Tuyển chọn, tối ưu hoá môi trường và điều kiện nuôi cấy cho chủng ACETOBACTER XYLINIM, chế tạo màng sinh học

Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum trên môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành nên một lớp màng, màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào v

trường đại học sư phạm hà nội ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2, sự giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Khắc Thanh và PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung các thầy cô là những người đã cung cấp cho em những kiến thức, những hướng đi đúng trong quá trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm

ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, cô không chỉ hướng dẫn chỉ bảo em một cách tận tình mà còn cung cấp cho em những tài liệu giá trị để em có hướng đi đúng đắn trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành đề tài Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị trong phòng Vi sinh Khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất, không chỉ về cơ sở vật chất mà còn cả

sự động viên, khuyến khích em hoàn thành đề tài này

Do thời gian nghiên cứu còn hạn chế, đề tài của em không tránh khỏi sai sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để đề tài của

em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2008

Sinh viên thực hiện

Đào Thị Nữ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Tất

cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua sử lí thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt và không trùng với bất cứ tài liệu nào.Trong đề tài của tôi có trích dẫn một số dẫn liệu của một số tác giả khác Tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khoá luận của mình

MỤC LỤC

1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter 6

1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter 10

2.2.3 Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ A.xylinum 30

3.1 Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter từ một số nguồn nguyên liệu 33

3.2 Tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum thuần khiết 34

3.3 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học 38

3.4 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng A.xylinum D 13 41

3.5 Khảo sát sự thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy của D13 45

3.6 Khảo sát khả năng tạo màng của D13 ở các môi trường nuôi cấy

khác nhau 46

3.7 Tối ưu hoá khả năng tạo màng của chủng A.xylinum D 13 48

3.8 Xử lý màng BC và bước đầu dùng màng để đắp lên vết thương

DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU HÌNH

Hình 3.1 Đồ thị diễn hàm lượng axit axetic của một số chủng Acetobacter Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc chủng Acetobacter xylinum D 13.

Hình 3.3 Vòng phân giải CaCO3 của chủng D13.

Hình 3.8 Đồ thị sinh trưởng của chủng D13.

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng axit axetic trong dịch nuôi cấy theo thời gian của chủng D13.

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương ở thỏ

Hình 3.11 Tiến trình lành vết thương ở thỏ

BẢNG

Bảng 1.1 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

Bảng 3.1 Hàm lượng axit axetic của một số chủng Acetobacter

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum

Bảng 3.3 Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào, giá trị OD610 của chủng D13 Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường khác nhau

Bảng 3.5 Các yếu tố và mức khảo sát của chủng D13

Bảng 3.6 Ma trận thực nghiệm của chủng D13

Bảng 3.7 Mô hình thực nghiệm của chủng D13

Bảng 3.8 Lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy của chủng D13

Bảng 3.9 Các yếu tố và mức khảo sát

Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm của chủng D13

Bảng 3.11 Mô hình thực nghiệm của chủng D13

Bảng 3.12 Lược đồ tối ưu hoá môi trường nuôi cấy của chủng D13 Bảng 3.13 Các bước xử lý màng BC

Bảng 3.14 Kết quả theo dõi tình trạng vết thương ở thỏ thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tự nhiên ngoài thực vật có khả năng tổng hợp màng cellulose còn

có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra màng cellulose gọi là màng

sinh học hay Bacterial Cellulose (BC), đặc biệt là các loài Acetobacter điển hình là chủng Acetobacter xylinum Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum trên

môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành nên một lớp

màng, màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn

[1] Do vậy, màng BC vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với

cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hoá lý đặc biệt như: độ

bền cơ học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hoá lớn [12] [13]

Màng BC có nhiều đặc tính hoá lý ưu việt nên nó được xem như là một nguồn polymer sinh học mới và đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất thạch dừa, là nguyên liệu tốt nhất của công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao, làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng, sử dụng như là một nhân tố để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí, làm màng nối mạch máu và màng thẩm tách [11] [17]… Các nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám chắc trên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước lỏng thấm qua nhưng lại cho hơi nước di chuyển, có khả năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế da tạm thời Vì vậy, màng BC được coi là nguyên liệu trong y học dùng để làm da nhân tạo [12]

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hàng ngày Ngoài làm tổn thương da, trường hợp bỏng nặng có thể còn gây rối loạn nội

tạng, để lại di chứng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khoẻ của người bệnh Ở Việt Nam riêng viện bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng 400 ca bỏng Hiện nay, nguời ta đã có nhiều dược phẩm dùng để điều trị bỏng như: Madecassol, Polymethan hay các chế phẩm sinh học như: màng

da ếch, màng ối, da lợn đã được chứng minh là có hiệu quả tốt [7] [8] Nhưng sử dụng các chế phẩm trên đều có hạn chế như: thời gian điều trị dài ngày, chi phí cao, không ngăn được sự xâm nhập của vi khuẩn, gây đau rát khi sử dụng …

Mặt khác đã từ lâu trong lịch sử y học, người ta đã sử dụng dầu mù u vào việc săn sóc bảo vệ da chống lại các tác nhân gây tổn hại, nó có tác dụng mạnh trong điều trị đau dây thần kinh, đau khớp xương; là một thuốc kháng viêm đắp tại chỗ rất có hiệu quả; chỉ định rộng rãi cho các vùng viêm tấy có vết thương; là thuốc đắp tuyệt hảo chữa các vết bỏng do kích thích mô hạt mọc nhanh, tạo một sẹo da mềm mại Dầu mù u được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh về da [18] [19]

Trên cơ sở những nghiên cứu về dầu mù u và màng BC đã có trước đó, với mong muốn tìm hiểu thêm về tác dụng của màng BC - dầu mù u chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn, tối ưu hoá môi trường và điều

kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học”

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter [1]

Từ rất lâu trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm thực tiễn của mình mặc dù họ chưa hiểu rõ được cơ sở của quá trình tạo giấm, càng không thể giải thích được bằng cách nào mà từ rượu loãng lại có thể chuyển thành giấm Cho đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá thì việc giải thích cơ sở của quá trình lên men giấm trở nên đơn giản Ngày nay, chúng ta đã khẳng định được rằng tác nhân của quá trình sản xuất giấm ăn là vi khuẩn

Acetobacter (vi khuẩn axetic, vi khuẩn giấm)

Những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic vào năm 1822

của Person Ông nghiên cứu lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt dịch giấm, sau đó tiến hành phân lập và thu được một loại vi sinh vật tên là Mycoderma

aceti Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm bằng cách loại bỏ hết các vi

sinh vật trong các bình giấm thì giấm sẽ không được tạo thành Ông đã đi đến kết luận: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật Cùng năm

1837, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng giấm 2 loại vi khuẩn giấm thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma

pasteurinanum

Những năm 1862 - 1868, Pasteur với sự trợ giúp đắc lực của kính hiển

vi, ông đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen là hoàn toàn đúng đắn Pasteur nghiên cứu màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn mà ông gọi tên là Mycoderma

aceti

Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên

cứu tiếp theo sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và cải thiện quá trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang đi vào những ứng dụng mới của vi khuẩn

Acetobacter bằng cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu

các đặc điểm cấu tạo sinh lý, sinh hoá nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng, trên cơ sở đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa

ra

1.2 Phân loại Acetobacter [1]

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

Để phân loại Acetobacter, các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây:

- Địa điểm phân lập: có liên quan đến các điều kiện môi trường sống

- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc … đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường thạch Khi nuôi cấy trên môi trường

lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường

đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường vàng

Ngoài các tiêu chuẩn cơ bản ở trên, ngày nay khi định loại Acetobacter

các tác giả còn sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN16S

1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter

Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được thực hiện từ thế kỷ

XIX Năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer (1899), Hansen ( 1911), Heneberg (1926), Janike (1931), Vanghn (1948),

Nergey (1948 - 1957), J.Prateur (1950) Trong đó khóa phân loại của Beijerinck (1899) đã thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả Ông chia vi khuẩn

axetic thành 4 nhóm cơ bản Đến năm 1916, Janke kế tiếp những nghiên cứu của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa trên 2

dấu hiệu sau đây:

Một: khả năng sử dụng đạm amoniac giúp cho các giai đoạn sinh trưởng

của vi khuẩn Acetobacter

Hai: có hay không có giai đoạn di động trong quá trình sinh trưởng và phát triển

Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng của vi khuẩn axetic, năm 1926

Henenberg đã phân loại chúng thành 4 nhóm sau đây:

- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng

- Nhóm 2: vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia

- Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang

- Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh

Đến năm 1934, các nhà nghiên cứu vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả

năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của C và N nên đã xếp vi

khuẩn axetic vào họ Nitrobacteriaceae Từ đó, vi khuẩn axetic có tên là vi khuẩn Acetobacter Đến năm 1936, các tác giả Kenyver,Wanneil, Staniel đã nêu ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonas vì chúng

có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động

Đến năm 1948, theo kết quả nghiên cứu của Vanghn: các vi khuẩn

Acetobacter melanoginum, Acetobacter oxydans đều có khả năng di động

Vanghn lí giải là: các loài trên thuộc cùng một loại có đơn mao ở cực và ông đề

nghị xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae

Cùng năm 1948, Krassilnicov với nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn,

cùng với một số tác giả người Mỹ trong các bài báo của mình đều thống nhất

xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae

Theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và cùng nhiều tác giả khác hiện

nay thì vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter - các vi khuẩn axetic được

xếp vào một họ riêng là Acetobacteriaceae Trong khoá phân loại của Bergeys

đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 loại:

a Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer) đại diện là: Acetobacter aceti

b Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất

- Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy dầy có chứa cellulose đại diện là: Acetobacter xylinum

-Trên môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa

cellulose: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneiiziganus

Loại 2: không oxi hóa axit axetic

* Tạo thành sắc tố nâu trên môi trường glucose

Sắc tố nâu tối tới đen nhạt : Acetobacter melanogenus

Sắc tố hồng : Acetobacter resens

* Không tạo thành sắc tố

Nhiệt độ thích hợp nhất là khoảng 30 - 35 0C : Acetobacter suboxydans

Nhiệt độ thích hợp nhất là 18-21 0C : Acetobacter oxydans

Năm 1960, Silwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy, sinh hoá

của chủng Acetobacter đã đưa ra kết luận: không thể có sự phân loại đồng nhất vi khuẩn Acetobacter

Những nghiên cứu về đặc điểm, về phân loại vi khuẩn Acetobacter này

đã tạo cơ sở cho nhũng nghiên cứu tiếp theo, đồng thời là cơ sở cho việc ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào đời sống thực tiễn ở giai đoạn về sau Hiện nay, người ta đã sử dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa

1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter [1]

Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit axetic Căn cứ vào tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống:

Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter đơn mao

Theo Bergey (1989) và Larpent et al (1990), Acetobacter và

Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn axetic quan trọng nhất của họ

Acetobateriaceae Hai giống vi khuẩn trên gặp rất nhiều trong tự nhiên như ở

trên bề mặt lá cây, hoa quả Cả 2 giống đó đều có khả năng tạo axit axetic từ rượu nhưng trong tế bào Gluconobacter không có chu trình ATC

(tricacboxylic) nên không thể diễn ra quá trình oxi hóa axetat thay vào đó có một số chu trình khác như chu trình Glyoxilat, quá trình photphoril hóa, còn

Acetobacter lại xảy ra các quá trình trên

Khi so sánh 2 giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng Tuy nhiên chúng cũng khác với Pseudomonas

ở những đặc điểm sau: có thể chịu độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa

pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di dộng hơn Một số loài vi khuẩn axetic khi sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu

ngày tế bào dễ bị biến đổi hình thái (kéo dài hay phình to, phân nhánh)[3]

Tế bào vi khuẩn axetic có dạng hình que hay hình elip, đứng độc lập

hay xếp thành chuỗi, kích thước 0,6 - 0,8 m, có thể có tiên mao và có khả

năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram

âm, không sinh bào tử

Bảng 1.1 Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

( So sánh với Pseudomonas )

Vi khuẩn Acetobacter thích hợp với pH = 4,2 – 6,8; nhiệt độ thích hợp 25 -

30 0C, có khả năng oxi hóa rượu etylic thành axit axetic, có quá trình oxi hóa hoàn

toàn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng

1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter [1] [3]

Trên môi trường đặc vi khuẩn axetic phát triển thành các khuẩn lạc tròn đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình khoảng 3 mm, riêng có một số loài

như: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ hơn đường

kính d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc dày hơn và đậm màu hơn các phần xung quanh Nhưng với một số loài khác khuẩn lạc lại lớn hơn (đường kính d = 4 - 5 mm), bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, có thể dùng que cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng Tuy

nhiên cũng có những khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó có thể gạt ra bằng que cấy

1.3.2 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

Sự hình hành màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường dịch rất đa

dạng, trên bề mặt môi trường dịch có thể tạo nên các loại màng có độ dày mỏng khác nhau Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn, khi lắc nhẹ sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành nên lớp màng mới Có loại màng mỏng như các tờ giấy xelofan, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình

và tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu Khi nghiên cứu các màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như các sợi bông, chắc khỏe được đan kết với nhau bởi chính các vi khuẩn

Acetobacter tạo nên độ dẻo dai, tính đàn hồi tốt và độ chắc khỏe của màng

Có những loại màng khác lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn hoặc nhăn nheo, bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường đục có màu vàng nâu, không trong, không có mùi thơm dễ chịu [1] [3]

Từ những quan sát về khuẩn lạc và các loại màng ở trên cũng góp phần

sơ bộ định loại các loài của vi khuẩn Acetobacter

1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter [1] [3] [5]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn Acetobacter có nhu

cầu rất lớn đối với một số chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng Nguồn cacbon

có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic và các axit hữu cơ

Vi khuẩn Acetobacter có thể sử dụng các muối amôn làm nguồn cung cấp

nitơ Các chất kích thích sinh trưởng như: các axit amin (izoloxin, alanin, prolin, valin), -aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantotenic, axit folic, biotin, nicotinamid … đều có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát

triển của vi khuẩn Acetobacter

Một số loài (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter

kiitzingianum …) có khả năng tự tổng hợp các polisaccarit phân tử lớn như:

cellulose, dextran Điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng

hợp được những sợi cellulose giống như những sợi bông

1.3.4 Con đường chuyển hóa cacbon [1] [3][5]

Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa cacbon các tác giả đã đi đến kết luận vi khuẩn axetic có thể oxi hóa cacbon theo những con đường sau:

Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia của các enzim đặc hiệu

Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con đường pentozophôtphát

Con đường thứ ba: Entner –Doudoroff (E.D)

Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxilat

1.3.5 Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter [1]

* Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi dài, kích thước 0,4- 0,8 x 1,0- 1,2 m, không di động, bắt màu Gram âm, bắt màu vàng với thuốc nhuộm iốt Khuẩn lạc to sáng trên nền gelatin, dịch lên men chứa 10% đường saccarozơ, tạo thành màng nhầy nhẵn, không được nâng lên theo thành bình Có thể phát triển ở môi trường có nồng độ rượu cao ( 11%), tích lũy được 6% axit axetic, nhiệt độ thích hợp là 30 0C, môi trường bia thích hợp cho sự phát triển của loài này

* Acetobacter suboxydans

Có dạng hình que ngắn, không có khả năng di động, đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi ngắn, tạo thành những váng mỏng dễ vỡ Có khả năng chuyển hóa glucozơ thành axit gluconic, sobit thành socboza Để phát triển tốt cần được cung cấp paraaminobenzoic, axit pantotenic và axit nicotilic

* Acetobacter hoshigaki

Trực khuẩn có kích thước từ 0,7 - 0,9 x 1,5 - 1,8 m, hay đứng riêng rẽ, không di động Khuẩn lạc trên môi trường nước chiết đậu nành dạng hạt nhỏ, tròn, màu sáng, sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men: tròn, màu trắng sữa về sau chuyển hóa thành màu nâu, phía mép ngoài khuẩn lạc màu vàng nhạt Có thể chuyển hóa axit gluconic từ dextroza, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 - 350C

* Acetobacter orleanense

Trực khuẩn dài vừa phải, không di động, khi gặp nhiệt độ cao có thể sinh

ra các tế bào dị hình: tế bào kéo dài hay phình to hơn Có khả năng phát triển được trên môi trường có nồng độ rượu cao từ 10 - 12% và tích lũy được 9,5% axit axetic, nhiệt độ thích hợp 25 - 30 0C

* Acetobacter plancatum

Trực khuẩn, kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4 - 1,6 m, tế bào có thể tạo thành những dạng phình to, kéo dài, không di động Khuẩn lạc tròn đều, hơi lồi lên, sáng, ẩm ướt, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25 - 30 0C

* Acetobacter ascendens

Trực khuẩn, không di động, khuẩn lạc trên glucozơ, gelatin khô trắng, có vầng sáng chói Trên môi trường lỏng tạo màng dầy, chắc, hướng lên thành bình, nhiệt độ thích hợp là 25 0C

* Acetobacter lindrenii

Trực khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, không di động, một số tế bào phồng to như hình cầu Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men: nhỏ, tròn, màu vàng Ở môi trường lỏng váng màu nâu, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 25 0C

* Acetobacter acetosum

Trực khuẩn, kích thước từ 0,4 - 0,8 x 1 m Các tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành chuỗi, không di động, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 30 - 360C

* Acetobacter schiitzenbachii

Tế bào hình que: 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6 m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành đôi,

có thể tạo thành những tế bào đặc biệt Ở môi trường già có thể tạo thành váng dày, không bền vững, axit axetic tích lũy được trong môi trường khoảng 11,5 %

* Acetobacter xylinum

Trực khuẩn có dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng chuỗi, không di động được Các tế bào được bao bởi chất nhầy, tạo màng nhẵn và khá dai, màng này bắt màu xanh với thuốc nhuộm iốt vì màng có chứa cellulose, tích lũy được khoảng 4,5% axit axetic trong môi trường,

Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong một loại nước

giải khát dân gian làm bằng nước chè đường loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, người Trung Quốc gọi là “Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nấm chè”

* Acetobacter pasteurianum

Có hình dạng tương tự A aceti nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và

nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm I2, tế bào xếp rời nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chùy phồng lên, di động không thường xuyên; khuẩn lạc trên gelatin nhỏ, tròn, nhiệt độ thích hợp để phát triển là

300C

*Acetobacter kiitzingianum

Có màng nhày, nhẵn ở mép và được nâng lên theo thành bình Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động, khuẩn lạc trên gelatin vớt dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm, thích hợp phát triển ở 300C

* Acetobacter orleanense

Trực khuẩn dài, tế bào, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng, có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao

10 - 20 % và tích luỹ 9,5% axit axetic, thưòng đựơc dùng để chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp chậm, thích hợp phát triển ở 25 - 300C

Hầu hết các loài Acetobacter phát triển tốt nhất ở 25 - 300C, đều có khả năng sử dụng muối phôtphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm một số vitamin nhất định, có khả năng oxi hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất là cellulose trên bề mặt môi trường nuôi cấy Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy, lớp màng này

có thể được ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn trong đời sống [7][15] Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng trên rất khác nhau vì vậy cần phải lựa chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất phù hợp với từng ứng dụng để đạt hiệu quả cao trong sản xuất

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguyên liệu chính

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập

ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền

Động vật thử nghiệm: thỏ nhà khỏe mạnh trọng lượng từ 1,4 - 1,6kg 2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, dầu mù u (Thành phẩm mua ở hiệu thuốc Viện bỏng Quốc gia)

2.1.2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) , máy li tâm Sorvall (Mỹ), micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 20l - 10ml, máy so màu UV - vis (Nhật), máy đo pH (MP 200 R - Thụy Sĩ), cân (Precisa XT 320 M - Thụy Sĩ) máy cất nước hai lần (Hamilton - Anh) , kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, la men, đèn cồn… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.1.3 Các loại môi trường

2.1.3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT1) [2] [4]

2.1.3.2 Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) [2] [4]

Glucozơ: 20g (NH4)2SO4:3g

KH2PO4: 2g MgSO4.7H2O: 2g

Pepton: 6g Axit axetic: 2% (Bổ sung sau khử trùng) Nước máy: 1000ml Rượu etylic: 2% (Bổ sung sau khử trùng) 2.1.3.3 Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng [6]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm) theo

phương pháp của Vinogradski [2] [4]

Để có được chủng vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi tiến hành quá trình

phân lập vi khẩn từ các nguồn nguyên liệu: bia, rượu vang, dịch hoa quả theo phương pháp của Vinogradski Trước hết thực hiện quá trình lên men giấm từ các nguồn nguyên liệu trên Vi khuẩn axetic là loài vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lỏng tạo thành một lớp màng dày, dai, màu trắng - màng này là tập hợp các vi khuẩn axetic và màng cellulose, lấy màng

đó đưa vào môi trường số 2 ( môi trường số 2 (MT2) đã được hấp khử trùng ở 1atm, nhiệt độ 1210C, thời gian là 15 phút, để nguội, bổ sung rượu và axit sau khi khử trùng) Sau khi thả màng vào môi trường số 2, giữ trong tủ ấm 28 -

300C trong thời gian 4 - 7 ngày trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn

Acetobacter

Phương pháp pha loãng của Pasteur: Chuẩn bị nước cất 2 lần, dùng 10 ống nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã được sấy khử trùng) cho 9ml nước cất đã chuẩn bị ở trên vào; đưa vào hấp khử trùng ở 1210C, áp lực là 1 atm, thời gian 15 phút (các thao tác làm trong box cấy vô trùng) Lấy mẫu màng từ các nguồn nguyên liệu đưa vào ống nghiệm đã chứa sẵn nước cất thanh trùng, đem vontex đều, lấy pipét vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm này cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút sẽ thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng ở mức 10-1 Tiếp theo, lại hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai vontex đều thu được dịch pha loãng ở mức 10-2 Với các thao tác lặp

lại như trên, ta sẽ thu được dịch pha loãng ở các mức độ: 10-1; 10-2; 10-3; ;

10-10 Mức độ pha loãng quyết định bởi số lượng vi sinh vật, căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7

để tiến hành phân lập trên môi trường thạch đĩa

Phương pháp thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 1210C và 1atm, để nguội, bổ sung rượu và axit; tiếp theo đổ vào hộp petri đã vô trùng,

để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại Dùng pipet vô trùng hút 100l dịch màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4-10-7) nhỏ vào lên trên bề mặt thạch, dùng que trang dàn đều các tế bào vi khuẩn lên trên khắp bề mặt thạch Bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28 - 300C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc) và vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc Dựa trên đặc điểm của khuẩn lạc thu được đối chiếu so sánh với đặc điểm của khuẩn

lạc Acetobacter chọn ra những khuẩn lạc của vi khuẩn axetic để tiến hành các

bước tiếp theo

Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều được làm trong box cấy vô trùng

2.2.1.2 Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng cellulose theo

phương pháp Graxinop [1] [2][4]

Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn: môi trường 1 sau khi vô trùng đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông, đặt nghiêng, để nguội Dùng que cấy đầu tròn (đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào một ống thạch nghiêng theo đường ziczac, với mỗi khuẩn lạc sẽ được mã hoá bằng một ký hiệu riêng Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày, các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy

Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường

oxi hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Cho 1ml nước cất thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi khuẩn đã được hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống được bảo quản trong tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo đường cấy sẽ được sử dụng để kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt các

tế bào ra đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi khuẩn đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng Tiến hành tuyển chọn liên tiếp 3 lần, chúng tôi thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất để dùng cho những nghiên cứu tiếp theo

Để giữ giống cần cấy chuyển giống theo chu kỳ 2 tháng 1 lần

2.2.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum thuần khiết

a) Phương pháp quan sát tế bào [2] [4]

Sau quá trình sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này cần tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học để xác định xem có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm không Quan sát hình dạng tế bào khi nhuộm Gram: phương pháp này gồm các bước sau:

- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4, rửa lại bằng cồn hoặc nước cất và lau khô

- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy lấy một ít màng trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (cách đèn cồn 10 - 15 cm)

- Đặt lên trên vêt bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian, giữ trong 1 - 2 phút

- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho hết thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, rửa bằng nước cất, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong 5 phút

- Rửa tiêu bản bằng nước, cồn ( trong 20 giây), rửa lại bằng nước cất

- Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữ trong 1 - 2 phút

- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên Đưa lên kính quan sát Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram

âm (G-) với vi khuẩn Gram dương (G+).Khả năng bắt màu của G+ và G- khác nhau do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn G+ được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie, có khả năng tạo với tím gentian và lugol một phức chất bền khó bị rửa trôi, nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn G+bắt màu tím của gentiam Trong khi đó những vi khuẩn G-không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên

dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn G- sẽ bắt màu hồng của Fucshin

b) Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter [2][4]

* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic

Như trên đã nói, Acetobacter và Gluconomonas là 2 giống vi khuẩn có

đặc tính hình thái, sinh lý tương tự nhau Vì vậy cần phải sơ tuyển chọn ra

nhũng chủng Acetobacter thuần khiết bằng phương pháp thử khả năng oxi hoá

ethanol thành axit axetic trên môi trường A và B:

Môi trường A: dịch chiết nấm men: 3%; CaCO3: 2%; rượu etylic: 15% - 2ml; agar- agar: 2% Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên môi trường A nếu là

Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thi vòng sáng sẽ rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc

hướng về phía vòng sáng - do vi khuẩn sinh trưởng và phát triến sẽ tạo ra axit axetic - axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo lớp cặn đục thấy rõ

Môi trường B: dịch chiết nấm men: 3%; agar - agar: 2%; rượu etylic: 15% - 2ml, 1ml xanh lục bromocresol 2,2% Khi nuôi cấy vi khuẩn axetic trên

môi trường B nếu là Glucononbacter làm môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng

nhưng có một vành màu xanh lơ do quá trình oxi hoá các axit

* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein làm chỉ thị [2][4]

Cho vào bình  loại 100ml (hay 250 ml): 10ml dịch lên men thêm vào

đó 1 đến 2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Tính số gam axit trong 100 ml dịch lên men

Lưu ý: Khi chuẩn độ cần lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 30 giây là được

Công thức tính: X V.K.1000

10

Trong đó: X: số gam axit trong 1l dung dịch lên men

V: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn 10ml dung dịch lên men

K: lượng axit tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N; K = 0,006 (đối với axit axetic) 10: số ml dịch đem chuẩn độ

* Phát hiện hoạt tính catalase [2] [7][9]

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu được tách

từ dịch, nuôi cấy bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút Nếu thấy hiện tượng sủi

bọt thì chủng đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu không thấy

sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase-)

c) Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn [2] [4]

Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy khác nhau tùy theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo phương pháp pha

loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100l dịch pha loãng, trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C trong 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

Trong đó: N - Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy

2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter

Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn được chủng vi khuẩn

Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai, chắc chế tạo màng sinh học dùng

cho trị bỏng Do vậy chủng vi khuẩn được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu sau:

- Quan sát quá trình hình thành màng đặc điểm tạo thành màng trên môi trường lỏng ( dày, mỏng, nhăn, trơn, có ăn theo thành bình hay không)

- Quan sát đặc điểm của môi trường nuôi cấy các mẫu A.xylinum (đục

hay trong)

- Xác định hàm lượng axit axetic tạo thành của mỗi mẫu

- Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học

- Đối chiếu so sánh đặc điểm giống nhau của các chủng đã phân lập được với các chủng đã biết dựa vào hệ số giống nhau để tuyển chọn các chủng cho màng mỏng

- Nghiên cứu đặc tính sinh lý của chủng đã được chọn

- Kiểm tra tính chịu lực của màng

2.2.1.5.Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn Acetobacter

Bước 1: xác định tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi khuẩn

- Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum cho vào ống

effendorf, đem ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút, bỏ phần dịch giữ lại phần sinh khối

- Cho 1ml nước cất vào phần sinh khối, vontex đều, tiếp tục quay ly tâm ( lặp lại 3 lần)

