Tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm

các bệnh nhân ung thư cho thấy chúng có hoạt tính sinh học với khả năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, không bị kết tủa và sử dụng dễ dàng nên được sử dụng nhiều trong phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đào Trọng Khoa

TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI

Ở QUY MÔ NỒI LÊN MEN VÀ TẠO CÔNG THỨC

BÁN THÀNH PHẨM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số chuyên ngành: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Trương Nam Hải

PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2015

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và PGS TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng

Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng như cuộc sống

Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh nói riêng cũng như trong toàn Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin được gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn chân thành nhất vì

đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội ngày 16 tháng 06 năm 2015

Học viên cao học

Đào Trọng Khoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về bệnh ung thư 4

1.1.1 Khái niệm về bệnh ung thư 4

1.1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư 10

1.2 Tổng quan về Interleukin-2 11

1.2.1 Cấu trúc của Interleukin-2 11

1.2.2 Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2 13

1.2.3 Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư 15

1.3 Hệ thống lên men nuôi cấy E coli tái tổ hợp 17

1.4 Tinh sạch protein dạng thể vùi 19

1.4.1 Tổng quan về tinh sạch protein 19

1.4.2 Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 22

1.5 Công thức pha chế bán thành phẩm 24

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Chủng giống và vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Chủng vi khuẩn E coli BL21 DE3 28

2.1.2 Vector biểu hiện 28

2.1.3 Hóa chất 29

2.1.4 Máy móc và thiết bị 29

2.1.5 Các môi trường và dung dịch 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E coli ở quy mô nồi lên men 5 lít 32

2.2.2 Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2 33

2.2.3 Phương pháp tinh chế Interleukin-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 34

2.2.4 Kiểm tra sản phẩm protein bằng điện di SDS-PAGE 35

2.2.5 Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western

Blot 36

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm và đông khô 38

2.2.7 Phương pháp xử lý kết quả điện di SDS-PAGE bằng phần mềm Quantity One 40

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn 42

3.1.1 Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít 42

3.1.2 Khảo sát thành phần dinh dưỡng 44

3.1.3 Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E coli BL21 IL-2 46

3.1.4 Lên men chủng E coli BL21 IL-2 đợt 2 47

3.2 Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp 48 3.3 Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC 54

3.4 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One 57

3.5 Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

DNA Deoxyribonucleotide acid

dOT Dissolved oxygene tension

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediamin tetra-acetic acid

FDA Food and Drug Administration

GnHCl Guanidine hydrochloride

HIV Human Immunodeficiency Virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IARC The International Agenecy for Research on Cancer

IL-2 Interleukin-2

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

LAK Lymphokine-Activated Killer cell

LB Môi trường Luria-Bertani

LBA Môi trường LB có bổ sung Amp

OD Optical density

PBS Phosphate buffer saline

PEG Polyethylene glycol

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

PVDF Polyvinylidene fluoride

rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE SDS-polyacylamide gel electrophoresis

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamin

TBS Tris buffer saline

TFA Trifluoroacetic acid

TMB Tetramethylbenzidine

TTBS Dung dịch TBS bổ sung Tween-20

WHO World Health Organization

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy xương

Hình 2 Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2

Hình 3 Đích tác động của Interleukin-2

Hình 4 Tác động của Interleukin-2 đến tế bào T

Hình 5 Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ

Hình 6 Hệ thống tinh sạch protein HPLC

Hình 7 Bản đồ vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen)

Hình 8 Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau khi lên men bằng hệ thống lên men 5 lít Hình 9 Điện di sản phẩm protein tổng số trong điều kiện thay đổi thành phần chất

dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy

Hình 10 Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng

(E coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2)

Hình 11 Lên men chủng tái tổ hợp E coli BL21 IL-2 đợt 2

Hình 12 Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian

Hình 13 Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, xử lý ly tâm

thu tủa không tan

Hình 14 Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, giảm nồng

độ GuHCl để thu hồi protein ở dạng tủa

Hình 15 Sơ đồ tóm tắt quá trình xử lý thô để thu hồi protein IL-2

Hình 16 Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình phá tế bào và xử lý thu

protein thô

Hình 17 Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC

Hình 18 Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình tinh chế HPLC

Hình 19 Xác định thành phần độ tinh khiết của protein bằng phần mềm Quantity One Hỉnh 20 Sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm Hình 21 Điện di kiểm tra các mẫu hoàn nguyên sau khi đông khô

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học

Bảng 2 Một số oncogene và tumor suppressor gene liên quan đến ung thư ở người Bảng 3 Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cô)

Bảng 4 Bảng công thức pha chế bán thành phẩm

Bảng 5 Bảng tiêu chuẩn đánh giá độ đục của sinh phẩm

Bảng 6 Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2

bằng phần mềm Quantity One

Bảng 7 Độ đục của các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm

MỞ ĐẦU

Ngày nay, thế giới đang ngày càng nhận thức rõ mức độ nghiêm trọng của các bệnh không lây nhiễm nói chung và bệnh ung thư nói riêng đối với sức khỏe con người Ước tính riêng ở Hoa Kỳ năm 2014, có 1 665 000 ca nhiễm ung thư mới được phát hiện và gần 586 000 người tử vong do ung thư, trung bình 1600 ca mỗi ngày [22] Theo ghi nhận của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), số trường hợp mắc ung thư mới đã tăng từ 12,7 triệu trường hợp năm 2008 lên 14,1 triệu trường hợp năm

2012, và vẫn có xu hướng tăng lên Các quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nhất là các nước có thu nhập thấp và trung bình, vì các nước này thiếu các trang thiết bị cần thiết để đối phó với sự gia tăng của các trường hợp ung thư [23]

Hiện nay có 5 phương pháp điều trị ung thư chính đó là phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, liệu pháp gene và liệu pháp miễn dịch, trong đó liệu pháp miễn dịch ngày càng được nghiên cứu sâu rộng và ứng dụng rộng rãi nhờ có nhiều ưu điểm là

an toàn, hiệu quả và không có tác dụng phụ Liệu pháp miễn dịch là sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ hệ miễn dịch của cơ thể để tiêu diệt tế bào ung thư đồng thời

hỗ trợ sức sống cho các tế bào bình thường khác trong cơ thể Một trong các loại sản phẩm đó là cytokine, với nhiều loại khác nhau do nhiều loại tế bào tiết ra Các cytokine đã được nghiên cứu từ lâu với mục đích điều trị và hỗ trợ điều trị cả bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm của người, trong đó Interleukin-2 là một trong những loại cytokine được nghiên cứu sớm nhất

Interleukin-2 (IL-2) từ lâu đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc hỗ

trợ điều trị hai loại ung thư thận và ung thư hắc tố Trước đây, IL-2 dùng cho điều trị được tách chiết tự nhiên từ tế bào T hoặc là từ các tế bào động vật nuôi cấy, phương pháp này có nhược điểm là hàm lượng IL-2 tách chiết được cũng như hoạt tính riêng khá thấp không đáp ứng được yêu cầu điều trị Để khắc phục những hạn chế trên, IL-2 chủ yếu được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp Hiện nay sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp dạng thương phẩm (Proleukin®) đã được bán rộng rãi ở trên thế giới Sự thử nghiệm chế phẩm Proleukin®IL-2 trên đối tượng động vật và trên

các bệnh nhân ung thư cho thấy chúng có hoạt tính sinh học với khả năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, không bị kết tủa và sử dụng dễ dàng nên được sử dụng nhiều trong phương pháp miễn dịch trị liệu để điều trị ung thư [39, 45], tuy

nhiên giá thành của sản phẩm hiện tại khá cao (2532 USD/ ống 1,3mg) [19] đặc biệt

là so với thu nhập bình quân đầu người của các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Vì vậy hiện nay Nhà nước và Bộ Y Tế đang rất khuyến khích việc nghiên cứu và sản xuất sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp của Việt Nam để hỗ trợ điều trị ung thư

Đề tài nghiên cứu KC.04.21/06-10 đã cho những kết quả nghiên cứu biểu

hiện Interleukin-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli khá khả quan ở cả quy

mô phòng thí nghiệm và ở hệ thống lên men 5 lít Tuy nhiên để đảm bảo sản phẩm Interleukin-2 có cấu trúc hoàn toàn giống với sản phẩm thương mại Proleukin, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xin cấp phép sử dụng sản phẩm sau này, protein IL-2 cần được cải biến để loại bỏ amino acid alanine ở đầu N Dự án “Hoàn thiện quy

trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp trên dòng tế bào E coli” giai

đoạn 2012-2015 được thực hiện nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất Interleukin-2 dạng cải biến

Giai đoạn đầu của dự án đã cho kết quả biểu hiện thành công IL-2 dạng cải biến ở quy mô phòng thí nghiệm Tuy nhiên để hướng tới sản xuất quy mô lớn và có khả năng ứng dụng thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2

ở quy mô lớn hơn trong hệ thống lên men Sau khi protein đã được biểu hiện thành công, cần có phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm Interleukin-2 và thiết lập công thức bổ sung các tá chất cần thiết trước khi tiến hành đông khô sản phẩm

để bảo quản

Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tinh chế Interleukin-2 người

tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công

thức bán thành phẩm” Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng

như tinh sạch IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để có thể sản xuất sản phẩm IL-2

người tái tổ hợp tiêu thụ trên thị trường Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2

người tái tổ hợp trên dòng tế bào E coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và ứng dụng

kết quả thu được từ nghiên cứu và triển khai của các đề tài:

(1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007

(2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2009-

2010

Đề tài được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 1 (Vabiotech), Bộ Y tế

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh ung thư

1.1.1 Khái niệm về bệnh ung thư

Ở hầu hết các mô và cơ quan của cơ thể trưởng thành, quá trình sản sinh ra các tế bào mới và quá trình tiêu diệt các tế bào già được giữ ở trạng thái cân bằng Mỗi loại tế bào khác nhau trong cơ thể có một thời gian tồn tại nhất định, sẽ được thay thế bằng bằng các tế bào mới có cùng chức năng khi tế bào đó chết đi Dưới các điều kiện bình thường, sự sản sinh của các tế bào mới được kiểm soát để số lượng một loại tế bào bất kỳ nào trong cơ thể là tương đối ổn định [5]

Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào Tất cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u (tumor) Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành ác tính (malignant) Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis) Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [4]

Hình 1 Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính

ở tủy xương [26]

Sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào bình thường dần tạo nên các khối u gồm nhiều lớp tế bào chồng chất lên nhau Nếu các tế bào khối u khu trú ở một vùng duy nhất của cơ thể, không có biểu hiện xâm lấn các mô xung quanh thì được gọi là khối u lành tính Ngược lại nếu các tế bào khối u tách khỏi vị trí ban đầu

và xâm lấn ra các mô khác của cơ thể thì được gọi là khối u ác tính Các khối u lành tính thường khá an toàn trừ khi kích thước của chúng quá lớn dẫn đến chèn ép các

cơ quan hoặc các cấu trúc sống khác Các khối u ác tính thì ngược lại, thường gây hậu quả nghiêm trọng vì xâm lấn đến các cơ quan khác, lan ra những mô ở xa hơn

và hình thành những khối u thứ cấp (di căn) gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của các cơ quan đó

Bảng 1 Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học

Thường có hoại tử trung tâm Không có vỏ bọc

Luôn tái phát

Di căn Ảnh hưởng lớn đến chức năng bình thường đến cơ thể

Trước kia các nhà nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện các nguyên nhân gây bệnh, vì vậy ung thư được xếp vào 3 nhóm dựa vào nguyên nhân gây bệnh như sau: (1) các virus gây ung thư, (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư, (3) một số trường hợp ung thư mang tính di truyền như bệnh ung thư ruột do di truyền có tên là Familial Polyposis, bướu Wilms

Vào các năm 1980 – 1990, khi các kỹ thuật di truyền được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, dù ung

thư có biểu hiện rất đa dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn nguyên của bệnh thực chất là do các sai hỏng của gene, hay nói cách khác là sự rối loạn của bộ máy di truyền [29] Tuy vậy, thông thường phải có vài sai hỏng xảy ra đồng thời mới chuyển một tế bào bình thường sang trạng thái ung thư Các nhà nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gene chính khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư Nhóm thứ nhất bao gồm các gene thúc đẩy quá trình phân chia tế bào một cách không kiểm soát, được gọi là các gene gây khối u

(hay gene ung thư, oncogene) Các gene gây khối u điển hình nhất được tìm thấy

đầu tiên ở các retrovirut Liên quan đến những gene này là các tiền gene gây khối u

(proto-oncogene) được tìm thấy ở các tế bào chủ Các tiền gene gây khối u có thể

đột biến thành các gene gây khối u Nhóm thứ hai bao gồm các gene khi ở dạng bình thường có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào, được gọi là các gene ức chế

khối u (tumor suppressor gene, còn gọi là gene kiềm chế gene ung thư) Một nhóm

các gene này trực tiếp tham gia vào các cơ chế sửa chữa DNA, nên khi bị đột biến chúng lại làm tăng tần số đột biến của những gene khác, vì vậy dạng đột biến của

chúng được gọi là các gene gây đột biến (mutator gene) [4]

Bảng 2 Một số gene ung thư và gene ức chế khối u liên quan đến ung thư ở người

[27]

Gene ung thư

Bcl-2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến

ung thư bạch cầu

c-myc Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi

L-myc Liên quan đến ung thư phổi

PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trưởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thư

não

RET Liên quan đến ung thư tuyến giáp

Ki-ras Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy

N-ras Liên quan đến ung thư máu

Gene ức chế khối u

APC Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày

DPC4 Mã hóa cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào,

liên quan đến ung thư tuyến tụy

p53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và

kích thích tế bào bất thường tự chết Liên quan đến rất nhiều loại ung thư

BRCA1 Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung

BRCA2 Liên quan đến ung thư vú

VHL Liên quan đến ung thư thận

WT1 Liên quan đến khối u Wilm của thận

Tế bào bình thường cần có tín hiệu sinh trưởng của tế bào để vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, một tế bào bình thường không thể tiến hành quá trình phân chia nếu không có đủ các điều kiện như đạt đến kích thước và sinh khối nhất định, tích lũy đủ chất dinh dưỡng, các quá trình nhân đôi DNA xảy ra chính xác; nếu như những sai hỏng trong quá trình sinh trưởng của tế bào quá nghiêm trọng và không thể sửa chữa được, các gene ức chế khối u sẽ khởi động quá trình cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) để bảo vệ tình toàn vẹn của hệ gene và duy trì số lượng tế bào ở một mức độ nhất định [36] Ở các tế bào khối u, một mặt các gene gây khối u hoạt động quá mức bình thường, dẫn đến việc tế bào luôn luôn nhận được các tín hiệu cho phép vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, mặt khác các gene ức chế khối u bị sai hỏng, dẫn đến quá trình apoptosis không xảy ra, các tế bào mang hệ gene sai hỏng vẫn tiếp tục tồn tại và phân chia

Douglas và Robert Weinberg đã đưa ra 6 cột mốc trong quá trình phát sinh ung thư ác tính [42] là:

- Các tế bào nhận được tín hiệu thúc đẩy tăng sinh tế bào (xuất hiện các gene gây ung thư)

- Các tế bào ung thư trở nên không nhạy cảm với các tín hiệu ức chế

- Đột biến xảy ra ở gene ức chế khối u, dẫn đến không còn hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), các tế bào ung thư không còn bị kiểm soát

- Các tế bào ung thư phân chia không giới hạn

- Các tế bào ung thư phát triển hệ thống mạch máu dẫn đến khối u để tăng cường chất dinh dưỡng nuôi khối u

- Các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vùng mô khác và hình thành ổ ung thư mới (di căn)

1.1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam

Hiện nay, bệnh ung thư được xem là một trong những bệnh nan y, đòi hỏi các nhà nghiên cứu cần nhiều nỗ lực cố gắng để tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị hiệu quả Đến nay trên thế giới đã nghiên cứu thành công một số loại thuốc và phương pháp chữa trị hiệu quả trong điều trị ung thư vú, ung thư máu… Tuy nhiên, với mức độ đa dạng của ung thư như hiện nay thì các nghiên cứu

về ung thư cần được quan tâm hơn nữa để có thể tìm ra cách điều trị hiệu quả và phù hợp

Sự biến đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma Có vô số các khả năng có thể gây ra ung thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gene tiền ung thư (proto-oncogene), sự bất hoạt gene ức chế khối u, hay sự đột biến ở gene sửa sai DNA trở thành gene gây đột biến Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân

bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường Quá trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường

Theo ghi nhận của Cơ quan nghiên cứu thế giới về ung thư IARC (The International Agenecy for Research on Cancer), trong năm 2008, có hơn 12,4 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư mới (trong đó 6 672 000 nam giới, 5 779 000 nữ giới), 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư (4 293 000 nam giới, 3 300 000 nữ giới) và 28 triệu người bị mắc bệnh ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm Theo ước tính đến năm 2030, khả năng mắc ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người,

17 triệu người khác bị chết vì ung thư và 75 triệu bệnh nhân bị ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm [7] Số lượng bệnh nhân bị ung thư đang tăng dần tại các nước đang phát triển do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm trùng có xu hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn Hơn nữa, người dân ở những nước này đang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo

Cũng theo cơ quan này, trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình là những nơi chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn thế giới) Tỷ lệ dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức độ thu nhập của các quốc gia, tập quán của người dân Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da, ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng…

Trước đây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật điển hình là của một nước thu nhập thấp, kém phát triển, có đời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí hậu nhiết đới nóng bức ẩm ướt, nên các loại bệnh chủ yếu là những bệnh truyền nhiễm và các bệnh suy dinh dưỡng Hiện nay, cùng với sự thay đổi mạnh mẽ về kinh tế, mô hình

bệnh tật của Việt Nam đã có xu hướng của nước phát triển với các bệnh ung thư, tim mạch… Hơn nữa, cùng với quá trình phát triển của nền kinh tế cũng kéo theo một loạt các vấn đề nhức nhối khác, đặc biệt là vấn đề ô nhiễm môi trường, nguồn thức ăn Việc sống trong điều kiện môi trường ô nhiễm có thể là lý do chính để lý giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có chiều hướng gia tăng nhanh chóng Những nguyên nhân gây ung thư chính có thể kể đến là việc hút thuốc lá, sử dụng

đồ uống có cồn, chế độ ăn không lành mạnh và thiếu những hoạt động thể chất [17] Những loại ung thư phổ biến nhất người bệnh thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, cổ tử cung…

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư

Như đã đề cập ở trên, ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và gây

tử vong lớn Vì vậy, việc phát hiện và điều trị ung thư là vấn đề hết sức quan trọng

và cấp thiết, đòi hỏi các nhà khoa học có rất nhiều đóng góp Nếu không được chữa trị sớm, hầu hết các loại ung thư có thể gây tử vong, đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong chính trong những nước phát triển Hầu hết các bệnh ung thư có thể chữa trị và nhiều bệnh có thể chữa lành, nếu được phát hiện và điều trị sớm Các phương pháp dùng trong điều trị ung thư có thể được chia thành 5 phương pháp như sau: phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu hay còn gọi là liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gene Liệu pháp gene có tiềm năng cao trong việc chữa trị tận gốc nhưng hiện nay vẫn chưa được áp dụng phổ biến do tính phức tạp và đặc thù với từng loại ung thư và cần được nghiên cứu thêm Cả ba phương pháp phẫu thuật,

xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thư, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác Tuy nhiên, việc điều trị ung thư bằng các phương pháp này thường gặp phải các tác dụng phụ không mong muốn và hiệu quả điều trị còn phụ thuộc vào vị trí và mức độ của khối u, giai đoạn của bệnh, cũng như tổng trạng của bệnh nhân

So với những phương pháp truyền thống như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, thì trị liệu miễn dịch tế bào tự thân có thể được coi là một hình thức trị liệu đầy triển vọng

vì hiệu quả điều trị rất rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt Liệu pháp này đã mang lại cho bệnh nhân ung thư giai đoạn trung gian và giai đoạn cuối thêm một hình thức điều trị hoàn toàn mới Đối với những trường hợp bệnh nhân không thể phẫu thuật hay xạ trị thì liệu pháp này lại có thể liên tục tiêu diệt tế bào ung thư, tăng cường sức miễn dịch cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả lâm sàng, kéo dài tuổi thọ, nâng cao chất lượng sống, giảm bớt những đau đớn do căn bệnh này mang lại cho bệnh nhân

1.2 Tổng quan về Interleukin-2

1.2.1 Cấu trúc của Interleukin-2

Interleukin-2 là một cytokine được tiết bởi tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch Tên thương mại của sản phẩm Interleukin-2 là Proleukin hoặc Aldesleukin IL-2 được Morgan và các cộng sự phát hiện năm 1975 khi sử dụng lectin để kích thích tế bào T hỗ trợ nhưng đến năm 1979, IL-2 mới được xác định như là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào T [47] Interleukin-2 cũng là một trong những cytokine đầu tiên được xác định ở mức độ

phân tử Gene il-2 được deVos và các cộng sự nhân dòng năm 1983 [35], sau đó cấu

trúc tinh thể của nó được làm sáng tỏ năm 1992 bởi Taniguchi và các cộng sự [54]

Về bản chất, IL-2 là một glycoprotein có cấu trúc dạng monome với khối lượng phân tử xấp xỉ 15 kDa IL-2 tồn tại với cấu trúc không gian có 4 xoắn α tạo thành dạng khá điển hình của cytokine loại 1

Hình 2 Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2), cũng được gọi là yếu tố tăng trưởng tế bào T, lần đầu

tiên được mô tả như là một lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào T

[12] IL-2 cũng đã được quan sát thấy nhiều khả năng điều chỉnh miễn dịch khác như tính chất gây độc của tế bào T, các tế bào giết tự nhiên (NK), kích hoạt tế bào

B, và hoạt hóa các tế bào giết (LAK) Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín hiệu tiết dài 20 amino acid và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid [53] Các kết quả nghiên cứu cho thấy có 3 vùng trên phân tử hIL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i) Vùng tận cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20); ii) Vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121-133) và iii) Cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2 [43] Phân tích trình tự amino acid cho thấy IL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105tạo cầu disulfide Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh học của IL-2 Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide có thể làm giảm 8-10 lần hoạt tính của IL-2, trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm tới 250 lần Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hưởng rất ít đến hoạt tính IL-2 và sự thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không ảnh hưởng tới hoạt tính của IL-2 Do vậy, đột biến thay đổi Cys ở vị trí 125 thành Ser có thể ngăn cản

sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc này với hai gốc Cys ở vị trí

58 và 105 [2, 3] Ngoài ra, tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên IL-2 trong tự nhiên tồn tại dạng glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vậy liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên độc tính của protein này trong cơ thể Vì vậy, IL-2 dạng thương phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ bị loại bỏ các gốc amino acid ở đầu N

1.2.2 Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2

Các nghiên cứu trước đây cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong hỗ trợ điều trị ung thư thận và ung thư hắc tố có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân Theo nghiên cứu của Rosenberg (1980) tại Viện Ung thư quốc gia (National Cancer Institute-NCI) Tây Ban Nha cho thấy, khi sử dụng IL-2 trong phác đồ điều trị cho các bệnh nhân ung thư thận ác tính với các liều lượng khác nhau có thể làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20% Ngoài ra, IL-2 còn có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư phổi [20],… Từ năm 1990, các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu làm tăng hoạt động của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều phương pháp trị liệu khác như hóa trị liệu và xạ trị liệu, kết quả là khoảng 5-10% bệnh nhân được điều trị có thể sống sót sau 10 năm

Lúc đầu người ta phát hiện ra IL-2 như là một yếu tố phát triển tế bào T, nhưng thật ra IL-2 có nhiều chức năng trong đáp ứng miễn dịch thu được [49] Thứ nhất, sự sản sinh IL-2 chỉ là nhất thời, vì vậy khi không có sự kích thích của kháng nguyên thì các tế bào T được hoạt hóa sẽ chết do mất đi các cytokine trong môi trường IL-2 do tế bào T tiết ra khi nhận diện kháng nguyên chịu trách nhiệm về việc tăng sinh tế bào đặc hiệu kháng nguyên Thứ hai, IL-2 khởi đầu một con đường chết theo chương trình đã được định sẵn cho tế bào [48] Thứ ba, IL-2 tăng cường

sự tăng sinh và hoạt hóa nhiều tiểu nhóm tế bào miễn dịch, gồm cả các tế bào T, tế bào diệt tự nhiên, tế bào B, tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính IL-2 đơn thuần hoạt động trong một phần nhỏ của các bệnh nhân có u ác tính các tế bào da (melanocyte) di căn và đã được dùng để hỗ trợ điều

trị in vitro ở bệnh nhân ung thư và nhiễm HIV IL-2 vẫn dùng để điều trị cho bệnh

nhân ung thư tế bào biểu mô thận di căn

Hình 3 Đích tác động của Interleukin-2

IL-2 giúp làm tăng hàm lượng các thành phần khác nhau của hệ thống miễn dịch trong máu, bao gồm tế bào lympho T và các tế bào giết tự nhiên (NK) [38] Khi tiếp xúc với tế bào khối u, tế bào NK đã hoạt hóa sẽ tấn công màng tế bào ung thư và tiêm một số chất vào tế bào chất làm phân hủy tế bào đích Cho dù kích thước nhỏ hơn tế bào ung thư, các tế bào NK thường tác động đến 2 hoặc nhiều tế bào ung thư cùng một lúc Nó có thể cải tiến chức năng của hệ thống các tế bào miễn dịch khác, như lymphokine có hoạt tính giết chết các tế bào và các tế bào lympho xâm lấn khối u Điều này giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thư

Hình 4 Tác động của Interleukin-2 đến tế bào T

Do khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch, nên ngoài ứng dụng để điều trị ung thư, IL-2 còn được nghiên cứu để chống bệnh nhiễm HIV Kết quả ban đầu cho thấy đây là dược phẩm an toàn và có hiệu quả khi phối hợp với các liệu pháp khác

trong điều trị chống HIV Cơ chế của IL-2 trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV có thể theo hai hướng: (i) Giúp bảo vệ hệ miễn dịch khỏi sự phá hoại do virus HIV gây

ra, (ii) Giúp cho hệ miễn dịch khống chế sự nhân lên của HIV Theo Kovacs thì

IL-2 gây tăng sinh các tế bào T CD4 không phải là do gia tăng tổng hợp chúng từ tuyến

ức, mà chủ yếu là do sự tăng sinh các tế bào tồn tại trong hệ tuần hoàn máu [46]

1.2.3 Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư

IL-2 được nghiên cứu rất nhiều trong điều trị ung thư bao gồm ung thư thận,

u hắc tố, ung thư da Caligiuri và cộng sự đã chứng minh với liều lượng IL-2 thấp ngăn ngừa chứng rối loạn tăng sinh các tế bào lympho [32] Hai ứng dụng chủ yếu của IL-2 là liệu pháp chống ung thư đối với các ung thư biểu mô thận và u hắc tố và liệu pháp miễn dịch trong các bệnh nhân nhiễm HIV Người ta cho rằng IL-2 ngoại sinh có thể tăng cường một số đáp ứng kháng ung thư

Đối với ung thư thận: do thận là một phần trong hệ tiết niệu với chức năng chính là lọc máu và sản xuất nước tiểu để loại bỏ chất thải ra ngoài cơ thể, nên khi ung thư thận phát triển, nó có thể xâm lấn vào các cơ quan ở gần thận như gan, ruột, tụy Tế bào ung thư thận có thể tách khỏi khối u ban đầu và di căn tới các bộ phận khác trong cơ thể Các triệu chứng ít gặp hơn như mệt mỏi, chán ăn, đau ở vùng thắt lưng, sốt lặp đi lặp lại nhiều lần Ung thư thận tăng theo độ tuổi, bệnh xuất hiện nhiều nhất là ở độ tuổi 50-70 Bệnh xảy ra ở nam giới nhiều gấp đôi nữ giới Nguyên nhân của ung thư thận là do đột biến gene, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ,… Rosenberg đã thực hiện sử dụng Interleukin-2 liều cao trong hỗ trợ điều trị đối với 283 bệnh nhân, kết quả cho thấy 7% bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn với IL-2 và tế bào ung thư được kiểm soát và biến mất toàn bộ, 13% số bệnh nhân có đáp ứng một phần, 76% trong số các bệnh nhân

có đáp ứng hết ung thư với thời gian trên 7 năm [50]

Còn đối với u hắc tố, đây là một loại ung thư thường gặp và đang có tần suất mắc bệnh nhanh nhất trong một số loại ung thư hiện nay Các nhà nghiên cứu dự đoán tần suất mắc bệnh tiếp tục tăng trong 20 năm tới Nguyên nhân làm tăng tần

suất mắc bệnh chưa được xác định Một số yếu tố có thể có liên quan, như thói quen phơi nắng và những thay đổi toàn cầu như thủng tầng ozon và sự ô nhiễm môi trường Theo thống kê, u hắc tố có thể gặp ở mọi lứa tuổi người trưởng thành và u hắc tố thường có tính chất gia đình Cắt bỏ khối u là lựa chọn điều trị dành cho u hắc tố, sau khi phẫu thuật bệnh nhân được chỉ định dùng các chất điều trị bổ trợ như interferon-α, Interleukin-2 nhằm ngăn ngừa hiện tượng di căn Đối với ung thư da

ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với IL-2 thì bệnh nhân kéo dài thời gian sống ít nhất 10 tháng, trong đó tỷ lệ sống trên 5 năm là hơn 10% [44]

Năm 1992 cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc của Hoa Kỳ (FDA) đã chính thức cho phép sử dụng IL-2 trong điều trị ung thư thận, u hắc tố và hỗ trợ điều trị HIV Hiện nay, IL-2 đang được thử nghiệm trong điều trị các loại ung thư buồng trứng [31], ung thư vú [40], ung thư bàng quang [34], ung thư tuyến tiền liệt [30],… Các nghiên cứu cho thấy, điều trị bằng IL-2 giảm 20% về tỷ lệ u bướu, 9% bệnh nhân ung thư thận phản ứng hoàn toàn với thuốc

Trong điều trị, từ những kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đều cho thấy, IL-2 có khả năng kích thích và phân triển các tế bào miễn dịch, tăng khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư, đặc biệt là 2 loại: ung thư biểu mô tế bào thận và u hắc tố ác tính Khả năng chữa trị cho 2 loại ung thư này có thể lên đến 18% với u hắc tố ác tính và 37% với ung thư biểu mô tế bào thận nếu có liệu pháp điều trị IL-2 phù hợp Trước đây, để có được IL-2 tinh khiết sử dụng trong điều trị, sản phẩm này được tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc nuôi cấy dòng tế bào động vật Mặc dù có thể tạo ra được IL-2 tái tổ hợp nhưng sản phẩm này thường có hàm lượng khá thấp [10] Việc sản xuất sản phẩm IL-2 theo các con đường này thường tạo ra sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo ra hiệu ứng không mong muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị Hơn nữa, do hiệu suất tạo sản phẩm cũng như hiệu suất tinh chế thấp nên ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm Sản phẩm IL-2 cuối cùng tạo ra thường có giá thành khá cao Chính vì vậy, công nghệ sản xuất IL-2 trên đã được thay thế bởi công nghệ mới hơn là công nghệ DNA tái tổ hợp

Trong tự nhiên, IL-2 là glycoprotein, có khả năng hoạt hoá tế bào NK và tế bào CTL, biệt hoá LAK Interleukin-2 có thể gây độc, sốt và sốc trong điều trị Hiệu quả gây độc được xác định là do hai nguyên nhân Thứ nhất, IL-2 có điểm glycosyl hoá được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên Do vậy, IL-2 tự nhiên có tính thấm cao với màng tế bào nên gây độc với cơ thể bệnh nhân điều trị bằng IL-2 Thứ hai, độc tính của protein này là gián tiếp do hoạt tính của IL-

2 lên các tế bào lympho khác làm tăng quá trình tiết TNF, IFN và lymphotoxin Chính vì vậy, bằng việc sử dụng kỹ thuật di truyền, IL-2 có thể được cải biến mất vị trí glylcosyl hoá, giảm độc tính IL-2 mà vẫn giữ nguyên được hoạt tính sinh học vốn có

1.3 Hệ thống lên men nuôi cấy E coli tái tổ hợp

Hệ thống lên men bioreactor là tên chung của các thiết bị có chức năng tạo một môi trường đặc trưng, được sử dụng để tiến hành một quá trình hóa sinh học

mà trong đó các vi sinh vật hoặc các tế bào và mô động thực vật có thể phát triển và tăng trưởng nhờ sử dụng các nguyên vật liệu thô trong môi trường, đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất Quá trình lên men có thể là kỵ khí hoặc hiếu khí Hệ thông lên men thường là các bình có dạng hình trụ, kích cỡ có thể từ hàng lít đến hàng mét khối và được làm bằng thép không gỉ

Hình 5 Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ

Vi sinh vật phát triển trong hệ thống lên men có thể ở dạng huyền phù trôi nổi trong môi trường lỏng hoặc là bám trên bề mặt của môi trường rắn Môi trường lỏng có thể sử dụng để nuôi dưỡng cả đối tượng trôi nổi và đối tượng phải bám cố định Môi trường lên men dạng trôi nổi có thể sử dụng cho một phổ rất đa dạng các loại sinh vật vì không cần có xử lý bề mặt bình lên men một cách đặc biệt, đồng thời có thể tiến hành ở quy mô lớn hơn nhiều so với môi trường bám cố định Tuy nhiên, trong trường hợp lên men liên tục, các sinh vật lên men trong hệ thống lên men trôi nổi có khả năng bị loại bỏ cùng với môi trường lấy ra Điều này không xảy

ra với hệ thống lên men bám cố định, tuy nhiên hệ thống này lại bị giới hạn về quy

mô vì vi sinh vật chỉ sinh trưởng được trên bề mặt của chất giá

E coli là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện, có thể sinh trưởng hiếu khí nhờ hô hấp

dùng O2 làm chất nhận điện tử cuối cùng, hoặc sinh trưởng kỵ khí nhờ hô hấp dùng các chất như nitrate, nitrite, fumarate, dimethylsulfoxide và trimethylamine N-oxide làm chất nhận điện tử cuối cùng, hoặc sinh trưởng kỵ khí nhờ lên men [55] Trong các hình thức sinh trưởng trên thì hô hấp sử dụng oxy là hiệu quả nhất về mặt năng

lượng, vì vậy E coli tái tổ hợp được nuôi cấy trong hệ thống lên men loại hiếu khí

có khuấy trộn để tăng cường tối đa lượng oxy hòa tan trong môi trường Hệ thống lên men này có ưu điểm là dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, chi phí sản xuất, chi phí đầu

tư, chi phí hoạt động đều khá thấp, dễ dàng vệ sinh hệ thống, tuy vậy có nhược điểm là thường xuyên bị bọt Vấn đề bọt của hệ thống có thể được khắc phục bằng dung dịch phá bọt (antifoam) phù hợp nhưng khi sử dụng cũng cần lưu ý lượng sử dụng thích hợp do chính bản thân chất phá bọt cũng có thể trở thành chất ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật

Có 2 ưu điểm chính cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống bình lên men: (i) Với hệ thống lên men, tất cả các thông số của quá trình lên men như nhiệt độ, pH, lượng oxy hòa tan, tốc độ khuấy, lượng khí sục vào môi trường, đều được kiểm soát chặt chẽ qua hệ thống máy tính giúp dễ dàng theo dõi diễn tiến của quá trình lên men, từ đó giúp tăng hiệu quả của quá trình lên men; (ii)

Hệ thống lên men đa dạng cho các quy mô khác nhau tùy vào mục đích lên men từ

5 lít, 10 lít, 30 lít và 100 lít Tuy nhiên, một vấn đề đáng quan tâm là tất cả các thông số tối ưu lên men ở quy mô phòng thí nghiệm nuôi cấy trong bình tam giác không thể áp dụng hoàn toàn vào quy mô bình lên men lớn vì nguyên lý và quá trình lên men giữa 2 điều kiện này sẽ có những sai khác về thông số lên men Do đó cần có bước nghiên cứu tối ưu lên men trong bình lên men quy mô 5 lít nhằm tránh những rủi ro khi áp dụng vào sản xuất lên men hàng loạt

1.4 Tinh sạch protein dạng thể vùi

1.4.1 Tổng quan về tinh sạch protein

Sự phân lập và tổng hợp IL-2 người trong E coli được mô tả đầu tiên bời

Devos và các cộng sự năm 1983 [35], tuy nhiên hầu hết các protein được biểu hiện tồn tại ở dạng thể vùi (inclusion body) không tan nằm trong tế bào chất [41] Sự

biểu hiện ở mức độ cao của các protein nguồn gốc nhân thật ở E coli thường tạo

thành thể vùi không tan nằm trong tế bào chất [33] Khi biểu hiện protein dị nguyên

trong E coli, thể vùi thường là sản phẩm không mong muốn vì ở trạng thái này,

protein thường không có hoạt tính Tuy nhiên, ưu điểm lớn của việc tạo thành thể vùi là khả năng biểu hiện protein ở mức độ cao so với việc biểu hiện ở dạng tan, việc phân tách protein nằm trong thể vùi ra khỏi tế bào cũng khá dễ dàng nhờ đặc tính không tan của thể vùi so với các thành phần khác của tế bào, protein thể vùi có mức độ tự phân giải và phân giải do protein nội bào thấp hơn, và sự đồng nhất cao của protein thể vùi giúp làm giảm số lượng các bước tinh chế cần sử dụng dể loại bỏ các tạp chất và thu hồi protein tinh [37]

Để tinh chế được sản phẩm IL-2 sạch, cần có nhiều bước để loại bỏ dần dần

các protein của tế bào vật chủ E coli ra khỏi mẫu chứa IL-2 Nhờ đặc tính không

tan trong dung môi không chứa chất biến tính của protein thể vùi, protein tổng số được giải phóng ra khỏi tế bào có thể được dễ dàng phân tách thành hai pha tan và không tan nhờ phương pháp ly tâm Protein IL-2 ở dạng thể vùi sẽ kết tụ lại trong tủa sau khi ly tâm, dịch nổi chứa những protein tan trong dung môi nước sẽ được loại bỏ Protein thể vùi chỉ trở thành dạng tan khi được xử lý bằng hóa chất có khả

năng biến tính cao như urea hay guanidine hydrochloride ở nồng độ cao [51], tuy nhiên các loại protein thể vùi khác nhau có khả năng tan trong các dung dịch trên ở nồng độ khác nhau Sau khi toàn bộ mẫu protein thể vùi được hòa tan bằng chất biến tính nồng độ cao, sự pha loãng chất biến tính đến một ngưỡng nhất định có khả năng đưa một số protein từ dạng tan trở lại dạng không tan, đồng thời vẫn giữ tính tan của một số protein khác trong hỗn hợp mẫu Vì vậy, protein tạp có thể dễ dàng tách ra khỏi protein IL-2 nhờ phương pháp ly tâm Quá trình tiền tinh chế protein cần có sự nghiên cứu để chọn ra chất biến tính phù hợp cũng như tối ưu nồng độ của chất đó để phân tách tối đa các loại protein, tăng hiệu quả của quá trình tinh sạch

Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng nghiên cứu được chức năng sinh học của chúng Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận không chính xác Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm việc tinh sạch chúng thường có tính đặc thù Các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù của nó về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi

là chức năng của chúng Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein đích còn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng, Để loại bỏ được các thành phần tạp, có thể phải sử dụng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau

Bước đầu tiên để thu hồi protein tái tổ hợp là phá vỡ tế bào, thường được tiến hành bằng cách sử dụng lysozyme, sóng siêu âm kết hợp với việc sử dụng các chất tẩy rửa có khả năng hoạt động bề mặt cao như Triton X-100 hay Tween-20 [37] Phá vỡ màng tế bào là một bước khá quan trọng vì nếu trong pha tủa sau khi ly tâm thu thể vùi vẫn tồn tại các tế bào không được phá vỡ hoàn toàn thì sẽ tăng khả năng xuất hiện các tap chất trong sản phẩm Ngoài ra, dung dịch đệm dùng để hòa và rửa

tế bào thường được bổ sung các chất ức chế protease như EDTA và PMSF để ngăn ngừa khả năng protein sau khi biểu hiện bị phân giải bới các protease nội bào

Sau khi phá vỡ tế bào, bước tiếp theo trong quá trình tinh sạch protein nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong việc phân lập protein và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc Ly tâm kết hợp với sử dụng gradient nồng độ sucrose có thể được sử dụng để tăng cường khả năng loại bỏ các tạp chất từ dịch chiết tế bào Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường, là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) trong môi trường nước hay trong các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau như phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc

ký, điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn [21] Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh

có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học

Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực hành chuẩn ở phòng thí nghiệm trong nhiều năm Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ và giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Sắc ký là phương pháp với khả năng chọn lọc

được yêu cầu để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95%

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu cụ thể như hòa tan mẫu phân tích, phù hợp với đầu dò, không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh, có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao, tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade)

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải

1.4.2 Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hình 6 Hệ thống tinh sạch protein HPLC

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển

và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách

trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ [13] HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do như có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành nhiều loại trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì

có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn

Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo (reversed phase chromatography) Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…) Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [13]

Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực Sắc ký pha thường dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không quá lớn Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng để phân tách các hợp chất từ không phân

cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo Dung môi sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, sắc ký pha đảo được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thường Nguyên lý của sắc ký pha đảo là protein sẽ gắn vào pha tĩnh theo tương tác

kỵ nước theo các mức độ khác nhau, khi thực hiện tách rửa, gradient nồng độ propanol được sử dụng tăng dần và gradient nồng độ nước giảm dần dẫn đến sự tăng dần của tính kỵ nước trong pha động, các protein bám trong pha tĩnh lần lượt được loại ra ngoài

Trong dược học, tá dược được định nghĩa là các chất hóa học được bổ sung vào một hỗn hợp dược phẩm chứa một chất đặc trưng nhằm làm tăng hoạt tính sinh học của chất đó so với khi chỉ sử dụng đơn lẻ [16] Các vật liệu cấu thành nên tá dược thường bị bất hoạt nhưng lại có ý nghĩa quan trọng với tính bền và hoạt tính sinh học của dược phẩm Đối với các sản phẩm dược học đòi hỏi cần phải có sự đảm bảo chặt chẽ về mặt hoạt tính sinh học như các protein, peptide, hoặc vaccine

thì giới hạn bền và công thức an toàn cho dược phẩm là mục đích đầu tiên Tuy nhiên, cũng cần dựa trên bản chất và thành phần protein trong dược phẩm mà cần phải có sự điều chỉnh hợp lý về các tá dược được bổ sung thêm vào

Phương pháp tạo hỗn hợp cho IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh chế bằng HPLC được mô tả trong sáng chế US4645830 [14] Sản phẩm của quá trình tinh chế từ HPLC là IL-2 tồn tại trong dung môi iso-propanol được hòa loãng nhiều lần trong dung dịch đệm có chứa một tỉ lệ SDS hợp lý nhằm tăng cường khả năng hòa tan của IL-2 sau khi loại bỏ dung môi Nồng độ SDS được sử dụng vào khoảng 200 µg/mg IL-2, kết hợp cùng với một số thành phần bổ sung khác như một số loại albumin như albumin huyết thanh người, albumin huyết thanh bò cùng với sorbitol, tinh bột hay manitol là một thành phần không thể thiếu Kết quả IL-2 tái tổ hợp sau khi đông khô, được hoàn nguyên lại bằng một lượng nước nhất định đã giữ được dạng ổn định khoảng hơn 3 tháng ở điều kiện nhiệt độ phòng

Sáng chế US4645830 đã chỉ ra hỗn hợp pha chế cho IL-2 tái tổ hợp với albumin huyết thanh người (HSA, 0,5-20 mg/ml) cùng với một số thành phần có tính khử như: glutathione (dạng khử), thioctic acid, N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thiodiglycol, thioethanolamine, monothioglycerol, dithiothreitol, thioalkanoic, acid ascorbic và điều chỉnh pH của dung dịch hoàn nguyên nằm trong khoảng từ 3 – 6 nhằm đảm bảo tính tan của IL-2 trong dung dịch [14] Một số thành phần tạo sức căng bề mặt như SDS, PEG-4000, Triton X305 (0,1% v/v); Tween-20, Tween-80 (0,2%, v/v) như là một thành phần làm tăng sự ổn định, sử dụng dextrose, manitol (5%, w/v), sucrose (1%, w/v) đã được sử dụng trong sang chế US5037644 A như một thành phần tạo độ xốp cho sản phẩm đông khô [28]

Kết quả nghiên cứu của một số sáng chế khác cho thấy, có sự kết hợp của một lọat các thành phần tá dược khác cùng với sự bổ sung của một số loại albumin huyết thanh nhằm làm tăng cường tính tan của IL-2 trong dung dịch Ví dụ, sáng chế US5078997 của Hora M S và cộng sự năm 1992 đã chứng minh vai trò làm

tăng tính tan và độ ổn định của IL-2 đông khô sau hoàn nguyên của hỗn hợp arginine và carnitine [11] Một số thành phần đóng vai trò làm tăng tính ổn định và tính tan của IL-2 trong dung dịch sau khi hoàn nguyên được sử dụng gồm có: hỗn hợp arginine và carnitine, carnitine, betaine, pyridoxine, muối của acid capric hay acid succinic, polyvinylpyrrolidone Hỗn hợp các tá dược được chỉ ra tối ưu cho việc làm bền và ổn định gồm có: arginine (0,2 – 3% w/v), carnitine (0,2-3% w/v), sucrose (2-6% w/v), citrate (0,01-0,3M), pH 6-7,5

Hỗn hợp trên có thể được bổ sung một số loại albumin huyết thanh, đường và dung dịch đệm như là một thành phần có vai trò làm ổn định và bền cấu trúc cũng như hoạt tính của IL-2 bao gồm: arginine (0,25-3% w/v), manitol (2-6% w/v), albumin huyết thanh (0,25-5% w/v), citrate (0,01-0,3M), pH 6-7,5 Tuy nhiên, một nhược điểm lớn của việc sử dụng albumin huyết thanh là tính an toàn thấp do phải tách chiết trực tiếp từ máu động vật hoặc người, do đó các nguy cơ lây bệnh luôn tiềm ẩn và là mối quan tâm hàng đầu trong việc sử dụng albumin huyết thanh cho việc tạo hỗn hợp cho dược phẩm Vì vậy trong các sáng chế US5874408, US6586573, US7247707, US20070059285, US20080274949, US20080176791, US20090324647 đã đề xuất các giải pháp thay thế albumin bằng các loại hóa chất khác như các loại đường sucrose, trehalose, raffinose; chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 hay các dung dịch đệm thay thế gồm có Tris, BIS-Tris Propane, PIPES (piperazine- N,N′ - bis (2- ethanesulfonic acid)), MOPS (3- (N-morpholino) propansulfonic acid), HEPES (4- (2-hydroxyethyl)- 1-piperazine

ethanesulfonic acid ) hay MES (2- (N- morpholino) ethanesulfonic acid) Mặt khác,

các sáng chế US20040180125 [18], US20020150616 [25], US6723353 [6] đề cập tới vai trò của cyclodextrin tỉ lệ từ 1-30% trong việc kết hợp cùng với một số thành phần muối để tạo nên hỗn hợp cho dược phẩm, cũng như hỗn hợp của một số loại thực phẩm nhằm làm tăng tính tan trong môi trường acid, tăng độ ổn định của dược phẩm trong môi trường có độ pH thấp như trong dạ dày

Trong nội dung của các sáng chế đã đề cập ở trên, các thành phần chủ yếu được sử dụng để tạo hỗn hợp cho IL-2 tái tổ hợp gồm có cyclodextrin (2-

hydroxylpropyl-β-cyclodextrin); albumin huyết thanh của người hoặc bò; các loại đường như glucose, sucrose; một số thành phần tạo khung cũng như làm tăng tính hấp thụ cho sản phẩm sau này như sorbitol, manitol; một số chất căng bề mặt như SDS, Triton-X, Tween-20 hoặc 80, PEG; một số amino acid như Glycine, Histidine, Arginine; một số dung dịch acid làm môi trường đệm như acid acetic, acid citric, đệm phosphate, đệm Tris và một số thành phần khác

Trên cơ sở thông tin liên quan tới công thức cho sản phẩm IL-2 được biểu

hiện trong E coli từ các sáng chế được công bố trước đây và sản phẩm IL-2 thương

mại, đề tài này thưc hiện nghiên cứu để tạo ra công thức IL-2 bán thành phẩm nhằm đảm bảo dạng tồn tại của IL-2 cũng như đạt yêu cầu của sản phẩm dược phẩm

Dựa trên những phân tích trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên

cứu này với những mục tiêu như sau: (i) Tối ưu điều kiện biểu hiện chủng E coli tái

tổ hợp mang gene mã hóa cho IL-2 người dạng cải biến ở quy mô nồi lên men 5 lít nhằm tăng sản lượng IL-2 tái tổ hợp; (ii) Tối ưu quá trình tinh chế IL-2 bằng hóa chất và hệ thống HPLC nhằm thu được lượng IL-2 lớn và đạt độ tinh sạch cao; (iii) Xây dựng được công thức bán thành phẩm đối với IL-2 tái tổ hợp để đảm bảo yêu cầu của sản phẩm dược phẩm

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chủng giống và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn E coli BL21 DE3

Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phải một số vấn đề của chủng biểu hiện đó là protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải Một trong những cách phổ biến để khắc phục vấn đề này là sử dụng các chủng biểu hiện mang các đột biến làm mất khả năng tổng hợp các protease

Chủng biểu hiện E coli BL21DE3 (Invitrogen) với đột biến trên lon protease (một protease nội bào) và ompT (một protease ngoại bào) là một chủng đột biến không

còn các protease có khả năng thủy phân protein Như vậy, cả protease nội bào và

ngoại bào của E coli đều bị bất hoạt

Ngoài ra, trong hệ gene của chủng E coli BL21 có chứa gene mã hóa cho T7

RNA polymerase, bình thường gene này bị bất hoạt bởi cùng cơ chế như operon lac, nhờ đó hạn chế sự biểu hiện không đặc hiệu của gene đích trên vector biểu hiện

Chính nhờ có những cải biến này mà chủng E coli BL21 trở thành đối tượng hữu hiệu trong việc biểu hiện gene ngoại lai Chủng E coli BL21 DE3 mang gene il-2 cải biến được ký hiệu là E coli BL21 IL-2

2.1.2 Vector biểu hiện

Gene mã hóa Interleukin-2 người được cải biến loại bỏ amino acid Alanine ở đầu N và gây đột biến thay thế amino acid Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine, sau đó được chèn vào trong vector biểu hiện pET22b(+)(Novagene Cat No 69744-3), vector này được ký hiệu là pET22-IL2 Toàn bộ plasmid pET22-IL2 là sản phẩm kế thừa giai đoạn nghiên cứu trước của đề tài, thuộc sở hữu của phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 7 Bản đồ vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen) 2.1.3 Hóa chất

Sodium Chloride, Bacto Trypton, Iso-propanol, Citric acid, Mecaptoethanol, Cao nấm men, Sucrose, Glucose, Ethanol, Mannitol, Sodium acetate, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, PEG-400, Glycerol, Formaldehyde, n-Hexan, Acetic acid, Guanidine chloride, Aceton nitrile, TFA, Triton-X100, Bis-Acrylamide, PMSF và các hóa chất khác thường dùng trong sinh học phân tử của các hãng tin cậy như Bio-Rad (Mỹ), Merck (Đức), Prolabo (Pháp)

2-2.1.4 Máy móc và thiết bị

Hệ thống nồi lên men quy mô nhỏ 5 lít (Hàn Quốc), hệ thống HPLC (Shimadzu), máy lắc IKA®KS 260 basic, máy siêu âm (Microson™), máy ly tâm nhỏ (Sorvall Biofuge Fresco), máy ly tâm lớn (Sorvall Legened RT), máy đông khô