Nghiên cứuphân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất từ dịch của lá cây mâm xôi = RUBUS ALCEAEFOLIUS POIR

trường đại học sư phạm hà nội 2 khoa hoá học cao thanh tùng nghiên cứu Phân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất từ dịch của lá cây mâm xôi rubus alceaefolius Poir khoá luận tốt nghiệ

trường đại học sư phạm hà nội 2

khoa hoá học

cao thanh tùng

nghiên cứu Phân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất từ dịch của lá

cây mâm xôi

(rubus alceaefolius Poir)

khoá luận tốt nghiệp đại học

chuyên ngành : hoá hữu cơ

Hà Nội - 2010

trường đại học sư phạm hà nội 2

khoa hoá học

cao thanh tùng

nghiên cứu Phân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất từ dịch của lá

cây mâm xôi

(rubus alceaefolius Poir)

khoá luận tốt nghiệp đại học

chuyên ngành : hoá hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

mục lục

Trang

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh muc những chữ viết tắt

danh mục các hình vẽ

danh mục các bảng biểu và sơ đồ

mở đầu 1

chương 1 tổng quan 4

I.1.Tổng quan về cây Mâm xôi 4

I.1.1 Thực vật học 4

I.1.2 Phân bố, sinh thái 5

I.1.3 Công dụng 5

I.1.4 Thành phần hoá học 6

1.2 Vài nét về lignan 8

I.2.1 Đại cương và phân loại 8

I.2.2 Các dẫn xuất quan trọng của Lignan 10

I.2.3 Tổng hợp Lignan 12

Chương II đối tượng và phương pháp nghiên cứu 21

II.1 Mẫu thực vật 21

II.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 21

II.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 21

II.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 21

II.2.3 Sắc ký cột (CC) 21

II.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 22

II.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 22

II.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 22

II.3.3 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) 22

Chương III Thực nghiệm và kết quả 23

III.1 Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu 23

III.2 Phân lập các hợp chất 23

III.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất 25

Chương IV Thảo luận 26

IV.1 Hợp chất RA21.6 26

(Axít-3-O-methylellagic7--D-Rhamnopyranoside) (7) IV.2 Hợp chất RA13.3 (Icariside E4) (2) 32

v kết luận

Tài liệu tham khảo

mở đầu

Việt Nam nằm trong vùng lục điạ Đông Nam á thuộc khu vực nhiệt đới

do vậy hệ thực vật Việt Nam vô cùng phong phú, đa dạng, đặc biệt là tài nguyên rừng Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú vào loại bậc nhất thế giới với khoảng 12000 loài, trong đó có 4000 loài [1] được nhân dân ta dùng làm thảo dược Đây thực sự là một tài sản vô cùng quý báu mà thiên nhiên đã ban tặng cho đất nước ta

Ngoài giá trị to lớn về kinh tế mà thực vật đem lại, nó còn có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc cải tạo môi trường đất, nước và không khí Những năm gần đây cùng với sự phát triển của một số ngành khoa học như công nghệ sinh học, công nghệ gen càng làm tăng thêm không chỉ về số lượng mà còn làm tăng thêm về giá trị mà thực vật đóng góp cho nền kinh tế đất nước với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học cao nguồn gốc trong tự nhiên, các nhà khoa học lại đi đầu việc tạo ra những loại thuốc đặc trị giúp điều trị những căn bệnh hiểm nghèo cho con người, cải thiện chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ

Cây mâm xôi (Rubus alceaefolius ) thuộc họ Hoa hồng hay có tên gọi khác là cây đùm đũm là một loài cây đã được sử dụng từ lâu trong dân gian làm thuốc chữa bệnh Quả cây mâm xôi chữa bệnh về đường tiêu hoá, đau thận, tinh ứ, liệt dương đái són hoạt tinh Cành lá và rễ cây dùng chữa viêm gan cấp và mãn tính, viêm loét miệng, dùng cho phụ nữ sinh đẻ uống làm thông máu, tiêu cơm Cây còn sử dụng làm trà uống giúp thanh nhiệt và lợi tiểu Theo nghiên cứu mới đây của các nhà nghiên cứu thuộc trường đại học Kentucky (ohio- Hoa Kỳ) trái mâm xôi đen có thể ngăn chặn các khối u phát triển trong trường hợp ung thư miệng Chỉ đó đã cho thấy tầm quan trọng của cây Mâm xôi trong việc chữa trị một số bệnh thường gặp của con người Tuy nhiên cho

tới nay chưa có một tài liệu chính thức nào xác định về thành phần các hợp chất hữu cơ có chứa trong dịch của lá cây mâm xôi

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn đó mà tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là:

" Nghiên cứu phân lập các hợp chất hữu cơ chiết xuất

từ dịch của lá cây mâm xôi "

Việc nghiên cứu và tìm hiểu nhằm tìm ra những chất mới giúp tăng thêm giá trị của cây mâm xôi trong đời sống

Nhiệm vụ của khóa luận

1 Phân lập một số hợp chất từ dịch chiết nước của cây mâm xôi

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

Chương 1 Tổng Quan

1.1 Giới thiệu về cây mâm xôi

1.1.1 Thực vật học

Cây Mâm xôi hay còn được gọi là đùm đũm có tên khoa học là Rubus

alceaefolius Poir., thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae Đây là loài cây bụi nhỏ,

thân leo có gai to và dẹt Cành mọc vươn dài, có nhiều lông Lá đơn, mọc so le, hình bầu dục, hình trứng hoặc gần tròn, chia thùy nông, không đều, gân chân vịt, mép khía răng, mặt trên màu lục sẫm phủ lông lởm chởm, mặt dưới có nhiều lông mềm, mịn màu trắng xỉn; cuống lá dài cũng có gai; lá kèm sớm rụng Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm ngắn; lá bắc giống lá kèm, hoa màu trắng; cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị rất nhiều thường dài bằng cánh hoa, chỉ nhị dẹt, lá noãn nhiều Quả hình cầu, gồm nhiều quả hạch tụ họp lại như dáng mâm xôi, khi chín màu đỏ tươi, ăn được Cây ra hoa tháng 2-3, quả tháng 5-7 [1, 2]

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự [1], trên thế giới chi Rubus có khoảng

hơn 400 loài, hầu hết là cây bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới, cận nhiệt đới và cả ở vùng nhiệt đới Bắc bán cầu Một vài loài được trồng lấy quả ở Việt Nam, chi này có 51 loài, 7 thứ, trong đó mâm xôi là loài phân bố tương đối rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng núi thấp, trung du và đồng bằng Cây ưa sáng và ẩm, thường mọc trùm lên các cây bụi và cây leo khác ở ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, nhất là trong các trảng cây bụi ưa sáng trên đất sau nương rẫy ở vùng đồng bằng, mâm xôi mọc lẫn trong các lùm bụi quanh làng, hai bên đường đi Cây này sinh trưởng, phát triển nhanh Những cây ít bị chặt phá ra hoa quả nhiều hàng năm Cây có khả năng tái sinh mạnh sau khi bị chặt phá

1.1.3 Công dụng

Lá, cành và rễ mâm xôi có vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, tán ứ, tiêu viêm, chỉ huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon miệng Cành lá phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau khi đẻ mất sức

và những người ăn không tiêu, đầy bụng Ngoài ra cành và lá mâm xôi còn được dùng phối hợp với Mộc thông, Ô rô để chữa viêm tuyến vú, viêm gan cấp

và mạn tính Quả có vị ngọt, tính bình, được dùng thay vị Phúc bồn tử trong y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm tráng dương, mạnh sức Quả được dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són, đái buốt [1, 2]

ở ấn Độ người ta dùng quả mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm của trẻ em Nước sắc lá và vỏ thân được dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêu chảy

ở Trung Quốc, mâm xôi được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa

mạnh chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 của dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ tế bào, con đường duy nhất để tế bào sinh sôi, là một quá trình sinh học được kiểm soát chặt chẽ và thực tế ung thư là sự tăng sinh vô hạn độ không mong muốn của các tế bào ung thư với sự thoái hóa của chu kỳ tế bào Do đó, các chất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng trong điều trị ung thư) [5]

1.1.4 Thành phần hoá học

Theo các sách về cây thuốc Việt Nam [1, 2], quả Mâm xôi chứa các axit hữu cơ (chủ yếu là axit citric, malic, salycilic), đường, pectin Lá chứa tanin Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít công trình nghiên cứu được công bố về loài

này và cũng chỉ nghiên cứu về cây thuốc này mọc ở Trung Quốc Còn ở Việt Nam hoàn toàn chưa có nghiên cứu nào về cây thuốc quí này

Theo sự tra cứu của chúng tôi, từ cây R alceaefolius mọc ở Trung Quốc,

năm 1998 Gan L và các đồng nghiệp đã phân lập được: axit corosolic (1), axit tormentic (2), niga-inchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) và suavissimoside R1 (5) [4] Năm 2000, Gan L và các đồng nghiệp lại công bố phân lập của alcesefoliside (6), hyperoside (7), vomifoliol (8), õ-sitosterol (9), daucosterol (10) và dotriacontyl alcohol (11) [5] Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Cui C -B đã công bố sự phân lập của rubuphenol (12) sanguiin H-2 ethyl ester (13), axit ellagic (14), ethyl gallate (15), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-õ-D- glucopyranose (16) và 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-õ-D-glucopyranose (17) [3]

Dưới đây chúng tôi dẫn ra cấu trúc của một số hợp chất đã được phân lập

từ loài R alceaefolius

Các hợp chất đã được phân lập từ cây Rubus alceaefolius.

HO

O

OH

OH OH

HO

O O OH

OH OH OH

OH HO

HO

O O

OH OH

OH OH

O O

HO

HO OH OH

O O

H O

O

O O

OH OH

OH O

OH

OH HO O

OH HO HO

OH HO

O O

O

13

O

O OH OH

O O

HO OH

14

CH2CH3

HO OH OH

15

O GO

OG

OG RO

GO

OH

OH

OH C

O

G =

16: R=G; 17: R=H

1.2 Vài nét về lignan

1.2.1 Đại cương và phân loại

Lignan là nhóm các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ các dẫn xuất của các cinamic acid, cinamyl alcohol, propenyl benzene và allyl benzen có liên quan đến sự chuyển hoá hoá sinh với phenyl alanine Cấu trúc của lignan được chia thành các đơn vị C6C3 hợp thành mà người ta phân biệt

lignan 2 đơn vị C6C3Sesquineolignan 3 đơn vị C6C3

dineolignan 4 đơn vị C6C3

Sesterneolignan 5 đơn vị C6C3

Lignan do 2 đơn vị C6C3 hợp thành Theo Freudenberg và Weiges đề nghị cách đánh số như sau (1961) Nhóm C6C3 đánh số từ 1-9

nhóm còn lại đánh số từ 1’-9’ Các vị trí 7, 8, 9 có thể thay tương ứng  ,  ,  Cũng do đó các vị trí 7’, 8’, 9’ được thay tương ứng  ' ,  ' ,  ' Trên cơ sở đó Haworth đề xuất nhóm hợp chất có nguồn gốc từ 2 đơn vị C6C3 có liên kết

) '

(

'  



   với nhau gọi là lignan (lignane, lignan)

Nếu 2 nhóm C6C3 liên kết với nhau bởi các liên kết khác chẳng hạn 3-3’ thay cho 8-8’ ta được Neolignan

3,3’ - Neolignan Nếu tạo một vòng bổ sung giữa hai nhóm C6C3 gọi là cyclolignan

2,7’ - cyclolignan Hai nhóm C6C3 liên kết với nhau bằng cách liên kết 8-8’ và một nguyên

có tác dụng ngăn chặn chu kì AMP Phosphodiesterase, làm nảy mầm chất ức chế đặc biệt dẫn xuất brom của nó với các chỉ số E C8

50 và SI thích hợp có tác dụng chống HIV bằng cách ức chế bản sao ngược của tế bào HIV-1 và kết hợp với DNA polymerase và RNAase

Lignan pinoresinol và laricresnol là thành phần quan trọng trong thực đơn

ăn kiêng trong thực đơn tiểu đường

Đông y Trung Quốc sử dụng Lignan điều trị viêm gan và bảo vệ gan

O

O

Dựa trên hoạt tính oxi-hoá mạnh, khoa học đã tìm ra nhiều hoá chất nguồn gốc Lignan đa dạng, cộng sinh với nhiều loại vi rút để tạo hướng phát triển mới trong y dược

1.2.2 Các dẫn xuất quan trọng của Lignan

 Dẫn xuất cacboxylic acids

MeO

HO MeO

Br OCH3

 Dẫn xuất ketone

 Dẫn xuất alcohols và phenols

Magnolol Honokiol

Cùng với sự tạo phức Fe3+

-ADP-O2 tác dụng oxi hóa chất béo

 Ethers and Alcohol or phenol Derivatives

OCH 3 OCH 3

H

H

OCH 3 OCH3

OCH 3 OCH 3

1 MeOH

2 NaBH 4

3 H 3 O+ 25%

OMe

OTBDMS MeO

MeO

MeO

MeO

OMe MeO

2 H 2 , Pd/C 10%

3.(+) MBA

LHMDS,O2

MeO MeO

R CO 2 Me

CO2H

O MeO

MeO

O

OBr MeO

 Theo Yoda

a, Methoxy benzyl magnes umchloride

b, c, CuI và trimethyl silyl chloride

e, f 80%

H 3 CO

ste

ps 23%

a, b 42%

O

O MeO

O

MeO

OMe

Cao Thanh Tùng 20 K32B - Hóa học

a: iBuli, THF,

-780C, 1hb: TFH, 3hc: HgO, BF3, 28h

OH

e 65%

n feoxidant

Pinoresinol lariciresinol reductase NaDPH

HO

OCH 3

1.3.Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu thực vật, tùy vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất có độ phân cực vừa phải…) mà

ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải phối hợp một tỉ lệ nhất định để tạo ra một hệ dung môi mới Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn hết sức cẩn thận Nó cần hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu) không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được trưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường

có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, axetynitat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

tri-n-butyl-Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphotphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofoc, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá

tương tự như vậy có một lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra sự phân hủy,

sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Bởi clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại clorofoc khả năng phân cực thấp hơn có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol phần lớn là các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước dường như là dung môi tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên thì cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ như trechlonolide A thu được từ Trechonaetes laciniata được chuyển hóa thành trechlonolide B bằng quá trình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy 1-hidroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythoxy novogranatense được chiết trong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ lá cây

mà thả vào đó là dung dịch nước của metanol

Đietyl ete hiếm khi được sử dụng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra peroit dễ nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành exetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình

chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được sử dụng đối với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi sử dụng các dịch chiết bằng axit, bazơ có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết thành dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 300C – 400C, với một vài hóa chất có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.3.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

 Chiết ngâm

 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

 Chiết sắc với dung môi nước

 Chiết lôi cuốn với hơi nước Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức

và thời gian, thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình rửa tách dung môi, dung môi nóng hoặc lạnh.Trước kia máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bằng bình thủy tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết tách liên tục bởi mẫu được ngâm trong dung môi

tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như Dragendorff và tác nhân Mayer Cũng vậy các flavonoid thường là những hợp chất màu bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết Khi chiết các chất béo nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của các cặn tiếp theo

đó sẽ biểu hiện sự kết thúc quá trình chiết Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và glicozid trợ tim, phản ứng keđe có thể được sử dụng biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể cho biết khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để chọn dung môi thích hợp và lựa chọn quá trình chiết hợp lí nhằm đạt kết quả cao Ngoài ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà ta có thể thu một số hợp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí (chromoatography) là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp thụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc kí gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính chất của chúng ( tính bị hấp thụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực