Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Khi nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học

trường đại học sư phạm hμ nội 2

khoa sinh - ktnn

-o0o -

nguyễn thị thanh tuyền

tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho

vi khuẩn acetobacter xylinum,

lời cảm ơn

Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài này, em đã nhận

được sự giúp đỡ chỉ bảo tận tình của PGS TS Đinh Thị Kim Nhung cùng các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2, sự giúp đỡ động viên của gia đình và bạn bè Vì vậy em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc vì sự giúp đỡ quý báu đó

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thuỳ Vân và PGS

TS Đinh Thị Kim Nhung đã hướng dẫn em cách tìm những kiến thức, tài liệu

để em có hướng đi đúng đắn trong quá trình nghiên cứu Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, cô

đã chỉ bảo em một cách tận tình giúp em có những tài liệu giá trị và hoàn thành đề tài

Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị trong phòng Vi sinh khoa Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất và tinh thần để em hoàn thành

đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2009

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Thanh Tuyền

K31 B Sinh

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 2

lời cam đoan

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này là kết quả nghiên

cứu của cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên

cứu của các tác giả khác Trong đề tài này tôi có trích dẫn một số dẫn liệu của

một số tác giả khác Tôi xin phép tác giả đ−ợc trích dẫn để bổ sung cho phần

tổng quan tài liệu trong khoá luận của mình

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Thanh Tuyền

K31 B Sinh

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 3

Môc lôc

Trang

Danh môc h×nh vμ b¶ng biÓu

Danh môc tõ viÕt t¾t

1.3.2 §Æc ®iÓm khuÈn l¹c cña vi khuÈn Acetobacter xylinum 8

1.3.3 §Æc ®iÓm mµng cña vi khuÈn Acetobacter trªn m«i tr−êng

láng

8

1.3.6 §Æc ®iÓm cña mét sè loµi Acetobacter quan träng 10

Ch−¬ng 2 VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 14

Ch−¬ng 3 KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 29 3.1 Ph©n lËp vµ tuyÓn chän vi khuÈn axetic tõ mét sè nguån nguyªn

liÖu

29

3.2 TuyÓn chän chñng vi khuÈn Acetobacter thuÇn khiÕt 31

3.3 TuyÓn chän chñng vi khuÈn Acetobacter xylinum t¹o mµng

GVHD: §inh ThÞ Kim Nhung SV : NguyÔn ThÞ Thanh TuyÒn 5

danh mục hình vμ bảng biểu

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

Hình 3.1 ảnh khuẩn lạc vi khuẩn axetic của 3 mẫu phân lập

Hình 3.2 Chuyển hóa rượu etylic thành axit axetic của vi khuẩn axetic

Hình 3.3 Khả năng oxy hóa axetat của vi khuẩn axetic

Hình 3.4 Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter

Hình 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường khác nhau

Hình 3.6 Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mật ong

Bảng 1.1 Phân loại các nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950)

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men

Bảng 3.1 Nguồn gốc, đặc điểm của các chủng vi khuẩn axetic trong mẫu phân lập được

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thành màng cellulose của 8 chủng Acetobacter

Bảng 3.3 Hàm lượng axit axetic hình thành của 8 chủng Acetobacter

Bảng 3.4 Một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào của 4 chủng

Acetobacter

Bảng 3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng Acetobacter

Bảng 3.6 Giá trị OD đo được ở bước sóng 610nm của 4 chủng Acetobacter Bảng 3.7 Động thái sinh trưởng và tổng hợp cellulose của chủng Acetobacter xylinum M5

Bảng 3.8 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trường khác nhau

Bảng 3.9 ảnh hưởng của pH đến hình thành màng BC

Bảng 3.10 ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hình thành màng BC

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 6

Bảng 3.11 ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC

Bảng 3.12 Đánh giá sản phẩm màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dưỡng da Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi hàm lượng axit axetic theo thời gian nuôi cấy của

chủng Acetobacter xylinum M5

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 7

danh môc c¸c tõ viÕt t¾t

BC: Bacterial Cellulose (mµng sinh häc thu ®−îc tõ qu¸ tr×nh lªn men

trªn m«i tr−êng láng cã sù tham gia cña vi khuÈn Acetobacter xylinum)

Mở đầu

1 Lý do chọn đề tài

Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sản sinh ra màng cellulose Khi nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học Bacterial Cellulose (BC)

Cho đến nay, Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có

khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên Loài vi khuẩn gram âm này sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến

hoá nhất của nhóm vi khuẩn tía Mỗi tế bào Acetobacter xylinum có thể

chuyển hoá tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn [17], [34]

Nét cấu trúc quan trọng trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose ở thực vật (PC) ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin hay những thành phần phụ khác, mà được cấu tạo từ những sợi microfibril tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao,

độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn, đường kính sợi nhỏ, khả năng polymer hoá và trạng thái kết tinh lớn [17], [34] Ngoài ra màng BC còn chứa nhiều dưỡng chất, axit hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân huỷ các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác

động của tia UV…

Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC được coi là một nguồn polymer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Trong công nghiệp giấy màng BC được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao [24]; Trong công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC làm màng

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 9

phân tách để xử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998) Ngoài ra màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989) [21], làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protêin hay cho sắc ký [25] Trong công nghệ thực phẩm người ta đã sử dụng vi khuẩn

Acetobacter xylinum nuôi trên môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất

thạch dừa [33] Trong lĩnh vực mỹ phẩm và dược phẩm, lợi dụng những đặc tính quý báu của màng BC như: thông thoáng, kháng khuẩn, tính tương đồng

về cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC được xem là nguyên liệu mới quý giá dùng để làm mặt nạ, da nhân tạo, thay thế da tạm thời

ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC mới được quan tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu Nhu cầu về các loại màng dùng để

đắp vết thương hở, dùng làm mặt nạ dưỡng da trong nước lớn và đều phải nhập ngoại với giá thành cao Trong khi đó, màng BC hoàn toàn có thể sản xuất

trong nước bằng phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum

trong môi trường lỏng Việc nghiên cứu, tuyển chọn màng BC mỏng, nhẵn, dai trong thời gian nuôi cấy ngắn là một đòi hỏi cần thiết cho công nghệ sản xuất màng BC dùng làm mặt nạ dưỡng da

Từ lý do trên chúng tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tìm

điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế

tạo mặt nạ dưỡng da.”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập, tuyển chọn và tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp về thời gian

nuôi cấy, nhiệt độ, độ pH cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng sản xuất màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dưỡng da

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 10

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng Acetobacter xylinum có khả năng hình

thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn từ các nguồn vật liệu: dịch giấm, nước uống lên men, màng BC (từ phòng thí nghiệm CNSH - Vi sinh)

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình hình thành màng BC của chủng tuyển chọn

- Bước đầu xử lý màng BC và thử nghiệm làm mặt nạ dưỡng da

4 ý nghĩa của đề tài

Tuyển chọn được 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng

hình thành màng BC mỏng, dai, bề mặt nhẵn dùng làm mặt nạ dưỡng da từ nguồn nguyên liệu tự nhiên với giá thành thấp

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 11

chương 1 tổng quan tμi liệu

1.1 Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi khuẩn

axetic)

Từ rất lâu trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm thực tiễn của mình song chưa hiểu rõ cơ sở khoa học của quá trình tạo giấm, càng không thể giải thích được vì sao rượu loãng lại có thể chuyển thành giấm Chỉ đến khi khoa học phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá thì vấn đề này mới được sáng tỏ Ngày nay, chúng ta khẳng định được rằng tác nhân của quá trình tạo giấm là

vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn axetic

Công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic là của Person (1822)

Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh

đó là một loài vi sinh vật có tên gọi Mycoderma aceti

Đến năm 1937, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đưa ra kết luận: quá trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn Cùng năm đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ

màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết ông gọi đó là: Mycoderma aceti và Mycoderma pasteuriamum

Từ năm 1862 đến năm 1868, nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi, Pasteur đã chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen là hoàn toàn đúng

đắn Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định:

màng đó được tạo thành từ vi khuẩn Mycoderma aceti

Các nghiên cứu tiếp theo đều nhằm hoàn thiện, làm rõ cơ chế của quá trình lên men giấm và từng bước phân loại vi khuẩn giấm thành các nhóm, loài khác nhau dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hóa và ứng dụng của chúng

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 12

1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

Để phân loại Acetobacter, người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:

- Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống

- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, màu sắc tế bào khi nhuộm gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy…

- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng hợp chất vô cơ và hữu cơ…

- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc… của khuẩn lạc trên môi trường thạch Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không…)

1.2.2 Lược sử phân loại Acetobacter

Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được tiến hành từ thế kỷ

XIX Trong đó có một số khoá phân loại đáng chú ý như sau: khoá phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn axetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:

Một là: Sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình

sinh 2trưởng và phát triển

Hai là: Không có hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển

Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn axetic làm 4 nhóm sau:

Nhóm 1: Vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với

chúng

Nhóm 2: Vi khuẩn sinh trưởng trên bia

Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trên dịch rượu vang

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 13

Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh

Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương

đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ

Nitrobacteriaceae Từ đó vi khuẩn axetic có tên gọi là vi khuẩn Acetobacter

[12]

Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae Mười hai năm sau (năm 1948) Vanghn tiến hành

nghiên cứu khả năng di động của một số loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn

axetic trong họ Pseudomonadaceae

Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi

khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonadaceae

Theo khoá phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi khuẩn

Acetobacter và Gluconobacter - các vi khuẩn axetic được xếp vào họ

Acetobacteriaceae [2]

Dựa vào khả năng oxy hoá axit axetic, Bergey (1914) phân chia các loài

trong Acetobacter thành 2 nhóm:

Nhóm 1: Có khả năng oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O

+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer) như: Acetobacter aceti

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất

- Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy chứa

cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 14

- Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa

cellulose như: Acetobacter xylinum

Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoá axit axetic

+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt

(Acetobacter melanogenus); sắc tố hồng (Acetobacter recens)

+ Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp trong khoảng 30 - 35oC

(Acetobacter suboxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18 - 21oC

- Khả năng oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O

- Khả năng oxy hoá glucose thành axit gluconic

- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu etylic làm

nguồn cacbon (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)

Bảng 1.1 Phân loại các nhóm vi khuẩn axetic theo Frateur (1950)

Có đầy đủ các đặc điểm trên

3 Oxydans

Acetobacter ascendans Acetobacter ransens Acetobacter lovaniens

Không có khả năng tạo các hợp chất xeto từ r−ợu bậc cao

Acetobacter paradoxum

Không có hoạt tính catalase, không oxy hoá glucose thành axit gluconic

1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

1.3.1 Đặc điểm về hình thái

Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axetic

Đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống: vi

khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter đơn

mao

Theo Bergey (1989) và Larpent et al (1990), Acetobacter và Gluconobacter là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất trong họ

Acetobacteriaceae Hai giống này gặp thấy nhiều trong tự nhiên, trên bề mặt

lá cây, hoa quả và đều có khả năng tạo axit từ r−ợu Nh−ng Gluconobacter

không có chu trình tricacboxylic (ATC) nên không có quá trình oxy hoá

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 16

axetat thay vào đó có một số chu trình khác như: chu trình Glyoxylat, quá

trình photphoril hoá, còn Acetobacter lại không xảy ra các quá trình trên

Đem so sánh 2 vi khuẩn trên với những vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng Tuy nhiên chúng khác với Pseudomonas ở những điểm sau: khả năng chịu độ axit cao hơn, khả năng

chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn Một số loài vi khuẩn axetic khi sống trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hoặc thời gian nuôi cấy lâu thì tế bào dễ bị biến đổi hình thái (kéo dài hoặc phình to hay phân nhánh) [18], [19]

Tế bào vi khuẩn axetic có hình que hoặc hình elip, đứng độc lập hay xếp thành chuỗi, kích thước 0,6 - 0,8μm, có thể có tiên mao và có khả năng di

động, sống hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng hữu cơ, nhuộm màu gram âm, không sinh bào tử [12]

Vi khuẩn Acetobacter thích hợp ở pH = 4,4 - 6,8 và nhiệt độ 25 - 30oC,

có khả năng oxy hoá rượu etylic thành axit axetic và có quá trình oxy hoá hoàn toàn các hợp chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay axit hữu cơ tương ứng

1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter

Trên môi trường đặc (thạch đĩa) chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, không màu, đường kính trung bình là 3mm Một số loài như:

Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum, có khuẩn lạc rất nhỏ (đường kính

d=1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh Một số khác có khuẩn lạc lớn (d = 4 - 5mm), bề mặt trơn bóng không màu, mỏng như các hạt sương nhỏ dễ tách khỏi môi trường nuôi cấy, một số khác tạo những khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường khó lấy bằng que cấy [18]

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 17

1.3.3 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

Trên môi trường dịch thể, vi khuẩn axetic sinh trưởng tạo thành những lớp màng BC có độ dày mỏng khác nhau Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, trơn, khi lắc nhẹ chúng sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành lớp màng mới Loại thứ 2 có màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, bám theo thành bình Khi quan sát cấu trúc của màng, người ta thấy rằng có nhiều sợi cellulose giống như sợi bông, chắc khoẻ đuợc đan với nhau bởi chính các tế bào vi khuẩn tạo thành lớp áo bảo vệ cho chúng tránh khỏi tác

động của điều kiện ngoại cảnh [29]

1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter

Vi khuẩn axetic có nhu cầu đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và các chất sinh trưởng rất đa dạng Chúng có thể đồng hoá nhiều loại thức ăn cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccharide, disaccharide, polysaccharide), rượu êtylic, axit hữu cơ nhưng không sử dụng được tinh bột [20], [22]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn axetic cần cung cấp một số axit amin như: valin, alanin, prolin, izolysine Một số chất kích thích sinh trưởng như: axit nicotic, axit folic, biotin [31]

Một số vi khuẩn axetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn như: cellulose, tinh bột, dextran… Người ta ứng dụng đặc tính này trong sản xuất công nghiệp Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose như bông: Acetobacter xylinum, Acetobacter acetigenum, Acetobacter kiitzingianum

1.3.5 Con đường chuyển hoá cacbon

Qua sự nghiên cứu về khả năng chuyển hoá cacbon các tác giả đã đi

đến kết luận: vi khuẩn axetic có khả năng oxy hoá gluxit theo các hướng sau:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 18

Hướng 1: Chuyển hoá gluxit theo con đường hexosemono phosphat

(HMP) hoặc pentose phosphat nhờ sự oxy hoá các cơ chất đã được photphoril hoá [22], [30]

Hướng 2: Theo con đường Entner - Doudoroff (ED) - chỉ gặp trong loài

có khả năng tổng hợp cellulose [23]

Hướng 3: Theo chu trình Kreps (ATC) hoặc glyoxylat [30]

Hướng 4: Sinh trưởng trên môi trường chứa glycerol

Hướng 5: Không có sự photphoril hoá cơ chất do thiếu enzyme

phosphofructokinase do đó không tồn tại con đường glycolysis [17]

1.3.6 Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter quan trọng

1.3.6.1 Acetobacter aceti (Pasteur, 1864; Beijerinck, 1898)

Trực khuẩn ngắn dạng hình que, kích thước 0,4 - 0,8μm x 1,0 - 1,2μm, không di động, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu gram âm, bắt màu vàng với thuốc nhuộm iôt Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên môi trường geletin Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 34oC, nếu nhiệt độ cao quá 43oC thì sẽ gây hiện tượng co tế bào Giống này có thể phát triển trong nồng độ rượu cao (11%) và tích luỹ tới 6% axit axetic Môi trường bia thích hợp cho sự phát triển của loài này [31] Tỷ lệ % (G + C) của ADN là 56,2 - 57,2% [22]

1.3.6.2 Acetobacter pasteurinum (Hansen, 1879; Beijerinck, 1916)

Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống với Acetobacter aceti, bắt màu

xanh với thuốc nhuộm iôt Tạo váng khô và nhăn nheo Tế bào xếp rời nhau thành chuỗi, đôi khi có dạng chuỳ phồng lên Nhiệt độ thích hợp khoảng 30oC,

chịu độ cồn thấp hơn Acetobacter aceti Trong điều kiện thuận lợi chúng có

thể tạo 5 - 6% axit axetic [30] Tỷ lệ % (G + C) của ADN là 51,8 - 53% [22]

1.3.6.3 Acetobacter orleanense (Henneberg, 1906)

Hình thái của vi khuẩn này giống 2 vi khuẩn trên, hình que nhỏ, hai đầu hơi nhọn, hình thành màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy Tế bào bắt màu vàng khi nhuộm iôt Giống này có thể sống được trong môi trường chứa

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 19

10 - 12% rượu và tích luỹ được 9,5% axit axetic, thường dùng chúng để chuyển hoá rượu vang thành giấm Sinh trưởng ở nhiệt độ 25- 30oC [12] Tỉ lệ

% (G+C) của AND từ 56,8- 58,7% [22]

1.3.6.4 Acetobacterschiitzenbachii

Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 0,3- 0,4μm x 1,0- 3,6 μm Nó

có thể tạo váng dày và không bền trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tích luỹ 11,5- 12% axit axetic trong dịch nuôi cấy, thường được dùng trong sản xuất axit axetic theo phương pháp chìm [13]

1.3.6.5 Acetobacter suboxydans

Hình que ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi ngắn, không

có khả năng di động, tạo váng mỏng dễ tan Nó có thể chuyển hoá glucose thành axit gluconic, sobit thành socbose, chịu được nồng độ cồn cao và tích luỹ đến 13% axit axetic Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 28 - 30oC Thời gian lên men ngắn khoảng 48 giờ, nhu cầu oxy rất ngặt nghèo chỉ cần ngừng

10 - 20 giây thì 1/3 tế bào sẽ chết [13]

1.3.6.6 Acetobacter hoshigaki

Trực khuẩn hình que, kích thước 0,7 - 0,9μm x 1,5 - 1,8μm, thường

đứng riêng lẻ không di chuyển Trên môi trường thạch đậu tương: khuẩn lạc nhỏ, tròn, dạng hạt sáng, sau đó trở thành màu nâu Trên môi trường thạch với dịnh lên men: khuẩn lạc tròn màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu vàng nhạt Chúng có khả năng chuyển hoá dextran thành axit gluconic Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 35oC [12]

1.3.6.7 Acetobacter curiculum

Có đặc điểm tương tự Acetobacter schiitzenbachii Trong môi trường

lên men thuận lợi, chúng có thể tạo 10 - 12% axit axetic, tạo váng chắc trên bề mặt môi trường Nhiệt độ lên men tối ưu từ 35 - 37oC [13]

1.3.6.8 Acetobacter plancatum

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 20

Trực khuẩn ngắn, kích thước từ 0,4 - 0,6μm x 1,4 - 1,6μm Trong khoảng nhiệt độ từ 28- 32oC chúng tạo thành những tế bào phình to, kéo dài, không di động Trên môi trường gelatin, rượu vang tạo thành khuẩn lạc tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25 - 30oC [13]

1.3.6.9 Acetobacter ascendens

Trực khuẩn không di động, trên môi trường thạch glucose, gelatin tạo thành những khuẩn lạc khô, trắng với màu sáng chói Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhầy, dày, hướng lên theo thành bình Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 25oC [12]

1.3.6.10 Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm,

đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động Chúng tích luỹ khoảng 4,5% axit axetic, khi nồng độ axit axetic trong môi trường quá cao nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 21

Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí

bắt buộc, không sinh bào tử Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất [17], [19]

Theo Bergey, pH tối ưu cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là từ 5,4- 6,2,

nhiệt độ thích hợp là từ 25 - 30oC Nghiên cứu của Maccormick và cs (1996)

cho thấy Acetobacter xylinum có thể sinh trưởng được ở nhiệt độ 12 - 35oC,

pH = 3 - 8, trong đó pH tối ưu là 6 [20], [22]

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành

khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường [20]

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose Màng này được hình thành từ tập hợp các sợi microfibril [17] Nó bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn có chức năng bảo vệ khỏi tác động bên ngoài môi trường Khi nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng lâu ngày hoặc môi trường bất lợi chúng có thể bị biến đổi hình dạng như: căng phồng, thon dài dạng sợi nhỏ, không có

khả năng hình thành màng BC Dưới điều kiện nuôi cấy thích hợp (đặc biệt có

bổ sung 2% rượu etylic vào môi trường), chúng có khả năng khôi phục lại

hình dạng ban đầu và tổng hợp cellulose [17]

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 22

chương 2 vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu và thiết bị

2.1.1 Vi sinh vật

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập, nghiên cứu khả năng hình thành màng BC của các chủng vi khuẩn axetic từ các nguồn sau: mẫu màng giấm từ kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Đặng Thị Hồng 2007 [7], giấm

làm theo phương pháp thủ công, nước uống lên men (kombucha)

Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichial coli (nhận được từ phòng Công nghệ sinh học - Vi sinh - Trường ĐHSP Hà Nội)

Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn được có khả năng hình thành màng BC

Đối tượng thử nghiệm: bước đầu thử nghiệm trên da người

2.1.2 Máy móc thiết bị

Nồi hấp khử trùng (Tomy, Nhật); tủ ấm vi sinh (Haraeus, Đức); tủ sấy (Haraeus, Đức); Box cấy vô trùng (Haraeus, Đức); cân điện tử (Precisa XT 320M, Thuỵ Sỹ); micropipet loại 20μl- 10ml (Gilson, Pháp); máy đo pH (Hana, Bồ Đào Nha); tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu (Tawashi, Nhật); máy li tâm (Haraeus, Đức); kính hiển vi quang học (Olympus CX41, Nhật); máy đo quang phổ tử ngoại UV mini 1240; các dụng cụ thông dụng khác

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 23

2.1.3 Hoá chất

Nguồn cung cấp cacbon: rượu etylic, glucose, glycerol, sacrose,

manitol, lactose, axit axetic

Nguồn cung cấp nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4

Nguồn cung cấp muối khoáng: KH2PO4, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4

Nguồn cung cấp nhân tố sinh trưởng: cao nấm men, cao ngô

Thuốc thử: dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromphenol

Thuốc nhuộm: tím gentian, fucshin, lugon

2.1.4 Môi trường

2.1.4.1 Môi trường phân lập vi khuẩn (Môi trường GCP) (g/l)

Glucose: 20 g CaCO3: 10 g Thạch aga: 20 g

Cao nấm men: 5 g KH2PO4: 2 g Pepton: 5 g

pH= 5,5- 6,0 H2O: 1000ml

Axit xitric monohydrate: 0,115 g

2.1.4.2 Môi trường giữ giống (g/l)

Glucose: 20g (NH4)2SO4: 2g Cao nấm men: 5g Thạch aga: 20g Pepton : 5g KH2PO4: 2,7g

H2O: 1000ml Axit xitric monohydrate: 1,15g

2.1.4.3 Môi trường nhân giống vi sinh vật nghiên cứu (g/l)

(NH4)2SO4: 2g Glucose: 20g KH2PO4: 2,7g

Cao nấm men: 5 g pH= 5,5- 6,0 Pepton: 5g

Axit axetic: 2% Nước dừa: 1000ml

2.1.4.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định

Cao thịt: 5g Pepton: 5g Nước: 1000ml

NaCl: 5g Thạch aga: 20g

2.1.4.5 Môi trường lên men

Chúng tôi đã sử dụng một số môi trường có thành phần theo bảng sau:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 24

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men

Nguồn vật liệu: giấm làm theo phương pháp cổ truyền sau 10 ngày tạo

thành một lớp màng màu trắng trên bề mặt dịch nuôi cấy Nước uống lên men

từ trà xanh sau 12 ngày nuôi cấy tạo thành lớp màng mỏng Mẫu màng giấm

của thạc sỹ Đặng Thị Hồng

Từ 3 mẫu màng ở trên chúng tôi đem rửa bằng nước cất loại bỏ phần

nước dư, sau đó tiến hành thử phản ứng của màng với axit sunfuric 60% và

dung dịch lugon trong ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng, lắc đều bằng

máy vôntex trong 10 phút thu được các ống nghiệm chứa mẫu màng gốc

Tiến hành phân lập: lấy một chút màng đã được rửa cho vào ống

nghiệm chứa nước cất thanh trùng rồi lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 25

thu được các ống nghiệm chứa mẫu màng gốc Thực hiện dãy nhiều nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp để đạt được nồng độ pha loãng thích hợp (10-1-10-8) Dùng pipet lấy 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-1 - 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, gạt đều bằng que trang vô trùng Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng Để các hộp petri ở nhiệt độ thích hợp (28- 30oC) Đếm số khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 sau 5 - 7 ngày nuôi cấy Sau khi đếm khuẩn lạc, dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (kích thước, màu sắc, vòng phân giải CaCO3), tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, làm sạch và tiến hành nuôi cấy trên môi trường giữ giống ở 28 - 30oC Sau 4 ngày ống giống chuyển sang bảo quản trong tủ 4oC Để tiện lợi cho tuyển chọn, chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc trên là một mẫu vi khuẩn

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

2.2.1.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp cho phép đếm số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Đây là phương pháp tốt nhất để xác định số lượng tế bào trong mẫu, độ nhậy cao, định lượng vi sinh vật ở nồng độ thấp, nhưng khả năng sai số lớn cần phải lặp lại nhiều lần trên một độ pha loãng

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy khác nhau tùy theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo phương pháp pha loãng Pasteur, dùng micropipet hút 0,1ml dịch pha loãng, nhỏ lên bề mặt môi trường thạch đĩa rồi trang đều Nuôi ở 30oC trong 5 ngày rồi tiến hành đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban dầu theo công thức:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 26

N: tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu

Ai: số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải CaCO3 trên đĩa phân lập

có độ pha loãng 10-n

Vi: thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập

10-n: độ pha loãng của mẫu phân lập

2.2.1.2.2 Phương pháp đo độ đục

Bước 1: Xác định tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum với giá trị OD ở bước sóng 610 nm

- Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum cho vào ống

eppendof, đem ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút, bỏ phần dịch giữ lại phần sinh khối

- Cho 1ml nước cất vào phần sinh khối, vôntex đều, tiếp tục quay li tâm (lặp lại 3 lần)

- Phần cặn còn lại hoà với 1ml nước cất, vôntex đều, pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau Với mỗi độ pha loãng hút 100μl dịch trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi trong tủ ấm, sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi hộp petri Phần dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đem đo OD ở bước sóng 610 nm (đối chứng là nước cất, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần)

- Xây dựng đồ thị tương quan giữa số lượng tế bào với giá trị OD ở bước sóng 610 nm tương ứng ở các độ pha loãng khác nhau Ta sẽ có một hàm số tương quan giữa 2 đại lượng này

Bước 2: Xác định giá trị OD ở bước sóng 610nm của dịch nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn để tính ra số lượng tế bào có trong dịch nghiên cứu đó vào thời điểm nuôi cấy khác nhau

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 27

2.2.1.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm gram

Vai trò: Nhuộm gram là phương pháp nhuộm sử dụng 2 hay nhiều loại

thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit

đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iôt [2], [3], [4], [5]

Tiến hành: Lấy các chủng Acetobacter xylinum có khả năng hình thành

màng cellulose được nhuộm tiêu bản theo phương pháp gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH - 2 với độ phóng đại 1000 lần [2], [3], [4], [5]

2.2.1.4 Phương pháp bảo quản chủng giống

2.2.1.4.1 Bảo quản trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và xác định sơ bộ là vi khuẩn axetic cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng nuôi 3 ngày ở tủ

ấm 28 - 30oC Sau đó, giữ trong tủ lạnh 4oC cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyển giữ giống trên ống thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng 1 lần [23]

2.2.1.4.2 Bảo quản trong dung dịch glycerin 24%

Các chủng có khả năng hình thành cellulose được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 30oC sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút với tôc độ 3000 vòng/phút, tách lấy phần sinh khối Hoà đều sinh khối trong 1 ml dung dịch glycerin 24% vô trùng, giữ ở -75oC trong các ống enppendof vô trùng Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống 1 đến 3 năm

2.2.1.5 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho

màng mỏng

Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn được các chủng vi khuẩn

Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai, nhẵn, để chế tạo màng sinh học

làm mặt nạ dưỡng da.Vì vậy cần tiến hành theo các chỉ tiêu sau [7]:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 28

- Quan sát đặc điểm quá trình hình thành màng BC (thời gian tạo màng,

đặc điểm của màng, độ dày mỏng của màng, tính chịu lực của màng )

- Quan sát kích thước và hình dạng tế bào trên tiêu bản nhuộm gram, kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng mới phân lập

Các chủng vi khuẩn Acetobacter tuyển chọn nuôi trong môi trường dịch

thể số 1 để kiểm tra khả năng tạo màng Chúng tôi tuyển chọn sau 3 lần liên tiếp thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.2 Xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn độ

Cho 10ml dung dịch lên men vào bình tam giác dung tích 100ml, thêm vào đó 1 - 2 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N lắc nhẹ khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt Tính số gam

axit axetic tạo thành trong 10ml dịch lên men (biết rằng 1ml NaOH 0,1N tương ứng với 0,006g axit axetic) [4]

Trong đó: X: Số gam axit axetic trong 1 lit dịch lên men

V: Thể tích của NaOH 0,1N đem chuẩn độ

10: Số thể tích đem chuẩn độ

2.2.3 Phương pháp hoá sinh

2.2.3.1 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (clatase+) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính calatase (calatase-)

Ngoài ra, có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 6000 vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 29

2.2.3.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành axit axetic

Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:

Cao nấm men: 10g Rượu etylic: 10 -15%

Nước máy: 1000ml pH: 6,8-7,0

Blue Bromphenol (BBP) 0,04%: 20ml

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5ml), khử trùng ở 121oC trong 20phút, để nguội khoảng 30oC cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hóa, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính [3]

Pha dung dịch Blue Bromphenol 0,04% : cân 0,1g Blue Bromphenol nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hòa tan cho

đều Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thể tích đạt 250ml [2], [3]

2.2.3.3 Phát hiện khả năng oxi hóa axit axetic

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxi hóa axit axetic của vi khuẩn tuyển chọn

Thành phần : Cao nấm men : 10 g Canxi axetat : 10 g

Thạch : 20 g Nước máy : 1000ml

pH : 7 - 7,2

Phân môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121oC trong 20 phút, để nguội khoảng 40 - 45 oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (18 - 24h) nuôi 6 - 7 ngày ở điều kiện thích hợp

Quan sát hiện tượng: nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính

2.2.3.4 Phát hiện khả năng chuyển hóa glucose thành axit gluconic

Chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn trên môi trường thạch GCP nếu xung quanh khuẩn lạc tạo vòng phân giải canxi , chứng tỏ chủng tuyển chọn có khả năng hình thành axit từ glucose

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 30

2.2.3.5 Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaxeton

Để thử khả năng hình thành dihydroxyaxeton từ glycerol Chúng tôi tiến hành nuôi vi khuẩn trên môi trường gồm những thành phần sau:

Nhỏ dung dịch Fehling vào 1ml dịch nuôi cấy trong ống eppendorf để

kiểm tra sự tạo thành dihydroxyaxeton (có sự xuất hiện kết tủa Cu 2 O màu đỏ gạch)

Cách pha dung dịch Fehling [1], [9]:

Fehling 1: CuSO4 5H2O: 34,6g Nước cất: 500ml

Fehling 2: Na K Tartrat: 173g NaOH: 70g Nước cất: 500ml Trộn lẫn Fehling1 và Fehling 2 theo tỷ lệ 1:1 ta được dung dịch Fehling mãu xanh thẫm

2.2.3.6 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Thành phần môi trường: (g/l)

(NH4)2SO4: 1g KH2PO4: 0,9g FeCl3 6H2O: 0,02g

MgSO4 7H2O: 0,25g K2HPO4: 0,1g Rượu etylic 99,5%: 20ml

Hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu ở nhiệt độ khoảng 30oC trong: 0, 12, 24, 48 giờ Sau đó hút 1ml dung dịch nuôi cấy cho vào eppendorf ly tâm với tốc độ 6000 vòng trong

màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugon và H2SO4 60% nó chuyển hóa thành màu xanh lam

2.2.4 Phương pháp toán học

Bằng ngôn ngữ toán học, tối ưu hóa là quá trình tìm các giá trị của yếu

tố x i để tại đó quá trình tiến hành có hiệu quả nhất, nghĩa là chọn hàm mục

tiêu y cực trị Thực tế có rất nhiều phương pháp tối ưu hóa, trong đó người ta hay sử dụng nhất là phương pháp Box - Wilson (phương pháp độ dốc) Đó là

phương pháp cho phép dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu khi các yếu tố này

đồng thời cùng thay đổi một lúc

Để thực hiện phương pháp này cần tiến hành 2 bước:

+ Bước 1: Thiết lập mô hình toán học

+ Bước 2: Tối ưu hóa trên cơ sở mô hình toán học

a Thiết lập mô hình toán học

Mô hình toán học biểu diễn mối liên hệ giữa hàm mục tiêu với các biến

số dưới dạng mặt đồng mức Mặt đồng mức có thể viết như sau:

n

n x b x

b x b b

y= 0 + 1~1 + 2~2 + + ~ (1)

1 1 1 3

1 13 2 1 12 2

2 1 1 0

~

~

~

~

n n n n

b x

b x b b

Phương pháp Box- Wilson chỉ hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các hệ

số phương trình đều có nghĩa (nếu có hệ số nào không có ý nghĩa thì cần loại

bỏ khỏi mô hình)

Có nhiều phương pháp để thiết lập mô hình toán học, nhưng phương pháp phổ biến nhất là phương pháp qui hoạch thực nghiệm Phương pháp này tiến hành như sau:

- Xác định chỉ tiêu tối ưu

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 32

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu

Trong đó: a: giới hạn dưới của khoảng xác định

b: giới hạn trên của khoảng xác định

- Ma trận thực nghiệm: số thực nghiệm cần phải làm để thiết lập mô hình với n yếu tố là: N= 2n với 2 là số mức

Ví dụ trong trường hợp có 2 yếu tố (n = 2) thì số nghiệm cần tiến hành

) (

Trong đó: k: số lần lặp lại của thí nghiệm

y j: số đo trung bình của thí nghiệm thứ j

yji: số đo lần thứ i của thí nghiệm thứ j

Sau đó, ta tính tiếp giá trị

∑

=

j j

j TT

S

S G

1 2

2

max

(4) (G TT = G tính toán)

Điều kiện để các sai số hội tụ là: GTT < GBB

ở đây GB là giá trị tìm được bằng cách tra bảng chuẩn Corhran khi biết

y N

b

1 0

Những hệ số quá bé, nghĩa là các biến hầu như không ảnh hưởng đến hàm mục tiêu được gọi là không có nghĩa và có thể đựơc loại bỏ khỏi mô hình

* Kiểm tra sự có nghĩa của hệ số:

Để đưa các hệ số không có nghĩa ra khỏi mô hình cần đánh giá theo chuẩn Student Hệ số có nghĩa phải thỏa mãn: b i ≥ S b.t

t: giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết N và

bậc tự do f = N(k- 1)

Sb được xác định như sau:

- Tính phân phối trung bình cho từng thí nghiệm:

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 34

=

j j

B: số hệ số của phương trình hồi qui

Từ số liệu thực nghiệm, mô hình được xây dựng bao giờ cũng có những sai lệch nhất định Để đánh giá độ sai lệch giữa thực nghiệm và mô hình ta dùng chuẩn Fisher Mô hình chỉ thích ứng khi FT< Fb trong đó Fb tìm được bằng cách tra bảng Fisher khi biết F1 = n- 1, F2 = N( k- 1) Để tính toán chuẩn Fisher theo mô hình, ta phải tính toán giá trị của hàm số theo mô hình đã tìm

được và tính phương sai thích ứng theo công thức sau:

y B N

S

1

2

) (

)

; ( 2 2

2 2

Ư T

Ư T

S S Min

S S Max F

b Tối ưu hóa

Giai đoạn tối ưu hóa gồm 2 bước:

+ Bước 1: Dựa vào phương trình hồi qui ta soạn ra một chương trình gồm một số thí nghiệm với những giá trị thay đổi của các yếu tố xi theo chiều hướng thẳng đứng

Để lập ma trận tối ưu hóa cần lần lượt tiến hành

Tính b i z i

bi: hệ số của phương trình hồi qui

zi: khoảng biến đổi của các yếu tố tương ứng

Sau khi chọn ra giá trị maxb i z i , ứng với giá trị này ta có biến cơ sở Bước nhảy của biến cơ sở: (Δx cs ) do ta tự chọn, còn bước nhảy của các biến

khác tính theo công thức:

cs cs cs

i i

z b

z b

Nếu hàm mục tiêu cần cực đại hóa thì dấu của ΔXi là +

Nếu hàm mục tiêu cần cực tiểu hóa thì dấu của ΔXi là -

Lập ma trận thực nghiệm: ma trận này được bắt đầu từ mức 0 của các biến số và các giá trị tiếp theo của chúng sẽ phụ thuộc vào bước nhảy đã xác

chương 3

kết quả nghiên cứu vμ thảo luận

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn axetic từ một số nguồn

nguyên liệu

Chúng tôi tiến hành phân lập 9 mẫu thuộc 3 nguồn: dịch giấm (theo

phương pháp thủ công), nước uống lên men (kombucha), màng BC (từ PTN

CNSH - Vi sinh) thu được 25 khuẩn lạc vi khuẩn axetic Để tiện cho việc tuyển chọn, chúng tôi tạm gọi 25 dạng vi khuẩn phát triển từ các khuẩn lạc vi khuẩn axetic này là 25 chủng với mã hóa kí hiệu riêng Kết quả phân lập và

đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn axetic trong từng mẫu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Nguồn gốc, đặc điểm của các chủng vi khuẩn axetic trong mẫu

theo phương pháp thủ công)

Khuẩn lạc to, d > 1mm, hình thái đa dạng

nhanh

(kombucha)

Hình cầu, bề mặt nhẵn, khô, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

chậm

CNSH- Vi sinh)

Hình cầu, nhẵn, mịn, sẫm màu, d = 0,8- 1,2 mm

nhanh

GVHD: Đinh Thị Kim Nhung SV : Nguyễn Thị Thanh Tuyền 38

GVHD: §inh ThÞ Kim Nhung SV : NguyÔn ThÞ Thanh TuyÒn 39