- Phần cặn còn lại hoà với 1ml nước cất, vontex đều, pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau Ở mỗi độ pha loãng hút 100 l dịch trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi trong tủ ấm, sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi hộp petri Phần dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đem đo OD ở bước sóng 610nm (đối chứng là nước cất - mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần)

- Xây dụng đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào với giá trị OD ở  =

610 nm tương ứng ở các độ pha loãng khác nhau Ta sẽ có được một hàm số tương quan giữa 2 đại lượng này

Bước 2: xác định giá trị OD ở bước sóng 610 nm của dịch nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn để tính ra số lượng tế bào có trong dịch nghiên cứu đó vào các thời điểm nuôi cấy khác nhau

2.2.2 Phương pháp toán học [9][14]

Mục đích của phương pháp qui hoạch hóa toán học thực nghiệm này là xác định thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp, điều kiện nuôi cấy phù

hợp cho quá trình lên men axetic vi khuẩn Acetobacter xylinum để tạo màng

sinh học Sử dụng phương pháp qui hoạch hóa toán học thực nghiệm cho

phép chúng ta nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố đến quá trình lên men cũng như sự tác động qua lại của các yếu tố đó

Thực tế có nhiều phương pháp để tối ưu nhưng người ta hay sử dụng phương pháp Box - Wilson (phương pháp độ dốc) Đó là phương pháp cho phép dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu khi các biến này đồng thời thay đổi cùng một lúc

Phương pháp Box - Wilson gồm hai bước chính:

2.2.2.1 Thiết lập mô hình toán học

Mục đích việc thiết lập mô hình toán học cho phép ta thấy được mối liên

hệ giữa hàm mục tiêu với các biến dưới dạng mặt đồng mức Mặt đồng mức được biểu diễn bằng phương trình hồi qui có dạng:

3 3 2 2 1 1

Phương pháp Box - Wilson chỉ có hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các

hệ số của phương trình đều có nghĩa Nếu hệ số nào không có nghĩa thì cần loại khỏi mô hình

- Để thiết lập mô hình toán học phải tiến hành các bước sau:

Xác định các chỉ tiêu tối ưu

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu

Xác định mức của các biến

Mức 0: là tương ứng với các giá trị 0

i

a bx

2



 a: giới hạn dưới của khoảng xác định

b: giới hạn trên của khoảng xác định

Mức dưới: tương ứng là xi xi

Mức trên: tương ứng với  1 0

i i

x x Xác định khoảng biến thiên của các yếu tố, đó là khoảng bé nhất khi biến số thay đổi một lượng như vậy, thì sẽ dẫn đến sự thay đổi trông thấy của hàm mục tiêu

Ma trận thực nghiệm: số thí nghiệm phải làm (N) để thiết lập mô hình với n yếu tố là: N = 2n với  là số mức

Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu

Mục đích để xem các số liệu có cùng một độ chính xác không, đầu tiên cần tính phương sai:

Trong đó: k: Số lần đo lặp lại của thí nghiệm

y : Số đo trung bình của thí nghiệm j

Yij: Số đo lần thứ i của thí nghiệm

2 j

j 1

max SG

S (GTT = Gtính toán) (4)

Điều kiện để các sai số hội tụ là: GTT < GB (GB: là GBảng) GB tính được bằng cách tra bảng chuẩn Corhran khi biết bậc tự do f1 = k - 1 và f2 = N Tính các hệ số của phương trình hồi qủ Các hệ số hồi qui được xác định:

Tất cả các hệ số trên giúp ta xác định được mức độ ảnh hưởng của các biến lên hàm mục tiêu Dấu của các hệ số cho biết hiệu ứng tác động của các biến tương ứng lên hàm mục tiêu theo chiều hướng nào

Đối với những hệ số quá bé có thể coi là không có nghĩa nên hầu như không ảnh hưởng gì tới hàm mục tiêu và được loại khỏi mô hình

Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số

Các hệ số thu được đánh giá dựa vào tiêu chuẩn Student, các hệ số không có nghĩa thì bị loại khỏi mô hình Hệ số có nghĩa thì yêu cầu phải thỏa mãn bi S tb

Với t: giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết trước N và bậc tự do f = N (k-1)

2 j 2

2 j 2

k.N

2 y

B: là hệ số của phương trình hồi qui

- Thông thường giữa số liệu thực nghiệm và mô hình bao giờ cũng có những sai lệch nhất định, để đánh giá độ sai lệch giữa thực nghiệm và mô hình ta dùng tiêu chuẩn Fisher

- Mô hình chỉ thích ứng khi FTT < FB, trong đó FB tìm được bằng cách tra bảng Fisher khi biết: F1 = n-1; F2 = N (k-1)

- Để tính toán chuẩn Fisher theo mô hình ta phải tính toán giá trị của hàm số theo mô hình đã tìm được và tính phương sai thích ứng theo công thức sau:

2 2

2 TU 2 y

S

;SMin

S

;SMax

( FTT = Ftínhtoán) (11)

Trong đó: 2

y

S được xác định theo (8); FTT < FB (F bảng) 2.2.2.2 Tối ưu hóa

Quá trình tối ưu hóa được thực hiện gồm 2 bước:

Bước 1: Dựa vào phương trình hồi qui ta soạn ra một chương trình gồm một số thí nghiệm với những giá trị thay đổi của các yếu tố xi theo chiều hướng thẳng đứng

Lập ma trận thực nghiệm, ma trận này được xác định từ mức 0 của các biến số Các giá trị tiếp theo của chúng thì dựa vào bước nhảy đã xác định ở trên

Bước 2: Tiến hành thí nghiệm theo ma trận, sau đó rút ra những kết luận

i 1

1x

n (14)

t/2: giá trị thu được từ bảng phân phối Student với (n-1) bậc tự

i 1

XM

n



Trong đó: M: là giá trị trung bình tổng thể

Xi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 đến n

n: số lần thí nghiệm

2.2.3 Phương pháp tạo chế phẩm màng sinh học cellulose từ

2.2.3.1 Công đoạn sinh học

Các chủng A xylinum được bảo quản trong các ống thạch nghiêng cần

được hoạt hoá trở lại trước khi nhân giống các cấp và nuôi cấy tạo màng sinh học

- Nhân giống: nhân giống cấp 1 với mỗi ống thạch nghiêng chứa giống được cho vào bình tam giác chứa sẵn 200 ml dịch lên men, để trong điều kiện nhiệt độ 28 - 300C, cho vi sinh vật phát triển trong 72 giờ Sau đó, tiến hành nhân giống cấp 2 với tỷ lệ nhân giống là 10%, sau 72 giờ lại tiếp tục nhân giống cấp 3 Quá trình nhân giống nhằm đảm bảo có đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men

- Tiến hành lên men: chúng tôi tiến hành quá trình lên men với điều kiện

và môi trường nuôi cấy đã được tối ưu hoá cho sự phát triển tốt nhất của chủng để thu được màng tốt nhất (sử dụng giống cấp 3) Sau 4 ngày lên men chúng tôi thu hoạch màng và chuyển sang công đoạn tiếp theo

2.2.3.2 Công đoạn hoá học

Trong giai đoạn này chúng tôi tiến hành các bước sau:

- Tách sản phẩm: sau 3 - 4 ngày trong dịch lên men đã hình thành lớp màng ở phía trên, tiến hành thu sinh khối, vớt lớp màng ra khởi dịch nuôi cấy bằng đũa thuỷ tinh Trong quá trình vớt màng phải tuyệt đối vô trùng để các

vi sinh vật khác không nhiễm vào dịch lên men, dịch lên men sau khi thu sinh khối có thể bổ xung thêm chất dinh dưỡng để tiếp tục thu sinh khối (các công đoạn đều được làm trong box cấy vô trùng)

- Màng thu được đem rửa bằng nước cất 3 lần

- Xử lý màng bằng dung dịch kiềm loãng NaOH 3% ở 300 trong 30 phút

- Trung hoà màng thu được bằng nước chanh loãng (hoặc HCl 3%)

- Ngâm màng với NaOH 3% ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ

- Trung hoà bằng nước chanh loãng hoặc HCl 3%

- Tiệt trùng màng BC

- Tạo chế phẩm màng sinh học: sau khi qua các công đoạn trên màng BC

sẽ được tẩm các hoạt chất làm tăng khả năng điều trị bỏng là dầu mu u Chế phẩm thu được là màng BC - mù u

2.2.4 Mô hình thử nghiệm tác dụng sinh học của chế phẩm BC mù u

* Mô hình gây vết thương ở thỏ: dùng kéo cắt bỏ miếng da thỏ diện tích 4cm2 ở các vị trí giống nhau

* Phương pháp tiến hành: để xác định khả năng làm vết thương nhanh lành nhất của các chế phẩm sử dụng, chúng tôi tiến hành làm các thí nghiệm

và chia thành các lô sau:

- Lô 1: đắp màng BC - mù u

- Lô 2: đắp gạc y tế có tẩm dầu mù u

- Lô 3: chỉ bôi dầu mù u

- Lô 4: lô đối chứng - để vết thương tự lành

Sau khi đã tạo ra các vết thương dùng màng và gạc đắp lên vết thương, sau 24 giờ thì thay một lần

* Phương pháp đánh giá kết quả: trong quá trình nghiên cứu cần: theo dõi tình trạng vết thương: có nhiễm trùng hay không có bị phù nề hoại tử không, đo diện tích vết thương còn lại theo thời gian, so sánh với diện tích ban đầu