phân lập vi khuẩncố định đạm hòa tan lân trong đất xám vùng rễ cây bắp trồng ở tỉnh bình dương và bà rịa vũng tàu

TÓM LƯỢC Bốn mươi chín dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường Burk’s không đạm và môi trường NBRIP từ đất vùng rễ cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Bình Dương và Bà Rịa –

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨNCỐ ĐỊNH ĐẠM - HÒA TAN LÂN

TRONG ĐẤT XÁM VÙNG RỄ CÂY BẮP TRỒNG Ở TỈNH BÌNH DƯƠNG

VÀ BÀ RỊA VŨNG TÀU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN GS.TS CAO NGỌC ĐIỆP NGUYỄN THANH HUY

MSSV:3103957 LỚP:VI SINH VẬT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨNCỐ ĐỊNH ĐẠM - HÒA TAN LÂN

TRONG ĐẤT XÁM VÙNG RỄ CÂY BẮP TRỒNG Ở TỈNH BÌNH DƯƠNG

VÀ BÀ RỊA VŨNG TÀU

MSSV:3103957 LỚP:VI SINH VẬT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập tại trường cho đến khi hoàn thành luận văn này tôi

đã nhận được sự giúp đỡ từ các thầy cô, bạn bè và gia đình rất nhiều Để có được kết quả như hôm nay, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Thầy GS.TS Cao Ngọc Điệp người đã dành nhiều thời gian, hướng dẫn tận tình, động viên cung cấp nhiều tài liệu, kiến thức quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi

và tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

- Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cô Nguyễn Thị Pha là cố vấn học tập lớp Vi Sinh Vật Học K36 luôn quan tâm trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

- Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang Cán bộ quản lí phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật đất và Vi Sinh Vật Môi trường truyền đạt kinh nghiệm và động viên tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

- Gia đình cùng chia sẻ những khó khăn, tạo mọi thuận lợi cho tôi yên tâm, có điều kiện tốt nhất để hoàn thành và đạt được kết quả trong suốt quá trình học tập của mình

Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Huy

TÓM LƯỢC

Bốn mươi chín dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường Burk’s không đạm và môi trường NBRIP từ đất vùng rễ cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Bình Dương và Bà Rịa – Vũng Tàu đều đa số khuẩn lạc có dạng tròn đều, một vài dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều, hầu hết các dòng vi khuẩn có dạng que ngắn và

có khả năng chuyển động Kiểm tra khả năng tổng hợp đạm trên môi trường Burk’s lỏng; khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng và khả năng tổng hợp IAA Kết quả có 49/49 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm, hòa tan lân khó tan

và tổng hợp IAA chiếm tỉ lệ 100% Trong 49 dòng vi khuẩn phân lập đã khảo sát thì có 6/49 dòng vi khuẩn tổng hợp NH4 + đạt lượng cao là: BDN2 (1,31 mg/l) VDB7c (1,43 mg/l), VDN6a (1,27 mg/l), VTN5c (4,41 mg/l, VDN2a (1,30 mg/l) và VDN3a (1,35 mg/l) Có 8/49 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân tốt là: VDN2a (66,66 mg/l), VDB6a ( 71,24 mg/l), và dòng VDN7c (83,56 mg/l, BDB4 (70,17 mg/l , VDN7d (91,56 mg/l) , VDB6b (61,38 mg/l), VDN4a (66,65 mg/l), VDB5a (64,04 mg/l) Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao là VDB5a (4,05 mg/l), BDN5 (4,33 mg/l, VDB7e (3,64 mg/l), VDB4 (3,18 mg/l, VDB3b (3,21 mg/l)

Từ khóa: Cố định đạm, đất xám, hòa tan lân, tổng hợp IAA

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÍ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về đất xám 3

2.1.1 Giới thiệu chung về đất xám 3

2.1.2 Phân loại 3

2.2 Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm 5

2.2.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên 5

2.2.2 Quá trình cố định đạm 6

2.2.3 Vi khuẩn cố định đạm 6

2.3 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân 7

2.3.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên 7

2.3.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn 8

2.3.3 Vi khuẩn hòa tan lân 10

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất

nông nghiệp 11

2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới 11

2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Phương tiện thí nghiệm 13

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 13

3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị 13

3.2.3 Hóa chất 14

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phân lập vi khuẩn 16

3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 17

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 17

3.3.4 Xác định hàm lượng NH4+ do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp Indophenol Blue 17

3.3.5 Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn 20

3.3.6 Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) 22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn vùng rễ

đã phân lập được 23

4.1.1 Nguồn gốc và kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ 23

4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn trên môi trường Burk’s 28

4.3 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP 31

4.4 Khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) của các dòng

vi khuẩn đã phân lập 34

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC

Phụ luc 1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đât vùng rễ cây bắp

1 Bảng 14: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường

Burk’s không đạm

2 Bảng 15: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường

NBRIP

Phụ lục 2: Kết quả các ngày đo đạm, lân và IAA

1 Bảng 16: Kết quả đo đạm (mg NH4+/l) của các dòng vi khuẩn sau 2

ngày, 4ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk’s không đạm

2 Bảng 17: Kết quả đo lân (mg P2O5/l) của các dòng vi khuẩn sau 5

ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng

3 Bảng 18: Kết quả đo IAA (mgIAA /l) của các dòng vi khuẩn sau 2

ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường

NBRIP và Burk's lỏng

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005)

dùng để phân lập vi khuẩn cố định đạm 14

Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)

dùng để phân lập vi khuẩn hòa tan lân 15

Bảng 3: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ 18

Bảng 4: Giá trị đường chuẩn NH4+ 19

Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 21

Bảng 6: Đường chuẩn đo IAA 22

Bảng 7: Nguồn gốc của 22 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Burk’s 23

Bảng 8: Nguồn gốc của 27 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP 23

Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

Bảng 10: Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 25

Bảng 11: Lượng đạm cố định (mg NH4+/l) của 49 dòng vi khuẩn phân lập

được sau 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm 28

Bảng 12: Lượng lân hòa tan (mg P2O5/l) của 35 dòng vi khuẩn

phân lập được sau 5 và 10 ngày nuôi trong môi trường NBRIP 31

Bảng 13: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở nghiệm thức

không có bổ sung tryptopan 34

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Chu trình nitơ 5

Hình 2 Chu trình lân trong tự nhiên 8

Hình 3: Phản ứng tạo màu xanh molypdate của đường chuẩn 188

Hình 4 Một số dạng khuẩn lạc trên đĩa petri môi trường đặc 27

Qua những nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân vi sinh vật để thay thế phân hóa học là một trong những giải pháp hữu hiệu mà chúng ta có thể áp dụng Phân vi sinh là sản phẩm chứa nhiều vi sinh vật có ích, có khả năng cố định đạm hay chuyển hóa các hợp chất lân khó tan thành dạng cây trồng dễ hấp thu, tham gia trực tiếp hay gián tiếp vào quá trình dinh dưỡng của cây trồng

Do được bổ sung vi sinh có ích nên sản phẩm an toàn, lượng nitrat trong sản phẩm giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp và cây dễ hấp thu dinh dưỡng hơn Đặc biệt ở các chủng vi sinh vật trong đất có khả năng tổng hợp nitơ tự do tạo nguồn đạm sinh học, hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây trồng Điều này có ý nghĩa rất quan trọng vì ngoài việc làm giảm chi phí trồng trọt, góp phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường và xây dựng mô hình phát triển bền vững trong nông nghiệp

Vì thế, việc nghiên cứu để tìm ra những dòng vi khuẩn vừa có hoạt tính cố định đạm tốt đồng thời có khả năng hòa tan lân và kali cao để phục vụ cho nhu cầu sản xuất phân bón vi sinh là rất cần thiết

Việc nghiên cứu, phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân nhằm làm giảm lượng phân hóa học sử dụng trong nông nghiệp nhưng vẫn giữ

được năng suất cao, cải thiện độ phì nhiêu của đất và an toàn cho môi trường là rất cần thiết

Vì vậy, đề tài “Phân lập vi khuẩn cố định đạm - hòa tan lân từ đất vùng rễ

cây bắp ở đất xám tỉnh Bình Dương và tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.” thực hiện nhằm

phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn sống ở đất vùng rễ bắp có khả năng cố định đạm, hòa tan lân tốt và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm - hòa tan lân

và tổng hợp IAA từ đất vùng rễ của cây bắp ở Bình Dương và Bà Rịa Vũng Tàu

Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng IAA của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về đất xám

2.1.1 Giới thiệu chung về đất xám

Diện tích gần 20 triệu ha, chiếm diện tích lớn nhất trong các loại đất nước ta, phân bố rộng ở trung du và rìa đông bằng

Hình thành ở những nơi có địa hình dốc thoải, nên quá trình rữa trôi các hạt sét, keo và chất dnh dưỡng diễn ra mạnh mẽ, cho nên đất rất dễ thoái hóa

Có tầng đất mặt mỏng, lớp đất có thành phần cơ giới nhẹ: tỉ lệ cát lớn, lượng sét, keo ít Đất thường bị khô hạn, đất chua hoặc rất chua Đất nghèo dinh dưỡng nghèo mùn

Số lượng vi sinh vật trong đất rất ít, hoạt động của vi sinh vật yếu

2.1.2 Phân loại

2.1.2.1 Đất xám bạc màu

Chủ yếu phát triển phù sa cổ, đá macma acid, đá cát Phân bố nhiều nơi có địa hình bằng thoải, thoáng khí, thoát nước dễ, chủ yếu tập trung ở Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và Trung Du Bắc Bộ

Đất có thành phần cơ giới nhẹ, pH phổ biến 3,0 – 4,5, do đó phản ứng đất chua vừa đến rất chua, nghèo cation trao đổi, hàm lượng mùn tầng từ nghèo đến rất nghèo (0,5 – 1,5%), mức phân gải chất hữu có mạnh (C/N < 10), các chất tổng số dễ tiêu nghèo, độ no bazơ thấp (<50%)

2.1.2.2 Đất xám glây (Gleyic Arisols)

Diện tích 101471 ha Phân bố tập trung ở Trung du Bắc Bộ, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ, ở địa hình bậc thang, bằng tấp, ít thoát nước, có thể bị chịu ảnh hưởng của nước mặt và nước ngầm nhiều tháng trong năm

Hình thái các đơn vị đất khác nhau căn bản bởi sự xuất hiện một trong những tầng chẩn đoán sau: Độ sâu tầng Glây hoặc tầng kết von, hoặc tầng đá ong, thành phần

cơ giới lớp đất mặt Những sự khác nhau về hình thái và điều kiện thành phần đất dẫn đến sự khác nhau về bản chất phát sinh và nông học của từng đơn vị đất phụ

Đât có thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình Phản ứng của đất rất chua, nghòe mùn, đọ no bazơ và dung tích hấp thu thấp nghèo chất dinh dưỡng tổng số và dễ tiêu

2.1.2.3 Đất xám loang lổ

Diện tích 221360 ha, phân bố tập trung ở Trung du Bắc Bộ Đa số diện tích nằm

ở địa hình bằng, thoải hoặc lượn sóng với độ dốc dưới 150

Đất hình thành do sản phẩm phong hóa của đá mẹ granit nên thành phần khoáng chủ yếu là thạch anh, kaolimit, haloizit, gowtit Thành phần tổng số chủ yếu là SO2 và các sesquioxyt

Một số tính chất vật lý tầng đất mặt: thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình, dung trọng 1,4 – 1,6, tỉ trọng 2,60 – 2,70, độ xốp trung bình <40%, sức chứa ẩm cực đại 28 – 31%, phẩu diện đất thường có tầng kết von đá ong ở độ sâu hơn 50 cm

Đất có phản ứng chua vừa đến rất chua ( pH 3,0 – 4,5 ), nghèo mùn ( < 1% ), độ

no baz và dung tích hấp thu thấp, nghèo các chất dinh dưỡng tổng số và dễ tiêu

2.1.2.4 Đất xám mùn trên núi (Humicacrisols )

Diện tích: 3139285 ha, phân bố tập trung độ cao 700 - 1800m so với mặt nước biển ở đại hình chia cắt, dốc nhiều, tầng đất thường không dày Loại đất này phát triển trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm vùng núi trung bình với nền nhiệt độ thấp và độ

ẩm cao hơn so với vùng đồi núi thấp hơn 700m

Có hàm lượng chất hữu cơ cao, quá trình feralit yếu hẳn hiếm thấy hiện tượng kết von, đá ong

2.1.2.5 Đất xám feralit ( Ferralic Acrisols)

Diện tích: 141789500 ha Đất hình thành trong điều kiện chia cắt, dốc nhiều, trên sản phẩm phong hóa của đá mẹ giàu secquioxyt Đất xám Feralit phân bố rộng, đặc điểm rất đa dạng phụ thuộc nhiều vào vị trí đại lý, mẩu chất hình thành đất, môi trường sinh thái sữ dụng đất

Dung trọng thấp (0,96 – 1,26 g/cm3, tỉ trọng cao ( 2,73 – 2,80 g/cm3), xốp Đất có phản ứng chua ( pH 3,6 – 4,8), hàm lượng mùn trung bình, dung tích hấp thu trung bình, nghèo cation tro đổi, độ no bazơ thấp, nghèo các chất dinh dưỡng dễ tiêu

2.2 Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm 2.2.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên

Nitơ là một chất cần thiết cho sự sống, là thành phần của protein và acid nucleic trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật Khí nitơ chiếm nhiều nhất trong không khí (79%) và là yếu tố dinh dưỡng giới hạn trong môi trường nước và trong các loại đất nông nghiệp Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật lại không sử dụng được nếu chúng không được chuyển thành ammonia

Chu trình nitơ được tóm tắt bao gồm các quá trình cơ bản sau:

2.2.2 Quá trình cố định đạm

Quá trình cố định nitơ xảy ra bởi các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học Trong đó người ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi trường

Quá trình cố định đạm sinh học là quá trình đồng hóa nitơ của không khí dưới tác dụng của một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nitrogenase hay nói cách khác quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3 dưới xúc tác của enzyme nitrogenase khi có mặt ATP, trong đó nitrogenase được cấu tạo bởi hai phần: Fe-protein có khối lượng khoảng 6,0x104 Dal và Mo-Fe-protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2x105 Dal theo sơ đồ phản ứng sau:

Một số vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong đất như:

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, chuyển động và có dạng hình que ngắn, là

vi khuẩn cố định đạm thúc đẩy sự phát triển, tăng năng suất cây trồng, tổng hợp IAA,

hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Bilal et al., 1990) Azospirillum

hiện diện ở trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây trồng (Glick, 1995) Chúng

Nitrogenase

cũng được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên thế giới, ở vùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Reinhold-Hurek et al., 1986)

Burk không đạmholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính

khoảng 1µm, di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero-Mellado et al.,

2004) Đây là vi khuẩn sống cộng sinh với cây trồng, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Chen

et al., 2006) Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí Tuy nhiên chúng phát triển tốt trong môi trường ít khí oxy

Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, có khả năng

di chuyển tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử, là vi khuẩn sống tự do (Chan, 1994)

Clostridium là vi khuẩn hình que, sinh bào tử, sống tự do trong đất và nước, có

thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện yếm khí (Lê Văn Nhương et al., 2009)

2.3 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân

2.3.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên

Phosphate (Pi) được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ăn thực vật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào trong đất Hầu hết Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liên kết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lại đất thì những Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô

cơ hoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành một thành phần hữu cơ của đất Sự phóng thích của những Pi vô cơ từ những Pi hữu cơ được gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được vi sinh vật bẽ gãy những liên kết hữu cơ Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm của đất (Busman et al., 2009)

Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình lân diễn ra trong tự nhiên Chu trình oxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron một cách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự nhiên Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử (redox) của lân nhưng những cơ chế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểu một cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996)

Hình 2 Chu trình lân trong tự nhiên

(Nguồn:http://pdsblogs.org/2011pdsapes5/2010/11/03/phosphorous-cycle/, ngày 20/07/2013; (TV) Thực vật; (Pi) Phosphate)

2.3.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn

Một vài loài vi khuẩn có khả năng khoáng hóa và hòa tan lân hữu cơ và vô cơ tương ứng (Hilda và Fraga, 2000) Cơ chế chủ yếu của sự hòa tan P vô cơ là hoạt động tổng hợp acid hữu cơ của vi sinh vật và giảm pH đất (Kpomblekou và Tabatabai, 1994) Theo nghiên cứu của Halder et al., (1990) cho thấy những acid hữu cơ phân lập

từ Rhizobium leguminosarum hòa tan một lượng P tương đương với lượng được hòa tan bởi chính vi khuẩn Bên cạnh đó, việc xử lý phần nước lọc ra từ Rhizobium với

Tảo , TV phù du

Nuôi sống sinh vật dị

Sự hô hấp tế bào thải ra

pepsin hoặc loại bỏ protein bởi việc tủa acetone thì không ảnh hưởng đến khả năng giải phóng P Tuy nhiên, trung hòa với NaOH sẽ phá hủy hoạt tính hòa tan

Acid hữu cơ được phân lập từ Rhizobium leguminosarum cũng như Rhizobium meliloti, Bacillus firmus, và một số loài vi khuẩn khác là acid α-ketogluconic Nhưng với vi khuẩn Pseudomonas sp, Erwinia herbicola và Burk không đạm hoderia cepacia

thì acid gluconic là acid hữu cơ chính được tạo để hòa tan lân Một số acid khác như acid glycolic, oxalic, malonic và succinic cũng được nhận diện trong số vi khuẩn hòa tan lân (Illmer và Shinner, 1992)

Chất chelate và acid vô cơ được xem như cơ chế khác trong việc hòa tan lân Tuy nhiên hiệu quả và sự đóng góp của chúng để giải phóng lân ít hơn acid hữu cơ

Sự phân hủy hợp chất lân hữu cơ phụ thuộc chủ yếu vào tính chất hóa lý và hóa sinh của những phân tử này, chẳng hạn acid nucleic, phospholipids và đường phosphate thì dễ dàng bị cắt, nhưng acid phytic, polyphosphate và phosphonate thì được phân hủy chậm hơn nhiều (Ohtake et al., 1996) Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase, phosphohydrolase gồm nhóm acid hoặc kiềm.) Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoester hoặc phosphoanhydride Acid phosphohydrolase, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành acid phosphatase đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’- nucleotidase và 5’- nucleotidase, hexose phosphatase và phytase Một nhóm đặt hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ (Ohtake et al., 1996)

Một vài phosphohydrolase được tiết ra bên ngoài màng sinh chất, chúng được giải phóng dưới dạng hòa tan hoặc được giữ lại như protein liên kết màng Sự định vị này cho phép chúng hoạt động như enzyme loại bỏ phosphoester hữu cơ, thành phần của trọng lượng phân tử lớn (như RNA và DNA) và không thể xuyên qua màng tế bào chất vật chất này đầu tiên có thể được chuyển thành thành phần trọng lượng phân tử thấp, và quá trình này có thể xuất hiện một cách liên tục như là sự biến đổi của RNA

và DNA thành nucleoside monophosphate thông qua Rnase và Dnase, tiếp theo là giải

phóng P và sản phẩm hữu cơ thông qua phosphohydrolase, cung cấp cho tế bào những chất dinh dưỡng cần thiết (Goldstein, 1994)

2.3.3 Vi khuẩn hòa tan lân

Trong đất, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện với số lượng khác nhau Chúng gồm

cả dòng hiếu khí và dòng kỵ khí, thường thấy dòng hiếu khí nằm trong đất (Sperberg, 1958) Mật độ của vi khuẩn hòa tan lân trong vùng rễ cao hơn so với đất ngoài vùng rễ (Katzelson et al., 1962), và hiện diện ở vùng đất mát mẻ và ẩm thấp nhiều hơn ở vùng đất khô hạn Một số vi khuẩn hòa tan lân được phát hiện như:

Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng hình thành

bào tử, di chuyển dễ dàng, là vi khuẩn yếm khí, và hình thành acid lactic

Bacillus pumilus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng hình thành bào tử do đó môi trường sống của Bacillus pumilus rất đa dạng Tuy nhiên, trong

tự nhiên chúng phân bố chủ yếu trong đất và mô thực vật chết (Smibert và Kreig, 1994)

Paenibacillus là vi khuẩn Gram dương, yếm khí, có khả năng hình thành bào tử,

phân phối rộng rãi trong đất, nước, không khí, các vùng rễ cây… (Daane et al., 2002)

Nhiều dòng trong chi Paenibacillus có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tăng

trưởng của thực vật Tăng cường sự phát triển của thực vật theo hai cơ chế: cơ chế trực tiếp bao gồm hòa tan lân, cố định đạm, phân hủy các chất gây ô nhiễm môi trường và sản xuất các hoormone; cơ chế gián tiếp bao gồm kiểm soát phytopatogens bằng cách cạnh tranh các nguồn tài nguyên như sắt, axit amin và đường, cũng như sản xuất thuốc khánh sinh (Bloemberg và Lugtenberg, 2001)

Acinetobacter là vi khuẩn Gram âm, sống hoại sinh, không sản xuất sắc tố,

được tìm thấy nhiều nơi trong đất, nước, sinh vật ngay cả trên da người (Barbe et al., 2004)

Brevibacillus gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, hiếu khí, chuyển động chậm, bào tử hình elip Brevibacillus có khả năng sản xuất acid từ glycerol,

LArabinose, rhammose, ribose, và D-Fructose, chủ yếu là các acid béo (Keiichi Goto

et al., 2004)

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp 2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới

Thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật cố định đạm, hòa tan lân trên cây trồng Trong đó nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân sinh học có chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân có thể thay thế một lượng phân hóa học đáng kể

Sản phẩm phân bón vi sinh cố định nitrogen tự do từ vi khuẩn Azotobacter và Clostridium đã được sản xuất tại Mỹ, Autralia và sử dụng nhiều nơi trên thế giới với

tên gọi E.2001 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm E.2001 có tác dụng tốt trong việc nâng cao năng suất rau, trong đó mức độ tăng có thể từ 33,33% đến 56% tùy từng loại rau E.2001 có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh do nấm và vi khuẩn gây nên như bệnh héo xanh, thối đen rễ, lở cổ rễ (Lê Văn Nhương et al., 2009)

Theo Gaur (1992) nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã chứng minh ở Liên

Xô, năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp tăng 30% khi sử dụng vi sinh vật hòa tan lân; hiệu quả này ở Ấn Độ tương ứng là 10-20% tương đương với bón P2O5

một lượng 50 kg/ha Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada và Ấn Độ cho thấy: vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 50-75% lượng lân cần bón bằng quặng phosphate

có hàm lượng P2O5 tổng số tương đương mà năng suất và chất lượng nông sản không thay đổi Ngoài tác dụng phân giải phosphate khó tan, vi sinh vật phân giải lân còn có khả năng sản sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật giúp cây trồng phát triển và chống chịu tốt hơn đối với các điều kiện bất lợi ngoại cảnh hoặc sinh tổng hợp chất kháng sinh góp phần kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng

2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước

Sản phẩm Dasvila của công ty Dasco chứa hai chủng vi khuấn Azospillium sp, Pseudomonas sp có tác dụng cố định đạm và hòa tan lân khó tiêu cung cấp cho cây

lúa Vi khuẩn cộng sinh với cây lúa tạo ra kích thích tố tăng trưởng IAA (Indol-3acetic acid), Cytokinins, Auxin, Gibberelin

Theo nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2011), ứng dụng vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus và Pseudomonas stutzeri với công thức bón 500kg

phân sinh học/ha – 103,5 N – 80 P2O5 kg/ha cho năng suất mía cây tương đương với

mía bón 207 N - 160 P2O5 kg/ha nhưng trữ lượng đường và tổng lượng đường/ha cao hơn cây mía chỉ bón phân hóa học (207 N - 160 P2O5 kg/ha) một cách rất có ý nghĩa Như vậy việc bón 500 kg/ha phân sinh học cho cây mía không những tiết kiệm được 103,5 N - 80 P2O5 kg/ha mà còn thu lợi cao nhất trong canh tác mía đường

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật môi trường và phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ

Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013

3.2 Phương tiện thí nghiệm

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức)

- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

Sau đó chỉnh pH môi trường về 7,0

Dung dịch EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O - Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt) hòa tan 6g EDTA với 100ml nước khử khoáng

Dung dịch phenol-sodium nitroprusside dehydrate: hòa tan 7g phenol (C6H5OH)

và 0,034g sodium nitroprusside dehydrate (Na2Fe(CN)5NO.2H2O) thêm nước đủ 100ml, dung dịch này được bảo quản lạnh

Dung dịch Sodium hypochloride: hòa tan 4,98g Na2HPO4; 1,48g NaOH và 20ml NaClO thêm nước đủ 100ml

Dung dịch đạm chuẩn N_NH4+ 1 mg/l

3.2.3.2 Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng lân hòa tan

Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) dùng để phân lập

vi khuẩn hòa tan lân

+ Trộn (1), (2), (3) và thêm nước cho đủ 1 lít

Dung dịch B: 200ml dung dịch A + 1,056g acid ascorbic

Dung dịch lân chuẩn P_P2O5 10 mg/l

Dung dịch B: 1,056 g acid ascorbic + 200 ml dung dịch A

Dung dịch lân chuẩn: P2O5: 10ppm (10 mg/l)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập vi khuẩn

Bước 1: Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân

- Dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất vùng cạnh rễ và vùng xung quanh rễ (cách rễ

0 - 1cm) cho vào lọ chứa đã tiệt trùng, bảo quản lạnh (4-5oC) (Viện Thổ nhưỡng Nông Hóa, 1998)

- Cân 1g mẫu đất vùng rễ cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml nước cất

vô trùng, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu Đem các bình tam giác lên máy lắc khoảng 2 giờ

- Sau khi lắc, tiến hành pha loãng mẫu 10, 100, 1000 lần, rồi nhỏ mỗi nồng độ pha loãng lên đĩa petri có chứa môi trường phân lập

- Tiến hành phân lập song song trên hai môi trường NBRIP và Burk’s:

 Dùng que gạt phân phối dịch mẫu trãi đều khắp dịch mặt thạch trên hai môi trường NBRIP và Burk

 Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh 2-3 ngày để vi khuẩn phát triển

Bước 2: Làm thuần

- Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường đĩa nuôi cấy, cấy chuyển nhiều lần sang môi trường như trên đến khi các khuẩn lạc rời và đều so với các khuẩn lạc khác trên môi trường

- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần Cách chuẩn bị mẫu

vi khuẩn:

 Từ một khuẩn lạc rời cấy vào một ống nghiệm chứa môi trương phân lập rồi ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh cho đến khi phát triển tốt

 Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn

 Nhỏ 30 µl nước cất vô trùng lên lam kính

 Khủ trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

 Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn trong ống nghiệm trải đều lên giọt nước trên lam kính

 Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với lam kính và giọt nước ép một góc 45o, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí

 Quan sát kiểm tra độ ròng của mẫu

- Nếu mẫu ròng thì cấy vào ống nghiệm chứa môi trường phân lập đễ trữ mẫu ròng

Bước 3: chọn lọc dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân:

- Cấy chuyển những dòng vi khuẩn đã ròng khi phân lập trên môi trường NBRIP sang môi trường Burk’s (không đạm)

- Cấy chuyển những dòng vi khuẩn đã ròng khi phân lập trên môi trường Burk’s (không đạm) sang môi trường NBRIP

- Đĩa môi trưởng đã cấy mẫu được ủ trong tủ ủ vi sinh 2-3 ngày để vi khuẩn phát triển

- Sau khi ủ 2-3 ngày tiến hành quan sát đánh giá những dòng vi khuẩn phát triển được trên 2 môi trường

3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Hình dạng và chuyển động của vi khuẩn cũng được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc

Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường

Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước centimet (cm) Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát

3.3.4 Xác định hàm lượng NH 4 + do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp Indophenol Blue

Đây là phương pháp xác định hàm lượng NH4+ bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế (Spectrophotometer) tại bước sóng 636 nm (phương pháp so màu Indophenol Blue) theo nguyên tắc:

Ion hypochloride NaOH

Chuẩn bị:

- Chủng 1 ml vi khuẩn gốc vào ống falcon 50-ml có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và tiến hành đo khả năng cố định đạm từng dòng vi khuẩn sau 2,4,6 và 8 ngày nuôi trên máy lắc 120 vòng/phút

* Các bước tiến hành định lượng đạm tổng hợp:

Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+

Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần như bảng sau:

Bảng 3: Thành phần của dãy đường chuẩn NH 4 +

Hình 3: Phản ứng tạo màu xanh molypdate của đường chuẩn

(ngày 22/10/2013)

0 1 2 3 4 5

Bước 2: Chuẩn bị mẫu đo: H2O (2 ml) + mẫu (0,5 ml) + Nitroprusside (1 ml) + Sodium Hypochloride (2 ml) Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút cho phản ứng màu tạo ra theo nguyên tắc nồng độ NH4+

càng cao thì màu xanh càng đậm dần

Bước 3:

Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 636 nm

Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đó tiến hành

đo OD các mẫu chuẩn bị

Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có NH4+ , không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần

Từ giá trị OD tương ứng với hàm lượng đạm đã biết, dùng chương trình vẽ đồ thị trong phần mềm Excel xác định phương trình đường chuẩn NH4+

Bảng 4: Giá trị đường chuẩn NH 4 +

Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính hàm lượng

NH4+ các mẫu còn lại: x = (y-b)/a

Từ kết quả trên sẽ đánh giá sơ bộ về khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được và trên cơ sở đó chọn những dòng tạo hàm lượng NH4+ cao

Phương trình đường chuẩn NH 4 + : y = a*x + b