khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn bacillus megaterium v1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

LÔNG GIA CẦM CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS MEGATERIUM V1

TS BÙI THỊ MINH DIỆU LÂM KIỀU DIỄM

MSSV: 3103948 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

LÔNG GIA CẦM CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS MEGATERIUM V1

TS BÙI THỊ MINH DIỆU LÂM KIỀU DIỄM

MSSV: 3103948 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

Bùi Thị Minh Diệu Lâm Kiều Diễm DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

-- -

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:

Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

TS Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng góp ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Nguyễn Thị Pha – Cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học, khóa 36 – trường Đại học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện

và hoàn thành luận văn này

Tập thể lớp Vi sinh vật học, khóa 36 cùng lớp bạn Công nghệ Sinh học, khóa 36

đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 16 tháng 11 năm 2013

Lâm Kiều Diễm

TÓM LƢỢC

Lông vũ chứa khoảng 90% keratin và được thải ra với một khối lượng lớn từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm làm ô nhiễm môi trường Sử dụng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn để xử lý nguồn chất thải chứa keratin này có ý nghĩa thiết thực trong ngành công nghiệp, nông nghiệp như chế biến thức ăn gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium V1 Kết quả khảo sát cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi khuẩn này là 3 ngày

Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong môi trường pH 8 tại nhiệt độ thích hợp là 35 o

C Hoạt động của vi khuẩn bị ức chế khi môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose (1% w/v) Trong khi đó, môi trường có bổ sung rỉ đường (1% w/v), mật số vi khuẩn cho giá trị cao nhất nhưng khả năng phân hủy bột lông lại giảm Ngoài bã đậu nành giúp làm tăng mật số vi khuẩn, các nguồn nitơ khác khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bột lông là nguồn dinh dưỡng duy nhất

Từ khóa: Bacillus megaterium, môi trường nuôi cấy tối ưu, phân hủy bột lông

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH iv

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về lông gia súc – gia cầm 2

2.2 Cấu trúc keratin 3

2.3 Enzyme keratinase 4

2.4 Sơ lược về vi sinh vật phân hủy keratin 5

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của lông gia cầm 6

2.5.1 Các yếu tố vật lý 6

2.5.2 Các yếu tố dinh dưỡng 7

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Địa điểm - Thời gian 13

3.1.2 Giống vi khuẩn 13

3.1.3 Vật liệu 13

3.1.4 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 13

3.1.5 Hóa chất 14

3.1.6 Thiết bị - dụng cụ 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống 15

3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 15

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 15

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 16

3.2.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 17

3.2.6 Phương pháp phân tích 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 20

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 21

4.3 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 24

4.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn 28

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ 2

Bảng 2 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía……….8

Bảng 3 Thành phần bã đậu nành 9

Bảng 4 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng 13

Bảng 5 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn 14

Bảng 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm………22

Bảng 7 Kết quả thí nghiệm 1

Bảng 8 Kết quả thí nghiệm 2

Bảng 9 Kết quả thí nghiệm 3

Bảng 10 Kết quả thí nghiệm 4

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 1 Cấu trúc keratin 4 Hình 2 Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian 20 Hình 3 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số vi

khuẩn 25 Hình 4 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân

hủy bột lông của vi khuẩn 26 Hình 5 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn 28 Hình 6 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân

hủy bột lông của vi khuẩn 29

Hình 7 Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến mật số vi khuẩn Hình 8 Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến khả năng phân hủy bột

lông của vi khuẩn………

CFU Colony Forming Unit

rpm Rotation per minute

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam đang trong quá trình đẩy mạnh công nghiệp hóa – đô thị hóa và cùng với đó là sự gia tăng các loại rác thải, do vậy công tác quản lý rác thải cần được thực hiện một cách nghiêm ngặt để tránh ô nhiễm môi trường Một trong những loại rác thải khó phân hủy là rác thải được thải ra trong quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia cầm, phế phẩm lông là khó xử lý nhất do thành phần chính của chúng là keratin, một loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần thời gian rất lâu để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên

Chất thải lông gia súc – gia cầm thường được xử lý bằng cách chôn lấp hoặc đốt cháy và thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường đất, nước và không khí, cho nên đòi hỏi cần phải có biện pháp xử lý mới tốt hơn cho các loại phế phẩm này; mục tiêu là vừa có khả năng phân hủy chúng và không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Công nghệ sinh học mà cụ thể là công nghệ vi sinh vật chính là chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề này Do bản chất của lông

là protein nên vi khuẩn hoàn toàn có khả năng phân hủy được chúng thông qua hoạt

động của hệ enzyme keratinase Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm

Minh Triết (2013) phân lập và đánh giá là một trong những chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc – gia cầm đạt hiểu quả cao Tuy nhiên, sự phát triển cũng như khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường nuôi cấy Do đó, việc xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp là một nghiên cứu cần thiết trước khi đưa chủng vi khuẩn này vào ứng dụng thực tế

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium V1” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho dòng vi khuẩn

Bacillus megaterium V1 phân hủy lông gia cầm đạt hiệu quả cao nhất

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về lông gia súc – gia cầm

Lông là một phế phẩm sinh ra với số lượng lớn tại các cơ sở giết mổ gia súc – gia cầm và nhà máy chế biến thực phẩm, khối lượng lên đến hàng tỷ tấn mỗi năm trên toàn thế giới (Gousterova et al., 2005) Thành phần chủ yếu trong lông là keratin, các chất thải giàu keratin này khó phân hủy và ngày càng tích lũy nhiều trong tự nhiên, góp phần gây ra vấn đề ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, sự phân hủy các chất thải chứa keratin vẫn mang lại những lợi ích thiết thực trong ngành công – nông nghiệp như chế biến thức ăn thủy sản, gia súc, gia cầm và sản xuất phân bón,

Bảng 1 Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ

Protein và các acid amin Hàm lượng (g/kg)

Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là  - keratin, nên chất thải lông được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi Nước ta là nước công nghiệp hóa – hiện đại hóa nhưng việc sản xuất lông vũ làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế Không những tiêu tốn năng lượng

và gây ô nhiễm môi trường, quy trình sản xuất này còn phá hủy một số acid amin, làm cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997)

Ngày nay, công nghệ vi sinh vật đang trên đà phát triển mạnh mẽ và đã mở ra một hướng đi mới, phân hủy chất thải lông bằng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của một số dòng vi khuẩn nhằm tạo ra một nguồn protein có tỉ lệ dinh dưỡng cân bằng hơn, cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế các nguồn protein đắt tiền khác, và đồng thời còn giúp hổ trợ xử lý các nguồn rác thải

có chứa nhiều cơ chất keratin để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

2.2 Cấu trúc keratin

Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, nó hình thành màng bảo vệ cho toàn

bộ động vật có xương sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ, Theo cấu trúc

cơ bản bậc hai, keratin đã được phân loại vào α (α - helix của tóc) và β (β - sheets của lông) (Voet và Voet, 1995; Akhtar và Edwards, 1997) Các sợi keratin ở cả hai dạng α

- helix và β - sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định của sợi (Zerdani et al., 2004) Ngoài ra, keratin cũng được nhóm lại thành hai loại: keratin cứng hiện diện nhiều ở tóc, móng guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao, thường rất cứng và không thể co giãn được Trong khi đó, keratin mền hiện diện ở da

và mô sẹo, có hàm lượng cầu nối disulfide thấp và mền dẻo hơn Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ vào những cầu nối disulfide, liên kết hydro và tương tác kỵ nước làm cho keratin có khả năng kháng lại tác động của các tác nhân phân hủy vật lý, hóa học và sinh học Keratin không tan trong nước, acid loãng, kiềm và dung môi hữu cơ, cũng như không bị phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein như pepsin, trypsin, papain (Veslava et al., 2009) Mặc dù keratin là loại protein khó phân giải nhưng một số loại

vi khuẩn, actinomycetes và nấm phân lập từ đất chôn chất thải giàu keratin có thể phân

hủy keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính enzyme keratinase tạo ra (Onifade et al., 1998; Riffel và Brandelli, 2006)

(*Nguồn: http://anthonydynar.blogspot.com/2013/05/science-of-perms.html, ngày 27/08/2013)

2.3 Enzyme keratinase

Keratinase thuộc họ protease có khả năng tấn công các mạch keratin và đóng vai trò quan trọng trong ứng dụng phát triển các phụ phẩm lông vũ giá thành thấp thành thức ăn chăn nuôi và phân bón Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, hoạt động mạnh với khoảng pH và nhiệt độ rộng Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt, chúng

có thể phân giải protein có sợi như: fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợi như: casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin,

Tuy keratin là một dạng protein khó bị phân hủy, nhưng thực tế ngoài tự nhiên các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn bị phân hủy Điều này có được là do hoạt động của các vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng sinh ra keratinase Tuy nhiên, khả năng tạo ra keratinase của vi sinh vật phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và cả điều kiện của môi trường Đây

được xem như một nguồn enzyme quan trọng có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,…

Hình 1 Cấu trúc của keratin

Các keratinase từ vi khuẩn thường được sản xuất dưới điều kiện chìm và lắc, ngoại trừ các dòng vi khuẩn chịu nhiệt (Nam et al., 2002; Riessen và Anttranikian 2001) và nấm (Kaul và Sambali 1999; Singh 1999) thì lên men chìm tĩnh Tuy nhiên, chưa có bài báo nào nói về lên men rắn cho sự sản xuất keratinase Một điều thú vị được phát hiện là lượng ezyme keratinase được sản xuất và sự phân hủy keratin không

tỷ lệ thuận với nhau Do đó, sự phân giải keratin không thể xem là dấu hiệu cho sự sinh keratinase và ngược lại với nhiều tài liệu cho thấy thời gian keratinase được sản sinh và sự phân hủy keratin khác nhau (Williams et al., 1990; Cheng et al., 1995; Sangali và Brandelli 2000; Kim et al., 2001; Ramnani và Gupta 2004; Thys et al., 2004) Điều này được cho là do các cơ chế phức tạp của sự phân giải keratin của các vi sinh vật

Phần lớn keratin bị phân hủy do tác động của keratinase tiết ra từ tế bào vi khuẩn, tuy nhiên theo nhiều báo cáo nghiên cứu, các tế bào vi khuẩn cũng giữ một vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy cơ chất chứa keratin Những thành phần disulfide reductases, sulfite, thiosulfate và keratinase có trong tế bào giúp bẻ gãy các cầu nối disulfide hỗ trợ cho quá trình phân hủy của enzyme ngoại bào được tốt hơn Như vậy,

có thể nói rằng, quá trình phân hủy keratin bao gồm hai bước là phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy protein (Gupta và Rammani, 2006)

2.4 Sơ lƣợc về vi sinh vật phân hủy keratin

Những dòng vi khuẩn sản sinh ra karatinase phân giải β – keratin được tìm thấy

trong lông gia cầm Các dòng này chủ yếu thuộc chi Streptomyces và Bacillus Vi

khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực

vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không

bắt buộc và hình thành nội bào tử Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

rất đa dạng Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám

Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được

mô tả có khả năng phân hủy keratin tốt (Manczinger et al., 2003) Bacillus

licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất, nhiệt độ tăng

trưởng tối ưu khoảng 30°C, sinh enzyme tối đa ở 37°C và có khả năng sinh bào tử ở môi trường khắc nghiệt

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô

hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ

từ 3 – 45o

C, tối ưu khoảng 30o

C Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên đến 63o

C Bacillus megaterium đã được sử

dụng trong công nghiệp hơn 50 năm, vì nó sở hữu một số enzyme rất hữu ích và là nguồn sản xuất exoenzymes dồi dào, vi khuẩn này được chọn lọc về khả năng của chúng để phân giải các chất hữu cơ và khả năng chuyển hóa các protein, carbohydrate, các chất béo, các chất dầu và các acid hữu cơ Nó được ứng dụng rộng rãi trong xử lý môi trường

Các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được tìm

thấy là các vi khuẩn Gram dương như: Arthrobacter sp (Lucas et al., 2003),

Microbacterium sp (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) Một số

dòng vi khuẩn Gram âm cũng có khả năng phân giải keratin như: Xanthomonas,

Vibrio, Stenotrophomonas, Chryseobacterium (Sangali và Brandelli, 2000; De Toni et

al., 2002) Bên cạnh đó, nhóm xạ khuẩn và nấm cũng có khả năng phân giải keratin

như: Streptomyces fradiae (Novel và Nickerson, 1959), Streptomyces sp A11 (Mukhopadhyay, Chandra, 1990), Streptomyces pactum (Bockle et al., 1995),

Streptomyces albidoflavus (Letourneau et al., 1998), Streptomyces thermoviolaceus

SD8 (Chitte et al., 1999) Chrysosporium, Aspergillus, Scopulariopsis, Sepedonium,

Alternaria, Penicillium, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis, Monodictys, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Doratomyces, Trichurus (Gradisar et al., 2000) Hoạt tính keratinase giúp phân giải keratin trong

nước còn được biểu hiện ở một số loài vi khuẩn chịu nhiệt như: Fervidobacterium

pennavorans (Friedrich và Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus

(Riessen and Antranikian, 2001), Fervidobacterium islandcum (Nam et al., 2002) và các dòng vi khuẩn ưa kiềm như: Nesternkonia sp AL-20 (Gessesse et al., 2003) và

Nocardiopsis sp TOA-1 (Shinju et al., 2004)

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của lông gia cầm

2.5.1 Các yếu tố vật lý

Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Các thông số vật lý cho sự sản xuất của vi sinh vật chuyên

biệt theo loài và vì thế thay đổi tùy theo từng dòng vi sinh vật Các giá trị pH kiềm nằm trong khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase và sự phân hủy lông gia cầm ở hầu hết các vi khuẩn Giá trị pH kiềm được cho là kích thích sự phân hủy keratin do làm biến đổi các cystine thành lathionine khiến cho keratinase dễ dàng tiếp cận cơ chất Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng từ 28 – 50o

C

ở hầu hết các vi khuẩn Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp kr6 phát triển tối ưu ở

nhiệt độ 30o

C và pH 8,0 và hoạt động phân hủy lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt

độ này (Riffel et al., 2003) Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là 30o

C,

và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại (Sangali et al., 1999) Theo Sinoy et al (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng

Bacillus sp phát triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30oC – 40oC và pH tối ưu là 6 –

8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ, pH này

2.5.2 Các yếu tố dinh dƣỡng

Nguồn carbon

Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3, ) hoặc chất hữu cơ Fructose, glucose, sucrose, lactose, galactose, starch, glycerol, maltose và dextrose là những nguồn carbon tốt nhất đối với quá trình sản sinh ra enzyme keratinase bằng vi sinh vật Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: một là thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Trên thế giới hầu như không có hợp chất carbon hữu cơ nào mà không bị hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải Không ít vi sinh vật

có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu

mỏ, parafin, khí thiên nhiên

Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân

để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấu thụ Người ta thường sử dụng đường

để làm thức ăn carbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau Với vi khuẩn người ta thường dùng 0,5 – 0,2% đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 – 10% đường

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường Thành phần chính của rỉ đường là đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và fructose Thành phần chính xác của rỉ đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy, đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và

độ nhớt Bảng 2 cho thấy biến động của các thành phần của rỉ đường

Bảng 2 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía (%)

(*Nguồn: Wolfrom vaf Binkley, 1953)

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ không đường và chất khoáng Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu Bên cạnh

đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin – kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Theo kết quả nghiên cứu của Mohammad et al (2007), bổ sung nồng độ rỉ đường với 1% thúc đẩy sự hoạt động của enzyme phân hủy lông gia cầm ở dòng vi khuẩn

Các dạng nitơ hữu cơ không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật Theo nghiên cứu của Mohammad et al (2007), NH4Cl được bổ sung với nồng độ 0,1% (w/v) cho kết quả là hoạt động enzyme tăng thêm 12% Trong trường hợp bổ sung cả rỉ đường và NH4Cl với nồng độ lần lượt là 1%

(w/v) và 0,1% (w/v), sự phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn Bacillus

licheniformis MZK-3 đạt hiệu quả cao

Bột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh enzyme (Cheng et al., 1995; Gradisar et al., 2000)

Bã đậu nành là phế phẩm thu được trong quá trình sản xuất sữa đậu nành hoặc đậu phụ (bánh đậu hủ) Bã đậu được loại bỏ trong quá trình sản xuất, có các thành phần như sau:

Bảng 3 Thành phần bã đậu nành

(*Nguồn: http://www.dost-bentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1246, ngày 26/11/2013)

Trong bã đậu nành vẫn giữ được khá đầy đủ các acid amin của đậu nành; 1kg bã đậu nành có 0,8g canxi, 0,6g phosphate Bã đậu nành thường dùng trong chế biến thức

ăn gia súc, gia cầm và thức ăn thủy sản, vì vậy đây là nguồn nguyên liệu giá rẻ thích hợp dùng làm chất cảm ứng sinh enzyme keratinase

2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ và vẫn chưa có nghiên cứu ứng dụng vào thực tế Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Hương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ

khuẩn và 15 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng

xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh

Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) đã phân lập một số dòng vi khuẩn (Bacillus sp Đ.NĐ 1.2, Bacillus sp Đ.HY 1.1, chủng L.HY 2.6 và L.TO 2.1) có khả năng phân hủy

lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Điều kiện thích hợp cho các chủng

vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy Tuy nhiên, vẫn chưa thấy báo cáo nào về ứng dụng các dòng vi sinh vật đã phân lập

Đinh Thị Bé Hiền (2011) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 19 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lông gia súc Trong đó, dòng vi khuẩn K13, dòng O3 và dòng K8 cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân giải lông gia súc lần lượt là 63,38%, 60,9% và 58,33%

Bùi Thị Minh Diệu et al (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả đánh giá khả năng phân giải lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối lượng bộtlông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37o

C Ngoài ra các dòng

vi khuẩncó khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày lắc ủ Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng phân giải lông gà hiệu quả nhất Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng

Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương

đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%

Nguyễn Thu Hiền et al.(2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã

phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ

Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên

cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối

ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 – 8, nhiệt độ

35C, nồng độ lông là 20g/l

2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng của enzyme này Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp

Mohammad et al (2007) nghiên cứu sự phát triển và hoạt tính keratinase của

dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phân lập từ chất thải gia cầm Dòng vi

khuẩn này phát triển và sinh enzyme tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40°C Khả năng phân hủy keratin tăng 12% trong môi trường có bổ sung NH4Cl với tỉ lệ 0,1% (w/v) và tăng 30% khi bổ sung rỉ đường với tỉ lệ 1% (w/v)

Bo Xu et al (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là

Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10) Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8

Onuoha et al (2011) đã chọn ra dòng vi khuẩn Bacillus sp D4 có khả năng phân

hủy lông vũ cao, pH tối ưu của dòng vi khuẩn này là 10 và phát triển tốt nhất ở nồng

độ bột lông từ 6 – 7% (w/v)

Hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có khả năng phân

hủy tóc, móng và lông gia súc đã được phân lập bởi Savitha et al (2010) Enzyme của chúng có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thịt, đồng thời enzyme được sản xuất từ các dòng vi khuẩn này cũng được sử dụng để xử lý các loại rác thải chứa keratin

Kết quả nghiên cứu của Riffel et al (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium

sp dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy Dòng

vi khuẩn này có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30ºC và pH tối ưu 8,0 Dưới điều

kiện này, hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa Nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính của keratinase bị ức chế bởi EDTA, Hg2+

, Cu2+ và được kích hoạt bởi Ca2+

Joshi et al (2007) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus sp PW-1 có khả

năng phân hủy lông vũ từ chất thải gia cầm Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò là nguồn carbon, niteogen và lưu huỳnh Theo

kết quả nghiên cứu của Agrahari et al (2010), ba dòng vi khuẩn B megaterium SN1,

B thuringenesis SN2, B pumilis SN3 phân lập từ bãi đất chôn lông gia cầm có khả

năng phân hủy lông gà và lông bồ câu sau 120 giờ nuôi cấy

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm - Thời gian

- Thời gian thực hiện: từ tháng 08/2013 đến 11/2013

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm Minh Triết (2013) phân lập

từ nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm do phòng thí nghiệm SHPT Thực Vật tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp

- Dịch rỉ đường được lọc qua vải lọc, loại bỏ các phần xác bã mía, bảo quản trong bình thủy tinh ở nơi khô mát

- Bột đậu nành, bã đậu nành và bột bắp được nghiền mịn, sấy khô ở 80°C trong 48 giờ, bảo quản trong ống nghiệm

3.1.4 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 4 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng

Bảng 5 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn

 Hoá chất dùng để nuôi cấy các dòng vi khuẩn:

K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, Glucose, Sucrose, NH4Cl, Yeast extract

- Cân điện tử (Sartorius Teg101 – Đức)

- Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha)

- Bộ micropipette (NichipetEX – Nhật Bản)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational – Ý)

- Kính hiển vi (Olympus U-CMAD3, Nhật Bản)

- Máy lắc mẫu (New Brunswich Scientific – Hoa Kỳ)

- Đĩa petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh

- Một số dụng cụ khác như: ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay, khẩu trang y tế, đèn cồn, bình hút ẩm,

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống

Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường bột lông vũ rắn, ủ ở 37o

C trong hai ngày Sau đó cấy vào bình chứa 100ml môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, nuôi tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37oC trong 48 giờ Rút 1ml dịch nuôi cấy tiến hành đếm mật số vi khuẩn Mật số cần đạt khoảng 108

CFU/ml Trữ lạnh bình nuôi tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4o

C

3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

 Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời

gian nuôi cấy thích hợp của dòng vi khuẩn B megaterium V1.

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian: ngày

1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5, ngày 6, ngày 7

- Số lần lặp lại: 3 lần

- Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức

- Số đơn vị thí nghiệm: 21

 Các bước thực hiện:

 Chuẩn bị 3 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng

 Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút

 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC

 Mỗi ngày rút 100µL trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy

 Chỉ tiêu theo dõi: Mật số của vi khuẩn

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Xác định mức nhiê ̣t đô ̣ và pH thích hợp cho sự sinh trưởng , phát triển và phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

 Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút

 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với các mức nhiệt độ như bố trí thí nghiệm

 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn

 Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm

 Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến

sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát

triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn B megaterium V1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ và pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2

- Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố thí nghiệm là nguồn dinh dưỡng chứa carbon như: glucose, sucrose, rỉ đường và bột bắp với nồng độ 1% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng carbon

- Số lần lặp lại: 3 lần

 Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút

 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với mức nhiệt độ chọn ra từ thí nghiệm 2

 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn

 Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm

 Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm

3.2.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sư ̣ phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát

triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn B megaterium V1

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiêt độ và pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2

- Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố thí nghiệm là nguồn dinh dưỡng chứa nitơ như: yeast extract, bột đậu nành, bã đậu nành, NH4Cl với nồng độ 0,5% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa nitơ

- Số lần lặp lại: 3 lần

- Tổng số nghiệm thức: 5 nghiệm thức

- Số đơn vị thí nghiệm: 15

 Các bước thực hiện:

 Chuẩn bị 12 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng; lần lượt bổ sung vào các bình thủy tinh các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm Ba bình không bổ sung các nguồn nitơ được dùng làm mẫu đối chứng Điều chỉnh pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2

 Đậy kín miệng bình và đem khử trùng ở 121ºC trong 15 phút

 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với mức nhiệt độ chọn ra từ thí nghiệm 2

 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn

 Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm

 Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm

3.2.6 Phương pháp phân tích

a Xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy

 Mục đích: Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau

 Khối lượng bột lông còn lại sau khi phân hủy = G2 – G1

 Tỉ lệ phần trăm lông bị phân hủy bởi vi khuẩn được tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):

A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐTrong đó: A (%) là tỉ lệ lông bị phân hủy bởi vi khuẩn

mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu

mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy

 Hút 10µL trong eppendorf ở độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị trước Dùng que trãi trãi đều mẫu trên đĩa môi trường

 Ủ ở 37oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường

 Số tế bào vi khuẩn trong 1 mL dịch nuôi cấy (CFU/mL) tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức

Trong đó: Di: độ pha loãng

Ci: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di Vi: thể tích dịch huyền phù vi sinh vật cho vào đĩa petri

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

Đường sinh trưởng của vi khuẩn thể hiện các giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy Nhờ vào đường sinh trưởng người làm nghiên cứu có thể xác định được thời điểm thích hợp để tiến hành thực hiện các thí nghiệm

Hình 2 Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian

Ghi chú: các giá trị thể hiện trên hình là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn B megaterium V1 cho thấy

mật số vi khuẩn tăng lên theo mỗi ngày từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 và có đấu hiệu giảm ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7 (Hình 2) Ở ngày thứ 1, 2 mật số vi khuẩn có sự thay đổi, mật số vi khuẩn tăng từ 8,87 log (CFU/mL) lên 9,06 log (CFU/mL) Ở ngày thứ 3 mật số vi khuẩn đạt cao nhất là 9,37 log (CFU/mL), và sau đó mật số vi khuẩn có sự giảm nhẹ theo từng ngày và thấp nhất ở ngày thứ 7 là 9,24 log (CFU/mL)

Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy mật số tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 2, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% Nguyên nhân là do đây là khoảng thời gian đầu vi khuẩn được đưa vào môi trường mới, cần có thời gian để vi khuẩn thích nghi và tổng hợp nên hệ enzyme cần thiết để phân giải nguồn dinh dưỡng của môi trường Sau khi đã thích nghi với môi trường, vi khuẩn bắt đầu tăng trưởng nhanh

và đạt mật số cao nhất ở ngày thứ 3, tuy mật số vi khuẩn đạt cao nhất nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6 Nguyên nhân