

tra sưng phù ở lớp dưới niêm mạc dạ dày bằng cách mổ khám các thanh mạc, tương mạc ñường cong lớn Cần phân biệt triệu chứng sưng phù của bệnh do

E coli gây ra với triệu chứng viêm phù nề ñi kèm với viêm loét cấp tính vùng thực quản tâm vị, thường các vết loét này xuất hiện ở vùng ven thực quản tâm

vị ở cả 2 bên, còn bệnh sưng phù ñi kèm theo là ở dưới niêm mạc quanh hạch tâm vị Túi mật ñôi khi cũng có biểu hiện sưng phù Màng treo kết tràng thường xuyên xuất hiện triệu chứng sưng phù nhất, ñôi khi ở ruột non hay trực tràng có biểu hiện sưng phù lớp dưới niêm mạc (Shanks, 1938) [60] Trong các trường hợp gây bệnh thực nghiệm, lớp dưới niêm mạc của kết tràng cũng xuất hiện hiện tượng sưng phù (Nielson, 1986 [53], Clugston, 1974 [22]) Trong xoang bụng có chứa sợi huyết và huyết thanh Các hạch lâm ba ở ruột và màng treo ruột có mức ñộ biến ñổi bệnh tích khác nhau, từ bình thường cho ñến sưng, sưng phù và xung huyết

Trong dạ dày lợn bệnh có chứa ñầy thức ăn khô, trông còn mới, còn ở ruột non tương ñối rỗng, chất chứa giảm ñến mức thấp Trong thực nghiệm, các nhà khoa học còn thấy lợn bị bệnh có thể ăn rất ít trong vòng 48 giờ trước khi chết, nhưng khi mổ khám thức ăn lại chứa ñầy dạ dày (Smith và Halls 1968) [63] Bên cạnh ñó, cũng có nghiên cứu cho rằng lợn bị bệnh phù ñầu cũng bị táo bón

Xoang màng phổi và xoang bao tim chứa ñầy dịch, 2 lá phổi bị sưng phù ở mức ñộ khác nhau Xoang ngoài tim có chứa nhiều dịch, lẫn cả sợi tơ huyết; thượng tâm vị và màng trong tim có xuất huyết ñiểm (Timoney và

cộng sự 1950) [71] Nếu chủng E coli gây bệnh có khả năng sản sinh ra cả

ñộc tố ñường ruột thì hiện tượng tiêu chảy sẽ gia tăng Trong trường hợp này, niêm mạc dạ dày bị xung huyết, xuất huyết, kết hợp với hiện tượng huyết khối mao mạch, làm sưng hạch bạch huyết màng treo ruột, xung huyết niêm mạc

ruột, tích máu ở nội tạng, xung huyết từng vết ñốm, xung huyết niêm mạc ruột nghiêm trọng và phù túi mật

Bệnh tích ở mạch máu xuất hiện vào ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm với

sự sưng phồng lên của tế bào nội mô (endothelial cell), có nhiều fibrin ở lớp dưới nội mô (sub-endothelial), thủy thũng quanh mạch, hình thành những sợi huyết tương rất nhỏ (microthrombus), hoại tử ở lớp áo giữa (tunicamedia) và tăng sinh những tế bào nội mô, có thể có hủy hoại thần kinh (plexuse) ở lớp dưới niêm mạc Sự phá hủy mạch máu ở thần kinh trung ương gây triệu chứng thần kinh

1.2.5.2 Bệnh tích vi thể:

Kiểm tra bệnh tích ở những nơi phù thũng bằng kính hiển vi ñiện tử cho thấy không có biến ñổi bệnh tích viêm ở mô gian bào vì không tìm thấy bạch cầu Bệnh tích vi thể quan trọng nhất là sự thoái hóa mạch máu bệnh lý

ở ñộng mạch và tiểu ñộng mạch (Kurtz và cộng sự 1969 [41], Clugston và cộng sự, 1974 [22]) Bệnh tích này còn thấy ở nhiều cơ quan và mô, ñặc biệt

là ở vùng mạng lưới ñộng mạch phân bố ở màng treo kết tràng, quanh các hạch lympho ruột (Tzipori và cộng sự 1989) [73] Tổn thương ñầu tiên là hoại tử các tế bào cơ trơn lớp áo giữa với hiện tượng kết ñặc nhân hoặc vỡ nhân làm thay ñổi tính chất ở các thành phần tế bào chất Ở một số mạch máu

bị tổn thương, có thể thấy sự thấm xuất fibrin Cũng có thể thấy sự trương lên của các tế bào nội mô và nếu bệnh kéo dài có hiện tượng tăng sinh các tế bào trung gian và các tế bào ngoại lai Tổn thương mạch máu khó phát hiện ở các trường hợp cấp tính, nhưng ở những con lợn sống sót hoặc không biểu hiện triệu chứng lâm sàng, các tổn thương này khá rõ ràng (Kausche, 1992) [38]

Trong gây bệnh thực nghiệm, bằng cách cho ăn thức ăn có vi khuẩn E coli

gây bệnh, khi tiến hành kiểm tra tiểu ñộng mạch dưới kính hiển vi ñiện tử

thấy hiện tượng sưng nội bì, hình thành khơng bào và tăng sinh, huyết khối nhỏ hoại tử (Methiyapun và cộng sự, 1984) [46]

Ở lợn đã hồi phục sau khi mắc bệnh tự nhiên hoặc sống sĩt sau vài ngày bị bệnh cấp tính, cĩ thể quan sát thấy các hiện tượng như nhũn não ở cuống não và tổn thương ở động mạch nhỏ và tiểu động mạch (Kurtz và cộng

sự 1969) [41] Một số trường hợp cấp tính cịn phát hiện thấy phù màng não tuỷ và vùng xung quanh mạch máu (Harding, 1986)

1.2.6 Chẩn đốn:

Chẩn đốn bệnh sưng phù đầu cấp tính cĩ thể dựa trên một số đặc điểm

về dịch tễ học như hiện tượng xuất hiện đột ngột các triệu chứng lâm sàng về thần kinh ở lợn từ 1- 2 tuần sau cai sữa Ở lợn cịn sống, chẩn đốn quan trọng nhất là sự kém ăn và đi lảo đảo, phù dưới da vùng hốc mắt và vùng xương trán

Chẩn đốn vi khuẩn học: Tiến hành phân lập vi khuẩn từ chất chứa ruột non và ruột già trên các mơi trường nuơi cấy cĩ thể phát hiện thấy các vi

khuẩn E coli gây dung huyết Các typ vi khuẩn E coli dung huyết phân lập

phổ biến là: O138: K81 và O141: K85 Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn cĩ thể giảm trong những trường hợp bệnh kéo dài (Bertschinger và cộng sự 2000

[17], Bertschinger và Pohlenz, 1983 [15]) Sau khi lợn chết, vi khuẩn E coli

cĩ thể bị lấn át bởi một số vi khuẩn đường ruột khác Vì vậy, điều quan trọng

là phải phân loại typ huyết thanh học vì cĩ những chủng E coli dung huyết

nhưng khơng cĩ khả năng gây bệnh cũng cĩ thể được tìm thấy rất nhiều trong đường ruột của lợn (Smith, 1963a) [61]

Bệnh sưng phù đầu ở mức cấp tính hoặc mãn tính đều được chẩn đốn dựa trên biểu hiện bệnh tích ở động mạch và những tổn thương ở não Bệnh

thể bị chết do sốc nội độc tố Khi lợn cĩ biểu hiện triệu chứng thần kinh, cần chẩn đốn phân biệt với bệnh viêm não do virus viêm màng não, do vi khuẩn

và mất nước Cĩ thể tiến hành các kiểm tra tổ chức học niêm mạc của ruột non, xem các nhung mao cĩ bị teo hay khơng

1.2.7 Phịng và điều trị bệnh:

1.2.7.1 Phịng bệnh:

ðể phịng bệnh phù đầu cĩ hiệu quả, cần phải thực hiện các biện pháp tổng hợp với phương châm tăng cường tốt khả năng miễn dịch của lợn con và giảm đến mức thấp nhất khả năng tiếp xúc với vi khuẩn Cĩ thể dùng kháng sinh trộn vào thức ăn để ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

- Miễn dịch thụ động:

Cĩ thể phịng bệnh bằng việc sử dụng những kháng thể được tạo ra bởi các yếu tố bám dính hoặc độc tố Lợn được cung cấp kháng thể tạo ra từ sự gây nhiễm yếu tố bám dính F18 cĩ thể được bảo hộ khỏi bệnh này (Nollet và cộng sự 1999) [54] Kháng thể thu được từ việc gây miễn dịch bằng độc tố VT2e cĩ thể bảo vệ lợn khỏi tác động của độc tố Vero với liều 1 LD50 tiêm tĩnh mạch (Johansen và cộng sự 1997) [35] Miễn dịch thụ động này phụ thuộc vào liều lượng kháng thể được tiêm cho lợn (Matise và cộng sự 2001) [45] Việc bảo vệ lợn bằng miễn dịch thụ động cịn cĩ thể thực hiện bằng cách

sử dụng những chủng vi khuẩn tái tổ hợp cĩ khả năng tổng hợp các yếu tố tiếp nhận đặc hiệu đối với độc tố Vero hoặc trung hồ độc tố Vero khi độc tố được sản sinh ra (Paton và cộng sự 2001) [56]

- Miễn dịch chủ động:

ðộc tố Vero bất hoạt đã được sử dụng để chế vacxin, kính thích miễn dịch, tạo kháng thể để chống lại bệnh, tuy nhiên, cĩ thể gây nên các hiệu ứng

phụ, ảnh hưởng ñến tăng trưởng và bệnh tích ở thể phi lâm sàng của những lợn ñược tiêm vacxin (Gordon và cộng sự 1992) [30] Một số nhà nghiên cứu khác ñã tìm cách gây ñột biến trên gen quy ñịnh việc tổng hợp ñộc tố Vero ñể tạo nên những chủng vi khuẩn tái tổ hợp, có thể sản sinh ñộc tố Vero, nhưng ñộc tố ñó lại không có tính chất ñộc hoặc rất ít ñộc Loại ñộc tố ñược tạo ra theo phương pháp này ñã ñược chứng minh là ñã tạo ñược trên ñộng vật thí nghiệm một sự ñáp ứng miễn dịch nhất ñịnh (Bosworth và cộng sự 1996) [18] Ngoài ra, những kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu với các tiểu phần A hoặc

B của ñộc tố Vero có thể ngăn ngừa triệu chứng thần kinh trên những lợn thí nghiệm ñược tiêm ñộc tố Vero (Mukherjee và cộng sự 2002)[49]

ðể chống lại bệnh phù ñầu do E coli gây ra, có thể sử dụng các vi khuẩn sống có mang yếu tố bám dính F18 nhưng không có khả năng gây bệnh Những vi khuẩn sẽ ñược sử dụng như là một vacxin cho uống qua ñường miệng (Alexander và cộng sự 1995) [13] Nhưng hiệu quả phòng bệnh bằng loại vacxin này cũng không cao do việc tổng hợp yếu tố bám dính F18 trong ñiều kiện nuôi cấy nhân tạo thường không tốt và tồn tại nhiều kiểu yếu

tố bám dính F18 khác nhau như: F18ab, F18ac Những yếu tố này có thể gây ngưng kết chéo nhưng lại không tạo ñược hiệu quả miễn dịch chéo Ngoài ra, còn 1 số khó khăn khác như làm cách nào có thể cung cấp cho tất cả lợn một lượng vi khuẩn vừa ñủ, nhanh chóng, dễ dàng ñể ñủ tạo ñáp ứng miễn dịch cũng là 1 vấn ñề còn tiếp tục phải nghiên cứu

1.2.7.2 ðiều trị:

Mục ñích của ñiều trị là giảm thiểu số lượng vi khuẩn E coli gây bệnh trong ruột ðối

với lợn bệnh ñã có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng thì biện pháp này là quá muộn

Còn với những cá thể ñang ủ bệnh hoặc chứa E coli gây bệnh ñang tiềm ẩn thì có thể làm giảm thiểu số lượng E coli trong ruột bằng kháng sinh

ðối với những lợn cĩ biểu hiện triệu chứng sưng phù đầu: ðiều trị trong trường hợp này là phải làm giảm bớt các tổn thương ở mạch, giảm áp lực của máu, tránh gây chứng sưng phù não Khi đã chẩn đốn bệnh đúng bệnh, phải chăm sĩc để giảm sự phát triển và lây lan về mặt lâm sàng, cĩ thể trộn kháng sinh vào trong thức ăn, nhưng phải biết mức độ mẫn cảm của loại kháng sinh đĩ, tránh hiện tượng kháng thuốc Sự hạn chế lượng thức ăn đạm

và tăng thêm chất xơ vào trong khẩu phần cho lợn cũng rất cĩ hiệu quả trong điều trị Những hướng trị liệu nhằm tăng tỷ lệ nhu động, tốc độ vận chuyển của thức ăn qua ruột non và giảm những căng thẳng do mơi trường bên ngồi

là vấn đề rất quan trọng Cĩ thể sử dụng các loại thuốc tẩy ruột để làm tăng

tính nhu động hay tác động tẩy rửa và qua đĩ làm giảm mật độ của E coli gây

bệnh trong đường ruột

ðiều trị bệnh chỉ cĩ hiệu quả khi chưa con vật bị bệnh chưa bị nhiễm độc máu Do sự phát triển quá nhanh của bệnh nên các biện pháp điều trị

thường kém hiệu quả Sử dụng kháng sinh với mục đích làm giảm lượng E coli ở ruột cĩ nguy cơ gây sốc nội tố đường ruột do sự phá hủy lượng lớn vi khuẩn Vì vậy các phương án điều trị phải giải quyết được 3 vấn đề sau:

1) Tiêu diệt vi khuẩn E coli gây bệnh

2) Chống xuất huyết phù nề do độc tố (Verotoxin)

3) Giảm khả năng bài xuất độc tố do vi khuẩn bị tiêu diệt bằng kháng sinh

Một số thuốc kháng sinh cĩ thể dùng để điều trị như: Neomycin, Colistin, Rifamycin, Ciprofloxacin…

Một số thuốc giảm viêm và chống xuất huyết như: vitamin C, vitamin

K, Dexamethazol…

Một số thuốc giảm huyết áp và chống phù nề não như: Melperone, Caviton vinpocetin

Chương 2 - NỘI DUNG - đỊA đIỂM - NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu:

2.1.1 Kết quả theo dõi tình hình lợn mắc bệnh phù ựầu tại tỉnh Hà Tây trong năm 2006:

2.1.1.1 Tỷ lệ lợn mắc và chết do bệnh phù ựầu

2.1.1.2 Sự phân bố tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi lợn

2.1.1.3 Các triệu chứng và bệnh tắch ựặc trưng của các lợn mắc bệnh phù ựầu tại Hà Tây

2.1.1.4 Kết quả kiểm tra trong phòng thắ nghiệm ựối với một số mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh phù ựầu tại Hà Tây

2.1.2 đánh giá ựộ an toàn và hiệu lực của vacxin trên ựộng vật thắ nghiệm 2.1.3 Kết quả xác ựịnh hiệu giá kháng thể hình thành ở lợn sau khi tiêm vacxin

2.1.4 Kết quả thử nghiệm vacxin tại một số trại chăn nuôi thuộc tỉnh Hà Tây

2.1.5 đề xuất quy trình tiêm phòng vacxin E coli phòng bệnh phù ựầu cho lợn tại tỉnh Hà Tây

2.2 địa ựiểm nghiên cứu:

- Các trại và hộ chăn nuôi lợn thuộc tỉnh Hà Tây

- Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y Quốc gia

- ðối tượng nghiên cứu: Các lợn trong ñộ tuổi 21-90 ngày nuôi tại các trại và nông hộ thuộc tỉnh Hà Tây

- Các môi trường hoá chất thông thường trong phòng thí nghiệm dùng

ñể nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E coli như thạch máu, thạch MacConkey, nước thịt thường, môi trường BHI

- Vacxin phòng bệnh phù ñầu lợn do Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y sản xuất

- Hồng cầu cừu, nước PBS, glutaraldehyde 1%,

- ðộng vật dùng cho thí nghiệm:

+ Chuột nhắt trắng khỏe mạnh có trọng lượng 18 – 20 g/con

+ Lợn trong ñộ tuổi từ 21 – 90 ngày

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Phương pháp ñiều tra:

- Sử dụng phương pháp ñiều tra hồi quy, kết hợp với một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ khác như: mô tả, phân tích và tổng hợp

2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh và xác ñịnh các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập ñược:

- ðược xác ñịnh theo quy trình chuẩn của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú

- Kiểm tra an toàn trên chuột bạch: chọn 15 chuột khoẻ mạnh tiêm vacxin với liều 0,2 hoặc 0,5 ml/con (gấp 2,5 lần miễn dịch) Theo dõi 10 ngày Chuột ñược thử an toàn ñều phải sống khoẻ mạnh qua thời gian 10 ngày theo dõi, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm

- Kiểm tra hiệu lực trên chuột bạch: mỗi lô vacxin chọn 10 chuột khoẻ mạnh, mỗi con tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da Sau 21 ngày, chuột tiêm miễn dịch cùng với 5 chuột ñối chứng ñem thử thách với chủng cường ñộc liều 10LD50 cho 1 chuột Toàn bộ chuột ñược theo dõi 10 ngày Ở lô thí nghiệm, yêu cầu là ít nhất phải có 70- 90% số chuột ñược bảo hộ Trong khi ñó, các chuột ñối chứng sau khi công cường ñộc ñều chết 100% trong vòng 24 - 48

giờ và ñều phân lập ñược vi khuẩn E coli từ máu tim các chuột chết

2.4.4 Phương pháp tiêm thử nghiệm trên lợn ñể ñánh giá hiệu lực phòng

Chọn những lợn khoẻ mạnh có cùng ñộ tuổi (14 -15 ngày tuổi) trong cùng 1 cơ sở chăn nuôi, chia làm 2 lô: Lô thí nghiệm và lô ñối chứng

+ Lô thí nghiệm 1: Tiêm cho lợn vacxin ñược chế tạo tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y 2 lần: lần 1 lúc 14 ngày tuổi và lần 2 lúc 21 ngày tuổi Liều

1 ml/con/lần vào dưới da gốc tai

+ Lô ñối chứng: Không tiêm vacxin

Trước và sau khi tiêm vacxin, tiến hành lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của các lợn tại các thời ñiểm: 0 ngày, 7 ngày, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng và 6 tháng ñể thực hiện phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu, xác ñịnh hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh ðồng thời, theo dõi các phản ứng của lợn sau khi tiêm

2.4.5 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng kháng thể trong máu của lợn bằng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu:

- Theo quy trình của JICA chuyển giao cho Viện Thú Y

- Hồng cầu cừu ñược lấy trong ngày trong dung dịch có chứa chất chống ñông Alsever Ly tâm ở 2500 rpm trong 10 phút và tiến hành rửa 3 lần bằng dung dịch PBS (pH=7.2) Sau lần rửa cuối cùng, hồng cầu cừu ñã ñược pha loãng 25% ñược tiến hành trộn với 1 thể tích tương ñương dung dịch Glutaraldehyde 1% Lắc nhẹ ở 4oC trong vòng 30 phút

- Kháng nguyên và hồng cầu cừu 10% ñã qua xử lý ñược trộn với nhau theo 1 thể tích tương ñương Ủ ở tủ ấm 37oC trong 1,5-2 giờ

- Huyết thanh lợn: Pha loãng ở nồng ñộ 1/10

* Tiến hành phản ứng:

- Phản ứng ñược thực hiện trên ñĩa nhựa 96 lỗ, ñáy tròn

- Cách tiến hành như sau:

+ Cho vào tất cả các giếng 25 µl dung dịch PBS

+ Nhỏ 25 µl huyết thanh ñã ñược pha loãng ở nồng ñộ 1/10 vào giếng thứ 1, trộn ñều, chuyển 25 µl từ giếng thứ 1 sang giếng 2 và cứ làm như vậy ñến giếng thứ 7 thì bỏ ñi 25 µl ðộ pha loãng huyết thanh của các giếng sẽ lần