Chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

Chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

Chuyển gen ở động vật

Sinh viên thực hiện

1. Mai Hữu Phương

2. Nguyễn Duy Hải

3. Ngô Thị Hoài Diễm

4. Lê Thị Thu Trang

5. Nguyễn Thanh Như

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

KHOA SINH HỌC

Quy trình và các phương pháp chuyển gen ở động vật

Mô hình chuyển gen ở gà

Thử nghiệm chuyển gen GFP trên Gà (Gallus Gallus domesticus)

1

2

3

1.1 Quy trình chuyển gen ở động vật

Chuyển gen nhờ virus

Chuyển gen nhờ sử dụng tế bào gốc

Thuận lợi

 Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh

 Năng suất trứng cao

 Kích thước thích hợp

 Trứng có môi trường vô trùng tự nhiên

2.2 Những thuận lợi và khó khăn khi sử dụng gà làm đối tượng chuyển gen

 Sản lượng trứng một năm khoảng 250 - 270 quả.

 Trứng to, nặng 60 - 65 g

 Tỉ lệ lòng trắng so với lòng đỏ cao

 Vỏ trứng màu trắng, dễ kiểm tra phôi trong quả trứng ấp

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay:

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Gà Leghorn là giống chuyên trứng cao sản nhất thế giới hiện nay

Gà Leghorn là đối tượng rất thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen ở gia cầm

với mục đích sản xuất protein dược liệu trong lòng trắng trứng

Vector transposon Sleeping Beauty (SB)

Hệ thống transposon SB chứa một gen đơn mã hóa cho enzyme transposase và một transposon chứa đầu tận cùng lặp lại tại vị trí liên kết với transposase

3.2 Vector pT2/BH-CVpf-SB11

3.2 Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

 Vector pT2/BH-CVpf-SB11 được biến nạp vào E.coli nhờ xung điện → Nuôi cấy vi khuẩn E.coli mang gen biến nạp

 Tách chiết, thu nhận plasmid từ E.coli Plasmid sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8 %

Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

3.4.1 Phương pháp rèn kim tiêm

 Ống mao quản thủy tinh, d = 1 mm

 Máy kéo kim để kéo được đầu kim tiêm có đường kính 30 – 40 8

 Bẻ đầu nhọn để có chiều dài và độ vát phù hợp

3.4.2 Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)

 Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 2 l lên bề mặt của 100 l môi trường Opti-MEM

 Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Nhỏ 0,8 g ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên

 Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-Liposome

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ

Vỏ đá vôi

 Dùng máy khoan mini khoan vỏ trứng thành các mảnh tròn có đường kính 1 cm

 Rửa sạch bụi với cồn 70o → rửa bằng PBS

 Bảo quản trong PBS để sử dụng cho các TN

Chuẩn bị vỏ đậy cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

 Trứng gà được khử trùng bằng cách xông KMnO4 + formon và đặt nằm ngang trước

khi tiến hành vi tiêm ít nhất 2h

 Dùng máy khoan mini cắt một vòng tròn nhỏ có đường kính 0,5 cm trên phần vỏ đá

vôi của trứng

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

 Bôi paraffin xung quanh mép cửa sổ

 Gắp phần vỏ đá vôi đã khoan ra và nhỏ 1 giọt PBS lên cửa sổ

 Trứng được đưa vào buồng thao tác vô trùng và được xé rách màng vỏ bằng panh

3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

Sử dụng kim vi tiêm tiêm 2 l ADN vào xoang dưới phôi (chú ý không để

bọt khí đi vào phôi)

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

Mở cửa sổ kết hợp vi tiêm DNA

 Lấy 1 miếng màng vỏ đậy lên cửa sổ

 Đậy tiếp 1 mảng đá vôi lên màng vỏ đã đậy

 Hàn kín cửa sổ bằng keo Duco

 Trứng được đem đi ấp và đặt theo chiều thẳng đứng với đầu tù quay lên trên

3.4 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp

3.4.3 Phương pháp mở cửa sổ

3.4.4 Phương pháp ấp trứng

 Trứng 0 giờ ấp sẽ được xông khử trùng bằng KMnO4 và focmon.

 Trứng sau khi đã khử trùng được xếp vào khay với đầu tù quay lên trên

 Khay trứng được chuyển vào tủ ấp với chế độ ấp như sau:

 Nhiệt độ: 37,8 oC.

 Đảo trứng: 2h/lần 10-12 lần/ngày.

Nhân dòng E.coli mang vector pT2/BH-CVpf-SB11

Tinh trùng Tinh trùng mang gen

pT2/BH-CVpf-SB11

3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng

Gà trống

3.5.1 Phương pháp lấy tinh trùng gà

 Thực hiện thao tác gây xuất tinh ở gà trống → cong đuôi lên → ngón cái

và ngón trỏ bóp nhẹ vào vùng lỗ huyệt và hơi ấn vào bụng dưới lỗ huyệt

để tăng thêm kích thích

 Dùng một tay vén ngược đuôi gà lên để lộ vùng huyệt → hứng tinh dịch

3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng

3.5.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng

 Pha loãng tinh dịch: Dùng ống trộn hồng cầu hút tinh dịch nguyên đến vạch 0.5, sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% (để giết chết tinh

trùng) đến vạch 101, lắc nhẹ trong 2 - 3 phút để trộn đều dung dịch

 Bỏ 3 - 4 giọt đầu, rồi nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu, đậy lamen

3.5.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng

Kết quả số lượng tế bào được tính theo công thức:

Trong đó:

C: Nồng độ tinh trùng (tinh trùng/ml)

n: Số lượng tinh trùng có trong 80 ô vuông nhỏ

200: Số lần pha loãng tinh dịch

710

80

4000000

200

.

n n

3.5.3 Phương pháp tạo phức hợp lipoplex (ADN- liposome)

 Lắc nhẹ LipofectaminTM 2000, nhỏ 20 l lên bề mặt của 100 l môi trường Opti-MEM

 Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Nhỏ 8 g ADN lên vị trí nhỏ LipofectaminTM 2000 ở trên

 Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng để tạo thành phức hệ ADN-Liposome

3.5 Chuyển gen GFP bằng vi tiêm vào phôi Gà 0 giờ ấp

 Lấy 1-1,5 ml tinh dịch thu được pha loãng với 4 ml môi trường DMEM không có FBS (tỉ lệ pha loãng thích hợp nhất của tinh dịch và

môi trường là 1:3)

 Trộn đều phức hợp lipoplex với tinh dịch vừa thu được (tổng khoảng 6ml), ủ 20 - 50 phút rồi tiến hành TTNT cho gà mái

3.5.4 Phương pháp chuyển phức hợp lipoplex vào tinh trùng

3.5 Chuyển gen GFP bằng PP chuyển gen qua tinh trùng

3.5.5 Phương pháp thụ tinh nhân tạo

Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và

nuôi cấy nguyên bào sợi

Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng

cầu và nội quan gà

Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng

cầu và nội quan gà

3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi

Tách tế bào phôi 7 ngày ấp

 Khử trùng trứng bằng cách lau cồn 70 độ

 Lấy phôi ra khỏi trứng và cho vào đĩa petri đựng dung dịch muối sinh lý

 Rửa sạch 2, 3 lần bằng dung dịch sinh lý cho sạch máu, lòng trắng và lòng đỏ

trứng

Tách tế bào phôi 7 ngày ấp

 Chuyển phôi vào buồng thao tác vô trùng và rửa bằng PBS khoảng 2 lần

 Chuyển sang ống Eppendorf, cắt nhỏ trong 0,5ml trypsin 0.25% trong 2 phút

 Thêm 1 ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin

 Loại bỏ cặn to, thu dịch tế bào và dùng để nuôi cấy

Nuôi cấy đơn dòng

 Đếm số lượng tế bào trong dịch huyền phù

 Hút dịch huyền phù tế bào chia vào 4 giếng đã có sẵn 0,5 ml MT nuôi cấy

 Sau 24 giờ, kiểm tra và thay môi trường cho các giếng nuôi cấy

 Sau 72 giờ, cấy chuyển và nuôi cấy in vitro → mật độ tế bào > 90% và tiến hành sàng lọc puromycin để kiểm tra sự có mặt của gen

3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi

Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin

Stock Puromycin (10 g/ml) → 1 g/ml, 2 g/ml và 3 g/ml

0 g/ml  

3 g/ml  

Sàng lọc tế bào mang gen chuyển bằng kháng sinh puromycin

 Sau 24 giờ - 48 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào đạt khoảng 0,5x106 tế bào/giếng, xử lý bằng puromycin trên 2 lô: lô TN và lô ĐC

 Sau khi bổ sung puromycin vào các giếng nuôi cấy, lắc nhẹ để puromycin hoà lẫn với môi trường và tiếp tục nuôi trong tủ ấm 37oC, 5%

CO2

 Sau 24h bổ sung puromycin, mang mẫu quan sát và đếm số lượng tế bào

3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi

Đếm số lượng tế bào

 Pha loãng huyền phù tế bào 200 lần bằng PBS sau đó dùng pipet nhỏ 1 giọt lên buồng đếm hồng cầu, đậy lamen

 Nồng độ tế bào được tính theo công thức sau:

C - nồng độ tế bào (tế bào/ml dịch mẫu tế bào)

n - số lượng tế bào đếm được (trong 80 ô nhỏ)

Phá vỡ tế bào

 Tế bào sau khi lấy từ các giếng nuôi cấy sẽ được li tâm thu cặn tế bào

 Tế bào trong các giếng được cho vào khoảng 10 dung dịch TE

 Để hỗn hợp tế bào trong TE vào nước ở 94oC trong khoảng 10 phút

3.6.1 Phương pháp tách tế bào phôi 7 ngày ấp và nuôi cấy nguyên bào sợi

Thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu

 Lấy máu gà 10 ngày tuổi

 Ly tâm với tốc độ 1200 RPM, trong 15 phút

 Loại bỏ huyết tương, thu hồng cầu

 Bổ sung thêm 0,5 ml TE

Thu nhận DNA từ nội quan gà

 Gà con khoảng 1 tháng tuổi

 Tách nội tạng của gà (gan, lách, ruột, phổi, tủy xương, tụy…) để riêng vào các ống eppendorf có chứa dung dịch PBS

 Chuyển các nội quan sang các ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch TE, nghiền nát các nội quan

 Sử dụng bộ kit để tách ADN

3.6.2 Phương pháp thu nhận DNA từ tế bào hồng cầu và nội quan gà

 Sử dụng kĩ thuật Multiplex PCR với hai cặp mồi đặc hiệu cho eGFP.

 Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP

 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 321 bp của gen ribosome 18S ở gà để chứng minh sự hiện diện của hệ

gen gà trong mẫu thí nghiệm

3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR

3.7 Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

3.7.1 Khuyếch đại bằng PCR

Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen eGFP

3.7 Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR như sau:

3.7.2 Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

Chuẩn bị Gel Agarose

 1,5 g agarose + 100 ml dung dịch đệm TBE 1X

 Đun sôi cho agarose tan hoàn toàn

 Để nguội xuống khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn lược Sau khoảng 1h khi gel, gỡ lược ra và đặt bản gel vào

bể điện di Đổ đệm TBE vào bể để dung dịch ngập mặt gel từ 1 - 2 mm

3.7 Phương pháp kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

3.7.2 Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

Tra mẫu DNA

 Lấy 10 l sản phẩm PCR tra vào các giếng trong bản gel

 Chạy điện di ở hiệu điện thế 70 V, trong khoảng thời gian 45 phút

 Sau đó, tiếp tục chạy ở hiệu điện thế 90 V trong 10 phút

3.7.2 Điện di kiểm tra sự có mặt của DNA ngoại lai

Nhuộm ADN bằng Ethidium Bromide (EtBr)

Bản gel được nhẹ nhàng lấy ra khỏi khuôn và cho vào ngâm trong dung dịch EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút Sau đó lấy bản gel ra tráng nước rồi quan sát và chụp ảnh

3.8 Kết quả

Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR kiểm tra sự có mặt

của gen eGFP trong nguyên bào sợi gà

3.8 Kết quả Kết quả điện di ADN thu được từ máu gà chuyển gen