Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn e coli

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1 Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc bệnhHemophilia theo Hiệp hội Hemophilia thế giới 3 Hình 2 Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Văn Phòng

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƯỜI Ở VI KHUẨN E COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Văn Phòng

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƯỜI Ở VI KHUẨN E COLI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NÔNG VĂN HẢI

Hà Nội - 2012

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS Amonium Persulphate Amonium Persulphate

cDNA Compelementary DNA DNA được tạo ra trên khuôn mRNA

bằng enzyme phiên mã ngược ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Axít Deoxyribonucleic

dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate

E coli Escherichia coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic acid

IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside Isopropyl-thio-β-D-galactoside

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng nhân bản DNA

pJET Vector pJET1.2/blunt Vector pJET1.2/blunt

rRNA Ribosomal Ribonucleic acid ribosome RNA

RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bệnh Hemophilia 3

1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia 3

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia 5

1.1.3 Phân loại Hemophilia 7

1.1.4 Biểu hiện của bệnh Hemophilia 9

1.1.5 Phương pháp điều trị bệnh Hemophilia 10

1.2 Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu 11

1.3 Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX 13

1.4 Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX 16

1.4.1 Cấu trúc của phân tử protein FIX 16

1.4.2 Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX 18

1.5 Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX 22

1.6 Vector biểu hiện pET32a 24

1.7 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 26

1.8 Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp 29

1.9 Tình hình nghiên cứu trong nước 30

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu 32

2.2 Phương pháp 35

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 35

2.2.2 Tổng hợp cDNA 36

2.2.3 Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR 37

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 39

2.2.5 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 40

2.2.6 Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose 41

2.2.7 Ghép nối DNA 42

2.2.8 Biến nạp plasmid vào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt 43

2.2.9 Tách chiết DNA plasmid 45

2.2.10 Xác định trình tự DNA 46

2.2.11 Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX 47

2.2.12 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 48

2.3 Sơ đồ thí nghiệm 49

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở người 52

3.1.1 Thu thập mẫu mô gan sinh thiết người 52

3.1.2 Tách chiết RNA tổng số 52

3.1.3 Tạo dòng và xác định trình tự gen FIX 53

3.2 Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIXnoSP) 60

3.2.1 Khuếch đại cDNA mã hóa FIXnoSP 62

3.2.2 Ghép nối cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu hiện pET32a 63

3.2.3 Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIXnoSP trong vector pET32a 64

3.3 Biểu hiện cDNA mã hóa FIXnoSP ở vi khuẩn E coli BL21(DE3) 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

Bảng 5 Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật 35

Bảng 6 Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn

DNA cần phân tách

39

Bảng 7 Thành phần các loại gel sử dụng trong điện di SDS-PAGE 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1 Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc

bệnhHemophilia (theo Hiệp hội Hemophilia thế giới)

3

Hình 2 Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so với thế giới

theo đánh giá của Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng 3

năm 2012

4

Hình 3 Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp cha mắc bệnh

và Mẹ không mang gen gây bệnh

6

Hình 4 Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp mẹ mang bệnh

và cha không mắc bệnh

7

Hình 5 Biểu hiện bệnh Hemophilia thể nặng ở trẻ sơ sinh 9

Hình 7 Vị trí của gen mã hóa yếu tố đông máu IX trên nhiễm sắc thể

X

14

Hình 8 Cấu trúc của gen FIX mã hóa cho yếu tố đông máu IX 15

Hình 9 Cấu trúc phân tử mRNA được phiên mã từ gen FIX 15

Hình 10 Trình tự amino acid và những biến đổi sau dịch mã của protein

Hình 15 Cơ chế cảm ứng promoter T7 bằng chất cảm ứng IPTG ở tế

bào E coli BL21(DE3)

28

Hình 16 Sơ đồ quá trình phân lập và dòng hóa cDNA mã hóa yếu tố 50

Hình 17 Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa

FIXnoSP và biểu hiệu trong tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3)

51

Hình 18 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1% 52

Hình 19 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX trên

gel agarose 0,8%

54

Hình 20 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8% 56

Hình 21 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen

FIX bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI

56

Hình 22 So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các

dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein FIX ở người và

trình tự đã công bố

60

Hình 23 Sơ đồ vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP 61

Hình 24 Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIXnoSP 63

Hình 25 Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi tinh

sạch trên gel agarose 0,8%

63

Hình 26 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8% 65

Hình 27 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn

chế trên gel agarose 0,8%

66

Hình 28 Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của các plasmid

pET32a/FIXnoSP bắt đầu từ TVF mang cDNA mã hóa FIXnoSP

MỞ ĐẦU

“Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị và chăm sóc tốt Ở Việt Nam, theo thống

kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20% bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên

cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B)

Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối năm 1980 Cho tới nay, việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và tế bào động vật đã phát triển vượt bậc [59] Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có giá trị trong điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao đáp ứng những nhu cầu cấp bách của thực tiễn [35]

Người bệnh Hemophilia có thể có cuộc sống gần như người bình thường nếu được phát hiện sớm và điều trị đúng cách Còn nếu người bệnh để bệnh phát triển thì hậu quả sẽ là chảy máu nhiều lần, gây biến dạng cơ và khớp, dẫn đến khó khăn trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, thậm chí tử vong sớm Ở nước ta, quá trình điều trị cho những người mắc bệnh Hemophilia gặp phải rất nhiều khó khăn Điều trị bằng phương pháp tiếp máu có những khó khăn như rất tốn kém và để có được

ẩn lây truyền các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm như virus viêm gan, HIV cho bệnh nhân Hemophilia Bên cạnh đó, nếu điều trị bằng cách sử dụng các dược phẩm dưới dạng các yếu tố đông máu VIII/IX thì phải nhập ngoại các dược phẩm này do không có sẵn trên thị trường Do vậy, giá thành của chúng rất cao Theo thông tin từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, chi phí cho một bệnh nhân Hemophilia trung bình khoảng 50 – 100 triệu đồng/năm

Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu sản xuất yếu tố đông máu IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện Do những nhu cầu cấp thiết trong điều tri ̣ bê ̣nh Hemophilia , chúng

tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề

hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân Hemophilia trong tương lai

Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau:

1 Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người

2 Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người

3 Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người

4 Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông

máu IX của người ở vi khuẩn E coli

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh Hemophilia

1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia

Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm” Bệnh này đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu

tố đông máu VIII, được gọi là Hemophilia A Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B Ngoài ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI [70], [71]

Hình 1 Quá trình đông máu ở người bình thường và người mắc bệnh Hemophilia

(theo Hiệp hội Hemophilia thế giới)

Người mắc bệnh Hemophilia không chảy máu nhanh hơn người bình thường Tuy nhiên, người bệnh lại chảy máu khó cầm hơn những người khác (Hình 1) Biểu hiện của bệnh là xuất hiện các vết thâm tím lớn dưới da, chảy máu khó cầm ở khắp các vị trí trên cơ thể Chảy máu xuất hiện một cách tự nhiên và kéo dài sau những

khớp nhiều lần sẽ làm teo cơ, cứng khớp, biến dạng khớp, khiến người bệnh gặp nhiều khó khăn trong việc đi lại, trở thành người tàn tật, sống cô lập với cộng đồng

và thậm chí dẫn tới tử vong sớm

Theo Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, hiện nay ở Việt Nam ước tính có khoảng gần 6.000 người mắc Hemophilia, trong đó số được chẩn đoán và quản lý mới chỉ chiếm chưa tới 20% [66] Do hiểu biết của cộng đồng, của bệnh nhân và gia đình về bệnh còn hạn chế, đa số bệnh nhân còn được chẩn đoán muộn

và chưa biết cách tự chăm sóc Bên cạnh đó, chế phẩm máu điều trị cho bệnh nhân còn chưa được cung cấp đầy đủ vì vậy tỷ lệ bệnh nhân tàn tật còn cao, chiếm 60%

Theo số liệu thống kế của Hiệp hội Hemophilia quốc tế, hiện nay trên thế giới có hơn 400.000 người mắc bệnh Hemophilia Trong đó, Hoa Kỳ có khoảng 20.000 người mắc bệnh và ước tính mỗi năm có khoảng 400 bé trai mới sinh mắc bệnh Hình 2 minh họa mối tương quan tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia của Việt Nam

so với thế giới [72]

Hình 2 Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia ở Việt Nam so với thế giới theo đánh giá

của Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng 3 năm 2012

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia

Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI Trong hầu hết các trường hợp, gen đáp ứng cho bệnh Hemophilia được truyền từ cha hoặc/và mẹ sang con cái Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp mắc bệnh Hemophilia được sinh ra

từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia trước đó Trong những trường hợp như vậy, nguyên nhân gây bệnh Hemophilia là do đột biến gen tự phát tại thời điểm thụ tinh [70]

 Nguyên nhân do di truyền

Gen mã hóa cho hai yếu tố đông máu VIII và IX đều nằm trên nhiễm sắc thể giới tính "X" [Nữ (XX), nam (XY)] Do đó, Hemophilia được gọi là rối loạn chảy máu di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính "X" Điều này có nghĩa là bệnh Hemophilia chủ yếu xảy ra ở nam giới, còn nữ giới là người mang gen gây bệnh Nam giới mắc bệnh có mức độ biểu hiện thấp hoặc không có yếu tố đông máu VIII

và IX trong tuần hoàn máu Trong khi nữ giới mang gen bệnh sẽ có ít nhất một nhiễm sắc thể giới tính “X” mang gen mã hóa cho yếu tố đông máu VIII và IX ở trạng thái bình thường, đáp ứng khoảng 50% mức độ yếu tố đông máu Các mô hình

di truyền chung cho cả hai bệnh Hemophilia A và B có thể được tóm tắt sau:

 Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp cha mắc bệnh, mẹ không mắc bệnh:

Người cha mắc bệnh sẽ di truyền gen gây bệnh nằm trên nhiễm sắc thể “X” cho toàn bộ con gái Do đó, tất cả con gái được sinh ra từ người cha này trở thành người mang gen bệnh Mỗi người con trai được sinh ra trong trường hợp này sẽ nhận một nhiễm sắc thể “Y” từ người cha và một nhiễm sắc thể “X” không mang gen bệnh từ người mẹ Bởi vậy, tất cả các con trai sẽ không mắc bệnh (Hình 3) [69]

Hình 3 Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp

cha mắc bệnh và Mẹ không mang gen gây bệnh [69]

 Bệnh Hemophilia được di truyền trong trường hợp người cha không mắc bệnh, mẹ mang bệnh:

Trường hợp này, người mẹ mang gen bệnh có thể di truyền chính chiếc nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh cho cả con gái và con trai của mình Do đó, cả hai con trai và con gái có 50% nguy cơ nhận được một chiếc nhiễm sắc thể X này từ người mẹ Nếu một người con trai nhận được nhiễm sắc thể “X” mang gen bệnh, người con này sẽ mắc bệnh Còn nếu, người con trai nhận được một chiếc nhiễm sắc thể X không mang gen bệnh, người con này sẽ không mắc bệnh Đối với con gái, nếu như một người con gái nhận từ nhiễm sắc thể “X” mang bệnh từ người mẹ, người còn gái này sẽ mang gen bệnh Vì vậy, các con gái được sinh ra từ trường hợp này có 50% nguy cơ cũng trở thành người mang gen bệnh Các con trai cũng có 50% nguy cơ mắc bệnh (Hình 4) [69]

Ngoài ra, sự thiếu hụt yếu tố đông máu XI thường là một bệnh di truyền, được gây ra bởi đột biến gen (alteration) của gen mã hóa cho yếu tố đông máu XI Đây là một rối loạn di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường, có nghĩa là cả

bố và mẹ đều phải mang gen bệnh thì mới có khả năng sinh ra một người con mắc bệnh Sự ảnh hưởng của gen gây bệnh này đối với cả nam và nữ là như nhau [74]

Hình 4 Sự di truyền bệnh Hemophilia trong trường hợp

mẹ mang bệnh và cha không mắc bệnh [69]

 Nguyên nhân do đột biến

Đột biến xảy ra ở các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu (VIII, IX và XI) chủ yếu là các đột biến điểm, đảo đoạn, mất nucleotide và đột biến vô nghĩa Các dạng đột biến này chiếm tỷ lệ tương ứng 46%, 42%, 8%, 4% Người bệnh nhận được những đột biến này theo phương thức tự phát hơn là được di truyền từ cha mẹ Bởi vì, một đột biến mới có thể được tạo ra ở một trong các giao tử do cha mẹ sinh

ra Các đột biến tự phát chiếm khoảng 30% trong tổng số các trường hợp mắc bệnh Hemophilia [54]

1.1.3 Phân loại Hemophilia

Quá trình đông máu được thực hiện nhờ sự tham gia tương tác của nhiều thành phần trong máu, trong đó có 13 yếu tố đông máu (Clotting Factor I-XIII) [32]

xảy ra chảy máu kéo dài (bệnh Hemophilia) Bệnh Hemophilia có thể được chia làm

3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và Hemophilia C [74]

a Hemophilia A: Là loại bệnh phổ biến nhất, do sự thiếu hụt chức năng của

yếu tố đông máu VIII trong tuần hoàn máu và gen gây bệnh liên kết với nhiễm sắc thể X, do đó bệnh chủ yếu xảy ra ở nam giới Tỷ lệ mắc bệnh là 1:10000 bé trai sơ sinh mỗi năm và chiếm khoảng 80% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia Ví dụ như Canada, hiện nay số người mắc bệnh này là 2.500 người

b Hemophilia B: Đây là bệnh phổ biến thứ hai sau bệnh Hemophilia A, so

với bệnh Hemophilia A thì nó thấp hơn khoảng 4 lần Bệnh được gây ra do sự thiếu hụt chức năng của yếu tố đông máu IX và gen gây bệnh liên kết với nhiễm sắc thể

X, do đó bệnh chủ yếu xảy ra ở nam giới Tỷ lệ mắc bệnh là 1:50000 bé trai sơ sinh mỗi năm và nó chiếm khoảng 20% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia Ví dụ như Canada, hiện nay số người mắc bệnh này là 600 người

c Hemophilia C: Bệnh này hiếm gặp nhất Bệnh được gây ra do sự thiếu hụt

chức năng của yếu tố đông máu XI Tỷ lệ mắc bệnh này là 1:100000 bé trai sơ sinh mỗi năm

Mức độ nặng của bệnh Hemophilia phụ thuộc vào lượng yếu tố đông máu có mặt trong máu Người bình thường, trong huyết tương nồng độ của các yếu tố đông máu VIII và IX dao động từ 50 – 150% [68] Tùy theo mức độ thiếu hụt yếu tố đông máu nhiều hay ít mà người ta phân chia Hemophilia thành 3 thể bệnh sau:

a Thể nặng (< 1%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX nhỏ hơn 1% Chảy máu

trong cơ, khớp hoặc các bộ phận khác xảy ra tự nhiên hay sau chấn thương nhỏ Thể bệnh nặng chiếm khoảng 60% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia

b Thể trung bình (1 – 5%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX từ 1% đến 5%

Chảy máu sau chấn thương trung bình hoặc phẫu thuật, nhổ răng Thể bệnh trung bình chiếm khoảng 15% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia

c Thể nhẹ (5 – 30%): Nồng độ yếu tố VIII hoặc IX từ hơn 5% đến 30%

Chảy máu thường liên quan đến chấn thương lớn, phẫu thuật hoặc nhổ răng Bệnh

nhân thường được chẩn đoán muộn, có liên quan đến chấn thương hoặc mổ xẻ Thể bệnh nhẹ chiếm khoảng 25% số trường hợp mắc bệnh Hemophilia

1.1.4 Biểu hiện của bệnh Hemophilia

Hầu hết bệnh nhân Hemophilia là nam giới Bệnh gặp ở khắp nơi trên thế giới với tỷ lệ khoảng 1:5000 bé trai mới sinh Nhìn chung, bệnh nhân Hemophilia càng nặng biểu hiện bệnh càng sớm Triệu chứng thường xuất hiện khi trẻ bắt đầu tập đứng và lẫm chẫm tập đi Sau những lần ngã thường có xuất huyết dưới da hoặc chảy máu môi, lưỡi

Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp [65] Hình 5 minh họa một trong những biểu hiện của bệnh Hemophilia

Hình 5 Biểu hiện bệnh Hemophilia thể nặng ở trẻ sơ sinh [23]

Các vết thâm tím dưới da tạo thành do chảy máu tĩnh mạch ở bệnh nhân Hemophilia

Chảy máu khớp: Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân Hemophilia

Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương Nếu điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều

đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp Điều trị sớm sẽ

dự phòng được tình trạng đau mãn tính và biến dạng khớp

Chảy máu trong cơ: Chảy máu trong cơ cũng thường gặp và xuất hiện tự

nhiên hoặc sau chấn thương Những cơ hay bị chảy máu là: cẳng chân, đùi, cánh tay Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài ngày Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị phá huỷ và có thể gây liệt

Chảy máu não: Có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương, ví dụ như

ngã hoặc đập đầu vào vật cứng Triệu chứng chảy máu não có thể xảy ra ngay hoặc vài ngày sau chấn thương bao gồm: dễ kích ứng, ngủ gà, đau đầu, lú lẫn, nôn, buồn nôn…

Chảy máu trong cổ và ngực: Chảy máu ở cổ và ngực có thể được coi là

nghiêm trọng vì sưng nề có thể gây chèn ép đường thở Nhiễm trùng cũng có thể làm sưng cổ và đôi khi khó có thể phân biệt hiện tượng sưng là do nhiễm trùng hay

do chảy máu

1.1.5 Phương pháp điều trị bệnh Hemophilia

Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc Người bệnh phải phụ thuộc vào các loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn máu hiến và họ có thể chung sống với bệnh Hemophilia được điều trị khác nhau tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của tình trạng bệnh

Hemophilia A nhẹ: Điều trị có thể bao gồm tiêm chậm hormon hesmopressin

(DDAVP) vào tĩnh mạch để kích thích trợ giúp cho sự vận chuyển yếu tố đông máu VIII đến nơi thành mạch máu bị tổn thương [46] Desmopressin cũng có thể được

dùng theo đường xịt mũi

Hemophilia A hoặc hemophilia B từ thể vừa tới nặng: Điều trị bằng cách

truyền yếu tố đông máu được chiết xuất từ máu người hoặc yếu tố đông máu tái tổ

hợp để cầm máu Có thể phải truyền nhiều lần nếu bệnh nặng

Hemophilia C: Cần truyền huyết tương để ngăn chặn các đợt chảy máu

Thông thường, việc truyền yếu tố đông máu dự phòng 2 hoặc 3 lần/tuần có thể giúp ngăn ngừa chảy máu Cách này giúp giảm thời gian nằm viện và hạn chế tác dụng phụ Bệnh nhân có thể được hướng dẫn cách tự tiêm truyền desmopressin tại nhà

1.2 Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu

Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó tạo ra các cục máu đông Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu Khi thành mạch máu

bị tổn thương, máu được cầm nhờ vị trí tổn thương được che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết Rối loạn đông máu có thể làm tăng nguy cơ chảy máu và/hoặc tạo cục máu đông và huyết tắc Cơ chế đông máu được bảo tồn khá chắc trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu cầu) và protein (13 các yếu tố đông máu) [32]

Trong quá trình đông máu, yếu tố đông máu IX đóng vai trò như một protease của quá trình cầm máu nên nó có vai trò hết sức quan trọng (Hình 6) Sự đông máu được điều khiển bởi một mức độ nồng độ các protein thông qua sự tương tác qua lại giữa hai con đường, nội sinh và ngoại sinh Con đường ngoại sinh bao gồm một số yếu tố, các yếu tố này thường không có mặt trong máu trong điều kiện bình thường và được gọi là yếu tố mô (tissue factor-TF) Yếu tố mô xuất hiện trên

bề mặt của các tế bào và nó liên kết với chất nền ngoại bào Ngược lại, con đường nội sinh chỉ bao gồm các yếu tố có thể phân lập được từ huyết thanh [31] Trong mạch máu, sự đông máu được khởi đầu bằng việc thành mạch máu bị tổn thương và tiếp theo yếu tố mô được bộc lộ trên bề mặt của các tế bào ngoài mạch máu để hoạt hóa yếu tố đông máu VII thành dạng hoạt hóa/FVIIa [47] Sự kiện này khởi đầu cho một chuỗi phức tạp các phản ứng thủy phân protein có liên quan đến nhiều yếu tố, nhiều loại tế bào và nhiều chất ức chế mà kết quả cuối cùng dẫn đến sự hình thành cục máu fibrin

Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX

hóa FXa thông qua sự kết hợp với cofactor của nó là FVIIIa (dạng hoạt hóa của yếu

tố đông máu VIII) và cơ chất là yếu tố đông máu X để hình thành phức hợp tenase [31] Phản ứng này cần có sự tham gia của ion Ca2+ và phospholipid, xảy ra trên bề mặt của cả tế bào tiểu cầu hoạt hóa và các tế bào nội bì [36] Sự hoạt hóa của yếu tố đông máu X trong phức hợp tenase thể hiện sự liên kết giữa cả hai con đường nội sinh và ngoại sinh Sự hoạt hóa yếu tố đông máu X phụ thuộc vào FIXa (dạng hoạt hóa của yếu tố đông máu IX) là điều kiện tiên quyết cho quá trình cầm máu, nếu như sự thiếu hụt một trong hai yếu tố đông máu VIII hoặc IX dẫn đến kết quả là mắc bệnh Hemophilia A hoặc Hemophilia B mà khó có thể phân biệt được kiểu hình giữa hai bệnh này

Hình 6 Biểu đồ thể hiện sự đông máu [67]

Các phản ứng liên quan tới yếu tố đông máu IX được thể hiện bằng màu chữ đỏ

Theo Hình 6, yếu tố đông máu X không chỉ được hoạt hóa bằng FIXa mà còn được hoạt hóa bởi chính phức hệ TF-FVIIa Tuy nhiên, TF-FVIIa không thể

hoạt hóa đủ yếu tố đông máu X để ngăn cản sự xuất hiện bệnh Hemophilia ở mỗi cá thể khi có sự thiếu hụt yếu tố đông máu VIII hoặc IX [36]

Yếu tố đông máu IX lưu thông trong mạch máu như là một zymogen bất hoạt

và phải được chuyển hóa thành dạng enzyme hoạt động (FIXa) Trước khi nó thực hiện chức năng là một chất hoạt hóa yếu tố đông máu X thì yếu tố đông máu IX được hoạt hóa bằng phức hợp TF-FVIIa hoặc bằng FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố đông máu XI) [27] Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng phức hợp TF-FVIIa được kết hợp với sự khởi đầu của quá trình đông máu hoặc xảy ra trên bề mặt tế bào mang TF [37] Cơ chế hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng TF-FVIIa chỉ tạo ra một lượng rất nhỏ FIXa

Con đường hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng FXIa tạo ra lượng FIXa nhiều hơn và xảy ra trên bền mặt của các tế bào tiểu cầu hoạt hóa [36] Sự hoạt hóa đông máu IX thông qua cơ chế này rất quan trọng cho việc duy trì sự hình thành và đảm bảo tính nguyên vẹn cục máu đông, đặc biệt trong một số trường hợp kích thích đông máu nghiêm khắc hoặc khi quá trình đông máu xảy ra trong môi trường thủy phân fibrin cao [22] Nhờ đó, yếu tố đông máu IX đóng một vài trò quan trọng trong

cả sự khởi đầu hình thành cục máu và duy trì tính nguyên vẹn của cục máu thông qua sự hoạt hóa yếu tố đông máu X

1.3 Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX

Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein

FIX), nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1 (Hình 7)

Gen FIX có kích thước khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron [17], [63] Trong đó,

trình tự nucleotide mã hóa cho protein FIX chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen và kích thước của exon lớn nhất khoảng 1935 bp (Bảng 1) [63]

Hình 7 Vị trí của gen mã hóa yếu tố đông máu IX trên nhiễm sắc thể X [64]

Về mặt cấu trúc, exon thứ nhất của gen FIX có chứa trình tự dẫn dầu và tín

hiệu cho sự khởi đầu quá trình phiên mã và dịch mã Quá trình dịch mã được bắt đầu với bộ ba mã hóa cho Met, nằm ở vị trí -46 trước khi bộ ba được dịch mã sang đầu amino của phân tử protein hoàn chỉnh [63] Nằm giữa exon thứ nhất và exon thứ hai là một đoạn intron có kích thước khá lớn, khoảng 6 kb (Bảng 1)

Bảng 1 Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX [63]

đồng với yếu tố sinh trưởng biểu mô tương ứng EGF1 và EGF2 [28] Exon thứ sáu nằm cách đầu 5’ khoảng 21 kb, mã hóa cho vùng hoạt hóa với hai đầu biên chính là hai vị trí tham gia vào hoạt hóa protein FIX thành dạng hoạt hóa FIXa Hai exon còn lại nằm ở đầu kết thúc của trình tự đầu 3’ và được phân tách bằng một đoạn intro ngắn Hai exon này cùng mã hóa cho vùng serine protease (Hình 8)

Hình 8 Cấu trúc của gen FIX mã hóa cho yếu tố đông máu IX [63]

Phân tử mRNA trưởng thành được phiên mã từ gen FIX có chiều dài 2803

base, bao gồm vùng 5’-UTR (29 base), một khung đọc mở có mang mã kết thúc (1383 base) và một vùng 3’-UTR (1390 base) (Hình 9)

5’-UTR

(29 nt)

3’-UTR (1390 nt)

Trình tự mã hóa + Mã kết thúc

(1383 nt) mRNA tổng hợp từ gen FIX (2803 nt)

Hình 9 Cấu trúc phân tử mRNA được phiên mã từ gen FIX [63]

1.4 Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX

1.4.1 Cấu trúc của phân tử protein FIX

Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham gia vào quá trình đông máu Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô gan dưới dạng một protein tiền chất của một serine protease-FIXa Sau khi được tổng hợp, protein tiền chất này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461 amino acid, khối lượng khoảng 56 kDa Phân tử protein FIX được chia thành các vùng chính: vùng tín hiệu (signal peptide-SP); vùng propeptide (PP); vùng Gla; hai vùng giống vùng nhân tố sinh trưởng biểu mô (epidermal growth factor – EGF); vùng hoạt hóa (activation peptide – AP) và vùng serine protease (Hình 10)

Để trở thành một protein FIX hoàn chỉnh gồm 415 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 57 kDa, lưu thông trong máu với nồng độ trung bình 4-5 μg/ml [20], có chứa khoảng 17% về khối lượng phân tử là carbonhydrate thì phân tử protein FIX tiền chất ban đầu phải trải qua những biến đổi sau dịch mã Những biến đổi này bao gồm: carboxyl hóa 12 amino acid glutamic đầu tiên của chuỗi polypeptide tạo thành γ-carboxyglutamate [58]; đường hóa các amino acid tại các vị trí Asn-157, Asn-159, Ser-53, Ser-61, Thr-159, Thr-169 và Thr-172 [24]; hydroxyl hóa gốc Asp-64 [29]; loại bỏ đoạn tín hiệu (28 amino acid) và đoạn propeptide (18 amino acid) (Hình 11)

Về mặt cấu trúc, phân tử protein FIX hoàn chỉnh được chia thành một số vùng như sau: vùng gắn acid carboxylic vào các amino acid glutamic đầu N (N-terminal gamma-carboxyglutamic acid domain, Gla: từ gốc 1-40); vùng kỵ nước (hydrophobic stack: 41-46); 2 vùng giống vùng nhân tố sinh trưởng biểu mô (epidermal growth factor-like domains, EGF1: 47-83, EGF2: 88-127) liên kết với nhau nhờ cầu nối linker (84-87); vùng hoạt hóa (activation peptide: 146-180) và vùng serine protease tận cùng đầu C (C-terminal serine protease domain: 181-415) [20] Vùng Gla chứa các vị trí có liên kết yếu và vừa phải với ion Ca2+

[16], trong khi đó cả vùng EGF1 và serine protease đều chứa một vị trí liên kết mạnh với ion

Ca2+ [18] Các đặc điểm cấu trúc phân tử của protein FIX được tạo thành nhờ liên kết của ion Ca2+ với mỗi vùng, do đó nó có thể thực hiện chức năng sinh học [43]

Hình 10.Trình tự amino acid và những biến đổi sau dịch mã của protein FIX [67]

Phân tử protein FIX hoàn chỉnh bao gồm một số vùng: peptide tín hiệu; propeptide; Gla; giống với nhân tố biểu mô (EGF); peptide hoạt hóa (AP) và serine protease Các vị trí liên kết peptide bị cắt thể hiện bằng các đường nét đậm giữa hai amino acid tương ứng Liên kết disulfide thể hiện bằng các đường màu đen kết nối giữa các cysteine (C)

Hình 11 Những biến đổi sau dịch mã của protein FIX trong con đường chế tiết [67]

Phân tử protein FIX được biến đổi với mức độ cao Trong Lưới nội chất, peptide tín hiệu được cắt bỏ, quá trình γ-carboxyl hóa xảy ra và quá trình gắn chuỗi glycan được khởi động Trong thể Golgi, propeptide được cắt bỏ, quá trình gắn chuỗi glycan xảy ra, quá trình phosphoryl hóa và sulphat hóa cũng xảy ra

1.4.2 Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX

 Quá trình carboxyl hóa

Phân tử protein FIX là một thành viên của nhóm protein phụ thuộc vào vitamin K, nhóm này bao gồm các protein liên quan trực tiếp tới sự đông máu như yếu tố VII, yếu tố IX, yếu tố X, prothrombin, protein C và protein S Tất cả các protein phụ thuộc vào vitamin K đều chứa acid γ-carboxy glutamic (Gla) Một acid γ-carboxy glutamic được tạo thành bằng việc gắn thêm một nhóm carboxylate vào một acid glutamic tại vị trí carbon γ Sự biến đổi này được thực hiện bởi enzyme γ-glutamyl carboxylase, một protein được nằm trong màng lưới nội chất của tế bào

mô gan [50] Phản ứng carboxyl hóa thực hiện được cần sự tham gia của cả vitamin

K và CO2 (Hình 12)

Trong quá trình phản ứng, đầu tiên vitamin K được oxy hóa để trở thành vitamin K 2,3-epoxide nhờ enzyme glutamyl carboxylase Sau đó, sản phẩm oxy hóa này lại được quay vòng trở lại thành một dạng khử của vitamin K thông qua sự xúc tác của enzyme vitamin K reductase [30] Một chất ức chế sự đông máu là warfarin, chất ngăn cản phản ứng chuyển hóa thành dạng khử của vitamin K Do đó, làm gián đoạn phản ứng hình thành nên acid γ-carboxy glutamic của các protein thuộc nhóm protein phụ thuộc vào vitamin K Quá trình carboxyl hóa đối với các protein phụ thuộc vào vitamin K là một quá trình cần thiết để giúp cho chúng thực hiện các chức năng sinh học [19]

Ở người, quá trình carboxyl hóa phân tử protein FIX được xúc tác bởi enzyme γ-glutamyl carboxylase xảy ra theo cơ chế dây chuyền Đầu tiên, enzyme carboxylase nhận biết và bám vào trình tự propeptide trên phân tử protein FIX Tiếp

đó, enzyme carboxylase sẽ trượt trên trình tự amino acid của chuỗi polypeptide để nhận ra acid glutamic và biến đổi acid glutamic thành acid γ-carboxy glutamic (Gla) [55] Tuy nhiên, enzyme carboxylase chỉ biến đổi các Glu gần vị trí mà nó biết trên trình tự propeotide, điều này giải thích tại sao các Glu lại tập trung ở đầu amino acid [33] Tất cả các phản ứng carboxyl hóa xảy ra trên phân tử protein FIX theo một phản ứng đơn giữa enzyme và cơ chất, tức là một phân tử enzyme sẽ liên kết với một cơ chất

Hình 12 Phản ứng carboxyl hóa [67]

Acid glutamic trong một protein phụ thuộc vào vitamin K được chuyển hóa trong lưới nội chất để trở thành acid γ-carboxy glutamic trong một phản ứng liên quan tới vitamin K, enzyme γ-glutamyl carboxylase và CO2

 Quá trình loại bỏ trình tự propeptide

Trong phân tử protein FIX, việc loại bỏ trình từ propeptide có vai trò rất quan trọng cho sự hoạt hóa của phân tử protein FIX thành dạng protein có hoạt tính protease/FIXa Sự loại bỏ trình tự propeptide khỏi phân tử protein FIX xảy ra trong thể Golgi của tế bào gan, trước khi nó được tiết vào máu [60] Mặc dù vậy, enzyme chịu trách nhiệm chính cho việc loại bỏ trình tự propeptide khỏi phân tử FIX đến nay vẫn còn chưa được xác định Tuy nhiên, một giả thuyết cho rằng enzyme furin

(enzyme furin được tổng hợp từ gen furin) là enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại

bỏ trình từ propeptide Enzyme furin được tìm thấy trong các tế bào gan, nó tham

gia xúc tác cho phản ứng cắt bỏ các amino acid ghép cặp Ngoài ra, enzyme này còn

có khả năng cắt bỏ trình từ propeptide trên phân tử protein FIX [38] Thực tế, khi đồng biểu hiện enzyme furin và gen mã hóa cho phân tử protein FIX trong tế bào CHO, đã có được mức độ cao hơn trong việc loại bỏ trình tự propeptide trong phân

tử protein FIX [60] Sự có mặt của trình tự propeptide trong phân tử protein FIX sẽ ngăn cản sự hình thành cấu trúc bậc hai và ba trong vùng Gla (cấu trúc Gla có ái lực cao với ion Ca2+), cấu trúc này là rất cần thiết cho phân tử protein FIX bám vào màng phospholipid hoặc cofactor hoặc chất hoạt hóa Ngoài ra, sự có mặt của trình

tự propeptide trong phân tử protein FIX còn làm giảm mạnh khả năng hoạt hóa của

phân tử protein FIX [21], [61] Vì thế, người mang đột biết gen FIX sẽ ngăn cản sự

loại bỏ trình tự propeptide trước khi phân tử protein FIX được tiết vào máu và thể hiện sự suy giảm quá trình đông máu

 Quá trình phosphoryl hóa và sulphat hóa

Ở người, hơn 90% phân tử protein FIX huyết thanh có chứa một serine được phosphoryl hóa (Ser-158), nằm trong vùng hoạt hóa [38] Mục đích của sự hoạt hóa Ser-158 đến nay vẫn chưa được xác định Phân tử protein FIX tái tổ hợp được tổng hợp trong tế bào CHO có chứa ít hơn 1% phân tử protein FIX được phosphoryl hóa, nhưng vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học tương tự như với phân tử protein FIX dạng tự nhiên Điều này chỉ ra rằng sự phosphoryl hóa là biến đổi không cần thiết cho sự hoạt hóa protein FIX Ngoài ra, mục đích khác của biến đổi này có thể ảnh hưởng tới tuổi thọ của phân tử protein FIX cũng đã được đưa ra, tuy nhiên điều này vẫn chưa được chứng minh và giải thích một cách rõ ràng

Phân tử protein FIX còn chứa một vị trí được sunfat hóa, (Asp-157) Sự sunfat hóa Asp-157 được xem là có liên quan tới cả sự phục hồi và tuổi thọ của phân tử protein FIX [38]

 Quá trình hydroxyl hóa

Sự hydroxyl hóa với phân tử protein FIX xảy ra ở vị trí carbon β của Asp-64

được xác định rõ Tuy nhiên, sự biến đổi này được xác biết là không cần thiết cho

sự hoạt hóa phân tử protein để thực hiện chức năng một protease Điều này được minh chứng, khi biểu hiện protein FIX tái tổ hợp trong môi trường ức chế sự hydroxyl hóa thì thấy protein tái tổ hợp này vẫn bộc lộ hoạt tính đông máu như bình thường [26] Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại Asp-64 trong vùng EGF vẫn thể hiện được ái lực cao với ion Ca2+ [57]

 Quá trình glycosyl hóa

Phân tử protein FIX huyết thanh có chứa bốn vị trí gắn với chuỗi O-linked oliosaccharide và hai vị trí gắn với N-linked oligosaccharide Hai vị trí gắn với O-linked oliosaccharide (Ser-53 và Ser-61), được glycosyl hóa đồng dạng và được tìm thấy ở vùng EGFI [38] Hai vị trí gắn với O-linked oliosaccharide còn lại (Thr-159

và Thr-169) được glycosyl hóa một phần và được định vị ở trong vùng hoạt hóa [38] Vùng hoạt hóa cũng chứa hai vị trí gắn với N-linked oligosaccharide (Asp-157

và Asp-164) [39]

1.5 Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX

Để yếu tố đông máu IX (protein FIX) trở thành một protease chức năng trong quá trình đông máu, đoạn peptide hoạt hóa phải được loại bỏ khỏi chuỗi polypeptide của protein FIX tiền chất Phân tử protein FIX có thể được hoạt hóa trở thành dạng protease (protein FIXaβ) bởi phức hợp TF/FVIIa hoặc FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố XI) cùng với sự có mặt của màng phospholipid và ion Ca2+ [27] Sự hoạt hóa này liên quan đến sự thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein FIX tiền chất tại hai vị trí liên kết: Arg145-Ala146 và Arg180-Val181, đồng thời giải phóng một đoạn peptide hoạt hóa (35 acid amin) (Hình 13) [27]

Hình 13 Các con đường hoạt hóa yếu FIX [67]

Phân tử protein FIX được hoạt hóa bởi FXIa (phản ứng 5), TF-FVIIa (phản ứng 1 và 2) và RVV (phản ứng 3 và 4) Sau khi peptide hoạt hóa (AP) được loại bỏ, chuỗi nhẹ (LC) và chuỗi nặng (HC) được gắn kết với nhau bởi các liên kết disulfide đơn

Sự hoạt hóa protein FIX bằng phức hệ TF/FVIIa xảy ra theo con đường ngoại sinh và cần có sự có mặt của màng phospholipid và ion Ca2+ [42] Phản ứng này xảy ra trên bề mặt của các tế bào mang yếu tố mô (TF) và cũng cần đến sự có mặt của vùng Gla chức năng trong phân tử protein FIX tiền chất Trong cơ chế này, đầu tiên phần tử protein FIX được thủy phân tại vị trí liên kết Arg145-Ala146 tạo thành dạng trung gian FIXα Sau đó, liên kết peptide tại vị trí Arg180

-Val181 mới được thủy phân tiếp, được thể hiện qua phản ứng (1) và (2) trong Hình 13 Kết quả của việc hoạt hóa này tạo ra protein FIXaβ có khối lượng khoảng 46 kDa, bao gồm một chuỗi nhẹ có khối lượng phân tử khoảng 18 kDa và một chuỗi nặng có khối lượng khoảng 28 kDa, hai chuỗi này được liên kết với nhau bằng các liên kết disulfide Chuỗi nhẹ được tạo ra từ đầu amino acid của phân tử tiền chất, có trình tự

đầu amino acid Tyr-Asn-Ser-Gly-Glu, bao gồm các vùng như Gla, EGF1, EGF2

Trong khi đó, chuỗi nặng được sản sinh từ đầu carboxyl của phân từ tiền chất, có

trình tự đầu amino acid Val-Val-Gly-Gly-Glu và chỉ chứa một vùng serine protease

Cơ chế hoạt hóa yếu tố đông máu IX bởi FXIa cũng theo phương thức tương

tự như với phức hệ TF/FVIIa Phản ứng hoạt hóa này xảy ra ở pha lỏng của mạch máu mà không phải trên bề mặt của các tế bào như các phản ứng khác của quá trình đông máu Tuy nhiên, gần đây đã có những bằng chứng chỉ ra rằng phản ứng này lại xảy ra trên chính bề mặt của những tế bào tiểu cầu hoạt hóa, liên quan tới một loại protein đặc hiệu bề mặt của tế bào tiểu cầu, chứ không chỉ đơn thuần màng phospholipid Một số dữ liệu gần đây còn chỉ ra sự thủy phân cả hai vị trí liên kết peptide trong phân tử tiền chất để hoạt hóa protein FIX thành protein FIXaβ mà không tạo ra dạng trung gian FIXα như sự hoạt hóa protein FIX bởi phức hệ TF/FVIIa [62], phản ứng (5) trong Hình 13

Yếu tố đông máu IX cũng được hoạt hóa bởi một protease được chiết suất từ lọc rắn Russell (Russell’s viper venom – RVV) Enzyme này khởi đầu bằng việc thủy phân liên kết peptide Arg180

-Val181 để tạo ra dạng trung gian FIXaα, phản ứng (3), Hình 13 Yếu tố trung gian này bao gồm một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ, hai chuỗi này liên kết với nhau bằng các liên kết đơn disulfide và chất trung gian có trọng lượng bằng với trọng lượng của tiền chất FIX (57 kDa) Phân tử trung gian này cũng có hoạt tính giống với hoạt tính của FIXaβ, có hoạt tính bằng 20% hoạt tính của FIXaβ chức năng [45] Sau đó, dạng trung gian FIXaα được chuyển hóa thành protein FIXaβ bởi yếu tố FVIIa và FXIa (phản ứng (4), Hình 13)

1.6 Vector biểu hiện pET32a

Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các

gen ngoại lai ở vi khuẩn E coli Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng

với mục đích chính là biểu hiện gen Ưu điểm quan trọng nhất của vector này nằm ở chỗ, các gen đích ngoại lại được chèn vào vector sẽ được dung hợp với protein thioredoxin (Trx.TagTM) có sẵn trên vector [41] Việc dung hợp giữa protein ngoại

lai với thioredoxin có ý nghĩa rất quan trọng trong việc tạo thành một dạng protein dung hợp có khả năng tan cao hơn Điều này góp phần giải quyết được vấn để thường gặp phải khi chúng ta biểu hiện các gen đích không có nguồn gốc từ vi khuẩn Khi chúng ta biểu hiện gen ở vi khuẩn thường hay xảy ra trường hợp các protein sau khi được biểu hiện sẽ tồn tại ở dạng không tan và sẽ không có ý nghĩa trong việc ứng dụng của các protein tái tổ hợp này

Việc dung hợp của protein thioredoxin với polypeptide không chỉ làm tăng tính tan của các protein đích mà còn có thể xúc tác sự hình thành các liên kết disulfide trong tế bào chất của dạng đột biến TrxB [41]

Vector pET32a sử dụng promoter T7 (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T7) đề điều khiển quá trình phiên mã gen ngoại lai Đây là một promoter hoạt động rất

mạnh trong tế bào E coli và có tính đặc hiệu cao Quá trình phiên mã được điều hòa bởi protein lacI – sản phẩm của gen lacI

Trên vector pET32a có gen lacI cho phép điều hòa quá trình phiên mã ngay

cả khi chủng E coi thiếu gen lacI nội sinh

Vùng đa điểm nối bao gồm các trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế thông thường, giúp cho quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở

nên dễ dàng

Tâm tái bản DNA từ thực khuẩn thể M13 cho phép sự tạo thành DNA sợi

đơn sử dụng thực khuẩn thể hỗ trợ (M13K07 Helper Phage)

Vector pET32a mang gen chọn lọc AmpR

(gen bla) truyền tính kháng

Ampicilin sang tế bào chủ, tạo thuận lợi cho việc nhận biết dòng tế bào mang plasmid

Hình 14 Cấu trúc vector biểu hiện pET32a

1.7 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

E coli BL21 là chủng được bắt nguồn từ E coli B, được phát hiện vào năm

1946 E coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử Chúng có

bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là một nhiễm sắc thể đơn với kích thước khoảng 5,44 x 106

cặp base Tế bào E coli có khả năng

sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu, trung bình khoảng 20 phút chúng lại phân chia một lần Đặc biệt, chúng có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền từ môi trường ngoài như plasmid, phage Ngoài ra, chúng có khả

năng sao chép DNA rất lớn Chính vì vậy, E coli đã được cải biến để sử dụng như

một vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng cũng như trong kỹ thuật biểu hiện gen [ 7], [10]

Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) được cải biến từ E coli BL21, chúng có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase (1 gen T7), gen này được điều khiển bởi

promoter lacUV5 [56] Promoter lacUV5 chính là một dạng cải biến từ promoter lac, promoter này có ưu điểm là mạnh hơn rất nhiều so với promoter kiểu dại Toàn

bộ sự sắp xếp của gen mã hóa T7 RNA polymerase và promoter lacUV5 được nằm trên hệ gen của phage λ, một phiên bản đặc biệt của phage λ mang toàn bộ cấu trúc

này được gọi là λDE3 λDE3 được chèn vào nhiễm sắc thể của E coli BL21 để tạo thành chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) Ngoài ra, trên hệ gen của λDE3 còn có các gen marker khác như lacI, ind1, sam7, nin5 Tuy nhiên, các gen marker này sẽ

không ảnh hưởng tới sự biểu hiện gen ngoại lai

E coli BL21(DE3) là vật chủ có nhiều điểm thuận lợi cho việc biểu hiện gen

của DNA plasmid có mang gen đích được điều khiển bởi promoter T7 Thứ nhất,

Trong DNA hệ gen của E coli BL21(DE3) có mang một bản sao của gen mã hóa

T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase là một enzyme có tính đặc hiệu cao cho promoter T7, các gen được điều khiển bởi promoter T7 sẽ được phiên mã một cách

quá mức Một lý do khác nữa, chủng E coli BL21(DE3) mang các gen đột biến làm

mất khả năng tổng hợp các protease như lon và ompT Protease lon là một protease

nội bào, nó thực hiện hai chức năng chính trong tế bào E coli Chức năng thứ nhất,

protease lon thủy phân các protein bị sai hỏng về mặt cấu trúc, điều này giúp cho tế

bào tránh được sự tích lũy những protein không cần thiết, trong chức năng này thì

gen lon như là một gen quản gia cho tế bào Chức năng thứ hai, protease lon cũng

thủy phân các protein nội bào (sulA), các protein sau khi thực hiện chức năng, điều này tránh cho tế bào giữ lại những protein không cần thiết (có thể phân giải protein

mà chúng ta mong muốn) và protein được phân giải trước khi tế bào được dung

giải Protease ompT là một protease nằm trên màng ngoài của tế bào, protease này

có tác dụng giúp cho E coli phân giải các protein ngoại bào, nó phân giải các

muốn trong quá trình tách chiết và tinh sạch Chính nhờ những cải biến này mà

E coli BL21(DE3) đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai

Cơ chế cảm ứng promoter T7: Trong tế bào BL21(DE3), chất ức chế lac

ngăn cản sự biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme T7 RNA polymerase Do dó,

trong điều kiện bình thường chất ức chế lac sẽ bám vào vùng operator lac nằm giữa

promoter lac và gen mã hóa cho enzyme T7 RNA polymerase Sự liên kết của chất

ức chế lac với operator lac sẽ ngăn cản sự phiên mã của gen mã hóa T7 RNA

polymerase Tuy nhiên, trong tế bào BL21(DE3) luôn có một lượng nhỏ T7 RNA polymerase được biểu hiện và có mặt trong tế bào Còn trong điều kiện có mặt của

chất cảm ứng IPTG, chất cảm ứng này sẽ liên kết với chất ức chế lac và sự liên kết

này làm thay đổi cấu trúc của chất ức chế nên không có khả năng liên kết với operator Do đó, tế bào tạo ra nhiều T7 RNA polymerase trong điều kiện có mặt của chất cảm ứng Enzyme T7 RNA polymerase là enzyme đặc hiệu cho promoter T7, nhờ đó mà protein được mã hóa trên plasmid sẽ được biểu hiện quá mức

Hình 15 Cơ chế cảm ứng promoter T7 bằng chất cảm ứng IPTG ở tế bào

E coli BL21(DE3) [49]

1.8 Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp

Mọi sinh vật đều có một bộ máy phân tử để sản xuất các protein cần thiết, nói cách khác, mọi sinh vật đều có khả năng tạo ra protein nhờ vào bộ máy di truyền của chính các tế bào trong cơ thể Bằng cách sử dụng kỹ thuật rDNA, các nhà khoa học có thể đưa một hoặc nhiều gen mã hóa cho một protein trị liệu vào một cơ thể/tế bào Khi cơ thể/tế bào này sinh trưởng, nó sẽ đọc và dịch mã gen ngoại lai này và sinh ra protein mong muốn (sẽ được sử dụng vào mục đích chữa bệnh) Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ (prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote) Hầu hết các dược phẩm sinh học

do Cơ quan Quản lý Lương thực và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) phê chuẩn đều được sản xuất thông qua sử dụng các hệ thống biểu hiện này

Hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E coli có rất nhiều ưu điểm quan trọng để đáp

ứng là một vật chủ thích hợp cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai như: dễ nuôi cấy; môi trường, trang thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản và không tốn kém Do đó, góp phần hạ giá thành sản phẩm; tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l Bên cạnh đó, hệ thống biểu hiện rDNA ở vi khuẩn vẫn còn tồn tại một số điểm hạn chế

Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào cực kỳ đơn giản, do đó, không giống như các

cơ thể đa bào, các vi khuẩn không có khả năng tiến hành các biến đổi hóa học đặc hiệu đối với protein sau khi protein đã được dịch mã từ trình tự DNA Trong khi đó, hầu hết các protein trị liệu ở người lại cần các dạng biến đổi này để hoàn thiện cấu hình không gian chức năng của chúng Tuy nhiên, những nhược điểm này có thể được cải thiện bằng cách sử dụng các vector biểu hiện thế hệ mới như: pET32a, pET32b sẽ góp phần cải thiện được sự tính tan của các protein biểu hiện hay sử dụng các phương pháp hóa học để cải biến cấu trúc của phân tử protein sau khi biểu hiện ở vi khuẩn thành dạng hoạt hóa như biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn

Để khắc phục những điểm yếu khi biểu hiện gen ở vi khuẩn, các hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, chẳng hạn như nấm men (ví dụ,

Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) đang ngày

càng được sử dụng rộng rãi Ưu điểm của nấm men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố

và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy mô lớn S cerevisiae là nấm men

được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp

Hiện nay, hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào thận người (Human Embryonic Kidney - HEK), tế bào thận chuột chưa trưởng thành (Baby Hamster Kidney - BHK) và tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary - CHO) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người Mặc dù, hệ thống này có rất nhiều nhược điểm như: sản lượng protein thu được khá thấp và giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao, do tốc độ sinh trưởng của tế bào chậm và môi trường nuôi cấy đắt tiền nhưng trong nhiều trường hợp tạo protein tái tổ hợp nó vẫn là lựa chọn duy nhất Đến nay, trên thế giới đã có khoảng 60 - 70% dược phẩm sinh học là protein tái tổ hợp được sản xuất nhờ sử dụng hệ thống tế bào CHO Đối với các glycoprotein có nguồn gốc từ người việc gắn nhóm đường là thiết yếu, do nó ảnh hưởng lên chức năng cũng như chu kỳ bán rã của protein Nếu đường hóa sai hoặc không xảy ra protein sẽ không bao giờ thực hiện được hoàn toàn chức năng của nó Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn hệ biểu hiện là tế bào động vật (CHO) vì yếu tố đông máu IX cũng cần phải trải qua quá trình đường hóa để thực hiện được chức năng xúc tác

1.9 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, bao gồm

các gen của người để nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất dược phẩm Công nghệ Sinh học Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu biểu hiện và tinh chế được các protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật như: Trichobakin từ cây qua lâu, có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư; protein bất hoạt ribosome (RIP) từ cây mướp đắng có hoạt tính kháng virus, nấm [8], [9], [12], [14] Viện cũng đã nghiên cứu

tách dòng và biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người, rh-IL2MM dạng đột

biến và kháng nguyên CD25 nhằm sử dụng trong điều trị và chẩn đoán ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng [1], [3], [4], [15] Các nhà khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã triển khai

tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người trong E coli [2] Các nghiên cứu

tạo vaccine tái tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm [6] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn và cộng sự tại Trường Đại học Y Hà Nội cũng bước đầu nghiên cứu phân lập và thiết kế vector biểu hiện một số vùng

chức năng của gen FVIII [13] Gần đây, nhóm chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện yếu

tố hoạt hóa plasminogen mô người (h-tPA) ở tế bào nuôi cấy từ buồng trứng chuột Hamster [11]