Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acetobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thoáng của dung dịch còn gọi là màng BC màng sinh h

Trang 1

Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngμnh Vi sinh vật học

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em đã nhận đợc sự hớng dẫn, chỉ

bảo tận tình của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, các thầy cô giáo bộ môn Vi

sinh Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh –

KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, anh, chị đang học tập và làm

việc tại phòng thí nghiệm trờng Đại học S phạm Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình

và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng em xin chân thành đợc cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm,

động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Trang 2

Trang

Mở Đầu

Chơng 1 Tổng quan tài liệu 4

1.1 Lợc sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acetobacter 4

1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter 7

1.3 Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter 11

Chơng 2 Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 26

3.1 Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu 26

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn A xylinum cho màng mỏng 31

3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum 36

3.4 Khảo sát khả năng tạo màng của chủng A xylinum C5 ở

3.5 Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum C5 ở

3.6 Xử lý màng BC và bớc đầu thử nghiệm làm mặt

Kết luận Vμ kiến nghị

Trang 3

Lời cam đoan

Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất

cả những số liệu đều đợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn

toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt đề tài nghiên cứu này không trùng với

công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Tác giả

Hoàng Thị Hạnh

Danh mục từ viết tắt

Trang 4

Từ viết tắt Từ đầy đủ

A xylinum

BC CNSH C5

EM MPA

Acetobacter xylinum

Bacterial Cellulose Công nghệ sinh học

Acetobacter xylinum C5

Effective Micorgamisms Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm

định

Trang 5

Bảng 3.1 Hàm lợng axit axetic của một số chủng Acetobacter 30

Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm

khuẩn lạc của các chủng Acetobacter phân lập đợc 32

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 33

Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum 35

Bảng 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau 39

Bảng 3.6 Khảo sát khả năng tạo màng ở các thời gian khác nhau 40

Bảng 3.7 Phiếu nhận xét cho điểm của một số ngời thử nghiệm

Hình

Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III 21

Hình 3.2 Mẫu dịch lên men giấm 27

Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn axetic của 3 mẫu phân lập 28

Hình 3.4 Khả năng phân oxy hoá axetat của vi khuẩn axetic 30

Hình 3.5 Khuẩn lạc C5 37

Hình 3.6 Vòng phân giải CaCO3 của C5 37

Hình 3.7 Màng BC của C5 37

Hình3.8 Tế bào C5 nhuộm Gram 37

Hình 3.9 Khả sát khả năng tạo màng ở các môi trờng lên men 38

Hình 3.10 Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mật ong 42

Trang 6

Mở Đầu

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật và công nghệ,

công nghệ sinh học (CNSH) đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo của nhiều

quốc gia trên thế giới Là một bộ phận của ngành CNSH, công nghệ vi sinh

học đã và đang phát triển mạnh mẽ với những ứng dụng thiết thực vào cuộc

sống như: công nghiệp, nông nghiệp, y học … Bằng việc ứng dụng các quá

trình lên men vi sinh vật vào sản xuất các chế phẩm, chúng ta đã tận dụng và

tiết kiệm được chi phí trong việc giải quyết rất nhiều vấn đề như nông nghiệp,

công nghiệp, bảo vệ môi trường… Vì vậy, việc nghiên cứu các quá trình lên

men, các đặc tính hoá, sinh học của các chủng vi khuẩn đang được nhiều

người quan tâm Một trong những chủng vi khuẩn đang được nghiên cứu là vi

khuẩn Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm)

Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acetobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó

tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thoáng của

dung dịch còn gọi là màng BC (màng sinh học, bacterial cellulose, BC)

Màng này được dùng để làm ra những sợi tơ to khoẻ và có độ đàn hồi cao

trong môi trường nước nóng Màng này được xem như một nguyên liệu mới

có tiềm năng ứng dụng để sản xuất đồ ăn kiêng và đồ tráng miệng…

Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn này được dùng để sản xuất

EM (Effective Micorgamisms) có tác dụng đa hiệu trên nhiều lĩnh vực đặc

biệt trong lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi hôi và giảm chi phí 10 lần

so với đốt rác Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta đã sử

dụng nguyên liệu là màng BC tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn

giấm Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acetobacter (chủng vi khuẩn

Acetobacter xylinum) được sử dụng để sản xuất thạch dừa - một món ăn giàu

dinh dưỡng và khá phổ biến hiện nay

Trang 7

Các nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám

chắc trên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước thấm qua nhưng lại

cho hơi nước di chuyển, có khả năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế da tạm thời

