Xác định hàm lượng vitamin c trong nước ép dưa hấu va thrio cam bằng phương pháp vôn ampe

Theo nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phương pháp điện hóa, đặc biệt là phương pháp vôn-ampe cực phổ.. Đây là một trong những phương pháp phân tích

MỞ ĐẦU

VitaminC (Vit.C) hay còn được gọi là axit L-ascobic là một trong

những loại hợp chất phổ biến và có vai trò quan trọng đối với sự sống của con

người

Vit.C đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ

thể người, nó tham gia vào quá trình trao đổi chất, điều tiết quá trình sinh tổng

hợp hoormon, là chất đề kháng cho cơ thể sinh vật, chất chống lão hóa các tế

bào

Nếu thiếu Vit.C có thể gây bệnh Scrobut, biểu hiện ban đầu: mệt mỏi,

đau cơ, xương khớp, chán ăn, da khô ráp, chảy máu chân răng, xuất huyết

dưới da, vết thương chậm liền sẹo, thiếu máu, … Nếu không điều trị kịp thời

sẽ bị phù tiểu cầu, thần kinh bị kích thích, xuất huyết não và chết

Vit.C còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với

vai trò là chất chống oxi hóa Nó giúp cho các sản phẩm giữ được sự tươi

ngon trong quá trình bảo quản Nhiều loại hàng hóa trên thị trường như nước

giải khát, nước ép trái cây đóng hộp, bột dinh dưỡng trẻ em… chứa Vit.C

nhằm duy trì chất lượng sản phẩm

Các loại trái cây tươi như nước ép Dưa hấu là nguồn cung cấp Vit.C tự

nhiên, rât tốt cho sức khỏe Ngoài ra Vit.C cũng được tổng hợp theo con

đường nhân tạo như nước uống đóng hộp (Triocam) đáp ứng nhu cầu cao về

vitamin của cơ thể người cũng như của các ngành công nghiệp có liên quan

Vitamin C có trong hầu hết các loại rau quả tươi, trái cây xanh chua, có

ít trong thịt

Tuy nhiên Vit.C là một chất rất dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ

và ánh sáng bình thường Do đó, việc xác định nó trong các đối tượng trên

một cách chính xác, nhanh chóng là một yêu cầu hàng đầu được đặt ra Ở Việt

Nam, phương pháp xác định hàm lượng Vit.C trong các phòng thí nghiệm chủ

yếu là phương pháp chuẩn độ thể tích, có độ chính xác và độ nhạy không cao

Theo nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các

phương pháp điện hóa, đặc biệt là phương pháp vôn-ampe (cực phổ) Đây là

một trong những phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt được

độ chính xác cao, hơn thế nữa chi phí cho máy móc và hóa chất rất phù hợp

với điều kiện của phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vậy em đã chọn đề tài:

“XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG NƯỚC ÉP DƯA

HẤU VÀ THRIO CAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP VÔN-AMPE”

Nhiệm vụ chính đặt ra:

- Nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp vôn-ampe

(cực phổ) một cách nhanh chóng, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ thực thi

trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

- Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

- Ứng dụng xác định Vit.C trong các đối tượng trên thị trường: các sản

phẩm nước đóng hộp, nước trái cây tươi…

NỘI DUNG

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VITAMIN C

O

CH2OH OH

1 2 3 4 5 6

ascobic, axit izo D-ascobic Trong các đồng phân này chỉ có axit L-ascobic và

axit izo L-ascobic là có tác dụng chữa bệnh, còn các đồng phân D và iso D là

các antivitamin là chất ức chế tác dụng của vitamin Trong thiên nhiên chỉ tồn

tại dạng axit L-ascobic, còn các đồng phân khác chỉ thu được bằng con đường

tổng hợp

Axit ascobic rắn là những tinh thể đơn tà, không màu, không mùi, có vị

chua, nóng chảy ở 193°C Axit asscobic dễ tan trong nước, ít tan hơn trong

rượu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực

Axit ascobic rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ

Vì vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp

O OH

CH2OH

-Axit L- dehidroascobic

Thế khử của nó phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường

Axit ascobic ở dạng khan, khá bền vững, nhưng do trong phân tử có 2

nhóm OH đính vào C chưa no (C2, C3) nên khi bị ẩm ướt hoặc ở trong dung

dịch nó rất dễ bị oxi hóa, ngay cả bởi oxi không khí, nhất là khi có mặt các

ion kim loại: đồng, sắt, magiê… theo phản ứng sau:

O

OH HO

OSản phẩm tạo ra là axit L-đehiđroascobic, chất này cũng có hoạt tính

sinh học tương tự như axit L-ascobic, nhưng không bền, nó dễ bị thủy phân

phá vòng tạo axit 2,3-đixetogulonic CH2OH-(CHOH)2-CO-CO-COOH, là

chất không có tác dụng sinh hóa

Tốc độ oxi hóa axit ascobic thành axit L-đehiđroascobic càng lớn khi

pH càng tăng Các chất saccarozơ, carotenoit, flavonoit,… có khả năng làm

chậm quá trình oxi hóa của axit ascobic nên được dùng làm chất ổn định hóa

Vit.C

Cơ chế sự phân hủy của axit ascobic bởi chất oxi hóa có thể được biểu

diễn theo sơ đồ sau:

O OH

Axit L- ascobic

2H +

2e 2e 2H +

Axit L- dehidroascobic

H2O

COOH

OH HO

OOH [ O] C

CH2OH

HO [ O]

COOH COOH

[ O]

O C

-Có thể thấy, axit ascobic đầu tiên bị oxi hóa thành axit

L-đehiđroascobic Dưới tác dụng của nước, axit L-đehiđroascobic bị thủy phân

mở vòng tạo thành axit 2,3-đixetogulonic không còn hoạt tính vitamin nữa

Phản ứng này không thuận nghịch, tăng nhanh theo pH và nhiệt độ của dung

dịch Tiếp theo, axit 2,3-đixetogulonic bị phân hủy thành một loạt các sản

phẩm trung gian khác, cuối cùng tạo axit oxalic

Ngoài sự phân hủy theo kiểu oxi hóa, axit ascobic còn có xu hướng

phân hủy theo kiểu thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit mạnh thành

fufurol và các sản phẩm khác qua phản ứng decacboxyl hóa và dehydrat hóa

Tương tự như vậy,axit ascobic dễ dàng nhường hiđro cho các peoxit, vì

vậy ngăn không cho các peoxit oxi hóa các hợp chất khác Do đó, người ta sử

dụng axit ascobic làm chất chống oxi hóa trong công nghiệp chế biến

b Tính axit

Trong dung dịch nước axit ascobic là một axit yếu ở nấc 1, pKa,1=4,2

tương ứng với quá trình phân ly H+

của nhóm OH đính vào C3 (*), và rất yếu

ở nấc 2, pKa,2 = 11,6 tương ứng với sự phân li H+ của nhóm OH đính vào C2

(*) Axit ascobic dễ dàng phản ứng với dung dịch bazơ mạnh như NaOH,

KOH, Ca(OH)2 tạo muối

O

OH

CH2OH

H2O NaOH

O

Các muối này dễ tan trong nước hơn axit ascobic nên trong công nghiệp

họ sử dụng dạng muối của axit ascobic làm chất bảo quản các dung dịch nước

Tuy nhiên, khi axit hóa và đun nhẹ thì vòng lacton lại lặp lại

c Tác dụng với axit hữu cơ tạo este

Trong CTCT của axit ascobic có nhiều nhóm OH như nhóm chức rượu,

có khả năng tạo este với các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit béo như axit

panmitic, axit stearic Sản phẩm este dạng 6-O-axyl L-ascobic (ascobyl

panmitat, ascobyl stearat) có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu Những este

này được tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế

biến Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng được sử dụng là:

O

OR HO

O OH

CH2OH

2- O- ankyl axit ascobic

O

OH RO

O

CH2OH OH

3- O- ankyl axit ascobic

O O

OH HO

O O R

5,6- O- ankyliden

O

OH HO

O OH

Trong đó, R là các gốc hiđrocacbon mạch dài, có thể no hoặc không no,

giúp cho các dẫn xuất của axit ascobic dễ tan trong dầu béo hơn

1.1.3 Hoạt tính sinh hóa

Vit.C có tác dụng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các

hiện tượng choáng hoặc ngộ độc hóa chất, độc tính của vi trùng do tính chất

khử mạnh của Vit.C

Vit.C tham gia vào quá trình oxi hóa khử khác nhau của cơ thể như:

Chuyển hóa hợp chất thơm thành phenol; quá trình hyđroxyl hóa triptophan

thành hyđroxyltritophan; điều hòa sự tạo AND từ ARN; chuyển procolagen

thành colagen, nhờ có quá trình hyđroxyl hóa prolin thành oxyprolin cần thiết

cho việc tổng hợp colagen, vì vậy Vit.C làm cho vết thương mau lành

Vit.C có vị trí quan trọng trong quá trình hình thành các hoormon của

tuyến giáp trạng và tuyến trên thận

Khi cơ thể thiếu Vit.C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lí như: chảy

máu ở lợi, răng, lỗ chân lông hoặc các cơ quan nội tạng Đó là do thành các

mạch máu bị mỏng

Cơ thể bình thường có nhu cầu Vit.C trong 24h là: 60÷80 mg

1.1.4 Các nguồn cung cấp Vit.C

Trong tự nhiên, thực vật tổng hợp được Vit.C, do đó Vit.C có nhiều

trong rau xanh đặc biệt là ớt và các loại rau cải, rau ngót….; Trong các loại

quả như: cam, chanh, bưởi, ổi, khế, táo, dưa hấu… không thấy xuất hiện

Vit.C trong các sản phẩm từ động vật như: thịt, trứng, sữa…

Một số cơ thể sống có khả năng tổng hợp vitamin C từ D-glucozo nhờ

tác dụng của enzim theo sơ đồ sau:

OH H

OH H

Axit L- ascobic D- glucozo

Ngoài ra con người tổng hợp Vit.C nhằm các mục đích khác nhau Các

chế phẩm dược chỉ chứa Vit.C, hay các viên vitamin tổng hợp trong đó có

Vit.C dùng mục đích chữa bệnh, tăng cường sức đề kháng cho người ốm Các

loại nước hoa quả, giải khát, bột dinh dưỡng trẻ em, sữa… chứa một lượng

nhỏ Vit.C, là một tiêu trí quảng cáo cho sản phẩm Một lượng lớn Vit.C làm

H H

CH2OH HO

C O

H +

C H

O H

CH2OH

O

O C

CH2OH HO

O H H

C COOH

Có thể chia các phương pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn:

- Nhóm các phương pháp phân tích hóa học

- Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

1.2.1 Phương pháp phân tích hóa học

Trong các phương pháp phân tích hóa học, phương pháp chuẩn độ oxi

hóa khử được sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hóa thành axit

đehiđroascobic của axit ascobic Để oxi hóa người ta sử dụng các thuốc thử

khác nhau như: 2,6-điclophenolindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling…

2,6-điclophenoindophenol được coi như là thuốc thử chuẩn dùng để

chuẩn độ chính xác Vit.C một cách trực tiếp Nó là một chất oxi hóa có màu

xanh đậm, có công thức phân tử là: C12H6Cl2NO2,  max trong dung dịch nước

bằng 602 nm Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất

Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ

từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic

trong môi trường có pH thích hợp Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có

sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên Trong các đối tượng khác

như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất khử khác nữa và

dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn cho việc xác định

điểm cuối chuẩn độ

Thực chất đã xảy ra phản ứng:

5Br BrO3 6H 3Br23H O2

C H O6 8 6 Br2  C H O6 6 6 2 Br  2 H

Khi hết axit ascobic lượng BrO3

cho vào sẽ sinh ra Br2 không được phản ứng tiếp Sau đó xác định lượng Br2 dư đó bằng phương pháp chuẩn độ

iot bằng dung dịch natri thiosunfat chuẩn

Tuy nhiên các phương pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời

có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao Vì vậy từ khi các phương

pháp phân tích công cụ ra đời, người ta khắc phục được rất nhiều nhược điểm

của các phương pháp phân tích hóa học

1.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển như vũ bão trong tất cả các

lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh,

chính xác, quy trình đơn giản, lượng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm

tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội Với sự hỗ trợ của các phương

pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng

đã đạt được những yêu cầu đó Đặc biệt, quy trình phân tích nhanh và đa số

trường hợp không phải xử lí mẫu trước khi giảm thiểu được sự mất mát Vit.C

trong quá trình định lượng

Các phương pháp phân tích công cụ có thể xác định Vit.C gồm nhóm

các phương pháp phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích

điện hóa

Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián

tiếp Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín

hiệu đo quang ở vùng khả kiến,vì vậy người ta thường dùng một tính chất nào

đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến đổi

tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C Hay khi dùng

phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao

nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS

Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách

cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương

pháp phân tích Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc

ký lỏng cao áp (HPLC), kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA)

