Phân lập, tuyển chọn, và tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng acetobacter xylnum h6, chế tạo màng sinh học

Việc nghiên cứu ra một môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học trên quy mô công nghiệp vẫn đang là hướng nghiên cứu đư

Trường đại học sư phạm hà nội 2

Khoa sinh - ktnn - -

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Bản cam đoan Mục lục 1 Danh mục bảng và hình 3 Đặt vấn đề 5 Nội dung 7 Chương 1 Tổng quan tài liệu 7 1.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter 7

1.2 Phân loại Acetobacter 8

1.2.1.Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn 8

1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter 9

1.3 Đặc điểm chung của Acetobacter 11

1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter 13

1.3.2 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng 13 1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của chủng Acetobacter 14

1.3.4 Con đường chuyển hoá Cacbon 14

1.3.5 Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter 15

1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men axetic 18

1.5 Các yếu tố điều kiện và môi trường ảnh hưởng 19

1.6 Màng sinh học (Bacterial cellulose, Biocellulose – BC) 20

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 22 2.1 Đối tượng – hoá chất 22

2.1.1 Đối tượng 22

2.1.2 Thiết bị - hoá chất 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter 24

2.2.2 Tuyển chọn Acetobacetr cho màng 25

2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter thuần khiết 25

2.2.4 Phân biệt vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram 26

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit 27

2.2.6 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 28

2.2.7 Phương pháp tuyển chọn các chủng 28

2.2.8 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn 29

2.2.9 Phương pháp quy hoạch hoá toán học thực nghiệm 29

2.2.10 Phương pháp tạo vết thương ở thỏ 33

Chương 3 Kết quả và thảo luận 35 3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter 35

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính hình thái 39

3.2.1 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum 39

3.2.2 Khảo sát khả năng tạo axit axetic của vi khuẩn 39

3.2.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng 42

3.2.4 Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A.xylinum 43

3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển A xylinum H6 47

3.4 Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn H6 51

3.4.1 Thiết lập mô hình toán học 52

3.4.2 Tối ưu hoá 56

3.5 Bước đầu dùng màng BC trị bỏng ở thỏ 58

Chương 4 Kết luận và kiến nghị 62 4.1 Kết luận 62

4.2 Kiến nghị 62

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng:

Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter……… 12

Bảng 2.1 Thành phần môi trường……… 23

Bảng 2.2 Cách sử lý màng……… 34

Bảng 3.1 Quan sát thời gian dặc điểm màng tạo thành……… 37

Bảng 3.2 Hàm lượng axit axetic của một số chủng………40

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A xylinum……… 42

Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum………… 43

Bảng 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng của H6……… 45

Bảng 3.6 Tương quan giữa nồng độ pha loãng……… 48

Bảng 3.7 Thời gian nuôi cấy và hàm lượng tế bào……… 49

Bảng 3.8 Các yếu tố và mức khảo sát………53

Bảng 3.9 Ma trận thực nhiệm……….54

Bảng 3.10 Kiểm tra sự thích ứng của mô hình……… 56

Bảng 3.11 Tối ưu hoá môi trường……… 57

Bảng 3.12 Diện tích vết thương còn lại trong thực tế………59

Hình: Hình 1.1 Cơ chế của quá trình oxy hoá rươụ etylic ……… 19

Hình 3.1 Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 1………38

Hình 3.2 Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 3………38

Hình 3.3 Tế bào chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 39

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic ……… 40

Hình 3.5 Vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn Acetobacter xylinum 41

Hình 3.6 Màng mỏng, dịch nuôi cấy đục……… 45

Hình 3.7 Màng mỏng, dịch nuôi cấy trong……… 45

Hình 3.8 Màng BC dày……… 46

Hình 3.9 Màng BC của chủng H6 46

Hình 3.10 Đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào của chủng H6 49

Hình 3.11 Đồ thị sinh trưởng phát triển của chủng H6……… 50

H ình 3.12 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương 59

Hình 3.13 Vết thương sử dụng màng trị bỏng………60

Hình 3.14.Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 9 ngày……… 60

Hình 3.15 Vết thương sử dụng màng BC tẩm dầu mù u sau 15 ngày………61

Hình 3.16 Vết thương không dùng màng BC, bôi dầu mù u sau 15 ngày… 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học (CNSH) không còn là một nghành mới mẻ mà nó đã trở thành một nghành kinh tế chủ đạo trong sự phát triển khoa học kĩ thuật và công nghệ Là một bộ phận của CNSH, công nghệ vi sinh đã và đang ngày càng phát triển mạnh mẽ

và ngày càng có những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật đã tạo ra chế phẩm giúp chúng ta tận dụng và tiết kiệm chi phí trong việc giải quyết nhiều vấn đề ví dụ như trong nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi trường Một trong các chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ lên men vi sinh là vi khuẩn

Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm)

Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng,

trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp một lớp màng trên bề mặt thoáng của dung dịch, màng này có bản chất là cellulose kết hợp với tế bào vi

khuẩn Acetobacter xylium Công thức cellulose do vi khuẩn sản xuất ra cũng

giống như cellulose của tế bào thực vật nhưng nó có một số tính chất ưu việt hơn: độ dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hoá cao…

Nhờ vào một số đặc tính lý hoá vượt trội mà màng BC ngày nay được coi như một nguồn polymer sinh học mới, một nguồn nguyên liệu có tiềm năng Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra thêm một số tính năng đặc biệt của màng như : bám chắc vào bề mặt khi nước bốc hơi lại có thể di chuyyển qua, ngăn cản được sự xâm nhập của vi khuẩn… [7], [8] Nhờ đó mà màng

BC được ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau: công nghệ thực phẩm làm thạch dừa là đồ ăn tráng miệng khá phổ biến, trong công nghệ sản xuất giấy chất lượng cao, trong y học làm màng thay thế cho da tạm thời ở các bệnh nhân bỏng, một loại màng siêu thấm, trong khoa học vật liệu mới

với việc sản xuất micro chất lượng cao, tác dụng trong bảo vệ môi trường do sản xuất ra EM (Effective Micorgamisms) [11]

Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sử dụng màng BC mới chỉ được quan tâm

trong thời gian gần đây và mới thu được những kết quả bước đầu (dùng màng đắp lên vết thương hở, dùng màng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ) [7], [8] Việc nghiên cứu ra một môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho chủng vi

khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học trên quy mô

công nghiệp vẫn đang là hướng nghiên cứu được nhiều tác giả quan tâm

Với mong muốn được tìm hiểu rõ hơn, tìm ra môi trường dinh dưỡng

tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum và những ứng dụng hữu ích của màng BC trên cơ sở kế thừa những kết quả thu được của các tác giả đã

nghiên cứu trước mà tôi quyết định chọn đề tài: “ Phân lập, tuyển chọn và

tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng Acetobacter xylinum H6, chế tạo màng sinh học’’

NỘI DUNG

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter ( vi khuẩn giấm)

Giấm là một sản phẩm rất quen thuộc có từ lâu đời mà cho đến ngày nay vẫn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và đời sống hàng ngày Từ

xa xưa con người đã biết làm giấm dựa vào kinh nghiệm thực tế của mình mà

họ chưa hiểu gì về cơ sở khoa học, càng không giải thích là bằng cách nào rượu loãng có thể biến thành giấm ăn Cho đến đầu thế kỉ XIX, khi khoa học

kĩ thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật dần được khám phá Con người cũng giải thích được cơ chế của quá trình lên men tạo giấm (Vinnnegar) nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay các nhà

khoa học gọi chúng là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic, vi khuẩn

giấm [4], [5]

Năm 1822, Person tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn

Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm Ông

khẳng định đó là một loại vi sinh vật, gọi là Mycoderma aceti [7]

Đến năm 1837, Kiitzing tiếp tục tìm hiểu sau khi loại bỏ hết các vi sinh vật trong chum làm giấm và thấy rằng giấm không được tạo thành Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật nếu không sẽ không diễn ra sự chuyển hoá rượu thành giấm Cũng trong năm

1837, Hansen (người Đan Mạch) đã tách được từ màng giấm hai loại vi khuẩn

thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma pastuerianum

Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur với sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi đã chứng minh được sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing, Hansen

và khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm Ông tiếp tục tiến hành

nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đưa đến kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn mà ông gọi tên là

Mycoderma aceti

Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên

cứu tiếp theo cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm mục đích tìm hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện quá trình lên men giấm Từng bước nghiên

cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập các

chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hoá của chúng để tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng dựa trên cơ

sở là các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra

1.2 Phân loại Acetobacter

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter

Để phân loại vi khuẩn Acetobacter có mốt số tiêu chuẩn phân loại :

+ Đặc điểm phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi trường sống

+ Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng

di động, vỏ nhầy, màu sắc khi tế bào nhuộm Gram…

+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính (trơn, xù xì…), tính chất (đục, trong…), màu sắc…của vết mọc (khuẩn lạc) trên môi trường thạch Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cần lưu ý đến sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm hay không mùi, có màu vàng nâu hay vàng nhạt)

+ Đặc điểm sinh hoá (theo khoá phân loại của Pasteur, 1950)

- Khả năng tạo catalase

- Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như: glyxerol, manitol, sorbitol

- Khả năng oxi hoá axetat thành CO2 và H2O

- Khả năng oxi hoá glucozơ thành axit gluconic

- Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon

- Khả năng tạo sắc tố nâu

- Khả năng tổng hợp cellulose

Ngoài các tiêu chuẩn trên, hiện nay khi phân loại Acetobacter, các tác

giả còn sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN 16S

1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter

Ngay từ thế kỷ XIX, các tác giả đã tiến hành phân lập Acetobacter

thành các chủng thuần khiết và tiến hành phân loại chúng

Trong đó, khóa phân loại của Beijerinck (1899) đã thu hút được sự quan tâm của nhiều tác giả Ông đã chia vi khuẩn axetic thành 4 nhóm cơ bản Năm 1916 kế tiếp nghiên cứu của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa trên 2 dấu hiệu sau:

- Một là: khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh trưởng và phát triển của mình

- Hai là: có hay không giai đoạn di động trong quá trình phát triển Dựa vào nơi sống đặc trưng của vi khuẩn axetic mà năm 1926, Heneberg đã chia chúng thành 4 nhóm khác nhau:

- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng

- Nhóm 2: vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia

- Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang

- Nhóm 4: vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh

Năm 1934, theo các nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của C và N từ đó vi khuẩn

axetic có tên là vi khuẩn Acetobacter

Đến năm 1936, các tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel cùng đề xuất ý

kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng co hiện tượng

ghép cực xoắn ở phần di động

Năm 1948, Vanghn tiếp tục nghiên cứu và công bố kết quả thu được

khi quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti,

Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum, Acetobacter pasteurianum Ông kết luận những loài trên đều thuộc một loại

có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn Acetobacter trong họ

Pseudomonadacae

Cùng năm 1948, Krassilhicov cũng như các tác giả Mỹ nghiên cứu về

xạ khuẩn và vi khuẩn đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ

diện là vi khuẩn Acetobacter aceti

b/ Không sử dụng muối amoni làm nguồn N duy nhất

+ Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose, đại

diện là : Acetobacter xylinum

+ Trên môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose, đại

diện là: Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneiziiganus, Acetobacter

rancens

Loại 2: không có khả năng oxi hoá axit axetic

a/ Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucozơ

- Sắc tố nâu tối tới đen nhạt đại diện là: Acetobacter melanogenus

- Sắc tố hồng, đại diện là: Acetobacter rasens

b/ Không tạo sắc tố

- Nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 350C: Acetobacter suboxydans

- Nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 210C: Acetobacter oxydans

Khoá phân loại của Frateur được nhiều người ủng hộ với 4 nhóm vi khuẩn axetic là:

Acetobacter subosydans

Acetobacter mezoxydans

Acetobacter oxydans

Acetobacter peroxydans

Cho đến nay, khoá phân loại của Bergey và nhiều tác giả khác xếp vi

khuẩn Acetobacter và vi khuẩn Glucobacter thuộc vào một họ riêng tên là:

Acetobacteriaceae

Sau này rất nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu và vẫn còn

nhiều tranh luận khác nhau về sự phân loại đồng nhất vi khuẩn Acetobacter

nhưng tất cả các nghiên cứu trên đều tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng vi khuẩn

Acetobacter vào đời sống thực tiễn

1.3 Đặc điểm chủng của Acetobacter [4], [6], [7], [8]

Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit

axetic Dựa vào đặc điểm và tiêu chuẩn phân loại học mà xếp chúng thuộc 2 giống:

- Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao

- Gluconobacter đơn mao

Bergey (1989), Lapent et al (1990) thì Acetobacter và Gluconobacter là

2 giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae Hai giống này giống rất phổ biến trong tự nhiên như trên bề mặt lá, hoa quả…Chúng đều có

khả năng tạo axetic từ rượu etylic Ở tế bào Gluconobacter không có chu trình

Tricacboxylic (ATC) nên không thể diễn ra quá trình oxi hoá axetat song lại

có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat) Ngược lại, ở tế bào

Acetobacter xảy ra các quá trình trên

Khi so sánh hai giống trên với những vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas thấy chúng có những điểm tương đồng Cũng có một số điểm

mà hai giống trên khác Pseudomonas như: chịu được nồng độ axit cao hơn,

khả năng chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn Một

số loài vi khuẩn axetic khi phát triển trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) hình thái dễ bị biến đổi (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh) [1]

Khi tiếp tục nghiên cứu hai giống với các vi khuẩn thuộc Pseudomonas

để xếp chúng thành các nhóm độc lập và thu được một số kết quả

Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter,

Gluconobacter với Pseudomonas

Đặc điểm so sánh Gluconobacte Acetobacter Pseudomonas

Ghi chú: Dấu (+): có Dấu (-): không Dấu (+/-): có hoặc không

Vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que hay hình elip, đứng

độc lập hay xếp thành chuỗi, kích thước khoảng 0,6 – 0,8 m, có hoặc không

có tiên mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hoá dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm, thích hợp với pH = 5,4 – 6,8,

nhiệt độ 25 – 300C, có khả năng oxi hoá rượu etylic thành axit axetic, khả năng oxi hoá hoàn toàn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng

1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter

Khi nghiên cứu về khuẩn lạc của vi khuẩn axetic trên môi trường đặc, người ta thấy rằng: khuẩn lạc đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình 3mm

riêng 1 số loài như: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ

hơn đường kính d = 1mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên dày

và sẫm màu hơn xung quanh

Nhưng một số loài khác thì khuẩn lạc có đường kính nhỏ hơn (d = 4 -5 mm), bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng như hạt sương nhỏ, có thể dùng que nuôi cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng Tuy nhiên cũng có những khuẩn lạc

ăn sâu vào môi trường, khó có thể gạt ra bằng que nuôi cấy

1.3.2 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter có sự hình thành màng trên

mặt thoáng, màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các loại màng cũng khác nhau

Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn bóng, khi lắc nhẹ sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành 1 lớp màng mới

Có loại màng mỏng như tờ giấy celophen, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình và hình thành nên 1 lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong và có mùi thơm dễ chịu Khi nghiên cứu màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như sợi bông, chắc khoẻ được đan kết với nhau bởi chính các vi khuẩn

Acetobacter tạo nên độ dẻo dai, độ đàn hồi tốt và tính chắc khoẻ của màng

Có những màng lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn mà nhăn nheo, bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường có màu vàng nâu, không trong va không có mùi thơm dễ chịu

Từ những quan sát về đặc điểm của khuẩn lạc và đặc điểm của các loại màng được hình thành nó cũng góp phần sơ bộ về định dạng các loại màng

của vi khuẩn Acetobacter

1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter [1]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi

khuẩn Acetobacter là rất phong phú Nguồn C, N và các chất kích thích sinh

trưởng cung cấp cho quá trình này là hết sức đa dạng: nguồn C có thể cung cấp từ các hợp chất đường: glucozơ, saccarozơ, rượu etylic và axit hữu cơ Muối amon làm nguồn cung cấp N, muối photphat làm nguồn P Ngoài ra, các chất sinh trưởng như: các axit amin (Izoloxin, alanin, prolin, valin), axit nicotinic, axit pantoneic, axit folic, biotin nicotinamid… đều có vai trò quan

trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter

Một số loài vi khuẩn có khả năng tự tổng hợp polysaccarit phân tử lớn

như cellulose, dextran… (Acetobacter xylium, Acetobacter aceti, Acetobacter

kiitzingianum…) Điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng hợp

được những sợi cellulose giống như những sợi bông

1.3.4.Con đường chuyển hoá cacbon

Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa C các tác giả đã đi đến kết luận: vi khuẩn axetic có thể oxi hóa các bon theo những con đường sau:

+ Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia của các enzym đặc hiệu

+ Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong

con đường pentozophotphat

+ Con đường thứ ba: Entner – Doudoroff (ED)

+ Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxinat

1.3.5 Đặc điểm một số loài vi khuẩn Acetobacter

1.3.5.1 Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 – 0,8 x 1 – 1,2 m, không di động được, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iot Khuẩn lạc to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10 % đường saccarozơ tạo thành màng nhầy, nhẵn Chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu cao (11 %) và có thể tích luỹ đến 6 % axit axetic trong môi trường Chúng thường phát triển trên môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 300C

1.3.5.2 Acetobacter xylinum

Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2 m, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, thuộc nhóm vi khuẩn Gram

âm, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày khi gặp H2SO4

và thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của cellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5 % axit axetic trong môi trường

Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng sẽ

hình thành trên bề mặt lớp màng , màng là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [9]

Vi khuẩn Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong

“nấm chè” còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, “hải bảo”, hay “vị bảo” – một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia đình, trên bề mặt

có một váng vi sinh vật được nuôi cấy bằng nước chè đường

1.3.5.3 Acetobacter pasteurianum

Có hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có

dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh của thuốc nhuộm iốt, tế bào xếp dời

nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động không thuờng xuyên Khuẩn lạc trên gelatin nhỏ, tròn Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 300C

1.3.5.4 Acetobacter acetosum

Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0,8 x 1 m Các tế bào xếp riêng rẽ thành từng chuỗi, không di động được Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát triển là 300C – 360C

1.3.5.5 Acetobacter kiitzingianum

Có màng nhày, nhẵn ở mép và được nâng cao lên thành bình Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ, tạo thành màng xếp nếp trên môi trường ẩm Thích hợp phát triển ở 300C

1.3.5.7 Acetobacter lindreni

Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to hình cầu, không di động Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, màu vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt Thích hợp phát triển ở

250C

1.3.5.8 Acetobacter orleanense

Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao

có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to.Tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao

(10 % - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic Thường được dùng để chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay phương pháp Orleans) Thích hợp phát triển ở 250C – 300C

1.3.5.9 Acetobacter suboxydans

Có dạng hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ Có khả năng chuyển hoá glucozơ thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza

- dùng để sản xuất axit ascorbic – vitamin C Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para aminobenzoic, axit pantoneic, axit nicotinic

1.3.5.10 Acetobacter hoshigakii

Trực khuẩn có kích thước 0,7 – 0,9 x 1,5 – 1,8 m, thường xếp riêng rẽ, không di động Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn, dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu vàng nhạt Có khả năng tạo thành axit gluconic Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 300C – 350C

1.3.5.11 Acetobacter ascendens

Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucozơ, genlatin khô trắng với vành sáng chói Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhầy chắc, nâng lên theo thành bình Thích hợp phát triển ở 250C

1.3.5.12 Acetobacter oxydans

Trực khuẩn có kích thước 0,8 – 1,2 x 2,4 – 2,7 m, các tế bào rời nhau hoặc xếp thành chuỗi Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di động Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng Nhiệt độ thích hợp từ 180C – 210C

1.3.5.13 Acetobacter plancatum

Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0.6 x 1,4 – 1,6 m, không di động Khuẩn lạc rượu vang trên gelatin tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt Nhiệt độ thích hợp từ 250C – 300C [4] Hầu hết các loài Acetobacter thường

phát triển tốt nhất ở 250C – 300C, đều có khả năng sử dụng muối phophat, đa

số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit

và trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất cellulose trên bề mặt môi trường nuôi cấy Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này có thể được ứng dụng vào rất nhiều nghành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn trong cuộc sống Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng

1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men axetic

Quá trình lên men axetic là quá trình oxi hoá rượu etylic thành axit

axetic trong môi trường khác nhau dưới tác dụng của Acetobacter

Sự chuyển hoá rượu etylic thành axit axetic bao gồm 2 giai đoạn: + Giai đoạn 1: rượu chuyển hoá thành axetaldehyt

+ Giai đoạn 2: axetaldehyt chuyển hoá thành axit axetic

Quá trình lên men này được mô tả cụ thể như sau:

Hình 1.1 Cơ chế quá trình oxy hoá rượu etylic thành axit axetic 1.5 Các yếu tố điều kiện và môi trường ảnh hưởng đến lên men axetic [4]

Ebner và Hromatka (1949 – 1953) cho rằng: axit axetic được tạo thành

bởi chính tế bào sinh sản Dưới tác dụng của vi khuẩn Acetobacter mà nhờ

quá trình lên men rượu etylic tạo thành axit axetic Bởi vậy các yếu tố như: thành phần môi trường, nhiệt độ, chế độ thông khí…đều ảnh hưởng đến quá trình lên men

Vi khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ thích hợp là

250C – 320C, sống hiếu khí do vậy cần cung cấp một lượng lớn oxi cho quá trình lên men Theo nghiên cứu người ta thấy rằng: để oxi hoá 1 mol rượu cần

sử dụng đến 1 mol O2 nhưng trong thực tế lượng O2 cần phải dùng gấp đôi

Để quá trình lên men tiến hành nhanh hơn trong dịch lên men cần cung cấp thêm một số chất như: rượu etylic, axit axetic, các chất khoáng, các muối (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, CaH2PO4, FeCl3…, vitamin và một số chất kích thích khác như: peptôn, cao nấm men, cao thịt, nước sốt cà chua…

1.6 Màng sinh học (Bacterial cellulose, Biocellulose- BC)

Màng BC có thể được tổng hợp từ nhiều nhóm vi khuẩn như:

Pseudomonas, Azotobacter, Argrobacterium, Acetobacter…nhưng chỉ với vi

khuẩn Acetobacter xylium cellulose mới được tổng hợp mạnh Bản chất của màng BC là sự kết hợp giữa cellulose và tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

Cellulozơ này được hình thành từ rất nhiều sợi nhỏ, các sợi này được kết hợp với nhau dựa trên liên kết hidro và lực vandecvan do vậy các sợi nhỏ liên kết với nhau rất chặt, một phần quy định tính chất của màng BC

So với cellulose của tế bào thực vật thì cellulose có trong BC có cùng công thức hoá học (là một loại polysaccarit cao phân tử, có cấu trúc bền vững, được cấu tạo từ rất nhiều đơn phân là các gốc1,4 glucozit Mỗi cellulose thường chứa khoảng từ 140 – 1000 gốc glucozơ) [12] Tuy nhiên, do quá trình tổng hợp cellulose khác nhau nên chúng có sự khác biệt về tính chất lý hoá như: độ bền cơ học, khả năng polymer hoá, độ tinh sạch…ưu việt hơn hẳn tế bào thực vật Riêng tính đàn hồi và độ bền cơ học của cellulose trong màng

BC đã được so sánh tương đương với nhôm

Nhờ nhưng thuộc tính đặc biệt trên mà màng BC được sử dụng rất nhiều ở các nước phát triển, ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp, nông nghiệp, bảo vệ môi trường, công nghệ vật liệu mới

…và đặc biệt với y học, màng BC ở các nước trên thế giới được nghiên cứu

và ứng dụng trong trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da…

Ở Việt Nam, từ những năm 2000 nhóm nghiên cứu Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự, bộ môn vi sinh, khoa Duợc của Đại học Y Duợc Thành Phố

Hồ Chí Minh đã có một công trình nghiên cứu về màng BC từ Acetobacter

xylium Bước đầu nghiên cứu được một số các tính chất đặc biệt của màng BC

như: khả năng thấm hút tốt, độ thông thoáng cao, có khả năng ngăn cản vi khuẩn xâm nhập…để là cơ sở cho việc chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam Đặc biệt, với những tính chất quý của màng BC đã và đang hứa hẹn những ứng dụng trong y học và công nghiệp mỹ phẩm, được coi là một vật liệu polymer có triển vọng

Chương 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng - hoá chất

2.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết được phân lập

từ màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm như: bia, giấm, dịch hoa quả trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 Từ các chủng phân lập được tuyển chọn các chủng cho màng dai, mỏng, trong

Cân (Precisa XT 320M- Thụy Sĩ)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Máy đo màu UV- vis (Nhật)

Máy đo pH (MP 200 R - Thụy Sĩ)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Buồng cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, lamen, đèn cồn… và một số dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.2.2 Hoá chất

Các loại hoá chất thông dụng: glucozơ, axit axetic, rượu etylic, pepton, cao nấm men, cao thịt, agar – agar, NaOH, MgSO4.7H2O, KH2PO4, (NH4)2SO4, CaCO3, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch fucshin, dung dịch lugol…được mua từ Trung Quốc hoặc sản xuất tại Việt Nam

Nước dừa nguyên chất, nước mía ép nguyên chất, nước dừa, dầu mù u (mua từ viện bỏng Quốc gia)

Chú ý: axit axetic, rượu etylic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường

Trong đó: MT1 là môi trường phân lập vi khuẩn giấm

MT2 là môi trường nhân giống cơ bản

MT3 …MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm) theo phương pháp Vinogradski [1], [2], [3]

Để có được chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi tiến hành phân lập từ

nguồn nguyên liệu là bia hơi Hà Nội, giấm làm theo phương pháp cổ truyền Trước hết cần thực hiện quá trình lên men từ nguồn nguyên liệu trên Vi

khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn hiếu khí sau một thời gian chúng sẽ hình

thành một lớp màng trắng, dai trên môi trường dịch thể, đó chính là tập hợp các tế bào vi khuẩn axetic Từ các mẫu màng trên chúng tôi tiến hành rửa sạch, cho vào ống nghiệm đựng nước cất thanh trùng, lắc đều bằng máy vontex thu được ống nghiệm đựng mẫu màng gốc

Khi phân lập cần pha loãng nồng độ vi sinh vật Chúng tôi sử dụng phương pháp pha loãng Pasteur Ban đầu chuẩn bị 10 ống nghiệm có định mức 10ml, có đậy nút bông và đã sấy khử trùng Đánh số thứ tự và cho vào mỗi ống nghiệm trên 9ml nước cất bằng pipet vô trùng Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm đựng mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông và lắc đều ống nghiệm bằng máy vontex (để vi sinh vật phân bố đều trong ống nghiệm) ta được dung dịch pha loãng ở nồng độ

10-1 Tiếp tục dùng pipet lấy 1ml dung dịch của ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ 2, đậy nút, lắc đều ta thu được dung dịch có nồng độ 10-2 Với các thao tác lặp lại như trên ta sẽ thu được dung dịch pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4 …10-10 Mức độ pha loãng này sẽ phản ánh số lượng vi khuẩn có trong mẫu ống nghiệm Chúng tôi lựa chọn mẫu có độ pha loãng

10-4 đến 10-6 để tiến hành các bước tiếp theo

Phương pháp thạch đĩa: chuẩn bị MT1 đã hấp khử trùng, đổ vào các hộp petri và để nguội Dùng pipet vô trùng hút và nhỏ một giọt dung dịch (có độ pha loãng 10-4 đến 10-6) vào hộp petri dẫ chuẩn bị trên Dùng bàn trang thuỷ

tinh trang một lần khắp mặt thạch Bao gói cẩn thận và cất trong tủ ấm ở 28oC -30oC Sau 3 – 4 ngày trên môi trường thạch có xuất hiện các khuẩn lạc riêng

rẽ Dựa vào đặc điểm của khuẩn lạc như: kích thước, màu sắc, độ trơn bóng

mà ta so sánh, đối chiếu mà chọn ra khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter 2.2.2 Tuyển chọn chủng Acetobacter cho màng cellulose theo phương pháp Graxinop [1], [2], [3]

Trước khi tuyển chọn cần nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách : dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy một khuẩn lạc riêng rẽ, đủ tiêu chuẩn cấy vào một ống nghiệm đã được đổ thạch (MT2 , đặt nghiêng, để nguội) theo đường ziczac Đánh dấu các ống nghiệm bằng một kí hiệu riêng, để trong tủ ấm ở 28oC – 30oC, sau 3 – 4 ngày vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường oxy hoá

(môi trường dich thể - MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Sau 3 lần liên tiếp tuyển chọn chúng tôi thu các chủng có khả năng tạo màng tốt nhất để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kì 2 tháng 1 lần

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết [5]

Sau khi đã có chủng vi khuẩn axetic cho lên men trên môi trường oxy

hoá, tiến hành tuyển chọn chủng Acetobacter thuần khiết dựa trên đối chiếu,

định loại đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường A và môi trường B

Thành phần MTA và MTB như sau:

Môi trường A Môi trường B

1 mg của dung dịch 2,2%

Ở môi trường A: nuôi cấy vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thì vòng sáng rõ

hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc huớng về phía vòng sáng

Ở môi trường B: nuôi cấy vi khuấn axetic nếu là Gluconobacter làm môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi

trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một màu xanh lơ do quá trình oxy hoá axit

2.2.4 Phân biệt vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram [1], [2], [3], [9], [11]

Vi khuẩn Acetobacter là vi khuẩn Gram âm (Gr -) do đó có thể phân biệt chúng bằng phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)

Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản Phương pháp nhuộm Gram bao gồm các bước cụ thể sau:

+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rử sạch HCl hoặc H2SO4, rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô

+ Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng (hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn) hoà vào cùng giọt nước đó, hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để

cố định mẫu (chú ý: mẫu cách ngọn lửa đèn cồn khoảng 10 đến 15 cm là hợp lý)

+ Đặt lên mẫu miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím geltian giũ trong 1 -

+ Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên

Khi đó tuỳ vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuẩn Gr – hay Gr+ Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr -, bắt màu tím là vi khuẩn Gr + Bản chất của hiện tượng bắt màu khác nhau này là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt, chứa muối Nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gential và Lugol một loại phức chất bền, khó bị rửa trôi, khi quan sát tiêu bản trên kính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tím geltian.Vi khuẩn Gr – không

có khả năng bắt màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr - mới bắt màu hồng của Fucshin

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit acetic bằng chuẩn

độ với NaOH 0,1 N có Phenolphtalein làm chỉ thị (phương pháp Therne) [4]

Để xác định lượng axit tạo thành trong quá trình nuôi cấy chúng tôi tiến

hành chuẩn độ bằng NaOH 0,1N có Phenolphtalein Hàm lượng axit axetic

tạo thành được xác định theo công thức:

.10010

V K

Trong đó: X là số gam axetic trong 100ml dung dịch lên men

V là số ml NaOH 0,1N sử dụng K=0,006 là lượng axit axetic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N

10 là số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.2.6 Phương pháp xác định số lượng tế bào [6]

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C trong 2 ngày đếm

số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào

vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

1000 1

100 10 n

Trong đó: N : Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A: Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10-n : Độ pha loãng dịch nuôi cấy

2.2.7 Phương pháp tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng mỏng

Việc tuyển chọn các chủng Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai

phải thông thông qua một số chỉ tiêu sau:

+ Quan sát quá trình hình thành màng: thời gian tạo màng, đặc điểm nuôi cấy…

+ Kích thước và hình dạng tế bào nhuộm Gram

+ Kiểm tra đặc tính sinh hoá của chủng vi khuẩn phân lập

+ Kiểm tra độ dày mỏng và tính chịu lực của màng

2.2.8 Phương pháp xác định sô lượng tế bào vi khuẩn bằng đo mật độ quang (Optical Density - OD) [8]

Để xác định được số lượng tế bào vi khuẩn dựa vào mật độ quang ta phải tiến hành những bước sau :

+ Bước 1: xác định mối tương quan giữa số lượng tế bào (CFU) vi

khuẩn Acetobacter xylinum với giá trị OD

Tạo huyền phù vi khuẩn Acetobacter xylinum : lấy 1ml dịch nuôi cấy

cho vào ependof, tiến hành li tâm (10 000vòng / phút trong thời gian 10 phút), loại bỏ dịch, phần thu được là các tế bào lắng xuống Bổ sung thêm 1ml nước cất vô trùng, vontex đều và tiếp tục li tâm Tiến hành lặp lại 3 lần, phần cặn thu được hoà tan vào 1ml nước cất vô trùng, lắc đều, sản phẩm thu được là

huyền phù vi khuẩn Acetobacter xylinum

Pha loãng huyền phù vi khuẩn theo nhiều nồng độ khác nhau, chúng tôi lựa chọn nồng độ 10 -4 – 10 -7 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo Một phần huyền phù ở nồng độ này chúng tôi đem phân lập ở các hộp petri để đếm số lượng khuẩn lạc Đồng thời, một phần khác đem đo OD bước sóng 610nm (OD610), tiến hành lặp lại 3 lần Sau khi đã đếm được số lượng khuẩn lạc qua phân lập và đo được giá trị OD610, chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa giá trị OD610 với số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với các nồng độ khác nhau

+ Bước 2: Dựa vào đồ thị, đã xác định giá trị OD610 sẽ tính được số lượng tế bào trong dịch nghiên cứu cùng nồng độ ở thời điểm khác nhau 2.2.9 Phương pháp quy họach hoá toán học thực nghiệm (phương pháp Box – Wilson) [4], [8], [9]

Phương pháp Box-Wilson là phương pháp dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu khi các biến số thay đổi cùng một lúc theo ngôn ngữ toán học Phương pháp này cho phép xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy,

thích hợp cho qúa trình lên men axetic, sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter

xylinum đồng thời tạo màng sinh học Phương pháp này gồm 2 bước:

2.2.9.1 Thiết lập mô hình toán học

Thiết lập mô hình toán học cho phép ta thấy được mối liên hệ giữa hàm mục tiêu với các biến dưới dạng mặt đồng mức

Mặt đồng mức được biểu diễn theo phương trình hồi quy:

3 3 2 2 1 1

0 b ~x b ~x b ~x

b

y     (1) Trong đó: bi là các hệ số  i   1 n 

y là hàm mục tiêu

i

x là các biến mã số (kod) Phương pháp Box- Wilson chỉ có hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các

hệ số của phương trình đều có nghĩa, nếu hệ số nào không có nghĩa cần loại khỏi mô hình Để thiết lập mô hình ta có các bước sau:

- Xác định các chỉ tiêu để tối ưu

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu

- Xác định mức của các biến

- Xác định khoảng biến thiên của các yếu tố

- Lập ma trận thực nghiệm

- Tính các hệ số của phương trình hồi quy

Từ số liệu thực nghiệm thu được, ta cần:

*) Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu:

- Tính phương sai:

2 2

1

1 1

y là số lần đo trung bình của thí nghiệm thứ j

ji

y là số lần đo thứ i của thí nghiệm j

- Tính giá trị tính toán G TT: (GTT = Gtính toán)

2 2 1

max j

j j

S G

1

1 N

j j

*) Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số:

Để đưa các hệ số không có nghĩa ra khỏi mô hình cần đánh giá theo tiêu chuẩn Student Hệ số có nghĩa phải thỏa mãn: bi  S tb.

Trong đó: t là giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết N và bậc tự do f = N(k - 1)