Vì vậy, màng BC được coi là nguyên liệu quý trong y học dùng để làm da

nhân tạo, màng mạch máu, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ Nó có thể thay thế

da tạm thời cho những bệnh nhân bỏng từ cấp độ 1 đến cấp độ 4 Chỉ riêng

Viện bỏng Quốc gia Hà Nội mỗi năm phải tiếp nhận hơn 4.000 ca bỏng Với

các bệnh nhân bị bỏng nặng thì chi phí cho các tấm màng đắp lên vết bỏng rất

cao Ngoài ra, các loại màng dùng để đắp lên vết thương hở và màng dùng để

đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ đều phải nhập ngoại với giá từ

30.000-45.000 đồng /1 chiếc Trong khi đó màng BC này hoàn toàn có thể sản xuất ở

trong nước bằng quá trình lên men nhờ vi khuẩn Acetobacter xylinum

Xã hội càng phát triển thì nhu cầu làm đẹp càng được quan tâm và mặt

nạ dưỡng da được chế tạo bằng quá trình lên men của vi khuẩn với rất nhiều

ưu điểm là sự lựa chọn của nhiều chị em phụ nữ Vì vậy, xuất phát từ thực

tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC trong nước, hợp với lý luận được tìm hiểu ở

trên, trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong và

ngoài nước, đồng thời căn cứ vào điều kiện cơ sở nghiên cứu chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter

xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da”

2 Mục tiêu của đề tài

+ Phân lập vi khuẩn axetic từ một số nguồn nguyên liệu

+ Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng

+ Xử lý màng BC và bước đầu thử nghiệm làm mặt nạ dưỡng da

3 Nội dung của đề tài

Nội dung của đề tài “ Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum,

chế tạo mặt nạ dưỡng da” để tìm hiểu đặc điểm, hình thái của vi khuẩn

Trang 8

Acetobacter, từ đó phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum

cho màng mỏng theo hướng chế tạo mặt nạ dưỡng da

4 ý nghĩa của đề tài

Đề tài cho phép phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả

năng tạo màng mỏng, từ đó chế tạo mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

Trang 9

Chương 1 Tổng quan tμI liệu

1.1 Lược sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn giấm

Từ rất lâu trong lịch sử con người đã biết cách làm giấm song chưa nắm

được cơ sở khoa học, càng không thể giải thích được bằng cách nào rượu

loãng lại có thể biến thành giấm ăn Cho đến đầu thế kỷ XIX, khi khoa học kĩ

thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật

được khám phá, con người mới biết được giấm là sản phẩm của quá trình lên

men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay người ta gọi chúng là vi khuẩn

Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5]

Năm 1822, Peson đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn

Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm Ông

khẳng định đó là một loại vi sinh vật và gọi là Mycoderma aceti [7]

Năm 1837, Kiitzing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm

và thấy rằng giấm không được tạo thành nữa Ông đã đưa ra nhận xét: quá

trình lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn

ra chuyển hoá rượu thành giấm Cũng năm 1837, Hansen (người Đan Mạch)

đã tách được từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma

aceti và Mycoderma pasteurianum

Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính

hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen và

khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm Ông nghiên cứu lớp màng

nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đi đến kết luận: màng đó được

tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi trực khuẩn đó là Mycoderma

aceti

Trang 10

Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên

cứu khác cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và

tìm cách cải thiện qua trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang đi vào

nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập

các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh

hoá của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ

sở đối chiếu các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra

1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter

+ Địa điểm nơi phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi

trường sống

+ Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả

năng di động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm

Gram…

+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc,

đặc tính vết mọc (trơn, xu xì…), tính chất vết mọc (đục, trong…), màu sắc vết

mọc trên môi trường thạch …Trên môi trường lỏng cần lưa ý tình trạng môi

trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không có mùi)

+ Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi

trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay

kỵ khí…), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và

hữu cơ

1.1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter

Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được thực hiện từ thế kỷ

XIX Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer

(1899), Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa vào hai dấu hiệu [6]:

* Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter

Trang 11

* Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong qua trình phát triển

Còn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm dựa

vào nơi sống đặc trưng của chúng:

* Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển bia vì hoa Hulon độc với chúng

* Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia

* Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang

* Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh

Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi

khuẩn axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon

và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ Nitrobacteriaceae Từ đó vi khuẩn axetic

được gọi là Acetobacter

Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi

khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng có hiện tượng ghép cực

xoắn ở phần di động

Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả khi quan sát sự di động

của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter

zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum Ông kết luận

những loài trên cùng thuộc một loài có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí

của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ Pseudomonas

Ngày nay, theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả

khác, vi khuẩn Acetobacter và Gluconbacter - các vi khuẩn axetic được xếp

vào một họ riêng là Acetobacteriaceae Trong khoá phân loại của Bergeys,

đáng chú ý nhất là khoá phân loại các loài thuộc giống Acetobacter, ông đã

phân giống Acetobacter thành hai loại :

Loại 1: Oxy hoá axit axetic thành CO2 và H2O Loại này gồm:

+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại

diện là vi khuẩn Acetobacter aceti

Trang 12

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt

môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi

khuẩn Acetobacter xylinum Trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không

tạo màng nhầy có chứa xeluloza, điển hình vi khuẩn: Acetobacter zances,

Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizigianus

Loại 2: Không có khả năng oxy hoá axit axetic

+ Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucoza:

* Sắc tố nâu đến đen nhạt : Acetobacter melanogenus

* Sắc tố hồng: Acetobacter recens

+ Không tạo sắc tố:

* Nhiệt độ thích hợp nhất là giữa 30°C-35°c: Acetobacter

subxydan

* Nhiệt độ thích hợp nhất giữa 18°C-21°C: Acetobacter oxydans

Năm 1960, Shilwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hoá

của vi khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không thể có sự phân loại đồng

nhất vi khuẩn Acetobacter

Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter

này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho

việc ứng dụng các vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này Hiện nay người

ta đã ứng dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo

ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn

1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

Như đã nêu ở trên, tác nhân của quá trình lên men axetic là vi khuẩn

Acetobacter Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học

thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc

không có chu mao và Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan

trọng nhất của họ Acetobacteriaceae (Lapent et al-1989), chúng sống phổ

Trang 13

biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả …có khả năng tạo ra axit axetic từ

rượu etylic Trong tế bào Gluconobacter không có chu trình Tricacbonxylic

(ATC) hoạt động nên nó không thể oxy hoá axit axetic song lại có một chu

trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), không oxy hoá axit axetic nhưng

vẫn có chu trình photphoril hoá Ngược lại trong tế bào Acetobacter xảy ra

quá trình trên Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tương tự Chúng chỉ khác

Pseudomonas ở chỗ chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hoá

pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố Nhiều loài vi khuẩn Acetobacter

khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu

ngày (môi trường già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc

phân nhánh)

Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng

oxy hoá rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5 Ngoài ra, chúng còn thực

hiện quá trình oxy hoá không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại

đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit

hữu cơ tương ứng Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu

khí; nhiệt độ thích hợp từ 25°C - 30°C; pH thích hợp từ 4,5 - 6,8; hoá dị dưỡng

hữu cơ

Trang 14

Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconbacter

so sánh với Pseudomons

Đặc điểm so sánh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas

1 Vị trí tiêm mao Đơn mao ở cực

Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình

que đến elip, kích thước từ 0,6 - 0,8μm Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp

thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ Tuỳ thuộc vào điều

kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt Vi khuẩn

Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo màng nhày, một số có khả

năng di động nhờ tiêm mao, một số không có khả năng này [1], [2], [3]

Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acetobacter trên

môi trường nuôi cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt nhất trên

môi trường nước bia, môi trường có chứa nấm men, glucoza, rượu etylic hoặc

Trang 15

manitol Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn,

đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm

Một số loại như Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc

rất nhỏ (d = 1mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày và sẫm

hơn các vùng xung quanh Một số loại khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4-5

mm), không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dàng dùng que cấy

gạt ra khỏi môi trường Có loại tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường,

khó lấy ra băng que cấy Trên môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter chỉ phát

triển trên bề mặt môi trường tạo thành màng dày nhẵn và trơn, khi lắc thì chìm

xuống đáy bình và thay vào đó là mội lớp màng mới được tạo thành, dịch dưới

màng này thường trong suốt Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza

giống như sợi bông Loại thứ hai màng mỏng như giấy xefan, một số nữa thì

tạo thành màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình và dịch nuôi cấy không

trong [8]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi

khuẩn Acetobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh

trưởng là rất đa dạng Chúng sử dụng chủ yếu đường glucoza hoặc saccaroza,

rượu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn

nitơ; muối photphat làm nguồn photpho Ngoài ra, trong quá trình phát triển

chúng còn có nhu cầu với một số chất kích thích sinh trưởng khác như:

para-aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin… các chất này có vai trò

quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter [9]