1.2.2.1 Phương pháp phân tích quang học

Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong

suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản

ứng phát quang, thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C

Các tác giả sử dụng chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián tiếp

xác định hàm lượng Vit.C Kali cromat được sử dụng làm chất oxi hóa axit

ascobic, kali cromat còn dư sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC) có mặt

axit nitric tạo phức màu có λmax = 548nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng kali cromat

dư và tỷ lệ nghịch với lượng Vit.C trong mẫu



Cr(III) tạo ra trong phản ứng thứ nhất là rất nhỏ nên không đóng góp

đáng kể vào mật độ quang A đo ở λmax=548nm Ưu điểm của phương pháp là

sử dụng hóa chất đơn giản, dễ kiếm, máy đo quang không đắt tiền, phổ biến

trong các phòng thí nghiệm

Hơn nữa, theo nghiên cứu thì các chất khác có mặt trong đối tượng

nghiên cứu cùng với Vit.C: các hợp chất glucozo, fructozo, sucrozo, lactozo,

saccarozo: các axit thường xuất hiện trong trái cây như: axit xitric, axit oxalic,

axit malic, axit tactric, các muối natri clorua, caxi clorua … Không gây ảnh

hưởng đến kết quả đo ở mức sai số ± 5% khi hàm lượng của chúng gấp 200

lần lượng axit ascobic

Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được

đường chuẩn tuyến tính hàm lượng Vit.C đến 5µg/ml (tương ứng 5ppm,

khoảng 3.10-5

mol/l) và giới hạn phát hiện tới 0,02 µg/ml (20 ppm, khoảng

10-7 mol/l) Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa

Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt

Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy

các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lượng Vit.C bằng phương pháp phân tích

quang học rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên không tránh khỏi một phần

Vit.C có thể phản ứng với oxi không khí hay các chất khử khác cũng có thể

phản ứng với các chất oxi hóa đó

1.2.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.1 Sơ lược về các phương pháp cực phổ và phương pháp vôn -

ampe

 Nguyên tắc của phương pháp

Nhóm các phương pháp phân tích cực phổ và vôn-ampe là những

phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa

Các phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc

chủ yếu vào việc đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện

cực làm việc và ghi đường vôn-ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường

độ dòng Faraday vào giá trị thế củ điện cực làm việc so với điện cực so sánh)

Hình 1.1: sơ đồ thiết bị phân tích vôn-ampe

 Điện cực làm việc

Trong các phương pháp phân tích vôn-ampe, điện cực làm việc thường

dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc,hoặc cacbon

kính

Phương pháp phân tích cực phổ sử dụng điện giọt Hg, hay dùng là điện

cực giọt treo (HMDE),điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh

(SMDE) Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đường kính khá nhỏ (≤1mm),

được rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10÷15 cm, với đường kính

trong khoảng 30÷50µm, mao quản được nối với bình chứa Hg bằng một ống

dẫn nhỏ polietilen

Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục được hình thành ở đầu ống

mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thước và chu kỳ (hay tốc độ chảy)

của giọt Hg được điều khiển bởi kích thước mao quản và chiều cao của bình

chứa Hg Tốc độ đó được quy ước tính bằng khối lượng Hg rơi ra khỏi mao

quản trong một đơn vị thời gian (theo mg/s) Thông thường người ta chọn

kích thước mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng

1,5÷4,0 mg/s, chu kỳ mỗi giọt khoảng 2÷6s

Trong điện cực giọt treo (thường dùng trong phân tích von-ampe vòng),

giọt Hg có kích thước nhỏ, có thể thay đổi được tùy theo yêu cầu thực

nghiệm Giọt được hình thành rất nhanh và được giữ ở đầu mao quản trong

quá trình đo

Ưu điểm của điện cực giọt Hg:

- Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì

vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa)

trong môi trường axit và đến -2V trong môi trường bazơ Tuy nhiên do có quá

trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ được sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V

(so với điện cực calomen bão hòa) tùy môi trường

- Bề mặt giọt luôn được đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của

phản ứng điện cực

- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van

khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi

phân tích

- Kích thước giọt nhỏ nên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không

đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử

trên điện cực thực tế là không xảy ra

 Điện cực so sánh

Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa

Điện cực so sánh phải có thế ổn định

 Sóng cực phổ khuếch tán

- Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại id tỷ lệ tuyến

tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id=f(C), người ta lợi dụng tính

chất này để phân tích định lượng Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điển có độ phân

giải không cao cũng như có dòng dư lớn Do đó hạn chế độ nhạy của phương

pháp chỉ xác định được 10-5M và khả năng xác định nhiều chất cùng trong

một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém (Hình 1.2)

- Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được

nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều, có thể kể đến

+ Cực phổ sóng vuông (SqW)

+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)

+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)

+ Các phương pháp vôn-ampe trên điện cực đĩa quay

+ Phân tích điện hóa hòa tan

Với độ nhạy đối với

+ Cực phổ cổ điển (DC) 10-4

÷ 10-6M + Cực phổ sóng vuông và xung vi phân 10-6

÷ 10-8M + Vôn-ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10-6 ÷ 10-9M

+ Vôn-ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg 10-8 ÷ 10-10M

trên cực rắn đĩa

Có thể thấy các phương pháp phân tích điện hóa rất phong phú và đa

dạng Phạm vi đối tượng nghiên cứu rộng, cả hợp chất vô cơ và hàng nghìn

hợp chất hữu cơ các loại Trong đó Vit.C là một trong những hợp chất hữu cơ

được nghiên cứu ứng dụng theo nhiều cách khác nhau dưới lý thuyết của các

phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.2 Ứng dụng các phương pháp phân tích điện hóa xác định Vit.C

Phương pháp phân tích điện hóa được dùng chủ yếu là các phương

pháp phân tích cực phổ và phương pháp vôn-ampe Trong đó việc sử dụng

điện cực Hg, đặc biệt là có sự hỗ trợ của thiết bị điện tử, kết nối với máy vi

tính tăng độ nhạy và độ chính xác của phép phân tích lên rất nhiều đồng thời

quy trình cho phép phân tích nhanh, không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh

được sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa không khí

Trước năm 1950, phương pháp cực phổ cổ điển đã được áp dụng xác

định hàm lượng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả Nhiều công trình

nghiên cứu đã tìm được điều kiện thích hợp cho phép xác định Vit.C Tuy

nhiên do giới hạn của phương pháp cực phổ cổ điển mà việc định lượng Vit.C

vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit

ascobic Các hợp chất sunfuhydryl thường có mặt trong các mô thực vật là

một trong số đó Vì vậy đối tượng phân tích còn hạn chế

Gần đây các kỹ thật quét thế và ghi dòng được hỗ trợ bởi các thiết bị

điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở

các phòng thí nghiệm Những nhược điểm đó được khắc phục, nhưng không

nhiều công trình nghiên cứu xác định xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực

giọt Hg mà một số nghiên cứu đi theo hướng chế tạo điện cực biến tính, điện

cực sinh học, chủ yếu là tạo màng sinh học hay màng polyme, các loại màng

được chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic

Khả năng tự động hóa tăng lên, cho phép xác định 120 mẫu/giờ Tuy

nhiên tuổi thọ của các điện cực này ngắn do trong quá trình phân tích axit

ascobic đã khử các ion kim loại trên bề mặt điện cực Để duy trì điện cực

người ta thường cho thêm vào hỗn hợp phản ứng một chất oxi hóa để tái tạo

các ion trên bề mặt, Julio Cesar đã dùng H2O2 là chất oxi hóa giúp tái tạo ion

Cu2+ từ ion Cu+, là sản phẩm của phản ứng điện cực với axit ascobic

Quay trở lại điện cực giọt Hg, ngoài nhược điểm duy nhất là tính độc

của Hg thì nó vẫn là điện cực tối ưu trong phương pháp cực phổ xác định các

chất hữu cơ Tuy nhiên các hãng sản xuất cũng đã khắc phục tối đa nhược

điểm này, kích thước hạt nhỏ (đường kính < 1mm), nếu sử dụng giọt treo thì

khối lượng Hg cho phép đo là không đáng kể, có thể thu hồi được, ví dụ: một

giọt Hg ở thiết bị phân tích điện hóa đa năng VA757 của Metrohm có diện

tích bề mặt từ 0,15 ÷ 0,60 mm2

Thế của axit ascobic trên điện cực Hg, trong điều kiện nền thích hợp

(so với điện cực Calomen bão hòa) cách khá xa thế khử của các ion kim loại

cũng như các vitamin và các hợp chất khác Các vitamin A, D, B1, B2, B6,

B12, Bc đều có sóng cực phổ ở khoảng thế âm, từ -0,3V của vitamin B2

trong nền đệm Britton-Robinson pH =1,81 ÷ -2,01V của vitamin D2 trong

nền H2O:dioxan 1:9, TBAOHO 1M, còn thế của Vit.C là +0,23V trong nền

axetat 0,05M pH=3, NaNO3 0,01M Thêm nữa, dùng kỹ thuật xung vi phân

(DDP), giúp cho việc xác định vị trí và chiều cao pic của Vit.C một cách rõ

ràng và chính xác Điều này có nghĩa là có khả năng xác định trực tiếp Vit.C

trên điện cực giọt Hg mà không cần xử lý mẫu để loại những chất nền ảnh

hưởng đến bản chất hóa học của phương pháp Quy trình nhanh, chính xác,

khả năng phân tích hàng loạt là có thể đạt được Vì vậy em chọn sử dụng điện

cực giọt Hg treo trong phân tích Vit.C

1.2.2.2.3 Phương pháp cực phổ xung vi phân

Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa

hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục

được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp

xung thường

Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một

điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm Ghi dòng tại hai thời

điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung Đường biểu diễn sự khác

nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng pic, rất dễ xác định, có độ

phân giải cao Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư,

một hạn chế của cực phổ cổ điển (hình 1.2)

