Nghiên cứu phân lập các hợp chất tritecpen từ lá cây mâm xôi (rubus alceaefolius poir )

Ngày nay với sự hỗ trợ của các máy móc hiện đại có thể giúp con người phân lập được rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên, cùng với sự đa dạng của thiên nhiên Việt

MỞ ĐẦU

Trong điều kiện phát triển của xã hội hiện nay chất lượng cuộc sống của con người đã được nâng lên, tuổi thọ tăng lên… Tuy nhiên cùng với sự phát triển đó thì con người cũng đang phải đối đầu với những nguy cơ mắc nhiều những căn bệnh hiểm nghèo Nguyên nhân đó là do ôi nhiễm bầu không khí, ôi nhiễm nguồn nước…Việc nghiên cứu tìm ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên có hiệu quả cao, dễ tìm nguồn nguyên liệu, ít tác dụng phụ,

ít độc tính để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác phục

vụ lợi ích của con người đã và đang là vấn đề được các nhà khoa học hết sức quan tâm

Nằm ở khu vực nhiệt đới gió mùa có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho các thảm thực vật phát triển như : nhiệt độ trung bình 15-280C, độ ẩm cao, lượng mưa lớn… nước ta có một kho tài nguyên thiên nhiên vô giá với nguồn dược liệu phong phú và đa dạng thuộc loại bậc nhất thế giới Theo các tài liệu

đã công bố [1] thì Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật, từ xa xưa nhân dân ta đã biết dùng các loại thảo dược để chữa bệnh và có rất nhiều bài thuốc quý còn được lưu truyền đến ngày nay Các bài thuốc này có rất nhiều ưu điểm trong chữa bệnh như ít độc tính, ít tác dụng phụ, dễ tìm nguyên liệu Nguồn kinh nghiệm quý báu xuất phát từ các bài thuốc cổ truyền này có vai trò hết sức quan trọng với sự phát triển của ngành y học nói chung và ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Ngày nay với sự hỗ trợ của các máy móc hiện đại có thể giúp con người phân lập được rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên, cùng với sự đa dạng của thiên nhiên Việt Nam hứa hẹn sẽ là nơi tìm ra rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần quan trọng trong việc tìm ra các phương thuốc chữa các căn bệnh hiểm nghèo hiện nay

Cây Mâm xôi được sử dụng rộng rãi trong dân gian để chữa một số bệnh về tiêu hóa [4] như : chữa chậm tiêu, kém ăn, một số bệnh về gan, dùng cho phụ nữ sau khi sinh để hồi sức…Chính vì những lí do trên em đã chọn đề

tài “ Nghiên cứu phân lập các hợp chất tritecpen từ lá của cây Mâm xôi”

Nhiệm vụ của khóa luận

1 Phân lập một số hợp chất tritecpen từ cây Mâm xôi

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp phổ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Mâm xôi

1.1.1 Thực vật học

Cây Mâm xôi hay còn được gọi là đùm đũm có tên khoa học là Rubus

alceaefolius Poir, thuộc họ Hoa hồng - Rosaceae Đây là loài cây bụi nhỏ,

thân leo có gai to và dẹt Cành mọc vươn dài, có nhiều lông Lá đơn, mọc so

le, hình bầu dục, hình trứng hoặc gần tròn, chia thùy nông, không đều, gân chân vịt, mép khía răng, mặt trên màu lục sẫm phủ lông lởm chởm, mặt dưới

có nhiều lông mềm, mịn màu trắng xỉn, cuống lá dài cũng có gai, lá kèm sớm rụng Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm ngắn, lá bắc giống lá kèm, hoa màu trắng, cánh hoa 5, mỏng hình tròn, nhị rất nhiều thường dài bằng cánh hoa, chỉ nhị dẹt, lá noãn nhiều Quả hình cầu, gồm nhiều quả hạch

tụ họp lại như dáng Mâm Xôi do đó có tên cây Mâm xôi, khi chín màu đỏ tươi, ăn được Cây ra hoa tháng 2-3, quả tháng 5-7 [1, 2]

Hình 1.1.1 Cây Mâm xôi Rubus alceaefolius Poir

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự [1], trên thế giới chi Rubus có khoảng

hơn 400 loài, hầu hết là cây bụi, mọc thẳng hay bụi trườn, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới, cận nhiệt đới và cả ở vùng nhiệt đới Bắc bán cầu Một vài loài được trồng lấy quả Ở Việt Nam, chi này có 51 loài, 7 thứ, trong đó Mâm xôi

là loài phân bố tương đối rộng rãi ở khắp các tỉnh vùng núi thấp, trung du và đồng bằng Cây ưa sáng và ẩm, thường mọc trùm lên các cây bụi và cây leo khác ở ven rừng ẩm, rừng núi đá vôi, đồi, nhất là trong các trảng cây bụi ưa sáng trên đất sau nương rẫy Ở vùng đồng bằng, Mâm xôi mọc lẫn trong các lùm bụi quanh làng, hai bên đường đi Cây này sinh trưởng, phát triển nhanh Những cây ít bị chặt phá ra hoa quả nhiều hàng năm Cây có khả năng tái sinh mạnh sau khi bị chặt phá

1.1.3 Công dụng

Lá, cành và rễ Mâm xôi có vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, tán ứ, tiêu viêm, chỉ huyết, kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon miệng Cành lá phơi khô, nấu nước uống thay chè, dùng cho phụ nữ sau khi đẻ mất sức và những người ăn không tiêu, đầy bụng Ngoài ra cành và lá Mâm xôi còn được dùng phối hợp với Mộc thông, Ô rô để chữa viêm tuyến vú, viêm gan cấp và mãn tính Quả có vị ngọt, tính bình, được dùng thay vị Phúc bồn

tử trong y học cổ truyền, có tác dụng bổ gan thận, giữ tinh khí, làm tráng dương, mạnh sức Quả được dùng chữa thận hư, liệt dương, di tinh, đái són, đái buốt [1, 2]

Ở Ấn Độ người ta dùng quả Mâm xôi làm thuốc chữa bệnh đái dầm của trẻ em Nước sắc lá và vỏ thân được dùng làm thuốc điều kinh, chữa tiêu chảy

Ở Trung Quốc, Mâm xôi được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa albumin niệu, viêm tuyến vú và viêm gan mãn tính Ở một số vùng của

Trung Quốc, nó còn được sử dụng để chữa một số bệnh ung thư nhất định Theo kết quả nghiên cứu của Cui C - B và cộng sự, rễ Mâm xôi thể hiện hoạt tính ức chế mạnh chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 của dòng tế bào tsFT210 (Chu kỳ

tế bào, con đường duy nhất để tế bào sinh sôi, là một quá trình sinh học được kiểm soát chặt chẽ và thực tế ung thư là sự tăng sinh vô hạn độ không mong muốn của các tế bào ung thư với sự thoái hóa của chu kỳ tế bào Do đó, các chất ức chế chu kỳ tế bào có khả tiềm tàng trong điều trị ung thư) [6]

1.1.4 Thành phần hoá học

Theo các sách về cây thuốc Việt Nam [1, 2], quả Mâm xôi chứa các axit hữu cơ (chủ yếu là axit xitric, malic, salycilic), đường, pectin Lá chứa tanin Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít công trình nghiên cứu được công bố về

loài R alceaefolius Mới chỉ có các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu loài

này và cũng chỉ nghiên cứu về cây thuốc này mọc ở Trung Quốc Còn ở Việt Nam hoàn toàn chưa có nghiên cứu nào về cây thuốc quí này

Theo sự tra cứu của chúng tôi, từ cây R alceaefolius mọc ở Trung

Quốc, năm 1998 Gan L và các đồng nghiệp đã phân lập được: axit corosolic

(1), axit tormentic (2), niga-inchigoside F1 (3), trachelosperoside E-1 (4) và suavissimoside R1 (5) [7] Năm 2000, Gan L và các đồng nghiệp lại công bố phân lập của alcesefoliside (6), hyperoside (7), vomifoliol (8), β-sitosterol (9), daucosterol (10) và dotriacontyl alcohol (11) [8] Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Cui C - B đã công bố sự phân lập của rubuphenol (12) sanguiin H-2

ethyl ester (13), axit ellagic (14), ethyl gallate (15),

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose (16) và 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose (17)

[6]

Dưới đây chúng tôi dẫn ra cấu trúc của một số hợp chất đã được phân

lập từ loài R alceaefolius

Các hợp chất đã được phân lập từ cây Rubus alceaefolius

HO

O

OH

OH OH

OH HO

O O

HO OH

HO OH OH

12

O O

H O

OH

OH HO O

OH HO HO

O O

O

13

O

O OH OH

O O

HO OH

14

CH2CH3

HO OH OH

15

O GO

OG

OG RO

GO

OH

OH OH C

O

G =

16: R=G; 17: R=H

1.2 Giới thiệu về lớp chất tritecpen [3, 4, 5]

1.2.1 Giới thiệu chung

Tecpen là một lớp hợp chất thiên nhiên mà cấu trúc có thể phân chia thành các đơn vị isopren, chúng có công thức chung là (C5H8)n n  2 Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thành người ta phân loại như sau:

Loại tecpen Khung cacbon Số lượng C Thí dụ

Ngoài ra trong thiên nhiên, người ta gặp một số polime mà phân tử của chúng gồm hàng chục ngàn mắt xích iso-C5 Đó là politecpen, quen thuộc

nhất là cao su thiên nhiên mà mỗi mắt xích iso-C5 có một liên kết đôi đều ở cấu hình cis:

C

CH3

poli - cis - isopren

Dưới đây là một số công thức của Tecpen

CH2

C C H2 CH3

C C

CH2

3 4 5 6 7 8

CH2

Mirxen

1 2 3

5 6 7 8 4

cam chanh

Sabinen Cedren Camphen

Sabinen được tách từ dầu cây Juniperus Sabina, Cedren được tách từ

cây Hoàng đàn, còn Camphen có nhiều trong tinh dầu như long não

Các tritecpen phân bố rộng rãi trong giới thực vật, cho đến những năm

bảy mươi có khoảng 500 hợp chất tritecpen được xác định cấu trúc Một số

tritecpen có tác dụng sinh lý, dược lý như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

viêm và kháng một số dạng ung thư, ngoài ra còn có tác dụng lên hệ thần kinh

trung ương, điều hoà nội tiết, hạ cholesterol máu và chống xơ vữa động mạch

Các dẫn xuất chứa oxi của tritecpen có nhiều và thường ở dạng đa

vòng, dạng 5 vòng sáu cạnh rất hay gặp trong tự nhiên đặc biệt là Fiđelin và

Fidelanol

Sự đóng vòng của squalenoxit trong chuỗi thuyền - ghế - thuyền - ghế

dẫn đến sự hình thành cation cầu nối như hình vẽ sau:

HO

R

Cation biến đổi tiếp tạo thành các hợp chất khác nhau, sau đây là một

số hợp chất tiêu biểu:

axit helvolic Cycloartenol

1.2.2.2 Sự đóng vòng của squalen epoxit trong chuỗi ghế - ghế - ghế -

thuyền

Đóng vòng của squalen epoxit

trong chuỗi ghế - ghế - ghế - thuyền

tạo ra cation có cấu dạng như hình

Từ cation này có thể tạo ra các

tritecpen 4 vòng xuất hiện trong nhựa

dammar là các chất dammarendiol I

hay dammarendiol II (đồng phân

epime ở vị trí C20)

H OH

HO

20

dammarendiol

Sự chuyển vị cation trên tạo ra

Euphol: 20 H; Tirucallol: 20 H

Từ cation trung gian trên các cation khác được hình thành và qua đó tạo ra các tritecpen khác như Taraxerol, Glutinol, Germanicol, Amyrin, Friedelin, Lupeol, Phyllanthol…

Shionon Ebelin Lacton Baccharis oxit

Taraxasterol

HO

H

Lupeol

1.2.2.3 Sự đóng vòng của squalen trong các chuỗi ghế - ghế - ghế - ghế - ghế, ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền, ghế - thuyền - ghế - ghế - thuyền

Đóng vòng của squalen theo cấu dạng ghế - ghế - ghế - ghế - ghế dẫn tới

các cation trung gian từ đó hình thành các diplopten, tetrahymanol và các tritecpen năm vòng

H H

Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen dẫn tới

sự hình thành của morotenol và các hợp chất liên quan qua cation trung gian như hình vẽ sau:

Đóng vòng theo cấu dạng ghế- ghế - ghế - ghế - thuyền của squalen kết

hợp chuyển vị tạo ra các hợp chất như neomotiol và fernen

H

Một đại diện quan trọng cho nhóm các tritecpen dẫn ra từ cấu dạng ghế

- thuyền - ghế - ghế - thuyền là Arborinol

H

Arborinol

1.2.2.4 Sự đóng vòng của squalen một cách đồng thời từ hai đầu

Một nhóm nhỏ tritecpen là sản phẩm của sự oxi hoá đồng thời từ hai đầu của phân tử squalen Các hợp chất tiêu biểu của nhóm này là onocerin và tritecpen 5 vòng thuộc khung serraten với chất đại diện là serratendiol

OH H

H

HO

OH H H

onocerin serratendiol

1.3 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu thực vật, tùy vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất có độ phân cực vừa phải…) mà

ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực

khác nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta

không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải phối hợp một tỉ lệ

nhất định để tạo ra một hệ dung môi mới Tuy nhiên những thành phần tan

trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần

phải được lựa chọn hết sức cẩn thận Nó cần hòa tan những chất chuyển hóa

thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu) không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này

nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có

lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trình

chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl

phtalat, tri-n-butyl-axetynitat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn

với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc khâu bảo quản như các

thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphotphtalat [di-(2-etylhexyl)

phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này làm sai lệch kết quả phân lập

trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính

trong quá trình thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây

Clorofoc, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựa

chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như lá, rễ, thân, củ)

Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng

với một vài hợp chất như các ankanoit tạo ra muối bậc bốn và các sản phẩm

khác tương tự như vậy có một lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra sự

phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Bởi

clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác

khéo léo cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc

Metylen clorit độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ

thấm tốt hơn qua màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ

thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại clorofoc khả năng phân cực thấp hơn có thể rửa giải các chất

nằm ngoài tế bào Các ancol phần lớn là các chất chuyển hóa phân cực cùng

với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thì

các chất này cũng bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong

nước dường như là dung môi tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên thì cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng

metanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ như trechlonolide A thu được từ

Trechonaetes laciniata được chuyển hóa thành trechlonolide B bằng quá

trình metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit và quá trình phân

hủy 1-hidroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythoxy novogranatense được

chiết trong metanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ lá cây

mà thả vào đó là dung dịch nước của metanol

Đietyl ete hiếm khi được sử dụng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc đồng thời nó có xu hướng tạo ra peroit dễ nổ,

peroxit của đietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có

thể tạo thành exetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá

trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được sử dụng đối với quá

trình phân tách đặc trưng, cũng có khi sử dụng các dịch chiết bằng axit, bazơ

có thể tạo ra các sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp

trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp

cho quá trình chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết thành dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt

 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi

nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và

thời gian, thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một khóa ở dưới đáy để

tạo tốc độ chảy cho quá trình rửa tách dung môi, dung môi nóng hoặc

lạnh.Trước kia máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện

nay có thể dùng bằng bình thủy tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương

pháp chiết tách liên tục bởi mẫu được ngâm trong dung môi trong máy chiết

khoảng 24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra Cần lưu ý sau một quá trình

chiết 3 lần dung môi, cặn thu được không còn chứa những chất giá trị nữa

Bởi vì khi chiết các ankaloit ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp

chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc

trưng như Dragendorff và tác nhân Mayer Cũng vậy các flavonoid thường

là những hợp chất màu bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh

dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết Khi chiết các chất béo

nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của các cặn tiếp

theo đó sẽ biểu hiện sự kết thúc quá trình chiết Trong trường hợp các lacton

của sesquitecpen và glicozid trợ tim, phản ứng keđe có thể được sử dụng

biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ

cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể cho biết khi nào

quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để chọn dung

môi thích hợp và lựa chọn quá trình chiết hợp lí nhằm đạt kết quả cao Ngoài

ra có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các hợp chất mà

ta có thể thu một số hợp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí (chromoatography) là một trong những phương

pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc

phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói

riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp thụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc kí gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với các tính

chất của chúng ( tính bị hấp thụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực

khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động

dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này tới lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại

quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha

tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác

yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua

quá trình sắc kí

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa

hai pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự

phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ cua dung dịch

( hoặc với chất khí là áp suất riêng phần ) gọi là định luật hấp phụ đơn phân

tử đẳng nhiệt Langmuir :

n = n bC1+bC



n : lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ : lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ

nào đó

b : hằng số

C : nồng độ của chất bị hấp thụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí pha động là các lưu thể (các chất ở trạng

thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành 2

nhóm lớn:

- Sắc kí khí

- Sắc khí lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc kí người ta chia ra thành các phương pháp

sắc kí chủ yếu sau :

1.4.3.1 Sắc kí cột

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp thụ là pha tĩnh gồm

các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo

YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng

thủy tinh hoặc kim loại nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của

chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng

tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết

càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ

có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường

hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi

không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung

bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất

quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc kí, tỉ lệ giữa

quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf

này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất

hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ

lệ này thấp (từ 1/5- 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào

hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này

trong khoảng 1/20 – 1/30

Trong sắc kí cột việc đưa chất lên cột rất quan trọng, tùy thuộc vào

lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các

phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến nhất

là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách

tinh thì đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột

với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột :

 Cách 1: Nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ được đưa trực

tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành

cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi

chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

 Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung

môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần

vào cột đến khi đủ lượng cần thiết Khi chuẩn bị cột phải lưu ý

không để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng

chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt,

gãy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng tới hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy

quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng tới tiến độ cộng việc

1.4.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc kí cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn

silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh Ngoài ra SKLM còn dùng để điều

chế thu trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng

silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy

sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải

hấp bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát

hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng

cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.5 Ứng dụng một số phương pháp hóa lí để xác định cấu trúc của các

hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các

phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà

người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì

yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp,

để xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất người ta phải dựa vào các

phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương

pháp sắc kí so sánh…

1.5.1 Phổ hồng ngoại ( Infraed Spectroscopy - IR )

Phổ hồng ngoại được xây dựng nhờ vào sự khác nhau về dao động của

các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại

Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó

dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng

trong hợp chất, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong các

nhóm hydroxyl là 3300-3450cm-1, của nhóm cacbonyl C=O là trong khoảng

1700-1750cm-1…

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy - MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion

của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho

các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế

phân mảnh, và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất Hiện nay có

rất nhiều loại phổ khối lượng, sau đây là những phương pháp chủ yếu:

 Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa

vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng

lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV

 Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là

phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn

phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu

là các pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên

kết có mức năng lượng thấp dễ bị phá vỡ

 Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá

nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng

lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh

với độ chính xác cao

 Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp

sắc kí kết hợp với phổ khác như : GC-MS (sắc kí khí – khối phổ),

LC-MS (sắc kí lỏng – khối phổ) Các phương pháp kết hợp này

còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất

(nhất là phân tích thuốc trong nghành dược)

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy - NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp phổ

hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật

phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu

trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và

cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1

H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn

bằng độ chuyển dịch hóa học (chemical shift) Ngoài ra đặc trưng của phân

tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

(spin coupling)

a) Phổ 1 H - NMR: Trong phổ 1H - NMR độ chuyển dịch hóa học

(δ ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm,

tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng

của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin mà ta xác định

được cấu trúc hóa học của hợp chất

b) Phổ 13 C - NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi

nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho

tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C - NMR là ppm, với dải

thang độ rộng 0 - 230ppm

c) Phổ DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation

Transfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon

khác nhau Trên phổ DEPT tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất,

tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 nằm về một

phía trên phổ DEPT 1350.Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín

hiệu phổ của các CH

d) Phổ 2D - NMR : Đây là kĩ thuật phổ hai chiều cho phép xác

định tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai

chiều Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

1.5.4 Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)

Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên

phổ này Trên phổ một là trục phổ 1

H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

1.5.5 Phổ 1 H- 1 H COSY (Homocosy), ( 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton

đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phân tử được nối ghép

với nhau

1.5.6 Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào

các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân

tử được xác định về cấu trúc

1.5.7 Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton

không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong

không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian

của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE

differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử bằng việc đưa vào

một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các

proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ

cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu cộng hưởng với cường độ mạnh hơn

Ngoài ra còn sử dụng phổ X- RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu

trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng tinh thể

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ người ta còn sử

dụng kết hợp với các phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các

phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác Đặc biệt với phân tử nhiều

mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính

xác được chiều dài các mạch Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc

xác định chính xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường

phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh

LC - MS hoặc GC- MS với các đường chuẩn dự kiến