Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng kiểm soát sinh học tổng hợp bệnh héo xanh vi khuẩn cây lạc và cây vừng

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học Nông nghiệp I – hà nội --- ---Nguyễn thị hồng minh Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng kiểm soát sinh học tổng hợp bệnh héo xanh vi

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường đại học Nông nghiệp I – hà nội

-

-Nguyễn thị hồng minh

Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng kiểm soát sinh học tổng hợp bệnh héo xanh vi khuẩn

cây lạc và cây vừng luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật

Người hướng dẫn khoa học: Ts Nguyễn ngọc cường

HÀ NỘI - 2007

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng

để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đ được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ được chỉ rõ nguồn gốc

Người cam đoan

Nguyễn Thị Hồng Minh

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Ngọc Cường là người đ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

Khoa Sau Đại học, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đ

tổ chức khoá đào tạo này, giúp tôi có điều kiện học tập và nghiên cứu để nâng cao trình độ

Tập thể các thầy cô giáo bộ môn Bệnh cây Nông dược, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội, đ tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án

Ban lnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, tập thể cán bộ phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đ tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận

án

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình và bạn bè đ tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà nội, ngày 19 tháng 9 năm 2007

Nguyễn Thị Hồng Minh

Mục lục

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình và đồ thị ix

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt x

1 Mở đầu 0

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.3 ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 3

1.4 Mục tiêu của đề tài .3

2 Tổng quan tàI liệu 4

2.1 Tình hình gieo trồng vừng và lạc ở Việt Nam và trên thế giới .4

2.1.1 Tình hình gieo trồng vừng ở Việt Nam và trên thế giới 4

2.1.2.Tình hình gieo trồng lạc ở Việt Nam và trên thế giới .4

2.2 Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 5

2.2.1 Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng 5

2.2.2 Biểu hiện triệu trứng của cây nhiễm bệnh 7

2.2.3 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum 8

2.2.3.1 Hình thái vi khuẩn 8

2.2.3.2 Đặc tính sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh héo xanh 8

2.2.3.3 Phân loại vi khuẩn R solanacearum 10

2.2.3.4 Tính độc của vi khuẩn R solanacearum 12

2.2.3.5 Các con đường xâm nhập của vi khuẩn R solanacearum vào cây chủ 13

2.2.3.6 ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh và phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây chủ 13

2.3 Vi sinhvật đối kháng 14

2.3.1 Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật 14

2.3.2 Vi sinh vật nội sinh đối kháng 16

2.4 Biện pháp phòng trừ sinh học bằng phương pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R Solanacearum 17

2.4.1 Cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn héo xanh R solanacearum 19

2.4.2 Các loại vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 20

2.4.3 ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông nghiệp bền vững 24

2.5 Phân loại vi khuẩn 26

2.5.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 26

2.5.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại bằng cách sử dụng kit “Api” và Vitek 26

3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 28

3.1 Vật liệu nghiên cứu 28

3.1.1 Nguồn vi sinh vật 28

3.1.2 Các thiết bị hoá chất và một số giống cây nghiên cứu 28

3.1.3 Các môi trường và dung dịch đệm chủ yếu 28

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh R.solanacearum 29

3.3.1.1 Phương pháp điều tra thu mẫu 29

3.3.1.2 Phương pháp thu thập, phân lập vi khuẩn gây bệnh từ mẫu cây bệnh 30

3.3.1.3 Phương pháp đánh giá tính độc của R solanacearum 30

3.3.1.4 Phương pháp xác định thứ sinh học (biovar) 32

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn R.solanacearum 33

3.3.2.1 Phân lập vi khuẩn đối kháng 33

3.3.2.2 Phương pháp phân loại vi khuẩn đối kháng 34

3.3.2.3.Phương pháp đánh giá tác động của vi khuẩn đối kháng lên sự nảy mầm của hạt vừng và lạc 36

3.3.2.4 Đánh giá hoạt lực kháng bệnh héo xanh của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng và cây lạc trong nhà kính 36

3.3.2.5 Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng lên cây vừng và cây lạc trong nhà kính 37

3.3.2.6 Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng, cây lạc trên đồng ruộng 37

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 38

4 Kết quả và thảo luận 40

4.1 Bệnh héo xanh cây lạc và cây vừng do vi khuẩn R solanacearum 40 4.1.1 Điều tra và thu mẫu 40

4.1.2 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh héo xanh 42

4.1.3.Nhận dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum 45

4.1.3.1 Thử nghiệm tính độc của các chủng vi khuẩn R solanacearum trên giống lạc Thiên Ngọc và giống vừng V6 45

4.1.3.2 Phân nhóm vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum

thành các thứ sinh học (biovar) 46

4.2 Vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh R solanacearum 48

4.2.1 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 48

4.2.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 49

4.2.3 Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng sử dụng trong xác định vị trí phân loại của chúng 52

4.3 Vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) 53

4.3.1 Khẳng định sự có mặt và tồn tại của vi khuẩn nội sinh trong cây vừng 53

4.3.2 Xác định vị trí tạo dòng của các chủng vi khuẩn nội sinh bên trong mô rễ cây vừng 53

4.4 ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng lên sự nảy mầm của hạt lạc và hạt vừng 55

4.5 Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng trên cây lạc 57

4.5.1 Đánh giá hiệu lực đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng với vi khuẩn R solanacearum trong điều kiện nhà kính 57

4.5.2 Đánh giá sự tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng lên sinh trưởng và phát triển của cây lạc trong điều kiện nhà kính 60

4.5.3 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên đồng ruộng phạm vi hẹp.62 4.5.4 Đánh giá sự tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng lên sinh trưởng và phát triển của cây lạc trên đồng ruộng phạm vi hẹp 63

4.6 Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng lên cây vừng 65

4.6.1 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên cây vừng trong điều kiện nhà kính 65

4.6.2 Tác dụng kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng trên cây vừng trong điều kiện nhà kính 67

4.6.3 Hiệu quả kháng bệnh trên cây vừng ngoài đồng ruộng 68

4.6.4 ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng đến sinh trưởng phát triển và năng suất cây vừng ngoài đồng ruộng 71

5 Kết Luận và kiến nghị 73

5.1 Kết luận: 73

5.2 Kiến nghị: 73

Tài liệu tham khảo 74

A Tài liệu tiếng Việt 74

B Tài liệu tiếng Anh 75

Phụ lục 84

Danh mục các bảng

Bảng 2.1 Những đặc tính sinh lí sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum 9

Bảng 2.2 Vi khuẩn đối kháng với R solanacearum 21

Bảng 3.1 Phân định mức độ độc của R solanacearum 31

Bảng 3.2 Cách thức phân vi khuẩn gây bệnh héo xanh thành các Thứ sinh học 33

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng gây bệnh thể hiện triệu chứng bệnh héo xanh 43

Bảng 4.2 Khả năng chuyển hoá các nguồn cacbon của các chủng vi khuẩn R solanacearum phân lập thể hiện tính độc 47

Bảng 4.3 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được 48

Bảng 4.4 Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các chủng R Solanacearum ( trong điều kiện invitro) 50

Bảng 4.5 Một số đặc điểm cơ bản phục vụ mục đích phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng 52

Bảng 4.6 Mật độ và khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn nội sinh trong mô rễ cây vừng và cây lạc 54

Bảng 4.7 ảnh hưởng của 4 chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng lên khả năng nảy mầm của hạt vừng và hạt lạc 56

Bảng 4.8 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng trên cây lạc trong điều kiện nhà kính .58

Bảng 4.9 So sánh thống kê sinh học tác dụng phòng trừ bệnh héo rũ vi khuẩn của các chủng nội sinh đối kháng trên giống lạc Thiên ngọc và giống lạc Thiên hoa 59

Bảng 4.10 Tác động tăng cường sinh trưởng trên cây lạc của các chủng vi khuẩn nội sinh 61

Bảng 4.11 Kết quả đối kháng vi khuẩn gây bệnh trên cây lạc gieo trồng

ngoài đồng ruộng phạm vi hẹp 62Bảng 4.12 Tác dụng tăng cường sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nội

sinh đối kháng lên cây lạc trên đồng ruộng phạm vi hẹp 63Bảng 4.13 Hiệu lực phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của các chủng vi

khuẩn nội sinh đối kháng trên cây vừng trong điều kiện nhà kính 65Bảng 4.14 So sánh thống kê sinh học hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ vi

khuẩn của các chủng nội sinh đối kháng đối với các giống vừng sản xuất 66Bảng 4.15 Kết quả tác động của các chủng vi khuẩn nội sinh lên sự sinh

trưởng phát triển của vừng trong nhà kính 67Bảng 4.16 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ cây vừng do vi khuẩn ngoài

đồng ruộng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng 69Bảng 4.17 Hiệu quả về năng suất do biện pháp kiểm soát bệnh héo rũ vi

khuẩn cây vừng V6 ngoài đồng ruộng bằng các chủng đối kháng nội sinh mang lại 71

Danh mục các hình và đồ thị

Hình 3.1 Chỉ tiêu đánh giá mức độ nhiễm bệnh………31

ảnh 4.1 Ruộng vừng bị nhiễm bệnh héo rũ .40

ảnh 4.2 Cây vừng bị chết héo xanh do vi khuẩn ngoài đồng ruộng 41

ảnh 4.3 Lát cắt dọc đoạn thân sát cổ rễ cây vừng biểu hiện triệu chứng nhiễm

bệnh héo xanh do vi khuẩn 41

ảnh 4.4 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh 44

ảnh 4.5 Sự chuyển hoá nguồn cacbon của các chủng thể hiện độc tính 47

ảnh 4.6 Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng đối kháng 49

ảnh 4.7 Vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh VT3 của vi khuẩn đối kháng NA4 51

Đồ thị 1 Hoạt lực đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn đối

kháng trên đĩa petri 51

ảnh 4.8 Sự tồn tại của vi khuẩn CI4-2 và NA4 trong gian bào mô rễ cây vừng 55

ảnh 4.9 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của các chủng vi khuẩn

đối kháng trên lạc trong điều kiện nhà kính 59

ảnh 4.10 Kết quả kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh trên

cây lạc ngoài đồng ruộng phạm vi hẹp 64

ảnh 4.11 Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh của các chủng vi khuẩn đối

kháng trên cây vừng trong điều kiện nhà kính 67

ảnh 4.12 Hình ảnh cây vừng ngoài đồng ruộng 70

Đồ thị 2 Tỷ lệ (%) cây vừng sống sót của thí nghiệm đồng ruộng 70

Danh MụC CáC THUậT NGữ VIếT TắT

AVRDC Asian Vegetable Research Development Center

VKNSĐK Vi khuẩn nội sinh đối kháng

1 Mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp với hầu hết các loại rau

và cây công nghiệp gieo trồng trên thế giới, lại còn có thể sản xuất gần như quanh năm Đây là những lợi thế không phải bất kỳ nước nào trên thế giới cũng có Với kinh nghiệm lâu đời của người sản xuất, ngành sản xuất nông nghiệp không chỉ cung cấp những sản phẩm cho tiêu dùng nội địa mà còn xuất khẩu sang các nước vĩ độ thấp như bắc châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ

So với cây lương thực và nhiều loại cây khác cây vừng và cây lạc là những cây có giá trị kinh tế cao trên một đơn vị diện tích Do vậy phát triển trồng vừng và lạc không chỉ thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho người sản xuất

Cây vừng có tên khoa học là Sesaum indicum L là cây lấy dầu với bộ phận thu hoạch chủ yếu là hạt Hạt vừng có hàm lượng dầu rất cao, giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng như ở dạng hạt thô Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, cây vừng còn là loại cây chịu hạn, có thể trồng ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng như đất cát pha Bên cạnh đó vừng là loại cây nhiệt đới có thể chịu được nhiệt độ từ 25- 32oC, vì vậy chúng được trồng khá rộng ri ở các tỉnh miền Trung và các tỉnh Nam trung bộ nước ta Vòng đời sinh trưởng của vừng khá ngắn chỉ vào khoảng từ 60 đến 90 ngày nên lợi ích do phát triển trồng vừng đem lại là rất cao

Cây lạc (Archis Hypogae I.) là cây công nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm

có giá trị dinh dưỡng cao có nguồn gốc từ Châu Mỹ Cây lạc được dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn cho chăn nuôi, đồng thời còn là cây cải tạo đất tốt và

là mặt hàng nông sản suất khẩu quan trọng đem lại lợi nhuận cao Từ năm 1990 trở lại đây diện tích, năng suất, sản lượng lạc đ không ngừng tăng lên Diện tích gieo trồng tăng lên từ 201.400 ha năm 1990 lên 243.900 ha năm 2000 (tăng

21,1%), năng suất tăng 37,1% và sản lượng tăng 65,6% Chính vì vậy cây lạc

đang là một trong 10 chương trình ưu tiên phát triển của nước ta

Nhưng thực tế, vấn đề trồng vừng và lạc trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng còn gặp rất nhiều khó khăn bởi bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra Đây là một trong 5 loại bệnh cây trồng thuộc

đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ tổng hợp của FAO Theo báo cáo tại hội nghị quốc tế tổng kết về bệnh héo xanh của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau Châu á (AVRDC), thì thiệt hại do bệnh này có thể là 100% Riêng ở Đài Loan thiệt hại đối với thị trường cà chua sạch hàng năm vào khoảng 12 triệu đô la [21] Ước tính mức độ thiệt hại cho sản xuất cà chua

do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra là 15% ữ 95%

ở nước ta bệnh héo xanh do vi khuẩn đ phát sinh ở hầu hết các địa phương có trồng các cây như: vừng, cà chua, lạc, thuốc lá, khoai tây, ở các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Nghệ An có nơi có lúc bệnh gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 100% cây trồng

Phòng trừ sinh học bệnh héo xanh bằng các vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum đ cho thấy nhiều hứa hẹn khả quan và là biện pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật hoá học

Do đó, vấn đề phân lập và bảo quản một bộ sưu tập những chủng vi khuẩn R solanacearum có độc tính cao để sử dụng trong việc chọn, tạo giống vừng và lạc kháng bệnh héo xanh, đồng thời tuyển chọn các chủng vi sinh vật

đối kháng với chúng và kích thích sự sinh trưởng, phát triển cây chủ như các tác nhân phòng trừ sinh học là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do và đòi hỏi nêu trên, chúng tôi đ tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng kiểm soát sinh học tổng hợp bệnh héo xanh vi khuẩn cây lạc và cây vừng”

1.2 Cơ sở khoa học của đề tài

Bệnh héo xanh cây trồng ngày càng gây thiệt hại trầm trọng trong thực

tế sản xuất ở Việt Nam và trên toàn thế giới Hơn nữa vi khuẩn gây độc ở các vùng địa lý khác nhau và các cây ký chủ khác nhau là có thể không giống nhau Vì vậy cần phải có những nghiên cứu cơ bản để có những kết quả chính xác và khoa học về loài vi khuẩn này để từ đó có những biện pháp phòng trừ hiệu quả

- Dựa vào một số phương pháp phân lập, thử nghiệm vi khuẩn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (chủ) và đối kháng với vi khuẩn R solanacearum để góp phần vào chiến lược phòng trừ tổng hợp vi khuẩn gây bệnh này

- Các nhà khoa học đang tiến dần tới chỗ xác định được cơ chế của quan

hệ vi khuẩn gây bệnh cây chủ, mức độ độc tính và quan hệ vi khuẩn đối kháng

- cây chủ – vi khuẩn gây bệnh, để tiềm tàng khả năng can thiệp và tác động lên quá trình hình thành dịch bệnh theo hướng mong muốn của con người

1.3 ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

- Khẳng định sự có mặt của R solanacearum như là một trong những loài vi khuẩn chính gây ra các vụ dịch chết héo xanh đang phổ biến ở nhiều

1.4 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập những chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh vừng, lạc và vi khuẩn đối kháng với chúng

- Xác định và sử dụng một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh chết héo, đồng thời kích thích cây sinh trưởng phát triển và có triển vọng áp dụng thực tiễn, nhằm góp phần vào việc phòng trừ bệnh héo xanh có hiệu quả

2 Tổng quan tàI liệu

2.1 Tình hình gieo trồng vừng và lạc ở Việt nam và trên thế giới

2.1.1 Tình hình gieo trồng vừng ở Việt Nam và trên thế giới

ở nước ta, vừng được trồng nhiều tại Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Quảng Bình, và một số ít tại vùng Bắc bộ Thời vụ gieo trồng vừng thường là:

Vụ xuân: từ 15 tháng 2 đến 10tháng 3 (tuỳ điều kiện canh tác)

Vụ hè thu: từ 10 tháng 5 đến 5 tháng 6 (tuỳ điều kiện canh tác)

Giống vừng được trồng chủ yếu là giống vừng V6 của Nhật được nhập vào Việt Nam và năm 2000 được công nhận là giống chuẩn quốc gia Năng suất trung bình đạt 1,2 tấn/ha Ngoài ra còn có giống vừng địa phương như vừng đen, vừng trắng,

Cây vừng có khả năng chịu hạn tốt nhưng khả năng chịu úng kém do vậy đất trồng vừng phải là đất dễ thoát nước Cây vừng dễ trồng, không đòi hỏi vốn đầu tư lớn Vừng không kén đất nên có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên nhiều loại đất [14]

Sản lượng vừng trên thế giới là khác nhau, sản lượng hàng năm 2 triệu tấn chủ yếu ở Châu á (55 - 60%), Châu Mỹ (18 - 20%), Châu Phi (18 - 20%), ngoài ra còn có ở Châu âu, Châu Đại Dương tuy chỉ rải rác, không nhiều Các quốc gia trồng vừng trên thế giới là ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc (320.000 tấn/năm), Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm) 2.1.2.Tình hình gieo trồng lạc ở Việt Nam và trên thế giới

Nước ta lạc được trồng nhiều ở Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Bình, Đắc Lắc và một số tỉnh phía Bắc như Hải Dương, Bắc Giang Thời vụ gieo trồng thuờng vào các vụ như sau:

đứng hàng thứ 5 trong sản xuất lạc của Châu á Thái Bình Dương Năng suất bình quân đạt1,79 tấn/ ha Sản lượng đạt 462 nghìn tấn/năm

Năm 2003 diện tích trồng lạc của thế giới đạt 22,73 triệu ha, năng suất bình quân đạt1,47 tấn/ ha và sản lượng đạt 33,45 triệu tấn

Cây lạc có khả năng chịu hạn tốt nhưng khả năng chịu úng kém, là cây

dễ trồng không đòi hỏi vốn đàu tư lớn, không kén đất nên có khả năng phát triển tốt trên nhiều loại đất

2.2 Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 2.2.1 Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng

Đ có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra

Năm 1875, Hallier lần đầu tiên đ phát hiện ra loại vi khuẩn gây thối củ khoai tây Sau này, vào năm 1885, E F Smith đ phát hiện thêm và nghiên cứu sâu, rộng trên nhiều loại vi khuẩn và trên hầu hết các loại cây trồng Năm 1892, Halsted khởi đầu cho các nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá, di truyền của các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Năm 1896, E F Smith đ mô tả bệnh héo xanh do vi khuẩn ở khoai tây, cà chua, cà tím Năm 1909 ông lại phát

hiện thêm bệnh này ở cây thuốc lá Năm 1954, Kelman công bố bệnh héo xanh do vi khuẩn ở trên 200 loại thực vật, cùng năm đó ông tìm ra môi trường 2,3,5 – Triphenil Tetrazolium clorit (TTC) đặc trưng để nhận biết loài vi khuẩn này [50]

Năm 1991 Denny, T.P và Back, S.R đưa ra bằng chứng rằng, chính polysaccharit ngoại bào (EPS) được tạo ra do vi khuẩn P solanacearum (tên gọi

cũ của Ralstonia solanacearum) là nguyên nhân chính gây bệnh héo xanh [33] Nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới đ cố gắng chứng minh điều đó

và cấu trúc những thành phần chính của polysaccharit ngoại bào đ được xác định (Orgambide etal, 1991) Những gen phức tạp trong quá trình sinh tổng hợp chúng cũng đ được tách thành công (Cook and Sequeira 1991) [34]

Cấu trúc thành phần của những thành phần EPS có tính chất axit đ

được làm sáng tỏ và người ta đ tìm ra một đơn vị của 2 đường không thay thế

là baclosamin (2,4,6 – trideaxit- glucoza) và galactosaminuronic axit (Orgambide etal, 1991) [64] Một vài gen sinh tổng hợp được xác định ở 1 vùng gọi là OPS Chúng đ được xác định là có chứa ít nhất 7 tiểu phần thể hiện chức năng có ảnh hưởng lên sự tổng hợp của cả OPS và LPS (Lipopolysacharit) E.F.Smith coi bệnh héo xanh là bệnh thực vật quan trọng nhất có nguồn gốc từ vi khuẩn trên toàn thế giới Loài này còn có tên mới là Ralstonia solanacearum (Hashimoto và cộng sự, 1992) [81]

Trong số hơn 2600 chủng được thử thì hơn 500 chủng có ở 4 dạng thực vật đ được đặc trưng là có khả năng chống chịu cao, bao gồm 3 kiểu dại, chúng có thể sử dụng trong công tác chọn giống và đánh giá giống Mầm bệnh

có thể biến đổi cả về kiểu gen và kiểu hình với phổ cây chủ đa dạng Không chỉ với các cây chủ họ cà mà còn ở cả các loài thuộc 50 họ thực vật khác cũng

đều có thể bị nhiễm (Hayward,1997) [45] Bệnh này phá huỷ chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, nơi mà có các cây trồng chủ yếu như cà chua, lạc, khoai tây,

cà tím, gừng Chúng làm giảm năng suất của cây trồng một cách đáng kể

Thông thường xét về mặt hình thái thì những khuẩn lạc dạng chảy sẽ

có tính độc nhưng năm 1990 Xu, PL, Iwata M, Leong, S, Sequeira, L bằng

phương pháp đột biến nhờ gen “nhảy” Tn5, đ phân lập được một loạt các

đột biến mà hình thái khuẩn lạc không chảy nhưng vẫn duy trì được khả

năng gây héo và gây chết thuốc lá Năm 1990 Huang, Y, Sequeira, L đ

nhận ra được một vùng (locus) điều khiển chức năng nhân lên của

R solanacearum Khi R solanacearum K60 mang một plasmit có nhiều

bản sao chứa dòng cosmit pE6C (từ nòi K60 kiểu dại) hoặc pBE6 (từ nòi B1

không có tính độc), một vài thay đổi hình thái đ được quan sát, cụ thể:

Mất tình độc, giảm hàm lượng polysachrit ngoại bào và tăng hoạt tính của

polygalacturonasa Cả hai cosmit đều chứa một đoạn ADN có kích thước

8000 đôi gốc bazơ đủ cho sự thay đổi kiểu hình Nhìn chung có rất nhiều

nghiên cứu về vi khuẩn R solanacearum ở các khía cạnh khác nhau, như di

truyền, sinh lý, sinh hoá, sinh học phân tử v.v…

Năm 1905 ở Indonesia đ phát hiện bệnh héo xanh gây hại trên cà chua,

lạc, khoai tây ở vùng Cirebon Tây Java, Breda de Hann (1990) Trong thời kỳ

1992 – 1994 các nhà nghiên cứu đ thu thập và tiến hành xác định nòi (race),

thứ sinh học (biovar) của 264 chủng phân lập từ các cây ký chủ như cà chua,

khoai tây, lạc, cà, ớt Các nguồn vi khuẩn thu thập từ những vùng có độ cao

trên 1000 m đ được xác định hầu hết thuộc nòi 1, biovar 3, chỉ có 1 hoặc 2

nguồn từ Iran thuộc nòi 1, biovar 4 (Machmud, 1992) [57]

2.2.2 Biểu hiện triệu chứng của cây nhiễm bệnh

Biểu hiện đầu tiên có thể quan sát thấy đó là những lá non ở phần ngọn

của cây bị héo trước tiên và dần dần rủ xuống Sau đó phần bị héo chuyển dần

xuống phía dưới gốc cây (trong phần lớn các trường hợp thấy các nhánh cây có

biểu hiện héo trước) Năm 1965, Kelman và Sequeira đ tìm ra được một số cơ

chế phát sinh của bệnh Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản

bào và mạch gỗ mà nó khác biệt so với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa,

và gây khối u Một số giai đoạn của cơ chế phát sinh bệnh do R solanacearum gây ra ở cây chủ như sau:

- Sự xâm nhập của một số ít tế bào vi khuẩn vào tiểu phần mô gỗ

- Sự nhân lên của chúng ở vùng mạch và sự lan truyền của quần thể vi khuẩn gây bệnh không gây ra các biến đổi nhận thấy ở vùng mô mềm cận gỗ hoặc các tế bào libe

- Những biến đổi bệnh lý ở phần lớn những thành phần của nhu mô như biểu hiện của phản ứng nhiễm bệnh hệ thống thường gặp dẫn đến suy yếu nghiêm trọng sự mao dẫn nước và sự xuất hiện héo xanh

- Phá huỷ thành tế bào và các tế bào nhu mô kế cận, dần dần hình thành các nội hốc xâm nhiễm libe lõi, mô vỏ hoặc phá huỷ đồng thời cùng một lúc nhất là các mô non và cây non Sự cố đầu tiên trong chuỗi các sự cố này có ý nghĩa quyết định để xác định sự đề kháng của cây chủ và tính đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh Người ta còn hiểu biết rất ít về các giai đoạn sau của diễn biến bệnh héo xanh Dọc theo phần gỗ phía trong thân cây bệnh thường bắt gặp các vết màu nâu hoặc màu đỏ sẫm ở vùng hệ mạch, càng lên cao dọc theo thân những vết này càng mỏng hơn và có màu sáng hơn [53]

2.2.3 Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum

2.2.3.1 Hình thái vi khuẩn

Tế bào loài vi khuẩn này có hình ovan ngắn, gram âm, tròn ở 2 đầu Thường gặp tế bào ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc ghép bốn, hiếm khi thấy chúng kết thành chuỗi Kích thước của chúng khoảng 1,0-1,5 x 0,5-0,6 (àm)

Vi khuẩn có từ một đến vài tiên mao và luôn chuyển động Khuẩn lạc của nó thường có bề mặt trơn nhẵn, ít khi gồ ghề, hơi chảy hoặc không chảy, có thể

có màu trắng, trắng đục hoặc phớt hồng Cả nguồn tính độc cao và nguồn tính

độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa (Mehan và cs, 1994) [62]

2.2.3.2 Đặc tính sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Vi khuẩn R solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào

tử, có khả năng tổng hợp poly-β-hydroxybutyrat như là nguồn cacbon dự trữ

Mặc dù nó không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang nhưng nó có thể tổng hợp sắc

tố khuếch tán mầu nâu trên môi trường thạch có chứa Tyrozin

R solanacearum có thể khử nitrat thành nitrit và tạo ra khí nhưng không thể

thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc không hoá lỏng gelatin

Những đặc tính sinh hoá chính của vi khuẩn R solanacearum được tóm

Sự ôxi hoá axetat +

Sự ôxi hoá xitrat +

Sự ôxi hoá malonat +

Sự ôxi hoá gluconat +

Chú thích:

(+) : Phản ứng dương hoặc phát triển được

( - ) : Phản ứng âm hoặc không phát triển

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển thay đổi từ 25-350C

R solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng sinh, các nòi vi khuẩn

có thể mẫn cảm với Streptomyxin, chống chịu với Penixilin, Viomyxin, (He

và cs, 1983) [46]

Về mặt sinh hoá của tính độc, năm 1963, khi nghiên cứu so sánh sự tổng

hợp IAA (axit indol 3-axetic) ở R solanacearum dạng chảy (lỏng) không cố

định có độc tính và dạng chai không độc, Sequeira và Williams đ phát hiện ra

rằng cả 2 dạng đều tổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi Triptophan không có

mặt trong môi trường nuôi cấy Hơn nữa, 1 chủng R solanacearum có độc

tính đ tổng hợp IAA từ nhân vòng của Triptophan chứ không phải từ mạch

thẳng Như vậy là chủng thuộc dạng khuẩn lạc chảy lỏng và có độc tính này

đ không tuân thủ trình tự chuyển hoá: Triptophan → Indol - axetaldehit →

IAA như đ thấy ở hầu hết các vi sinh vật và thực vật bậc cao [66] Trong khi

đó, đột biến có dạng khuẩn lạc hình chai không độc lại chuyển hoá cả nhân

vòng và mạch thẳng của Tryptophan thành IAA (Sequiera và 1963) [66]

2.2.3.3 Phân loại vi khuẩn R solanacearum

Vị trí phân loại của R solanacearum được sắp xếp như sau:

Bacteria-Proteobacteria-β Proteobacteria- Burkholderiales- Burkholderiaceae-Ralstonia

solanacearum

Trong gần 30 năm qua, một hệ thống phân loại theo hai xu hướng đ

được sử dụng, nó phản ánh những hướng tiếp cận thật khác biệt để giải quyết

vấn đề phân loại dưới loài

- Xu hướng thứ nhất, đề cao ái lực giữa vi khuẩn với cây chủ và xác lập

ra các nòi “race”

- Xu hướng thứ hai, khai thác các đặc điểm sinh hoá đ được lựa chọn

kỹ, làm cơ sở để phân biệt thành các chủng sinh học (biovar)

“Chủng” và “chủng sinh học” đều là cách ghép nhóm mang tính hình

thức ở mức độ cấu trúc dưới loài và không bị ràng buộc bởi bất kỳ một khoá

phân loại vi khuẩn nào Kết quả 5 chủng đ được mô tả dựa vào quan hệ mật thiết với cây chủ và 5 biovar khác nhau dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (3 đường và 3 rượu) Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh dưỡng kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các biovar còn khác nhau bởi các hình

ảnh điện di đồ, các protein màng Biovar 1 và 2 còn khác biovar 3, 4 và 5 trên cơ sở các mẫu ADN thăm dò và trên cơ sở phân tích RFLP

Biovar 1 và 2 chiếm ưu thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu á ở Philippin thấy có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi đó biovar 3 có đặc điểm dinh dưỡng linh hoạt hơn cả Có một bằng chứng cho rằng R solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi Ralstonia Theo phân loại, R.solanacearum như là một nhóm ở bên trong Ralstonia đ được biết trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu của những

đặc điểm hình thái, lai ADN - ADN hoặc ARN-ARN

Các chủng R solanacearum biến đổi mạnh về các hoạt động sinh hoá, phổ cây chủ và khả năng gây bệnh Năm 1962, Buddenhagen đ đề cập đến các sơ đồ phân loại khác nhau và chia R solanacearum thành 3 chủng dựa trên hình thái và sinh thái học của chúng :

Chủng1: Gồm các cá thể gây bệnh ở thuốc lá, các cây chủ họ cà (Solanaceae) và một số loài thực vật khác

Chủng 2: Gồm các cá thể gây bệnh ở cây chủ thuộc họ Musaceae Chủng 3: Gồm các cá thể gây bệnh ở lạc, khoai tây và một số ít cây chủ khác Năm 1964, Hayward đ nhóm các chủng thuộc loài R solanacearum thành 5 biovar Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN được tạo ra bởi các enzym cắt giới hạn (RFLP), Cook (1989), đ chia các chủng sinh học thành hơn 40 nhóm RFLP [33], [34] Kelman và Hayward cho rằng R solanacearum là một loài không đồng nhất, đa dạng với tính chuyên hoá khác nhau, bao gồm một số biovar và pathovar khác biệt nhau [48], [51]

2.2.3.4 Tính độc của vi khuẩn R solanacearum

Kelman đ kết luận rằng có mối quan hệ giữa hình thái khuẩn lạc với tính độc và các chủng tổng hợp polysacharit ngoại bào là các chủng có tính

độc (Kelman và cs 1954) [50] Các nòi đột biến của R solanacearum có thể

được phát hiện dễ dàng khi chúng được cấy vạch trên môi trường thạch Kelman có 2, 3, 5- Triphenyl Tetrazolium Clorit (TTC) sau 36-48 giờ (Kelman, 1954) [50] Những đột biến có tính độc hoặc không có tính độc hình thành các khuẩn lạc nhỏ hình chai có một quầng đỏ xẫm nổi bật Nòi dại có độc tính hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm Những đột biến mất độc tính hình chai có thể tách trực tiếp từ cây bệnh tuy với số lượng ít so với loại có độc tính Sự hình thành các cá thể không có độc tính trong canh khuẩn dao động phụ thuộc vào

điều kiện bảo quản Những vi khuẩn có độc tính có thể bảo quản dễ dàng trong nước cất vô trùng (Kelman và cs, 1961) [48]

Tổng hợp chất nhầy polysacharit là một thuộc tính chung của tất cả các chủng phân lập R solanacearum có tính độc (Trigalet và cs, 1992) [71] Nhưng khi xem xét trong phạm vi tính đặc hiệu loài thì không thấy có sự liên quan giữa tính độc và sự tổng hợp chất nhầy vì bản thân tính độc là phức tạp hơn nhiều Vì thế, không thể giải thích tính độc của vi khuẩn căn cứ vào sự hiện hữu hay không hiện hữu của chất nhầy polysacharit

Một sự tương quan chặt chẽ giữa việc tạo ra exopolysacarit (EPS) và tính

độc, được chứng minh bằng việc tạo ra những đột biến không độc, gen điều khiển EPS nằm ở vùng gen ops [34] và eps [35] Cấu trúc của polysacarit đ được xác

định [64], những đột biến không có polysacarit và không độc hoàn toàn sẽ không

có khả năng hình thành khuẩn lạc trên rễ cây chủ Những số liệu này cho thấy, đ

có mối liên quan giữa tính độc, tính xâm thực vào rễ và chất lượng của polysacarit

đ được tạo ra trong thân cây

2.2.3.5 Các con đường xâm nhập của vi khuẩn R solanacearum vào cây chủ

Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mao mạch thân gỗ, vi khuẩn R solanacearum rất khác biệt với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây thối Những hình thức chủ yếu mà vi khuẩn R solanacearum xâm nhập vào cây chủ như sau (Li và cs, 1981) [56]:

- Do tương tác giữa vi khuẩn gây bệnh với các quần thể đơn bào ăn rễ như giun tròn thì tỉ lệ mắc bệnh cao vì giun tròn làm tổn thương và biến dạng bộ rễ của cây, qua đó vi khuẩn R solanacearum dễ dàng xâm nhập vào bên trong mô mạch

- Do sự chăm sóc làm cho cây bị đứt rễ, sây sát thân, dập lá, mà vi khuẩn tiềm trữ trong đất, không khí hoặc qua nguồn nước có cơ hội tấn công vào cây chủ

- Do côn trùng như : ong, kiến, châu chấu… hoặc các loại sâu hại, mang

vi khuẩn R solanacearum, chúng chích hút vào cây, qua đó vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào cây chủ Hình thức này rất phổ biến và vi khuẩn lan truyền nhanh có thể làm cho cả một cánh đồng bị chết héo

- Với những vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, chúng có thể xâm nhập qua các lỗ mở ở rễ cây, thuỷ khổng, lỗ ở vỏ khí khổng ở lá

2.2.3.6 ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh

và phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây chủ

Các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ môi trường, nhiệt độ và độ ẩm của đất, các loại đất, mưa gió và cường độ chiếu sáng, có ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển và bùng phát thành dịch của bệnh héo xanh

Bệnh héo xanh xuất hiện ở những vùng có nhiệt độ nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển từ 25-350C, nhiệt độ tối thiểu là 100C và tối

đa là 410C, pH thích hợp 7,0- 7,2 (Kelman và cs, 1994) [51] Nhiệt độ cao làm tăng nhịp độ sinh sản của vi khuẩn gây bệnh trong cây chủ dẫn đến cây héo

nhanh hơn, số lượng vi khuẩn xâm nhập vào đất nhiều hơn và đó là nguồn gốc cho chu kỳ xâm nhiễm cây bên cạnh tăng lên Nhìn chung nhiệt độ môi trường

ở phạm vi 300C-350C thì nguy cơ mắc bệnh và nhịp độ phát triển của bệnh héo xanh cũng tăng lên

Nhiệt độ trên 250C ở độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm đất cao thuận lợi cho bệnh phát triển (Wang và cs, 1983) [78] Độ ẩm của đất và các vi sinh vật đối kháng là quan trọng hơn cả tính chất đất, độ ẩm của đất đ quyết định độ lớn của quần thể vi sinh vật đối kháng và chúng đến lượt mình làm tổn thương tới

sự tồn tại và phát triển của R solanacearum trong đất

Lượng mưa cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi khuẩn R solanacearum Những vùng có mưa nhiều bệnh thường nặng hơn Sau khi mưa

to, thời tiết nóng lên hoặc xen kẽ giữa những ngày mưa và thời tiêt nắng đẹp

sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển và kết quả là hiện tượng héo và chết cây sẽ nghiêm trọng (Tan và cs, 1994) [68]

2.3 Vi sinh vật đối kháng

2.3.1 Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật

Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng

và phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng thường được gọi là vi sinh vật đối kháng Hiện tượng đối kháng được quan sát ở nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn có thể trực tiếp (competition, antibiosis) hoặc không trực tiếp (tạo tính kháng của cây chủ) Người ta còn biết rằng những chủng không độc của R solanacearum

có khả năng đối kháng với những chủng vi khuẩn độc khi lây nhiễm hỗn hợp Việc sử dụng hiện tượng đối kháng này trong công tác bảo vệ thực vật được gọi là biện pháp phòng trừ sinh học Phương pháp này đ được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua [72]

Biện pháp sinh học kiểm soát sâu bệnh thực vật đ được phát triển, nhưng đôi khi thực hiện ở điều kiện ngoài tự nhiên lại không có hiệu quả như mong muốn Như vậy, mối tương quan giữa tính đối kháng của vi khuẩn đ

được chứng minh trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tế là chưa chặt chẽ [39] Kích thước vùng ảnh hưởng đối kháng trực tiếp trên môi trường thạch

đôi khi không được biết chính xác, hơn nữa ở những điều kiện in vitro thì rất thuận lợi nhưng lại không có tính thực tế, vì điều kiện ngoài môi trường thường là ít thuận lợi hơn điều kiện in vitro, điều này dẫn đến đôi khi kết luận

sẽ là không chính xác [35]

Vùng ức chế sinh trưởng trên môi trường thạch có thể là do những yếu

tố hoá học (pH thấp hoặc cao), sự có mặt của những chất kháng sinh có phổ hoạt động mạnh, hoặc những bacteriocin đặc biệt, hoặc sự có mặt của thực khuẩn thể Chae Gun Phae đ cho rằng, chủng Bacillus subtilis NB22 có thể tiết vào đất chất iturin, chất này có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh héo xanh [28]

Nhiều tác giả đ đề nghị rằng, sự đối kháng trực tiếp có thể có những cơ chế khác, không có bất kỳ một sự đối kháng nào thể hiện trong điều kiện in vitro, lại không có hiệu quả trong việc giảm mức độ bệnh của cây trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng, một số chủng độc mất độc tính và không có hoạt tính kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhưng lại có hiệu quả giảm độ nghiêm trọng của bệnh trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng [55], [71])

Mặc dù, dưới những điều kiện kiểm tra rất thuận lợi, nhưng chưa có một trong những tác nhân kiểm soát sinh học nào đ chứng tỏ có hiệu quả cao trên

đồng ruộng Trong hầu hết các trường hợp, những thí nghiệm trên đồng ruộng

là quá hạn chế [61] Sự bảo vệ cây trước bệnh héo xanh không có hiệu quả là vì sự hình thành những khuẩn lạc ở rễ cây của những tác nhân kiểm soát sinh học là quá thấp, hoặc phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện môi trường [59]

2.3.2 Vi sinh vật nội sinh đối kháng

Nội sinh (endophyte) theo tiếng Hy Lạp “endon” có nghĩa là bên trong

và “phyte” có nghĩa là thực vật và thuật ngữ này thường được áp dụng cho nấm (Carroll, 1988; Clay, 1988) [32], bao gồm nấm cộng sinh (mycorrhizal fungi) Theo Wilson (1995), định nghĩa nội sinh cho đến nay được áp dụng cho cả nấm và vi khuẩn có tất cả hay một phần của chu trình sống xâm nhập vào mô thực vật sống và không gây nhiễm cũng như gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho mô thực vật

Nhận thức về môi trường ngày càng tăng đ thúc đẩy việc phát triển các phương pháp sinh học thay thế cho các phương pháp bảo vệ thực vật bằng các tác nhân hoá học Vi khuẩn từ vùng lá (Phylloplane) có thể phòng trừ sinh học một số bệnh cây trồng Hầu hết các vi khuẩn được dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học đều được chọn lọc từ vi khuẩn hệ rễ Tuy nhiên, các vi khuẩn này không đảm đương được vai trò của mình do khả năng tạo dòng kém ở hệ rễ và không bền vững khi nuôi cấy dài ngày Chính vì vậy, quan hệ mật thiết giữa vi khuẩn nội sinh và cây chủ đ khiến vi khuẩn nội sinh trở thành ứng viên tự nhiên cho công tác chọn lọc các tác nhân phòng trừ sinh học do chúng có khả năng tạo dòng hệ rễ cao và đây được xem là một tính trạng cần thiết của vi khuẩn nội sinh để xử lý vào hạt hay rễ trước và khi trồng

Vi khuẩn nội sinh tạo một ổ sinh thái tương tự như ổ sinh thái của các vi khuẩn gây bệnh thực vật, đặc biệt là các mầm bệnh xâm nhiễm mạch gây héo

Điều này tạo cho vi khuẩn nội sinh trở nên ưu thế khi sử dụng như các tác nhân phòng trừ sinh học Có rất nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học hệ rễ cho thấy rằng 5 trong số 6 vi khuẩn hệ rễ cảm ứng kháng hệ thống ở dưa chuột có khả năng tạo dòng rễ cả trong và ngoài Vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng chống lại một số mầm bệnh thực vật như Clavibacter michiganensis subsp sepedonicum, tác nhân gây bệnh thối vòng trên khoai tây ứng dụng vi khuẩn nội sinh vào cây bông bằng

tiêm cành làm giảm thối rễ gây ra bởi Rhizoctonia solani và héo mạch gây ra bởi F oxysporum f.sp vasinfectum (Chen và cộng sự, 1995) [30] Xử lý hạt

cà chua với chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus pumilis SE4 cản trở đường vào của nấm bệnh gây héo mạch F oxysporum f.sp radicislycospersici và sự sinh trưởng của khuẩn ty chỉ hạn chế ở biểu bì và bao rễ ngoài ứng dụng chủng P fluorescens 63-28 hạn chế sự sinh trưởng của Pythium ultimum ở đậu (Benhamou và cộng sự, 1996)[23] Và các phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây sồi có hoạt tính sinh học chống lại mầm bệnh gây héo sồi Ceratocystis fagacearum (Brooks và cộng sự, 1994) [25]

Chen và cộng sự (1995) [30] cũng chỉ ra rằng trong số 170 chủng vi khuẩn phân lập từ nội mô của cây bông, 40 chủng có hoạt tính sinh học chống lại Rhizoctonia solani ở cây bông và 25 chủng cảm ứng kháng hệ thống với Colletotrichum orbiculare ở dưa chuột

Crop Genetics International (Hannover, MD) kiểm tra tiềm năng sử dụng vi khuẩn nội sinh được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền để phòng trừ sinh học bệnh cây trồng nông nghiệp Bằng kỹ thuật di truyền, vi khuẩn nội sinh Clavibacter xylli đ được chuyển gen nội độc tố delta của Bacillus thuringensis subsp kurtaki vào cây bông để phòng trừ sâu European corn borer Mặc dù các công nghệ như vậy vẫn còn đắt và chưa được công nhận rộng ri nhưng chúng có thể là các hệ thống chuyển thuốc trừ sâu sinh học

đích và không gây lo ngại về môi trường truyền thống như sử dụng các tác nhân phòng trừ hoá học

2.4 Biện pháp phòng trừ sinh học bằng phương pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R Solanacearum

Một bức tranh toàn cảnh gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về biện pháp phòng trừ sinh học vi khuẩn loài R solanacearum đ được Trigalet, Frey và Demery (Trigalet và cs, 1994) [72] đưa ra như sau:

- Các tác nhân phòng trừ sinh học đều cho thấy sự giảm các mức độ quần thể R solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết quả đều

ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà lưới và quy mô đồng ruộng nhỏ Quan niệm

sử dụng phòng trừ sinh học được dựa trên khả năng các nhân tố phòng chống cạnh tranh ở vùng rễ quyển, sinh kháng sinh hay cảm ứng cây chủ ưu tiên cho

sự tăng trưởng của nhân tố phòng trừ sinh học và ức chế sự tăng trưởng của R solanacearum

- Các chủng R solanacearum không độc và vi sinh vật đối kháng chính

là các tác nhân phòng trừ mà được nghiên cứu nhiều trong chiến lược phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Chẳng hạn như các chủng không độc có khả năng phòng chống héo ở lạc trong điều kiện nhà kính (He, 1983) [46] Nhiều chủng có khả năng sản sinh bacteriocin (Cuppels và cs, 1978) [35] và một số chủng sinh bacteriocin không độc có khả năng giảm triệu chứng héo của cà chua trong điều kiện nhà kính Bacillus polymyxa và P.flurescens giảm héo ở

cà chua trong điều kiện nhà kính (Aspiras và cs, 1986) [20] Hamidah S và cộng sự (1993) [41] đ công bố rằng cải tạo đất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphate, bột xương, bột hải ly, cua, glycerol, xỉ silic và valine đ làm tăng tần suất tạo khuẩn lạc ở đầu rễ của các chủng P fluorescens chính vì vậy đ làm tăng khả năng phòng chống héo cho cây trong các thực nghiệm trong chậu

- Một loài khác P cepacia được phân lập từ rễ ngô (Elphinstone và Aley, 1993) đ cho thấy khả năng đối kháng trong thí nghiệm dịch nuôi cấy

và trong chậu (Hartman và cs, 1993) [43]

- Tanaka và cộng sự năm 1990 đ phát hiện được các chủng thực khuẩn thể không độc có vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học đối với vi khuẩn

R solanacearum Wall và Sanchez năm 1993 đ phát hiện thấy tần suất cao hơn trong đất không có cây bị nhiễm so với những vùng gần ruộng bị nhiễm

kề cạnh [77]

Việc ứng dụng cơ chế kháng ở cây chủ do nhiễm các chủng độc bị sốc nhiệt, các đột biến không độc hoặc các chủng đối kháng của R solanacearum

đ được thông báo đối với Nòi1 (Averre và Kelman, 1965; Sequeira và cs, 1977; Tanaka, 1983; He và Kang, 1986) [53] Đột biến không độc được cảm ứng gen Tn5 có khả năng tạo khuẩn lạc ở rễ cà chua và ngăn cản sự tạo khuẩn lạc của các chủng dạng dại một cách hiệu quả (Trigalet và Trigalet-Demery, 1994) [72] 2.4.1 Cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn héo xanh

ra một số kết luận không chính xác (Abo-El-Dahab và El-Goorani,1969; Wagih, 1991) [16] Các vùng ức chế sinh trưởng trên môi trường thạch có thể

do các chất hoá học (pH thấp), các chất kháng sinh có phổ hoạt động rộng, do các chất kháng khuẩn đặc hiệu hơn, hoặc do sự có mặt của thực khuẩn thể Các kỹ thuật thích hợp phải được hình thành để phân biệt các cơ chế khác nhau này

Phản ứng do các chất đặc hiệu gây ra được gọi là chất kháng sinh có

ảnh hưởng đến vi sinh vật Vi sinh vật đối kháng tạo ra những chất này có khả năng ức chế sinh trưởng chỉ một số loài nhất định Một số vi sinh vật đối kháng chỉ ức chế vi khuẩn gram dương và một số khác có thể ức chế cả vi khuẩn gram âm và gram dương Một số khác chỉ có tác động đến liên cầu khuẩn hay Bacillus v v Các chất giống như kháng sinh do Pseudomonas cepacia (Aoki và cs, 1991) [17] và Pseudomonas glumae (Wakimoto, 1987) [76] sản sinh cần được nghiên cứu nhiều hơn để đánh giá vai trò tiềm tàng của chúng chống laị vi khuẩn R solanacearum ngoài đồng ruộng

Vai trò sinh học của các chất kháng sinh nói riêng và hiện tượng đối kháng nói chung là rất quan trọng trong sự sống của vi sinh vật Bằng cách sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của mình, vi sinh vật đối kháng có khả năng

ức chế các tác nhân cạnh tranh ở một mức độ nhất định và chúng điều hoà quần thể vi sinh vật trong tự nhiên

Rất nhiều tác giả cho rằng đối kháng trực tiếp không liên quan đến inplanta mà có những cơ chế khác như cảm ứng kháng cho cây chủ Gợi ý này dựa trên những quan sát về các chủng mất tính độc không có hoạt tính kháng invitro lại có hiệu quả giảm độ nghiêm trọng của bệnh trong điều kiện nhà lưới và thí nghiệm trên đồng ruộng (Zehr, 1971; Kempe và cs, 1983; Wakimoto, 1987; Trigalet và Trigalet-Demery, 1990) [76] Cảm ứng kháng ở cây chủ do nhiễm nhân tạo các chủng độc bị giết bởi nhiệt, các đột biến không

độc hoặc các chủng đối kháng của R solanacearum vào rễ, cành và lá đ được thông báo rộng ri (Averre và Kelman, 1965; Sequeira và Hill, 1974; Rathmell và Sequeira, 1975; Graham cs, 1977; Sequeira và cs, 1977; Tanaka, 1983, 1985) [53]

Các nhân tố quyết định sự phản ứng của cây chủ đối với vi khuẩn đối kháng rõ ràng là rất phức tạp và nhiều hợp chất thực vật có thể là các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn này (Sequeira, 19823) [54]

2.4.2 Các loại vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn đối kháng với R solanacearum được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau chẳng hạn như những vùng đất và vùng rễ quyển ức chế bệnh của cây chủ Ngoài ra các chủng R solanacearum không độc cũng được thông báo

là có hoạt tính đối kháng các chủng độc hoặc là khi nhiễm chung hoặc xử lý trước những chủng này với cây chủ

Bảng 2.2 Vi khuẩn đối kháng với R solanacearum

Pseudomonas fluorescens Kempe và Sequeira (1983)

Ciampi-Panno và cs (1989) Gallardo và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990) Pseudomonas glumae Wakimoto (1987)

Furaya và cs (1991) Pseudomonas cepacia Aoki và cs (1991)

Elphinstone và Aley (1993) Bacillus sp

Bacillus polymyxa

Fucikovsky và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990) Aspiras và cs (1986)

Các thể đột biến R solanacearum

không độc

Kempe và Sequeira (1983) Chen và Echandi (1984) Tanaka (1985)

Trigalet và Trigalet-Demery (1990) Hara và Ono (1991)

Triwidodo và cs (1995) Mặc dù vi sinh vật đối kháng hứa hẹn khả năng phòng trừ bệnh này nhưng chưa có một tác nhân phòng trừ sinh học nào chứng tỏ có hiệu quả cao trong môi trường tự nhiên Trong hầu hết các trường hợp thì thực nghiệm trên

đồng ruộng vẫn còn nhiều hạn chế và việc bảo vệ không đủ cho mục đích sử dụng thương mại (Anuratha và Gnanamanickam, 1990; Tanaka và cs, 1990) [17] Việc bảo vệ không thành công có thể là do sự tạo xâm nhiễm trong rễ của các nhân tố phòng trừ sinh học còn quá nghèo (Chen và Echandi, 1984) [31] hoặc do sự phụ thuộc quá nhiều vào các điều kiện tự nhiên (McLaughin

và Sequeira, 1988) [59] Cho đến nay các thực nghiệm đồng ruộng triển vọng nhất trong phòng trừ sinh học là việc sử dụng phân lập đối kháng Pseudomonas fluorescens BC8 có thể làm giảm héo ở khoai tây khi dùng như một yếu tố bổ sung, tốt nhất là nhiễm ở giai đoạn củ Hơn nữa các nhân tố phòng trừ sinh học dường như là rất thích nghi với sự sống sót theo kiểu hoại sinh trong đất bị nhiễm tự nhiên và có thể xâm nhập vào cây qua hệ rễ từ đất

Chiến lược phòng trừ sinh học trong phòng thí nghiệm thường không thành công trong điều kiện đồng ruộng bởi vì các chiến lược này chủ yếu dựa trên những điều kiện phải cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh như trong đất bị nhiễm bệnh tự nhiên Trong các vi môi trường đất và rễ quyển các nhân tố phòng trừ sinh học phải đấu tranh với các nhân tố sinh học và vật chất phức tạp gồm có các cấu phần, cấu trúc, độ ẩm và pH của đất Tất cả các yếu tố này

đều ảnh hưởng đến cấu trúc của khu hệ vi sinh vật (Nesmith và Jenkins, 1985; Weller, 1988) [63] Trong một nỗ lực để hạn chế các nhân tố này chúng ta phải chuyển sang một phương pháp mới như việc sử dụng nhân tố đối kháng nội ký sinh (Endophytic antagonist) có nguồn gốc từ mầm bệnh dạng dại Như vậy các vi sinh vật này sẽ có khả năng thích nghi tốt trong vi môi trường của cây và cạnh tranh được với mầm bệnh

Việc sử dụng nhân tố đối kháng nội ký sinh có một số ưu thế hơn so với việc sử dụng một nhân tố đối kháng bên ngoài Chẳng hạn như khi nhân tố đối kháng này bản thân nó đ hình thành được trong cây nó có thể vẫn tồn tại khi cây phát triển và bằng cách đó nó liên tục bảo vệ cho cây Nhân tố lý tưởng này sẽ giữ lại được những đặc điểm cần cho sự tạo khuẩn và khả năng sống sót theo kiểu nội ký sinh trong cây nhưng mất khả năng gây bệnh Nhân tố này có thể tạo khuẩn lạc trong rễ để xâm nhập vào hệ mạch xylem và nhân lên bên trong mô mạch

Các thể đột biến không độc tự phát của R solanacearum bị giảm khả năng sản sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) mà đ được giả thiết là nhân tố

gây độc Những thể đột biến này đầu tiên được Kelman (1954) [50] miêu tả

và có thể phân lập một cách dễ dàng (Kelman và Hruschka, 1973) [52] Các thể đột biến như vậy được xem là nhân tố phòng trừ sinh học cho bệnh héo do

vi khuẩn Một số thể đột biến này đ được thông báo là có thể nhân lên trong mô của cây chủ mẫn cảm sau khi nhiễm bằng kỹ thuật cắm tăm (Averre và Kelman, 1954) [50] Tuy nhiên, sự lan truyền có hệ thống này của chúng bị hạn chế có thể bởi vì chúng dễ dàng bị kết dính với lectin của cây hoặc bị liên kết với thành tế bào cây chủ (Sequeira, 1983) [65] Có thể EPS cho phép sự di chuyển có hệ thống của vi khuẩn độc bằng cách ngăn cản quá trình kết dính với thành tế bào

Một mối tương quan mạnh mẽ giữa việc sản sinh EPS và tính độc gần

đây đ được chứng minh bằng các thể đột biến mất tính độc được cảm ứng bởi gen nhảy nằm trên nhóm gen ops (Cook và Sequeira, 1991) [34] và eps (Denny và Baek, 1991) [36] Cấu trúc của polysaccharide quan trọng này đ

được xác định (Orgambide et al., 1991)[64] và các đột biến không có loại polysaccharide này hoàn toàn không độc và không thể tạo khuẩn lạc trong cây chủ sau khi nhiễm (Trigalet-Demery và cs, 1994) [72] Các thể đột biến mà sản sinh một lượng ít polysaccharide này có tính độc rất mạnh sau khi nhiễm vào rễ Các dữ liệu trên đây cho thấy rằng có những tương quan trực tiếp giữa tính độc, sự xâm chiếm rễ sau khi nhiễm và số lượng polysaccharide này được

sản sinh trong cây Người ta cho rằng một đột biến R solanacearum có tính

độc yếu có khả năng tham gia kháng bệnh hơn một đột biến hoàn toàn không

độc (Hara và Ono, 1991) [42], có lẽ là do đột biến có tính độc yếu có khả năng xâm nhập vào mô mạch và cảm ứng phản ứng kháng của cây chủ trong khi đó thể đột biến hoàn toàn không độc không thể xâm nhập vào bên trong cây chủ và như vậy chỉ có thể tạo ra sự đối kháng trực tiếp tại vùng rễ quyển

Một loại đột biến không độc thứ 2 vẫn còn khả năng sản sinh EPS dạng dại nhưng không có khả năng gây phản ứng siêu nhậy trên cây chủ kháng và

gây bệnh trên cây mẫn cảm Một số đột biến này nằm trên nhóm gen hrp 23

kb (Boucher và cs, 1985, 1987, 1992) [24] Các thể đột biến gen hrp không

độc trên cây cà chua nhưng vẫn có khả năng xâm nhập qua rễ và nhân lên trong cây mẫn cảm (Trigalet và Demery, 1986) [73] Các thể đột biến hrp biến đổi theo sự xâm nhập của chúng khi rễ bị nhiễm mà không gây sát thương nhân tạo; có một sự tương quan dương giữa sự xâm nhập của thể đột biến với mức độ bảo vệ cho cây; không có thể đột biến nào cho thấy khả năng kháng sinh chống lại vi khuẩn độc, chính vì vậy đối kháng xảy ra trong cây là

do sự cảm ứng cơ chế kháng của cây chủ và sự có mặt cuả thể đột biến hrp trong mô cây chủ tương quan với sự giảm khả năng tạo khuẩn lạc của chủng

độc trong thân Các dữ liệu trên cho thấy rằng nhiễm các thể đột biến hrp vào

rễ cây trước đ hạn chế được sự phát triển của bệnh

Một số kết quả khởi đầu sử dụng các chủng R solanacearum đột biến gen hrp làm nhân tố phòng trừ sinh học bệnh héo ở cà chua đ mở ra một chiến lược phòng trừ khả thi trong điều kiện đồng ruộng Các kết quả nghiên cứu đ chứng minh rằng các thể đột biến gen hrp có thể bảo vệ cây khỏi bệnh

từ 80 đến 100% trong những điều kiện thích hợp nhất ngay cả khi nồng độ vi khuẩn độc nhiễm vào cây cao

Tóm lại, vi sinh vật đối kháng đ được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và đ đưa vào sản xuất nhiều loại chế phẩm Tuy nhiên, hiệu quả trong lĩnh vực phòng chống bệnh héo xanh cây trồng còn nhiều hạn chế, vì phải phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: kỹ thuật thâm canh, tiểu vùng khí hậu, giống cây trồng, nhiệt độ, thời vụ canh tác…

2.4.3 ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông nghiệp bền vững

Sử dụng vi khuẩn nội sinh trong vi nuôi cấy để thúc đẩy thay đổi phát triển và sinh lý của vật liệu thực vật giúp tăng cường kháng stress sinh học và phi sinh học ở cây non hình thành từ vật liệu nuôi cấy này ở những vùng khí

hậu mùa xuân ẩm và lạnh và mùa trồng trọt ngắn, việc sử dụng vi khuẩn nội sinh hệ rễ có thể thúc đẩy sự hình thành hạt và ổn định trong các điều kiện bất lợi và chính vì vậy tối đa hoá thời gian sinh trưởng có sẵn Ví dụ như trong các

điều kiện stress về nhiệt, khoai tây được xử lý với vi khuẩn nội sinh có thể tăng cường khả năng tạo củ (+63%)

Chọn giống cây trồng để cải thiện tương tác cây chủ và vi khuẩn nội sinh Để tăng năng suất cây trồng cần xem xét đến việc cải tạo độ bền vững của tương tác vi khuẩn nội sinh và cây chủ Có thể cải tạo khả năng làm chủ (phản ứng) của cây chủ hoặc chọn các tính trạng có lợi của vi khuẩn trong các quần thể vi khuẩn cư trú trong cây chủ Bằng chứng gián tiếp gợi ý rằng vi khuẩn nội sinh đ thích ứng với cây chủ qua thời gian và mối quan hệ như vậy

có thể trở nên đặc hiệu cây trồng Chính vì vậy, một vài chu trình trong cùng một cây chủ có thể biến đổi vi khuẩn nội sinh để sống trong cây chủ mới đó Tương tự một số cây chủ phản ứng với xử lý vi khuẩn nội sinh kích thích sinh trưởng hơn các cây chủ khác Ví dụ như khoai tây giống Red Pontiac phản ứng tốt với các tác động kích thích sinh trưởng sau khi xử lý với vi khuẩn Pseudomonas sp PsJN hơn giống khoai Shepody

Lịch sử canh tác cây trồng và chọn lọc giống cây trồng kích thích quần thể vi khuẩn nội sinh đặc hiệu Quần thể vi khuẩn nội sinh thực vật đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh tồn tại trong đất ruộng Khi thực vật chết, thực vật cũng giải phóng quần thể vi khuẩn nội sinh trở lại đất, chính vì vậy mật độ quần thể tỷ lệ trực tiếp với dung tích vật liệu thực vật phân huỷ Ví dụ như củ khoai tây chứa mật độ cao quần thể vi khuẩn nội sinh và có thể đóng góp vào quần thể vi khuẩn nội sinh của đất khi củ khoai tây mẹ thối rữa Mở rộng ra với trình tự cây trồng đặc hiệu có thể tạo ưu thế xây dựng lên quần thể vi khuẩn nội sinh đặc hiệu Nếu trình tự cây trồng bổ sung có thể lý giải rằng quan hệ nội sinh có lợi được củng cố qua thời gian

Tóm lại, vi khuẩn nội sinh thực vật giúp tăng trưởng thực vật, kháng bệnh và tăng năng suất cây trồng Để sử dụng chúng hiệu quả hơn cần phải chọn lọc và cải tạo quần thể vi khuẩn nội sinh cây trồng và các nguồn đất của chúng và để ổn định chúng ở mức độ cực thuận Do các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp có thể phá vỡ trạng thái bền vững của quần thể vi khuẩn nội sinh nên cần xem xét sự liên quan của các tác động có hại tiềm tàng trên cây trồng, đất trồng và ngay bản thân bên trong quần thể vi khuẩn nội sinh Chẳng hạn như việc sử dụng bừa bi các loại thuốc hoá học nông nghiệp có thể phá

vỡ thế bền vững của vi hệ sinh thái đất-cây trồng Thách thức với cộng đồng nghiên cứu sẽ là phát triển hệ thống để cực thuận quan hệ có lợi của thực vật

và vi khuẩn nội sinh

2.5 Phân loại vi khuẩn

2.5.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống

- Căn cứ vào khả năng dinh dưỡng, chuyển động của vi khuẩn, đặc

điểm của tiên mao, khả năng hình thành bào tử, tình trạng bắt màu gram, hình thái, kích thước khuẩn lạc và tế bào, đặc tính quang học, đặc điểm sinh

lý, sinh hoá

- Dựa trên khả năng sử dụng một số nguồn cacbon để xác định sự tăng trưởng hoặc sự thay đổi màu dẫn tới sự giảm màu trong quá trình oxy hoá nguồn C do vi khuẩn [64]

2.5.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại bằng cách sử dụng kit “Api”

và Vitek

Api và Vitek là những kit và hệ thống có kích thước nhỏ, gọn, thuận tiện cho việc xác định nhanh các nhóm vi khuẩn, bao gồm sự kiểm tra đặc

điểm sinh lí sinh hoá, sản sinh enzyme ngoại bào và đặc điểm của bộ máy trao

đổi chất (khả năng và đặc điểm chuyển hoá các chất dinh dưỡng) của vi khuẩn đích bao gồm cả khả năng đồng hoá các loại đường Sự kiểm tra mức

độ tương đồng được tiến hành theo lược đồ sau: nuôi cấy huyền phù tế bào vi

khuẩn cần xác định vị trí phân loại trong các giếng của phiến nhựa 96 giếng

đ được tráng với một “chất thử” xác định Trong suốt giai đoạn nuôi cấy sự chuyển hoá “chất thử” dẫn đến làm thay đổi màu canh khuẩn trong các giếng hoặc tự động hoặc khi có bổ sung thêm thuốc thử Kiểm tra khả năng đồng hoá một loại cơ chất nào đó của vi khuẩn được kiểm tra bằng cách cấy tế bào chủng vi khuẩn hoà tan trong môi trường tối thiểu với hoá chất tráng sẵn trong từng giếng của “Kít Api 20 NE” hoặc “Hệ thống Vitek 32” là nguồn dinh dưỡng thiết yếu duy nhất (nguồn C, N,…) Thông qua mật độ quang học trong mỗi giếng (đục hay trong ) có thể biết kết luận chủng vi khuẩn xác định

có phát triển trong một giếng xác định hay không - chủng vi khuẩn chỉ sinh trưởng nếu chúng có thể sử dụng cơ chất tương ứng có trong giếng của “Kit”

So sánh kết quả những phản ứng sinh lí, sinh hoá do chủng vi khuẩn cần xác

định vị trí phân loại tạo ra với kết quả trong thư mục dữ liệu chuẩn để có kết luận về vị trí phân loại cần tìm

3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Nguồn vi sinh vật

- Nguồn vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ các cây lạc và cây vừng có biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh điển hình thu thập từ một số tỉnh như: Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Thanh Hoá, Nghệ An ở các thời vụ gieo trồng khác nhau

- Nguồn vi sinh vật đối kháng được phân lập từ những mẫu đất và các

bộ rễ của các cây họ cà, ớt, hành và cây xen canh

3.1.2 Các thiết bị hoá chất và một số giống cây nghiên cứu

Giống vừng V6: Là giống vừng được nhập từ Nhật Bản, có tiềm năng năng suất cao và chất lượng tốt Đây là giống vừng mới có khả năng chịu hạn khá, thích ứng rộng và đang được thực tế sản xuất chấp nhận và đánh giá cao

Giống vừng địa phương: Là giống vừng trắng và vừng đen mà ở các vùng Thanh Hoá và Nghệ An hay trồng

Giống lạc Thiên Ngọc, giống lạc Thiên Hoa: là giống có khả năng chịu hạn tốt, năng suất cao, do Trung tâm sinh học Nông nghiệp - Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

3.1.3 Các môi trường và dung dịch đệm chủ yếu

- Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R solanacearum (Kelman, 1954): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5g; thạch 20g; nước cất 1 lần 1000 ml Khử trùng ở 0,5 at, 121°C, 20 phút, làm lạnh đến 60°C và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1%

- Môi trường 523: Để nuôi cấy R solanacearum: MgSO4.7H2O (6,25%)

5 ml; K2HPO4 (12,5%) 16,3 ml; yeast extract 4g; casein hydrolyzat 8g; sucaroza 10g; agar 18g; nước cất 1000 ml

- Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml

- Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco Bacto): tryptone 10g; difco bacto yeast extract 5g; NaCl 5g; nước cất 1000 ml 3.2 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn, phân lập và tuyển chọn các chủng R solanacearum gây bệnh héo xanh trên vừng và lạc

- Phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng với

R solanacearum

- Đánh giá mức độ kích thích sinh trưởng của một số chủng vi khuẩn

đối kháng lên cây và hoạt lực đối kháng với vi khuẩn R solanacearum trong

điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính và ngoài đồng ruộng trên cây vừng và lạc, đồng thời tìm hiểu sự tương tác giữa vi khuẩn đối kháng – cây chủ – vi khuẩn gây bệnh

Yêu cầu đối với mẫu: Mẫu bệnh để thu là những cây mới chớm bị héo

ở phần ngọn, hoặc có thể ở vài cành phía ngọn cây, ở thời điểm này số lượng

vi khuẩn gây bệnh bên trong mô cây nhiễm bệnh đạt mật độ cao nhất

Phương pháp thu mẫu: Để thu được các chủng vi khuẩn gây bệnh đại diện cho một quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh tại một địa phương, chỉ thu mẫu ở những cây bị bệnh tại các thửa ruộng với đa số cây còn khoẻ và đang ở thời kỳ ra hoa, kết quả Tiến hành thu mẫu ở 2 hoặc 3 thửa tại mỗi x, tuỳ theo tình hình trồng lạc và vừng của mỗi huyện sẽ thu mẫu ở nhiều hoặc ít x

Cách thu mẫu: Mỗi thửa ruộng (khoảng 200 m2) thu cây nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn theo đại diện cho 5 điểm chéo góc, thu một đoạn thân sát gốc khoảng 3 cm, giữ trong túi polyetilen Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), địa điểm, giống cây Sau mỗi lần cắt, kéo phải được tẩy trùng bằng cồn 70% để tránh làm lây lan vi khuẩn gây bệnh giữa các mẫu với nhau 3.3.1.2 Phương pháp thu thập, phân lập vi khuẩn gây bệnh từ mẫu cây bệnh Rửa sạch các mẫu bệnh được thu ở ngoài đồng, sau đó cắt lấy phần trên ngang mặt đất (cổ rễ), sát trùng bề mặt bằng cồn 70% rồi dùng dao vô trùng

bổ dọc đoạn thân cây (mẫu) và cắt những phần bị nhiễm bệnh (phần có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng Sau một khoảng thời gian có thể quan sát thấy dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi

ra từ mẫu bệnh Sau 20 phút loại bỏ đoạn thân bị nhiễm bệnh ra khỏi dịch vi khuẩn Những ống dịch vi khuẩn này được bảo quản ở 20OC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Phân lập R solanacerum theo phương pháp truyền thống - Pha long dịch thôi vi khuẩn với dung dịch đệm hoà long để đạt nồng độ thích hợp sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên môi trường TTC ủ hộp lồng cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 30OC ± 2OC, theo dõi kết quả sau 24,

48, 72 giờ Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc, tiến hành chọn từ 3-5 khuẩn lạc

để cấy vạch trên môi trường 523 Sau 24-48 giờ nuôi ở nhiệt độ 28OC ± 2OC, tiến hành lựa chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái điển hình của loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh có tính độc để giữ trong nước cất vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3.1.3 Phương pháp đánh giá tính độc của R solanacearum

Độc tính của vi khuẩn R solanacearum được đánh giá theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên cây vừng V6 và giống lạc Thiên Ngọc

Những khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn R solanacearum được cấy trên môi trường 523, sau đó nhiễm vào những cây vừng và cây lạc có 5 ữ 6 lá thật bằng phương pháp cắm tăm (dùng tăm nhọn vô trùng lấy một ít tế bào cắm vào nách lá), cây được chăm sóc ở điều kiện tự nhiên, nhiệt độ trung bình

280C ữ 300C, ghi kết quả số cây chết và sống sót hàng ngày Dựa vào kết quả