ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia

Do đó, đề tài “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia” đã được thực hiện nhằm bước đầu nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN

TRÊN BÃ BIA

LỚP: VSV K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN

TRÊN BÃ BIA

LỚP: VSV K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM ƠN -* -

Qua thời gian thực hiện luận văn đã giúp em rèn luyện khả năng làm việc độc lập, học cách tiếp cận với những vấn đề mới Để hoàn thành được đề tài này có sự đóng góp không nhỏ của Quý thầy cô, bạn bè và người thân Qua đây em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu và truyền đạt nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em học tập tại trường

Xin cảm ơn các anh chị, các bạn của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ thông tin

và tài liệu trong quá trình học tập

Kính chúc Quý thầy cô, các anh chị và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống

Ngày 20 tháng 11 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trung Duẩn

TÓM LƯỢC

Ở Việt Nam, hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng bã bia thải ra một cách có hiệu quả mà chỉ dừng lại ở việc dùng làm thức ăn thô cho gia súc hoặc làm phân bón Bã bia chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid amin, vitamin, canxi, photpho, kali, sắt, kẽm,…) rất thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật trong đó có nấm men Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật xử lý bã bia và sản xuất các sản phẩm từ bã bia sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao nhờ tận dụng được các phụ phế

phẩm để tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng Do đó, đề tài “Ảnh hưởng của các yếu

tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia” đã được thực hiện

nhằm bước đầu nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia Các thí nghiệm đã được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy (độ pha loãng

bã bia, nồng độ rỉ đường bổ sung, pH, mật số nấm men ban đầu) lên quá trình tăng sinh khối của nấm men trên bã bia Mật số nấm men được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng bã bia trong môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men là 30 g/l Sinh khối nấm men tăng rõ rệt và khác biệt có ý nghĩa thống kê khi bổ sung 3% rỉ đường Mật

số nấm men ban đầu thích hợp là 10 4 tế bào/ml và đạt 10 8 tế bào/ml sau 48 giờ nuôi cấy Nghiên cứu cho thấy có thể sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae từ nguồn dinh dưỡng còn lại trong bã bia, mở ra hướng sản xuất thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng từ nguồn phụ phẩm này

Từ khóa: bã bia, nấm men, Saccharomyces cerevisiae, sinh khối

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM ƠN

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae 2

2.1.1 Phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm hình thái 2

2.1.3 Thành phần cấu tạo 3

2.1.4 Sinh trưởng và sinh sản 5

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của nấm men 7

2.1.6 Quá trình trao đổi chất của nấm men 8

2.3 Bã bia 9

2.3.1 Tổng quan về bã bia 10

2.3.2 Thành phần hóa học 10

2.4 Rỉ đường 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Phương tiện nghiên cứu 14

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 14

3.1.2 Dụng cụ 14

3.1.3 Hóa chất 14

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Quy trình chung cho các thí nghiệm 15

3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men 16

3.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men 17

3.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men 17

3.2.5 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật số nấm men giống đến khả năng tạo sinh khối nấm men theo thời gian 18

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men 19

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường đến khả năng tạo sinh khối nấm men 21

4.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men 23

4.4 Ảnh hưởng của mật số nấm men giống đến khả năng tạo sinh khối nấm men theo thời gian 25

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2 Kết quả

Phụ lục 3 Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisise 3

Bảng 2 Hàm lượng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisise 8

Bảng 3 Thành phần bã malt 9

Bảng 4 Thành phần trung bình của tro 10

Bảng 5 Thành phần hóa học của mầm malt 10

Bảng 6 Giá trị thức ăn gia súc của mầm malt (trong 100 kg mầm malt) 10

Bảng 7 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía 11 Bảng 8 Kết quả đếm mật số thí nghiệm 1 PL2 Bảng 9 Kết quả đếm mật số thí nghiệm 2 PL2 Bảng 10 Kết quả đếm mật số thí nghiệm 3 PL2 Bảng 11 Kết quả đếm mật số thí nghiệm 4 PL2

Bảng 12 Mật số tế bào S cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các độ pha loãng bã bia khác

nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) .PL3

Bảng 13 Mật số tế bào S cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các nghiệm thức bằng phương

pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) .PL3

Bảng 14 Mật số tế bào S cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các pH khác nhau bằng

phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) .PL3

Bảng 15 Mật số tế bào S cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các nghiệm thức mật số giống

khác nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) .PL3

Hình 14 Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae PL1 Hình 15 Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi PL1 Hình 16 Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trường bã bia ở các thời

điểm nuôi cấy PL1

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển, sản lượng bia được tạo ra với một số lượng lớn, kéo theo lượng bã bia thải ra cũng tăng Một

số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia ướt hoặc khô và men bia khô Bã bia chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid amin, vitamin, calcium, photpho, kali, sắt, kẽm,…) rất thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật trong đó có nấm men, và trong tế bào nấm men lại chứa rất nhiều các chất dinh dưỡng có giá trị nổi bật như protein và vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm

B Hàm lượng protein của nấm men dao động trong khoảng từ 40 – 60 % vật chất khô

tế bào Protein nấm men gần giống protein có nguồn gốc từ động vật, chứa khoảng 20 acid amin, trong đó có đủ các acid amin thiết yếu Vì vậy, nấm men được sử dụng để tạo ra men chiết xuất được sử dụng như là một chất điều vị trong chế biến thực phẩm hay làm thành phần cung cấp nguồn nitơ và các chất kích thích sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy vi sinh Men chiết xuất gồm các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và kinh

tế cao như dịch chiết nấm men (yeast extract), dịch tự phân nấm men (yeast autolysate), dịch vách tế bào nấm men (yeast cell wall), hay dịch chiết nấm men chứa nucleotide tự nhiên

Ở Việt Nam, hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng bã bia thải ra một cách có hiệu quả mà chỉ dừng lại ở việc dùng làm thức ăn thô cho gia súc hoặc làm phân bón Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật xử lý bã bia và kỹ thuật sản xuất các sản phẩm từ bã bia sẽ mang lại hiệu quả kinh tế nhờ tận dụng hiệu quả các sản phẩm phụ để

tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Từ đó, đề tài “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia” được đưa ra nhằm bước đầu nghiên cứu ứng dụng sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định các mức độ thích hợp về độ pha loãng bã bia, nồng độ rỉ đường bổ sung,

pH, mật số tế bào nấm men ban đầu cho sự phát triển của sinh khối nấm men trong môi

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae

Loài: Saccharomyces cerevisiae

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae ngày 30/07/2013)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae

(*Nguồn: www.khoahoc.com.vn ngày 30/07/2013)

Nấm men Saccharomyces có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6 -8 µm x 5-6 µm Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước

nhỏ, từ 5-14 µm, là loại nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, gồm có nấm men chìm

và nấm men nổi :

- Nấm men chìm (lager): hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi Hình dạng chủ yếu là hình cầu

- Nấm men nổi (ale): tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với nhau tạo thành chuỗi tế bào nấm men Hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc ovan với kích thước 7-10 µm

Khuẩn lạc thường có màu trắng hoặc màu kem khi được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng rắn Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh, trừ khi được nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn (Lương Đức Phẩm, 2006) Nếu môi trường giàu dinh

dưỡng, nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình bầu dục, trong điều kiện yếm khí

có hình tròn và tế bào kéo dài hơn trong điều kiện hiếu khí

2.1.3 Thành phần cấu tạo

Nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm những thành phần chủ yếu sau:

- Vách tế bào: chiếm 26 - 32 % trọng lượng khô của tế bào Có chứa protein, lipid

và ít nhất 2 loại polysaccharide, mannan, glucan và glycogen Glycogen trong vách tế bào không có chức năng như thành phần cấu trúc Mannan liên kết với protein hiện diện trong tế bào Vách tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài là màng nhẵn, dày 10-30 nm gồm chủ yếu lipoprotein, lớp tiếp theo chứa phức hợp mannan protein dày 100nm, lớp trong cùng dạng keo và sợi li ti dày từ 10 - 250 nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucose

và 6% hexoamin (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000)

Bảng 1 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisise

(Klis Frans et al., 2006)

- Màng tế bào: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein, photpholipid, giữ vai trò điều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào

- Tế bào chất: gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme khác nhau, đảm bảo sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cấu tử khác nhau như bộ máy Golgi, lyzosome, không bào Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy

ra trong ty thể cũng nằm trong tế bào chất Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin di truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào Nhân nấm men có phần trên là trung thể và centrochrometin và phần đáy của nhân có thêm không bào, bên trong chứa 6 cặp nhiễm sắc thể và bên ngoài màng nhân

có nhiều ti thể bám quanh Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào

- Nhân: được bao bọc một lớp màng, bên trong là dịch nhân và hạch nhân Nhân chứa protein và acid nucleic Trong trạng thái lên men, nhân tăng từ 20 đến 30 lần so

với trạng thái hô hấp Nhân của Saccharomyces cerevisiae chứa 17 cặp nhiễm sắc thể

DNA trong tế bào có khối lượng phân tử là 1x1010 Da (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

- Không bào: không bào thường xuất hiện lúc tế bào nấm men bị già Trong không bào chứa các enzyme thủy phân, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

- Ty thể: có vai trò như nhà máy cung cấp năng lượng cho tế bào

Hình 2 Cấu tạo của nấm men Saccharomyces cerevisiae

*Nguồn: http://en.angelyeast.com/ (ngày 30/07/2013)

2.1.4 Sinh trưởng và sinh sản

- Sinh trưởng

Cũng như các vi sinh vật khác, quá trình sinh trưởng của nấm men gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong

Hình 3 Đường cong sinh trưởng của quần thể nấm men

trong môi trường nuôi cấy

*Nguồn: http://www.sinhk33.com (ngày 13/10/2013)

 Pha lag (pha tiềm phát)

Trong pha tiềm phát nấm men hầu như không sinh sản do nấm men còn thích nghi với môi trường mới, trong đó, một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể bị chết Số lượng nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể nhưng sự trao đổi chất của chúng diễn ra mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng đáng kể, hàm lượng protein, acid nucleic đều tăng lên Các enzyme thích ứng cũng được tổng hợp mạnh mẽ Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng trẻ thì pha tiềm phát càng ngắn Có thể cấy một lượng giống lớn các tế bào khỏe làm cho pha này rút ngắn

và giống có thể phát triển ngay sau khi cấy Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi nấm men đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại

 Pha logarid (pha log)

Trong pha này nấm men sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý, nói chung không thay đổi theo thời gian

Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”

 Pha ổn định (pha cân bằng)

Trong pha này quần thể nấm men ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi Kết quả là số tế bào sống không tăng cũng không giảm Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc độ sinh trưởng của nấm men cũng giảm Do đó việc chuyển từ pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần Nguyên nhân tồn tại của pha

ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất)

 Pha suy vong

Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm) Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha suy vong Sự chết của tế bào

có thể nhanh hay chậm và có liên quan đến quá trình tự phân Nguyên nhân của pha suy vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên quan đến điều kiện bất lợi của môi trường Trong trường hợp môi trường tích lũy các acid là nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ hiểu Nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết của hàng loạt tế bào Ngoài đặc tính của bản thân chủng nấm men, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha suy vong Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong như deaminase, decarboxylase, các amylase và protease ngoại bào Ngoài chức năng xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác cho quá trình phân giải

- Sinh sản:

Nấm men có thể sinh sản vô tính thông qua mọc chồi hoặc hữu tính thông qua sự hình thành của nang bào tử Chồi nấm men được bắt đầu khi tế bào mẹ đạt tới một kích thước tới hạn cùng lúc với sự khởi đầu sinh tổng hợp DNA Tiếp theo là làm yếu đi một

vị trí trên vách tế bào, cùng với sức căng bề mặt do áp suất, cho phép phun tế bào chất vào trong vùng giới hạn bởi vật liệu của vách tế bào mới Trong quá trình sinh sản vô tính, chồi mới phát triển từ nấm men mẹ khi các điều kiện thích hợp và sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của nấm men trưởng thành thì nó tách ra khỏi nấm men mẹ Khi các điều kiện dinh dưỡng kém các nấm men có khả năng sinh sản hữu tính sẽ tạo ra các nang bào tử

 Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính ở nấm men thường gặp nhất là nẩy chồi, khi một chồi hoàn chỉnh sẽ phát triển ngay, ở đó chồi sẽ nối liền với tế bào mẹ và khi chồi rời ra tế bào mẹ gọi là điểm sinh sản

 Sinh sản hữu tính: Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh dục mà chúng sinh

ra hai tế bào dinh dưỡng mà nhiệm vụ giống như các giao tử Quá trình hợp tế bào chất

và hợp nhân xảy ra và thành lập tế bào nhị bội, nang và cuối cùng là bào tử nang thành lập trong nang (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010) Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân nhưng thường là 8, bào tử nang được giải phóng, nảy mầm

để hình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây chúng sinh sản vô tính bằng sự nẩy chồi hay phân đôi

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của nấm men

Nấmmen rất giàu chất đạm, chất khoáng, chất xơ, sinh tố và khoáng chất Ngoài

ra, nấm men còn chứa các polysaccharid (mannan, glucan), sterol (ergosterol, zymosterol) có giá trị cao Ngoài việc cung cấp nhiều dưỡng chất bổ dưỡng, người ta còn dùng men tươi, men khô (còn sống) để uống giúp điều hòa môi trường ruột, trị nhiều rối loạn tiêu hóa, biến dưỡng đường ruột Nấm men thường được dùng để trị tiêu chảy, giúp ăn ngon miệng, mụn trứng cá và là nguồn cung cấp vitamin B Nấm men có những tác dụng chống lại các vi khuẩn độc hại ở ruột, nấm men làm giảm lưu lượng nước và

chất điện giải nơi ruột, kích ứng bởi độc tố của E coli Men bia cũng có thể giúp tăng

hoạt tính của các enzyme trong ruột như maltase và lactase để giúp giảm các triệu chứng tiêu chảy Men bia chứa nhiều chromium, cũng giúp tăng hoạt động của insulin rất có ích cho bệnh nhân tiểu đường Trong nấm men có 1 số enzyme tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích tăng trưởng Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhược điểm là mặc dù hàm lượng protein cao khoảng 55 – 60%, nhưng đồng thời nó cũng chứa lượng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hưởng tới sức khỏe con người Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lượng acid nucleic này Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein

Bảng 2: Hàm lượng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisise (mg/g men khô)

(Nguồn: Lương Đức Phẩm et al., 2006)

2.1.6 Quá trình trao đổi chất của nấm men

Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn: Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào Chuỗi các phản ứng hóa học, biến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu cho tế bào Môi trường dinh dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau Các chất không điện tích như đường saccharose, rượu acid hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch tán hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl, Mg, Ca và các kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận động ngược lại thang nồng

độ (vận chuyển hoạt động) Ngoài nguồn hydratcarbon và nguồn nitơ hoặc vô cơ hoặc hữu cơ, nấm men còn sử dụng các nguyên tố vi lượng như K, Na, Ca, Mg có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng nấm men Riêng natri có ý nghĩa quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào nấm men Ion natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng

cả 2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó thâm nhập vào tế bào nấm men, mang theo

cả saccharose, amino acid, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường

2.2 Bã bia

2.2.1 Tổng quan về bã bia

Một số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia ướt hoặc khô và men bia khô Thành phần dinh dưỡng của vật liệu sẽ khác nhau, tùy thuộc vào loại chất nền được sử dụng (lúa mạch, lúa mì, ngô, ), tỷ lệ lên men và quá trình lên men được sử dụng Nhà máy bia cho ra phụ phẩm là bã bia ướt Bã bia ướt cần phải được sử dụng trong thời gian ngắn vì chúng có chứa một lượng lớn nước (75-80%)

và vận chuyển có thể tốn kém Trong ngành chăn nuôi, mầm malt được sử dụng làm thức ăn gia súc vì hàm lượng các chất dinh dưỡng trong mầm malt rất cao Trong công nghiệp thực phẩm, mầm malt được dùng để sản xuất acid lactic và làm nguồn cung cấp nitơ cho quá trình sản xuất nấm men từ rỉ đường Ngoài ra do trong mầm malt còn có các enzyme khác nhau nên mầm malt có khả năng thúc đẩy sự lên men của dịch đường

Do đó, mầm malt là nguyên liệu rất tốt để điều chế các chế phẩm enzyme như protease

2.2.2 Thành phần hóa học

Bã malt được tạo ra trong quá trình dịch hóa và lọc dịch đường Trong quá trình dịch hóa, dưới tác dụng của enzyme amylase, protease và các men khác thì 65 – 70 % vật chất khô của malt sẽ chuyển vào dịch sau khi lọc, phần còn lại nằm ở trong bã malt Tùy thuộc vào phương pháp tách mà độ ẩm của bã dao động từ 75 – 85 % Với độ ẩm này thì bã malt được dùng làm thức ăn gia súc Bã malt tươi thường có dạng sền sệt, có màu nâu nhạt, vị ngọt và mùi mạch nha

Bảng 4 Thành phần trung bình của tro (%)

2.3 Rỉ đường

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường

Thành phần chính của rỉ đường là đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và fructose Thành phần chính xác của rỉ đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy rỉ đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt Bảng 7 cho thấy biến động của các thành phần của rỉ đường

Bảng 7 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía (%)

là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu Rỉ đường mía có đặc điểm là có tỷ lệ đường khử tương đối cao Trong chu trình kết tinh các loại đường khử tăng lên tới mức mà saccharose không thể kết tinh được nữa bởi vì đường

khử làm giảm khả năng hoà tan của saccharose Các chất khoáng có xu hướng giữ saccharose trong dung dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng sẽ quyết định sản lượng saccharose lý thuyết có từ cây mía

Các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ đường quyết định nhiều tính chất vật

lý của nó, đặc biệt là độ nhớt dính Nó bao gồm chủ yếu là các loại glucide như tinh bột, các hợp chất chứa N và các acid hữu cơ Nói chung hàm lượng các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ đường củ cải đường cao hơn là rỉ đường mía Trong rỉ đường không chứa xơ và lipit Tỉ lệ protein thô trong rỉ đường mía rất thấp (3-5%) Trong rỉ đường mía còn có một lượng đáng kể các acid hữu cơ, trong đó chủ yếu là axit acotinic Rỉ đường cũng chứa một lượng acid béo bay hơi, trung bình khoảng 1,3%

Rỉ đường là một nguồn giàu khoáng So với các nguồn thức ăn năng lượng thông dụng khác như hạt ngũ cốc thì hàm lượng Ca trong rỉ đường mía cao (tới 1%), trong khi

đó thì hàm lượng P lại thấp Rỉ đường mía giàu Na, K, Mg và S Rỉ đường cũng chứa một lượng đáng kể các nguyên tố vi lượng như Cu (7 ppm), Zn (10 ppm), Fe (200 ppm),

Mn (200 ppm) Rỉ đường rất giàu các chất sinh trưởng như: acid pentotenic, nicotinic, folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin (Trương Thị Minh Hạnh et al., 2006)

Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin

và các chất điều hoà sinh trưởng Trong đó có vitamin H (biotin) là chất kích thích sinh trưởng đối với phần lớn nấm men Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàm lượng biotin cao hơn rỉ đường từ củ cải đường Chính vì thế, ở nhiều nước không có mía, người ta phải nhập rỉ đường từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để đảm bảo hàm lượng biotin cho nấm men phát triển Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men Muốn sử dụng cho quá trình lên men,

ta phải tiến hành một số quá trình xử lý

Các đặc điểm ảnh hưởng quá trình lên men: Rỉ đường thường có màu nâu sẫm, được tạo ra trong quá trình chế biến đường Màu này rất khó bị phá hủy trong quá trình lên men Sau khi lên men, chúng sẽ bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng sẫm Màu này không phải màu tự nhiên của nấm men và việc tách màu ra khỏi sinh khối rất tốn kém và khó khăn Các chất màu này bao gồm các hợp chất caramen, phức chất của phenol – Fe +2, Melanoidin, Melanin Hàm lượng đường khá cao, nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men

Hệ keo trong rỉ đường có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Hệ keo trong rỉ đường hình thành bởi protein và pectin Hệ keo này tạo ra độ nhớt cao làm giảm khả năng hoà tan của oxy, làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men Nếu hệ keo không được phá sẽ gây thoái hoá tế bào, dẫn đến hiệu suất thu nhận sinh khối nấm men thấp

Rỉ đường được ứng dụng trong sản xuất nhiều sản phẩm như: bột ngọt, rượu rum, sản xuất nấm men, acid lactic, cồn, tăng sinh khối protein Ngoài ra còn rất nhiều các quy trình công nghệ tiên tiến khác cũng dùng rỉ đường làm nguyên liệu như: Micromix-

3 kết hợp bổ sung rỉ đường, NPK để xử lý rác, xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzyme dùng làm thứ ăn cho gia súc, gia cầm,…

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013 tại phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Giấy nhôm, kẹp, kéo

- Tủ cấy vô trùng Telstar (Spain)

- Nồi khử trùng Pbi (Italia)

- Lò vi sóng (Panasonic)

- Tủ ủ Binder (Germany)

- Máy ly tâm (Hermle)

- Máy vortex (Italia)

- Cân điện tử (USA)

- Kính hiển vi Olympus (Japan)

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu

- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và chủng nấm mốc Aspergillus

oryzae do phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ cung cấp

- Bã bia được thu ngay sau quá trình lọc bã malt tại Công ty Cổ phần Bia Phong Dinh, Thành phố Cần Thơ sau đó trữ lạnh ở 0oC

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình chung cho các thí nghiệm

Nuôi trên môi

Đếm mật số Khử trùng

Hình 4 Quy trình thực hiện thí nghiệm

Tách ròng

Nấm men giống

Cấy giống

a Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm:

 Chuẩn bị giống nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được nuôi trên môi trường YEPD đặc sau đó

cấy nấm men sang môi trường YEPD lỏng nuôi trong bình tam giác trong 3 ngày Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu

Mật số tế bào của huyền phù mẫu được tính theo công thức:

N = (a/0,016)x103x hệ số pha loãng

Trong đó: N là số tế bào trong 1ml

a là số tế bào đếm được trong 4 ô lớn

 Chuẩn bị môi trường bã bia

Bã bia sấy khô ở 105oC sau đó nghiền thành dạng bột mịn Bã bia pha loãng với nước cất theo tỉ lệ được bố trí trong thí nghiệm, bổ sung rỉ đường và điều chỉnh pH theo từng thí nghiệm, dùng ống đong, đong 100ml dung dịch vào các bình tam giác 250ml, đậy nút bông và khử trùng ở 121oC trong 20 phút

b Chủng giống nấm men

Chủng 1ml dung dịch nấm men S cerevisiae đã nuôi vào dung dịch lên men đã

chuẩn bị với mật số theo từng thí nghiệm và lắc ủ 120 vòng/phút ở 300C

c Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi quá trình tăng sinh khối nấm men bằng phương pháp đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu sau mỗi khoảng thời gian là 12 giờ trong 3 ngày

3.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Chọn được độ pha loãng bã bia thích hợp cho sự phát triển

và tăng sinh khối của nấm men trong thời gian ngắn, hiệu quả cao

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với bốn nghiệm thức là bã bia được pha loãng với nước cất theo 4 mức khác nhau, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại Tổng cộng có 12 đơn vị thí nghiệm

Nghiệm thức 1: bã bia 10g/l

Nghiệm thức 2: bã bia 20g/l

Nghiệm thức 3: bã bia 30g/l

Nghiệm thức 4: bã bia 40g/l

Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1 Ở thí nghiệm này, bã bia được pha loãng theo các nghiệm thức là 10, 20, 30, 40 g/l Chủng 1ml dung dịch nấm men giống đã chuẩn bị có mật số 6,9x108 tế bào /ml Lắc ủ 120 vòng/phút ở 300C

Chỉ tiêu theo dõi: Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Cứ sau mỗi

12 giờ lấy chỉ tiêu 1 lần và kết thúc sau 3 ngày ủ

3.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp cho sự phát triển của nấm men

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức gồm các 3 mức rỉ đường bổ sung và nghiệm thức đối chứng không bổ sung rỉ đường, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 12 đơn vị thí nghiệm

Nghiệm thức 1: Không bổ sung rỉ đường

Nghiệm thức 2: Bổ sung 1% rỉ đường

Nghiệm thức 3: Bổ sung 3% rỉ đường

Nghiệm thức 4: Bổ sung 5% rỉ đường

Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1 Ở thí nghiệm này, bã bia được xử lý và pha loãng theo các nghiệm thức tốt nhất từ các thí nghiệm trên

và bổ sung rỉ đường theo các nghiệm thức Chủng 1ml dung dịch nấm men giống có mật

số 6,3x106 tế bào /ml đã chuẩn bị Lắc ủ 120 vòng/phút ở 300C

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Cứ sau mỗi 12 giờ lấy chỉ tiêu 1 lần và kết thúc sau 3 ngày ủ

3.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Xác định mức pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men trong môi trường bã bia

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức gồm các mức pH 3, 4, 5, 6 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 12 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành: Bã bia được xử lý và pha loãng và bổ sung rỉ đường theo các nghiệm thức tốt nhất từ các thí nghiệm trên và chỉnh về các giá trị pH khác nhau Môi trường được khử trùng ở 121oC/20 phút, để nguội và chủng 1ml giống nấm men có mật số 5x106 tế bào /ml, lắc ủ 120 vòng/phút ở 300C

Chỉ tiêu theo dõi: Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Cứ sau mỗi 12 giờ lấy chỉ tiêu 1 lần và kết thúc sau 3 ngày ủ

3.2.5 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật số nấm men ban đầu đến khả năng tạo sinh khối nấm men theo thời gian

Mục đích thí nghiệm: chọn được mật số nấm men ban đầu thích hợp cho quá trình phát triển của nấm men trong môi trường bã bia

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức

là các mật số nấm men khác nhau, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại Tổng cộng có 12 đơn

vị thí nghiệm

Nghiệm thức 1: mật số men là 100 tế bào/ml

Nghiệm thức 2: mật số men giống là 102 tế bào/ml

Nghiệm thức 3: mật số men giống là 104 tế bào/ml

Nghiệm thức 4: mật số men giống là 106 tế bào/ml

Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường bã bia theo các nghiệm thức tốt nhất từ các thí nghiệm trên Khử trùng môi trường ở 1210C/20 phút Tế bào nấm men được nuôi trong môi trường YEPD lỏng, sau đó nhân sinh khối trong môi trường rỉ đường 20 độ Brix trong 48 giờ Thu sinh khối nấm men bằng cách ly tâm 9000rpm/15 phút Thu sinh khối

và đồng nhất với nước cất theo tỷ lệ 50% Sau đó pha loãng theo dãy thập phân (Trần Linh Thước, 2002) Chủng 1ml dịch nấm men đã pha loãng theo các nồng độ, lắc ủ 120 vòng/phút ở 300C

Chỉ tiêu theo dõi: Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Cứ sau mỗi 12 giờ lấy chỉ tiêu 1 lần và kết thúc sau 3 ngày ủ

3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu trung bình được xử lý bằng phần mềm Excel Dùng phần mềm Minitab kiểm tra phương sai và so sánh trung bình các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men

Bã bia được pha loãng theo các nghiệm thức là 10, 20, 30, 40 g/l Chủng 1ml dung dịch nấm men giống đã chuẩn bị có mật số 6,9x108 tb/ml

Số liệu về mật số nấm men được ghi nhận bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu sau mỗi khoảng 12 giờ trong 3 ngày và xử lý thống kê trên số liệu logarit đã được chuyển dạng từ số liệu ban đầu (đơn vị tính là tế bào/ml)

Hình 5 Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men

*Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự giống nhau khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%

Qua hình 5 cho thấy mật số tế bào ở các nghiệm thức sau 3 ngày nuôi cấy đều tăng mạnh Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy, cho thấy nghiệm thức 30g/l có mật số nấm men cao nhất (8,64), kế đến là nghiệm thức 20 g/l (8,50) và 40g/l (8,43) cuối cùng thấp nhất là nghiệm thức 10 g/l (8,12), sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% (P< 0,05) Số lượng tế bào nấm men tăng giảm theo qui luật, phù hợp với các giai đoạn phát triển của chúng Trong giai đoạn thích nghi với môi trường, mật số tế bào tăng không đáng kể (trước thời điểm 12 giờ) Từ giai đoạn 12 – 48 giờ là giai đoạn logarit, số lượng

tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân, tùy vào lượng dinh dưỡng trong môi trường mà mật số nấm men đạt giá trị cực đại ở các thời điểm khác nhau