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

∆E: biên độ xung

Do vậy khi tăng biên độ xung thì theo phương trình (1.4) dòng i tăng

theo (1.6), do đó giảm độ phân giải của phương pháp Trong trường hợp biên

độ xung đủ nhỏ (|∆E| < 20/n mV) thì bán chiều rộng được tính bởi công thức

(1.7)

W1/2 = 3,52.R.T/(n.F) = 90/n mV ở 25oC (1.7)

Vì vậy để đạt được giá trị dòng lớn đồng thời W1/2 đủ nhỏ, thường đặt

biên độ xung khoảng từ 10÷100 mV

Hình 1.2 so sánh sự giống và khác nhau về kỹ thuật biến đổi thế và kỹ

thuật ghi dòng giữa các phương pháp cực phổ cổ điển (DC), cực phổ xung

thường (NP) và cực phổ xung vi phân (DP) Thấy rõ ưu điểm của phương

pháp cực phổ xung vi phân từ việc phân tích sóng cực phổ có dạng pic là tăng

độ nhạy, tăng độ phân giải, độ chọn lọc

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn sự biến thiên thế theo thời gian và dạng sóng

cực phổ trong một số phương pháp

(a) Thế biến thiên trong thời gian đo cực phổ

(b) Thế biến thiên trong 1 chu kì giọt, (▪: thời điểm ghi dòng)

(c) Sóng cực phổ

DC: Cực phổ cổ điển NP: Cực phổ xung thường DP: Cực phổ xung vi phân

Chương 2: THỰC NGHIỆM

2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Dụng cụ

Các dụng cụ thủy tinh: buret, pipet, bình định mức của Đức có độ chính

xác cao được ngâm rửa thường xuyên bằng hỗn hợp kali đicromat và axit

sunfuric đặc 98%

2.1.2 Thiết bị, máy móc

● Máy phân tích điện hóa đa chức năng 757VA Computrace, Metrohm

- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg

- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl

● Axit ascobic (North general pharmaceutical factory China)

● Axit axetic băng

● Natri axetat, natri clorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O

● Axit pecloric, axit oxalic, axit tactric, axit citric

Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA)

Các dung dịch nghiên cứu đều được pha từ lượng cân chính xác hóa

chất chuẩn bằng bình định mức đã được kiểm tra độ chính xác thể tích

2.2 CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu cơ bản

Trong bản khóa luận này, em tập trung nghiên cứu điều kiện tối ưu xác

định Vit.C trên cơ sở thiết bị, máy móc, hóa chất, môi trường phòng thí

nghiệm ở Việt Nam Mục đích là xác định Vit.C trong các đối tượng thực tế

một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả

Bảng 2.1: Chương trình ghi sóng cực phổ của vit.C

Thời gian khuấy sau khi cho mẫu 3s

Thời gian cân bằng trước khi quét thế 10s

2.2.1.1 Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong một số nền

Xét phương trình cho e

của axit ascobic:

O

OH HO

O OH

CH2OH

2H + 2e

-Axit dehidroascobic Axit ascobic

Trong phương trình trên, có sự góp mặt của H+, vì vậy nồng độ H+

ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính cực phổ của axit ascobic Em chọn điều kiện ghi

tín hiệu cực phổ của axit ascobic trong các nền đệm, nhằm duy trì pH ổn định

trong suốt quá trình đo Theo tài liệu nghiên cứu, ba loại đệm hay được dùng

trong phân tích các chất hữu cơ bằng phương pháp cực phổ là đệm xitrat +

hidrophotphat, đệm axetat và đệm photphat Em tiến hành ghi sóng cực phổ

xung vi phân của axit ascobic trong ba nền như trên

Chẩn bị dung dịch nền

 Nền đệm xitrat + hidrophotphat

- Pha dung dịch axit xitric 0,1M (cân 10,500g axit xitric, hòa tan bằng

nước thành 500ml dung dịch)

- Pha dung dịch hidrophotphat 0,2M (cân 22,82g muối K2HPO4.3H2O,

hòa tan bằng nước thành 500ml dung dịch)

- Trộn hai dung dịch trên để được các dung dịch đệm có pH khác nhau

pH V dd Axit xitric 0,1M(ml) V dd hiđrophotphat 0,2M (ml)

- Pha dung dịch CH3COONa 0,2M: cân 8,203g nattri axetat hòa tan

vào nước, định mức thành 500ml dung dịch

- Trộn hai dung dịch theo thể tích

pH V dd axit axetic 0,2M (ml) V dd Natri axetat 0,2M (ml)

Thực nghiệm:

Lấy 10ml dung dịch đệm vào bình đo, đuổi khí oxi hòa tan 300s, đo

đường nền, thêm 0,1ml dung dịch Vit.C 500 mg/l vào bình đo, ghi sóng cực

phổ của Vit.C tương ứng Nhận xét chất lượng pic của Vit.C trong các nền

đệm khác nhau

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan

Đo đường cực phổ của dung dịch chứa Vit.C 2mg/l trong đệm axetat

0,2M, thời gian đuổi khí lần lượt là 3s, 30s, 60s, 90s, 120s, 150s Chọn thời

gian đuổi khí khi pic của Vit.C đã ổn định

2.2.1.3 Khảo sát pH của nền axetat

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến pic của Vit.C em chuẩn bị một

dãy dung dịch đệm axetat 0,1M có pH khác nhau bằng cách trộn hai dung

dịch axit axetic 0,1M và natri axetat 0,1M theo tỷ lệ thể tích (9,5 : 0,5), (8 : 2),

(5 : 5), (2 : 8), (0,5 : 9,5), đo pH của các dung dịch đó trên máy pH meter

Tiến hành ghi đường cực phổ của Vit.C ở ba nồng độ 1, 2, 3 mg/l trong

các nền đã chẩn bị Lặp lại 2 lần, chọn nền axetat có pH thích hợp cho các

phép đo tiếp sau

2.2.1.4 Khảo sát nồng độ nền axetat

Để loại trừ dòng điện chuyển, nồng độ chất điện ly trơ trong dung dịch

phải lớn hơn nồng độ chất nghiên cứu khoảng 50 lần, khoảng nồng độ chất

phân tích đo bằng cực phổ tốt nhất theo tài liệu là 10-5

÷ 10-4M, vậy nồng độ điện ly trơ nên lớn hơn hoặc bằng 0,01M tương đương nồng độ nền axetat

(5:5) là 0,02M Tuy nhiên thực tế nghiên cứu cho thấy cần nồng độ nền lớn

hơn , vì vậy em tiến hành khảo sát pic của Vit.C trong các dung dịch nền có

nồng độ khác nhau như sau:

● Chuẩn bị dung dịch đệm axetat

- Dung dịch đệm axetat 1M (CH3COOH 0,5M; CH3COONa 0,5M):

Cân 20,5075g natri axetat cho vào bình định mức 500 ml, thêm nước cất hai

lần, hòa tan hoàn toàn, thêm 18,75 ml axit axetic băng, định mức đến vạch

- Pha loãng dung dịch đệm axetat 1M bằng nước cất hai lần để được

các dung dịch đệm có nồng độ 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,01M; 0,005M

● Tiến hành đo đường cực phổ của vit.C trong các nền trên ở 3 khoảng

nồng độ 5, 10, 15 mg/l (2,8; 5,6; 8,4.10-5M), đo lặp 2 lần, lấy giá trị trung

bình

Chọn nồng độ nền tối ưu

2.2.1.5 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn iP = f(Cvit.C) theo phương pháp hồi quy tuyến

tính, từ đó chọn được khoảng nồng độ tối ưu, tại đó chiều cao sóng cực phổ

của Vit.C phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nó

Các giá trị cho trong bảng

Bảng 2.2: Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn theo phương pháp

hồi quy tuyến tính

STT xi yi1

yij yik yi xi

k

ji j i

y y

Thay xi vào phương trình (2.2) vừa tìm, được ŷi tính theo lý thuyết

t là thừa số student lý thuyết với độ tin cậy thống kê là 95%, hệ số tự do

f=n(k-1)

Đánh giá tính có có ý nghĩa của hệ số b:

- Nếu t.sb > b thì b là giá trị không có nghĩa, chấp nhận b = 0, tính lại

phương trình đường chuẩn theo dạng y=ax

- Nếu t.sb < b thì b có nghĩa, đúng là b ≠ 0

Đánh giá độ đúng của đường chuẩn:

Pha dung dịch vit.C có nồng độ µX coi như chưa biết, ghi đường cực

phổ, thay giá trị Yj vào phương trình đường chuẩn được nồng độ Xj, lặp lại m

lần, j=1÷m

j j

m

  (2.11)

X

s s

X t

- Nếu t > tb chấp nhận Ha, X ≠ µX, đường chuẩn vừa tìm được không

phù hợp với độ tin cậy 95%

- Nếu t < tb chấp nhận H0, X ≠ µX chỉ do ngẫu nhiên, đường chuẩn vừa

tìm được là phù hợp

Giới hạn phát hiện của phương pháp:

Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích còn có thể

xác định được bằng phương pháp với độ tin cậy thống kê

yDL = y0 + zσo

yDL: tín hiệu tại giới hạn phát hiện

y0: tín hiệu của mẫu trắng

σo: độ lệch chuẩn của tín hiệu đo mẫu trắng

z: hệ số tùy thuộc vào độ tin cậy thống kê

Z=3 đạt được độ tin cậy thống kê là 99,9%

Nếu dùng đường chuẩn y = ax + b thì có thể thay y0= b; zσo = t.s

a

 (2.15)

Em tiến hành xây dựng đường chuẩn tại 9 mức nồng độ (n=9)

- Pha dung dịch Vit.C chuẩn 50 mg/l và 200 mg/l từ dung dịch gốc

- Thực nghiệm: hút 10 ml dung dịch đệm axetat 0,1M (5:5) vào bình

đo, đuổi khí 90s, thêm 3 lần dung dịch Vit.C chuẩn 50 mg/l, mỗi lần thêm

0,1 ml, ghi đường cực phổ, lặp lại 2 lần (k=2)

- Làm tương tự với dung dịch Vit.C chuẩn 200 mg/l và 1000 mg/l

- Xây dựng đường chuẩn qua 9 mức nồng độ: 0,50; 0,98; 1,46; 1,98;

- Hút 10 ml dung dịch đệm axetat 0,1M (5:5) vào bình đo, đuổi khí

90s, thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn vừa pha, ghi đường cực phổ Làm lặp lại 8

lần (m = 8) cho mỗi nồng độ

Sử dụng đường chuẩn tính X1 và X2, so sánh với hai giá trị đã pha µX1,

µX2

Tính giới hạn phát hiện của phương pháp, so sánh với thực nghiệm

2.2.1.6 Khảo sát các chất ảnh hưởng

Em nhận thấy trong thuốc, rau, quả, nước đóng hộp…, ngoài Vit.C còn

chứa một số chất cũng có hoạt tính cực phổ Vì vậy em tiến hành khảo sát

mức độ ảnh hưởng của các chất đó đến pic của Vit.C

Trong các loại nước đóng hộp, các chất có ảnh hưởng chủ yếu là

glucozơ, các loại axit hữu cơ khác như axit xitric, axit oxalic, axit malic, axit

tactric, các muối natri clorua, canxi clorua…

Để xác định tỷ lệ về khối lượng chất cản trở ảnh hưởng đến pic Vit.C

em tiến hành như sau:

 Pha dung dịch chuẩn Vit.C 200 mg/l từ dung dịch gốc 1000 mg/l

 Pha dung dịch axit oxalic nồng độ 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l

 Pha dung dịch axit xitric nồng độ 10; 20; 40; 80; 100 g/l

 Pha dung dịch axit tactric nồng độ 5; 10; 40; 80; 100 g/l

 Pha dung dịch natri clorua nồng độ 0,5; 1; 5; 10; 25 g/l

Lấy 10ml đệm axetat 0,1M (5:5) vào bình đo, đuổi khí trong 90s, thêm

0,1 ml dung dịch Vit.C chuẩn 200 mg/l, ghi đường cực phổ của dung dịch chỉ

chứa Vit.C 2mg/l, sau đó thêm 0,1 ml dung dịch chất ảnh hưởng, ghi đường

cực phổ của Vit.C khi có mặt chất ảnh hưởng với các nồng độ đã pha Xây

dựng đồ thị phụ thuộc độ giảm chiều cao của pic Vit.C khi có mặt các chất

ảnh hưởng (%Ia/I0) theo tỷ lệ nồng độ giữa các chất cản trở (Ca) và Vit.C (C0)

2.2.1.7 Khảo sát độ bền của Vit.C theo thời gian

Vit.C trong dung dịch bị phân hủy theo thời gian, tốc độ của quá trình

này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhiệt độ, ánh sáng, oxi hòa tan, pH, các ion

kim loại lạ trong dung dịch Em tiến hành khảo sát độ bền của Vit.C trong

một số nền dùng để pha mẫu như sau: