Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và khả năng chống rối loạn trao đổi lipid của dịch chiết từ hạt loài đậu đen (vigna cylindrica (l )) trên mô hình chuột đái tháo đường thực nghiệm

Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen Vigna cylindricaL.trên mô hình chuột ĐTĐ type 2...15 2.3.5.. Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ hạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN

PHẠM THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG RỐI LOẠN TRAO ĐỔI LIPID CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẠT LOÀI ĐẬU ĐEN • • •

('Vigna cylindricaịL.) TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT ĐÁI

THÁO ĐƯỜNG THỤC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • •

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Ngưòi hưóng dẫn khoa học TS

TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Trần Thị

Phương Liên khoa Sinh - KTNN trường Đại học sư phạm Hà Nội

2 đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cùng với các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh - KTNN - trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, phòng Hóa sinh - bệnh viện Hữu nghị Việt

Xô, trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyến giao công nghệ cùng với phòng Thí nghiệm Hóa sinh - trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợigiúp tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp

đỡ, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 thảng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Phương

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu và kết quả

nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chưa có ai công bố sử dụng để bảo

vệ một học vị nào từ trước đến nay

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những nội dung được đề cập trong bảnkhóa luận này

Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện

LỜI CAM ĐOAN Phạm Thị Phương

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 NỘÌ dung nghiên cứu 2 NỘI DUNG 3

Chương 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hạt loài Đậu đen (Vigna cyỉìndricaỉ(L.) 3

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hình thái, phân bố 3

1.1.2 Thành phần hóa học 3

1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý 3

1.2 Bệnh béo phì 4

1.2.1 Định nghĩa 4

1.2.2 Phương pháp đánh giá 4

1.2.3 Phân loại 4

1.2.4 Nguyên nhân gây béo phì 5

1.2.5 Biến chứng của béo phì 5

1.3.Bệnh đái tháo đường 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Phân loại 7

1.3.3 Biến chứng và tác hại của bệnh đái tháo đường 8

1.3.4 Tiêu chí chẩn đoán đái tháo đường 9

1.3.5 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam 9

1.3.6 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường 10

1.4.Rối loạn trao đổi lipid 11

1.4.1 Khái niệm 11

1.4.2 Phân loại 11

1.4.3 Nguyên nhân và triệu chứng rối loạn lipid 11

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Mầu thực vật 12

2.1.2 Mầu động vật 12

2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 13

2.2.1 Hóa chất 13

2.2.2 Các dụng cụ thí nghiệm 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu đen 13

2.3.2 Phương pháp nuôi chuột béo phì 13

2.3.3 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo type 2 14

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.) trên mô hình chuột đái tháo đường type 2 14

2.3.4.1 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2 14

2.3.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.)trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 15

2.3.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh 15

2.3.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết 16

2.3.5.2 Định lượng triglycerid huyết thanh theo phương pháp enzyme 16

2.3.5.3 Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh theo phương pháp enzyme 17

2.3.5.4 Định lượng HDL-C 18

2.3.6 Phương pháp xử lí số liệu 18

3.1 Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm 203.2 Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 243.3 Tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen trên mô

hình chuột BP thực nghiệm 253.4 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna

cyỉindricaỉ(L.) đến nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột ĐTĐ 273.5 Tác dụng đến chuyến hóa lipid của hạt loài Đậu đen (Vigna

cỵlindrical(L.) trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 29KẾT LUẬN 31TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

BP :Béo phì

CHCL3 :Choloroform

ĐC :Đối chứng

ĐTĐ :Đái tháo đường

ĐTĐKĐT :Đái tháo đường không điều trị

WHO :TỔ chức y tế Thế giới

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á 5

Bảng 1.2 Tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ theo Tổ chức Y tế Thế giới 9

Bảng 2.1 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.) 15

Bảng 3.1 Trọng lượng trung bình tính theo (g) của hai nhómchuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau 20

Bảng 3.2 So sánh một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột bằng hai chế độ ăn khác nhau 22

Bảng 3.3 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trước và sau khi tiêm STZ 24

Bảng 3.4 So sánh trọng lượng của các lô chuột BP trước và sau khi điều trị 26 Bảng 3.5 Ket quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen đến chuột ĐTĐ sau 21 ngày điều trị 28

Bảng 3.6 So sánh một số chỉ số lipid máu ởchuột ĐTĐ trước và sau điều trị bằng cao phânđoạn CHCL3 vàcaophân đoạn EtOH 29

Hình 2.1 Hình thái hạt Đậu đen (Vigna cỵlindricaỉ(L.) 12

Hình 2.2 Mau chuột nuôi với hai chế độ ăn khác nhau (thí nghiệm) 12

Hình 3.1 Biểu đồ tăng trọng lượng của chuột trong 6 tuần 21

Hình 3.2 Biểu đồ một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột nuôi bằng hai chế độ ăn khác nhau 23

Hình 3.3 Biếu đồ nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm (72h) 25

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khối lượng của các lô chuột BP trước và sau khi điều trị 26

ngày điều trị 28Hình 3.6 So sánh một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị bằng cao phân đoạn CHCL3 và cao phân đoạn EtOH 30

Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn

đề lớn cho sức khỏe vì bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trong quá trình trị liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ.ĐTĐ loại 2 (type 2) là một chứng bệnh mãn tính phát triển khi tuyến tụy khôngsản xuất đủ insulin hoặc khi các mô trong cơ thể không thể sử dụng insuliun một cáchbình thường [3]

Bệnh ĐTĐ là hậu quả của tình trạng béo phì và thừa cân quá mức

ĐTĐ còn gây ra nhiều biến chứng như: mù mắt, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não, suy thận, cưa chân

Y học hiện đại ngày nay có nhiều loại thuốc chống ĐTĐ và rối loạn trao đổi lipid khá hiệu quả như: Insulin, Metformin, Fluoxiten Tuy nhiên chúng thường có tác dụng phụ không mong muốn và chi phí điều trị đắt đỏ [10].

vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu phát triển các loại thuốc nguồn gốc thảo dược với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và ít có tác dụng phụ Với nhiều người đậu đen không chỉ là thực phẩm mà còn có nhiều công dụng phòng, chữa bệnh rất hiệu quả [6 ] Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và khả năng chống rối loạn trao đối lipid của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna

cylỉndrical(L.) trên mô hình chuột đái tháo đường thực nghiệm

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ hạt loài đậu đen đến hàm lượng glucose huyết và một số chỉ số lipid máu ở chuột ĐTĐ type 2 nhằm tạo cơ sở cho việc tìm kiếm và sản xuất thực phẩm chức năng từ thảo dược có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh

BP và ĐTĐ

3 NỘÌ dung nghiên cửu

3.1 Tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đường

3.2 Xác định liều độc cấp LD50 của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna

cyỉỉndricaỉ(h.)

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng lượng, nồng độ glucose, lipid

NỘIDUNG Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrical^L.)

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hình thái, phân bố

Đậu đen (Vỉgna cỵlindrical(L.) có nguồn gốc ở Châu Phi, từ đó lan sang Trung

Á, Ân Độ và nhiều khu vực khác của Châu Á

Đậu đen là cây thân thảo, sống hàng năm Thân cao 50-100 cm, phân nhiều cành, toàn thân không lông Lá kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn

lá chét hai bên Hoa màu tím nhạt, quả giáp dài, đường kính tròn, trong chứa 7-10 hạt màu đen Hạt có vỏ màu đen, nhân hạt trắng hoặc xanh

Hiện nay cây Đậu đen được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và kể cả Hoa Kỳ

1.1.2 Thành phần hóa học

Thành phần chủ yếu của hạt Đậu đen: glucid 53%, protein 24%, lipid 1,7%, các vitamin A, Bl, B2, pp, c, ngoài ra còn giàu acid amin và các nguyên tố vô cơ: Ca,

p, Fe

Tăng cường năng lượng cho cơ thể và ổn định lượng đường huyết Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng on định lượng đường trong máu Trường hợp cơ thể kháng insulin

Trong đó:

mắc bệnh ĐTĐ thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuốicùng on định lượng đường huyết

Theo y học cổ truyền có rất nhiều sách viết về tác dụng chữa bệnh của đậu đen Sách Bản thảo Đường tân tụ nói rằng đậu đen chữa được thủy thũng Sách Bản thảo Thập di nói rằng đậu đen còn chứa được chứng phong tê thấp, nếu ăn lâu ngày thì đẹp nhan sắc Bản thảo Cương mục cho rằng, nước đậu đen có thế bố thận, giải được độc

- Béo phì đơn thuần: Là do năng lượng được hấp thu vào cơ thể nhiều vượt quá mứccần thiết dẫn đến tình trạng tích lũy mỡ.

- Béo phì bệnh lí: Là do bệnh lí như một số bệnh nội tiết như hội chứng Cushing khiến lượng hormon cortisosteroid trong cơ thể quá cao, buồng trứng đa năng, suy tuyến giáp trạng [8]

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Au và Châu A

Mức độ thể trọng Người trưởng thành Châu Âu

Người trưởng thành ChâuÁ

1.2.4 Nguyên nhân gây béo phì

- Ăn nhiều: vượt quá nhu cầu cơ thể thường là nguyên nhân BP (95%).

- Hoạt động thể lực kém: ít vận động.

- Nguyên nhân do thuốc: gần đây, thuốc được thêm vào danh mục nguyên nhân

của các yếu tố BP, bởi vì gia tăng dược liệu pháp

- Nguyên nhân di truyền: 69% người béo phì có bố hoặc mẹ béo phì; 18% cả bố

lẫn mẹ đều béo phì, chỉ có 7% là có tiền sử gia đình không ai BP

- Nguyên nhân nội tiết: Hội chứng Cushing, cường insulin do u tụy tiết insulin,

tăng ăn ngon, ăn nhiều và tân sinh mô mỡ, giảm hoạt tuyến giáp, tăng tiêu glucid

1.2.5 Biển chứng của béo phì

Biến chúng về chuyển hóa:

- Chuyển hóa acid uric: acid uric máu thường tăng, có lẽ có liên quan đến tăng triglyceride máu cần chú ý đến sự tăng acid uric đột ngột khi điều trị nhằm giảm cân,

có thể gây cơn Gout cấp tính (do thoái giáng protein)

- Chuyến hóa lipid: triglyceride huyết tương thường tăng trong BP Sự tăng lipoprotein có liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid nói trên làm cho gan sản xuất nhiều VLDL hơn Cholesterol máu ít khi ảnh hưởng trực tiếp bởi BP nhưng nếu có tăng cholesterol trước đó thì dễ làm tăng LDL HDL thường giảm khi có triglyceride tăng

- Chuyển hóa glucid: có tình trạng kháng insulin, tăng tiết insulin, phát hiện qua nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống bị rối loạn, dễ dẫn đến bệnh ĐTĐ, vì vậy BP là một yếu tố nguy cơ của ĐTĐ

Biến chứng về nội tiết: tăng insulin máu, tăng đề kháng insulin và ĐTĐ type2, giảm số lượng và chất lượng insulin, kích thích tế bào beta do ăn nhiều glucid Chức năng nội tiết sinh dục: giảm khả năng sinh sản

Biến chứng ở phổi: giảm chức năng hô hấp Hội chứng Pickwick: ngưng thở khi ngủ, tăng hồng cầu

Biến chứng về xương khớp: tại các khớp chịu lực cao (khớp gối, khớp hang, cột sống) dễ bị đau, thoái khớp, thoát vị đĩa đệm, trượt đốt sống

Biến chứng tim mạch: BP là một trong những yếu tố nguy cơ cho bệnh lý tim mạch như: tăng huyết áp , huyết áp giảm khi giảm cân Suy mạch vành, suy tim, tai biến mạch máu não

1.3 Bệnh đái tháo đường

1.3.1 Khái niệm

- Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng rối loạn chuyến hóa cacbohydrat có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin hoặc do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin

WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối

loạn chuyến hóa mà điến hình là bệnh ĐTĐ Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoành hành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI” [1].

1.3.2 Phân loại

Dựa vào những tiến bộ khoa học trong những năm gần đây ĐTĐ được phân loại dựa vào hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh

- ĐTĐ type 1 (còn gọi là tiếu đường phụ thuộc insulin): Chiếm 5 - 10%, thường gặp

ở người dưới 40 tuổi Ở loại này, sự bài tiết insulin bị tiêu hủy do sự phân hủy tự miễn tế bào p của đảo tụy Langerhans nơi tiết insulin Các giai đoạn trong ĐTĐ type 1:

• Giai đoạn 1: Bản chất di truyền, nhạy cảm gene

• Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn

• Giai đoạn 3: Phát triến một loạt các kháng thế

• Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào p đảo tụy

• Giai đoạn 5: ĐTĐ lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào p đảo tụy Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến chứng [7]

ĐTĐ type 2 (còn gọi là tiểu đường không phụ thuộc insulin): Chiếm 90

-95% tổng số bệnh nhân tiểu đường, thường xảy ra với những người lớn tuổi, hoặc những người thừa cân, béo phì Ở loại này, insulin được bài tiết bình thường, lưu thông trong máu nhưng không có tác dụng do có quan hệ chặt chẽ với tính kháng insulin ở cơ quan đích ĐTĐ type 2 diễn biến qua 3 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bìnhthường, nhưng

có hiện tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

• Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng tăng glucose huyết sau ăn

• Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng

glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài.

Cùng với hai dạng phổ biến trên còn có các dạng ít gặp hơn:

- ĐTĐ thai kì: Chiếm khoảng 3 - 8% tổng số phụ nữ mang thai mắc ĐTĐ thai kì Là tình trạng rối loạn dung nạp glucose huyết lần đầu tiên phát hiện trong thai kỳ Bao gồm cả các trường họp đái tháo đường đã có từ trước nhưng chưa được phát hiện Phụ

nữ bị ĐTĐ thai kỳ có nhiều khả năng phát triển thành bệnh ĐTĐ type 2 sau này [1]

- ĐTĐ thứ phát ở một số bệnh (bệnh về tụy hoặc phụ thuộc những hormon khác với insulin), nhưng ĐTĐ gây ra do điều trị ĐTĐ liên quan đến dinh dưỡng

Cũng có trường hợp dung nạp không hoàn toàn glucose, tình trạng trên có thể coi là tình trạng tiền ĐTĐ

1.3.3 Biến chứng và tác hại của bệnh đái tháo đường

Neu không được điều trị tốt, bệnh tiểu đường gây ra nhiều biến chứng có thể làm bệnh nhân tàn phế, thậm chí tử vong

- Biến chứng cấp tính: Do đường huyết tăng cao, có thể gây hôn mê nhiễm cetone hayhôn mê do tăng áp lực thấm thấu Neu không được điều trị kịp thời có thể dẩn đến tử vong Hạ đường huyết là biến chứng cấp tính, thường do quá liều thuốc, insulin gây nên Có thế do bệnh nhân nhịn đói, kiêng khem quá mức hay do uống nhiều rượu Neukhông được điều trị kịp thời có thể hôn mê và thậm chí tử vong

• Biến chứng mắt: Bệnh lý võng mạc (27,8%), đục thủy tinh thể (6,1%),

tăng sinh gây mù lòa (1,1%) _

• Biến chứng thần kinh: Biến chứng thần kinh ngoại biên do ĐTĐ gây mất cảm

giác ở chân, gây đau nhức, tay hay dị cảm, tê .là nguy cơ của nhiễm trùng chân đưa đến đoạn chi.

• Biến chứng thận: microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận từ

độ 1 đến độ 4 (3,5%)

1.3.4 Tiêu chí chẩn đoán đái tháo đường

Tiêu chí của WHO về chẩn đoán ĐTĐ

Bảng 1.2 Tiêu chỉ chẩn đoán ĐTĐ theo Tổ chức Y tế Thế giới

Kết luận

Đường huyết lúc đói

Đường huyết 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết

Đường huyết tạithời điếm bất kì

ĐTĐ >7mmol/l >1 l,lmmol/l

>1 l,lmmol/l kèm theo triệu chứng uống nhiều, đái nhiều và gây sốt

Rối loạn dung

nạp đường

>5,6mmol/lvà<7mmol/l

>7,8mmol/l vàcl l,lmmol/l

Bình thường <5,6mmol/l <7,8mmol/l

1.3.5 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam

* Trên thế giói

Theo WHO: năm 1995 thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4% dân số thế giới, năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 350 triệu người, chiếm 6% Các nước đang phát triển sẽ phải hứng chịu hậu quả nghiêm trọng của căn bệnh này bởi tốc độ phát triển của nó có thể lên tới 170%

ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm nhưng được coi là đại dịch bởi tốc độ phát triến nhanh chóng nhất trên thế giới, chủ yếu là các nước đang phát triến (trong đó có Việt

Nam) Nó đang là gánh nặng cho sự phát triển kinh tế, xã hội và sức khỏe của con người toàn thế giới trong thế kỷ 21.

* Ỡ Việt Nam

Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời Khu vực nông thôn trước đây thường rất ít thì nay bệnh đã trở nên phổ biến do quá trình đô thị hóa

Ở nước ta, đối tượng mắc bệnh ĐTĐ thường ở độ tuổi từ 30-65, tuy nhiên hiện nay có những bệnh nhân ĐTĐ mới chỉ 9-10 tuổi, điều này phản ánh sự trẻ hóa của bệnh Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến

và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ

1.3.6 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến mối quan hệ giữa BP và ĐTĐ type 2 bao gồm:chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thế, chỉ số khối cơ thế, thời gian béo phì Một thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thế >30kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người BP dưới 5 năm, và nếu trọng lượng

cơ thế tăng lkg thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% Đây chính là cơ sở để Reed

và cộng sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [12], [13]

Béo phì và ĐTĐ là hai căn bệnh không truyền nhiễm nguy hiếm nhất của thế

kỉ 21, chúng có mối quan hệ chặt chẽ với nhau Một cuộc khảo sát ở Mĩ gần đây chỉ

ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP Béo phì có liên quan đến ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng lên 100ỊJM thì mức đề kháng insulin tăng lên khooảng 5-10% [3]

1.4 Rối loạn trao đỗỉ lipid

1.4.1 Khái niệm

Rối loạn lipid máu là tình trạng tăng cholesterol, triglycerides (TGs) huyết tương hoặc cả hai, hoặc giảm nồng độ lipoprotein phân tử lượng cao, tăng nồng độ

lipoprotein phân tử lượng thấp làm gia tăng quá trình xơ vữa động mạch.

1.4.3 Nguyên nhân và triệu chứng rối loạn lipid

Nguyên nhân gây rối loạn lipid máu có thể là thứ phát (do thói quen ăn uống, sinh hoạt hoặc một số bệnh lý) hoặc nguyên phát (do các bệnh về gen) Rối loạn lipid máu thường không có triệu chứng đặc trưng Hầu hết là những triệu chứng “mượn” của các cơ quan khác Bệnh nhân có thể biểu hiện bằng các triệu chứng của bệnh tim mạch như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu ngoại biên

Hình 2.2 Mẩu chuột nuôi vói hai chế độ ăn khác nhau (thí nghiệm)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mau thực vật

Bộ phận sử dụng hạt Đậu đen ( Vigna cylindricalL.)

2.1.2 Mẩu động vật

Chuột nhắt trắng Mus musculus chủng Swiss 6 tuần tuổi (17 - 20g) và thức

ăn chuẩn cho chuột do viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

- Đậu đen (Vigna cỵlindricaỉ(h.)

Hình 2.1 Hình thái hạt Đậu đen (Vigna cylindricalL.)

- Máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa OLYMPUS AU 640, Nhật.

- Máy quang phổ uv - VIS 1000

- Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác

-Tủ sấy Memert, Đức

- Máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra và que thử của công ty Johnson - Johnson - tập đoàn Lifescan của Mỹ

- Máy li tâm eppendorf, li tâm lạnh

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài đậu đen

Từ 3000g hạt Đậu đen (Vigna cỵỉindrical(L.) sấy khô được ngâm với ethnol 96% ở

nhiệt độ phòng 22°c trong vòng 14 ngày (quá trình được lặp lại

3 lần) Gộp dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất loại dung môi dưới bóng điện

220V- 220w chúng tôi thu được cao tổng số ethnol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, chloroform, ethylacetate các dung môi dưới bóng điện 220V - 220W thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng

2.3.2 Phương pháp nuôi chuột béo phì Chuột nhắt trắng chủng Mus musculus

(17 - 20g) được nuôi giống nhau về không gian và thời gian nhưng với 2 chế độ ăn khác nhau, lô thí nghiệm cho ăn thức ăn giàu lipid, còn lô đối chứng cho ăn thức ăn chuẩn của Viện vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

Sau thời gian 4-6 tuần, tiến hành cân trọng lượng của các lô chuột nuôi thí

nghiệm, từ đó so sánh mức độ tăng trọng của các lô chuột được nuôi theo 2 chế độ ăn

khác nhau kể trên.

2.3.3 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo type 2

Chuột cho nhịn ăn 16h trước khi tiêm STZ STZ được pha trong đệm citrate (0,0IM, pH 4,5) và giữ lạnh trong khi sử dụng

Chuột gây bệnh được tiêm màng bụng dung dịch STZ ( lOmg/ml) với liều lượng duy nhất lOOmg/kg thể trọng Đối chứng chỉ tiêm citrate Sau khi tiêm cho chuột ăn bình thường

Xác định nồng độ glucose huyết của chuột trước và sau 72h tiêm STZ Chuột xem như đã mắc ĐTĐ khi nồng độ glucose huyết lúc đói >13,9mmol/l

Chuột nuôi béo phì được gây đái tháo đường type 2 bằng tiêm STZ dưới màng bụng Sau 3 - 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ đường huyết > 18mmol/lit

2.3.4 Phương pháp nghiên cúĩi tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.) trên mô hình chuột đái tháo đường type 2

2.3.4.1 Phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng type 2

Chuột nuôi béo phì được gây đái tháo đường type 2 bằng tiêm STZ (1

lOmg/kg pha trong đệm citrate 0.0IM, pH = 4,3) dưới màng bụng, gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2 phát triến từ béo phì Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 12 giờ Sau đó chúng được tiếp nhận nước và thức ăn bình thường Sau từ 3-4 ngày những con chuột bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xác định > 18mmol/l [7], [8] Tiếnhành phân các lô chuột đã bị bệnh để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu đen

Bảng 2.1 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn

dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.)

L

ô Chê độ ăn trước khi điêu trị Phương pháp điêu trị Liêu uông

1 Thức ăn chuân Uông nước cât, không điêu trị

2 Thức ăn béo Ưông nước cât, không điêu trị

3 Thức ăn béo Ưông cao phân đoạn ethanol 2000mg/kg/ngày

4 Thức ăn béo Uông cao phân đoạn n-hexan 2000mg/kg/ngày

5 Thức ăn béo ưông cao phân đoạn EtOAc 2000mg/kg/ngày

6 Thức ăn béo ưông cao phân đoạn nước 2000mg/kg/ngày

Chuột bị bệnh uống điều trị các phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu đen và

metformin, được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở các thí

điểm khác nhau ( 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) trong vòng 21 ngày (3 tuần)

2.3.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ hạt loài Đậu đen (Vigna cylindrica(L.)trên mô hình chuột ĐTĐ type 2

Các lô chuột đái tháo đường type 2 (10 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hàng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ hạt đậu đen với liều 2000mg/kg Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày

thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, 14, 21 khi điều trị

2.3.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglyceride, HDL- c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động

(Phòng hóa sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô)

2.3.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết

Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ KIT thử tương ứng (One Touch, Johnson & Johnson, USA)

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên phản ứng đặc hiệu của Glucose oxidase (GOD) có sẵn bộ KIT thử với Glucose trong máu tạo thành acid gluconic và H202

(phản ứng 1) H202 tạo thành peroxydase phân hủy giải phóng oxi, oxi hóa o - Dianisidin tạo phức chất màu vàng nâu (phản ứng 2) Glucose + H202 + 02 —> Acid Gluconic + H202 (Phản ứng 1)

o - Dianisidin + H202 —► Phức họp nâu vàng -I- H202 (Phản ứng 2)

Cường độ màu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng

Phương pháp tiến hành

Ấn nút điều khiển để khởi động máy Gắn que thử vào máy

Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiến thị trên màn hình

2.3.5.2 Định lượng triglycerỉd huyết thanh theo phương pháp enzyme Nguyên lý:

Thủy phân triglyceride bang enzim lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 -

chlorophenol phản ứng với hydrogen peroxidaza theo các phản ứng sau:

Kết quả: Đo mức độ quang học quinonimine ở bước sóng 546nm

(máy Olympus AU400) rồi so sánh với chuẩn

Lipase

Triglycerid -► Glycerol + acid béo

Glycerol kinase Glycerol +

2H2O2+ 4-amino-Antipyrin + 4-chloro-Phenol -► Quinonimin + HC1 + 4H20

2.3.5.3 Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh theo

phương pháp enzyme

Nguyên lý: Thủy phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol

esterase (CHE) và oxy hóa bang cholesterol oxydase (CHO) Đo mật

độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide

với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase theo

các phản ứng:

cholesterol esterase Cholesterol

este + H20 -►

cholesterol + acid béo

cholesterol oxidase Cholesterol + O2

Cholesterol-3-one+ H2O2

- ► _

peroxidase (POD)

2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol * Quinonimin +

H20

Kết quả: So mật độ quang học của quinonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus

AU400) với chuẩn

2.3.5.4 Định lượng HDL-C

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm 2 bước đặc hiệu Bước thứ nhất cholesterol trong

chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu, Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự

có mặt của chat surfactant đặc hiệu cho HDL