Một số vi khuẩn Acetobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân

tử lớn như: xenluloza, dextran và người ta ứng dụng khả năng này trong công

nghiệp Một số ít vi khuẩn Acetobacter có thể tổng hợp được những sợi

xenluloza giống như bông, điển hình như là Acetobacter xylinum Một số loài

tổng hợp được dextran giống như Leuconostoc mesenteroides khi môi trường

thiếu dextran hoặc xenluloza

Trang 16

Vi khuẩn Acetobacter có khả năng oxy hoá gluxit theo 4 hướng sau:

* Hướng thứ nhất: không có sự photphorit hoá cơ chất với sự tham gia

của các enzim đặc hiệu

* Hướng thứ hai: oxy hoá các hợp chất đã được photphorit hoá trong

con đường Pentose phosphate

* Hướng thứ ba: theo sơ đồ Enter - Doudroff

* Hướng thứ tư: theo chu trình Crep (Krebs) hoặc Glyoxlat

1.3 Một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter

1.3.1 Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 ì 1-1,2μ m không di động được,

xếp thành chuỗi dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram, màu vàng với thuốc

nhuộm iốt Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đường

saccaroza tạo thành màng nhầy, nhẵn Chúng có khả năng phát triển trên môi

trường có nồng độ rươụ cao (11%) và có thể tích luỹ đến 6% axit axetic trong

môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 30°C

1.3.2 Acetobacter xylinum

Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm tế bào đứng riêng rẽ

hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, các tế bào được bao bởi chất

nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H2SO4

thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng có

thể tích luỹ 4,5% axit axetic trong môi trường Chúng thường sống chung với

nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, “hải bảo” hay “vị

bảo”-một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia đình, trên

bề mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè

đường

Trang 17

1.3.3 Acetobacter pasteurianum

Có hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng váng vi khuẩn có

dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời

nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động

không thường xuyên Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, tròn Nhiệt độ thích hợp để

phát triển là 30°C

1.3.4 Acetobacter acetosum

Trực khuẩn có kích thước 0,4 - 0,8 ì1μm Các tế bào xếp riêng rẽ

thành từng chuỗi, không di động được Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng

phát triển là 30°C - 36°C

1.3.5 Acetobacter kiitzingianum

Có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng cao lên theo thành bình Tế

bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với

dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm Thích

hợp phát triển ở 30°C

1.3.6 Acetobacter shiitzenbacchii

Trực khuẩn khá dài, kích thước khoảng 0,3 - 0,4 ì1,0 - 3,6μm, thường

xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và không bền vững Có khả

năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% axit axetic do đó thường được sử

dụng để chuyển hoá rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp

nhanh)

1.3.7 Acetobacter lindreni

Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to như

hình cầu, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ,

màu vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt Thích hợp phát triển

ở 25°C

Trang 18

1.3.8 Acetobactere orleanense

Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao

có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo váng vi khuẩn rất

dày trên môi trường lỏng Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu

cao (10% - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic Thường được dùng để

chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm

hay phương pháp Orleans) Thích hợp phát triển ở 25°C - 30°C

1.3.9 Acetobacter suboxydans

Có hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có

khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ, có khả năng chuyển hoá

glucoza thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza-dùng để sản

xuất axit ascorbic-vitamin C Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường

cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para - aminobenzoic, axit

patoneic, axit nicotinic

1.3.10.Acetobacter hoshigakii

Trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 ì 1,5 - 1,8μm, thường xếp riêng rẽ

không di động Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn,

dạng hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên

men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu

vàng nhạt Có khả năng tạo thành axit gluconic Nhiệt độ thích hợp cho sự

phát triển là từ 30°C - 35°C

1.3.11 Acetobacter ascendens

Trực khuẩn không di động, các khuẩn lạc trên glucoza, genlatin khô

trắng với vành sáng chói Trên môi trường lỏng tạo thành màng nhày chắc,

nâng lên theo thành bình Thích hợp phát triển ở 25°C

Trang 19

1.3.12.Acetobacter oxydans

Trực khuẩn có kích thước 0,8 - 1,2 ì 2,4 - 2,7μm, các tế bào rời nhau

hoặc xếp thành chuỗi Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di

động Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự

Hầu hết các loài Acetobacter thường phát triển tốt nhất ở 25°C - 30°C

đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin,

chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng phát

triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề mặt

môi trường nuôi cấy Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này

có thể được ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn

cuộc sống Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác

nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo

màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng

Trang 20

Chương 2

Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân

lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm: bia, rượu

vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền

2.2 Trang thiết bị và hoá chất

2.2.1 Trang thiết bị

Dụng cụ : hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ

tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh…

Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp Tommy (Nhật), máy

lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích,

kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần… và nhiều dụng cụ khác

2.2.2.Hoá chất

+ Các loại đường chuẩn: glucoza, saccaroza, fuctoza, mantoza, manitol

+ Một số hợp chất hữu cơ: rượu etylic (C2H5OH), axit axetic

(CH3COOH), pepoton, agar-agar, dịch chiết nấm men (cao nấm men), axit

xucxinic, axit lactic, phenolphtalein

+ Một số hợp chất vô cơ: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4,

Na2HPO4.12H2O, CaCO3, NaOH chuẩn

+ Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Fucshin, dung dịch

Lugol, thuốc nhuộm iốt và H2SO4

Trang 21

Kho¸ luËn tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc

2.3 M«i tr−êng

Glucose : 20g (NH4)2SO4 : 3g Axit axetic: 2%

KH2PO4 : 2g MgSO4.7H2O: 2g R−îu etylic: 2%

Th¹ch Agar: 20g

Glucose : 20g (NH4)2SO4: 3g

KH2SO4 : 2g MgSO4.7H2O: 2g

Pepton : 6g Axit axetic : 2%

Nước m¸y : 1000 ml Rượu etylic : 2%

2.3.3 C¸c m«i tr−êng nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¹o mµng (g/l)

khi hÊp m«i tr−êng lÇn thø 3 [6], [8],[9]

Trang 22

2.3.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (MPA)

Cao thịt: 5g Pepton: 5g

NaCl: 5g Thạch agar: 20g

Nước: 1000 ml

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski

Nguồn nguyên liệu là: bia, dịch hoa quả loãng và rượu vang, chúng tôi

tiến hành phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski

Trước hết, chúng tôi thực hiện lên men giấm trên các vật liệu trên.Vi khuẩn

axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lỏng tạo

thành lớp màng dai, màu trắng Màng đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axetic,

lấy màng đó đưa vào môi trường số 2 Môi trường số 2 được pha chế đầy đủ

các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp xuất 1 atm, trong thời

gian 15 phút, để nguội, bổ sung rượu etylic và axit axetic, chia vào các bình

cầu hoặc bình tam giác Sau khi thả màng vào giữa trong tủ ấm 28°C - 30°C

trong thời gian 4 - 7 ngày (chú ý khi nút bông các bình không qua chặt cũng

không quá lỏng) trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới Từ

màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter

Phương pháp pha loãng của Pasteur: Việc pha loãng được thực hiện với

dung dịch NaCl 0,5% vô trùng hoặc nước cất vô trùng Chuẩn bị dung dịch

pha loãng rồi khử trùng ở 1atm, ở 121oC, thời gian 15 phút, dùng 10 ống

nghiệm định mức 10ml (đậy nút bông, đã khử trùng) Sử dụng pipet vô trùng

chia vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml dung dịch NaCl hoặc nước cất,

sau đó dùng pipet lấy 1ml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chữa sẵn

9ml nước cất hoặc dung dịch NaCl trên, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách

vontex trong 5 phút sẽ thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1 Dùng

pipet lấy 1ml dung dịch ở ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 nhỏ vào

Trang 23

ống nghiệm thứ 2 (cũng có 9 ml nước), đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách

vontex trong 5 phút thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10-2 Tiếp tục

pha loãng như vậy đến nồng độ 10-10 ta được 10 ống nghiệm chứa dung dịch

lên men với các nồng độ từ 10-1 đến 10-10 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có

trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở mức độ pha loãng 10-4 đến 10-7 để tiến hành

phân lập lại trên môi trường thạch đĩa

Phương pháp thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 121oC

và 1atm, để nguội, bổ sung rượu và axit, tiếp theo đổ vào hộp peri đã vô trùng,

để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại Dùng pipét vô trùng hút 100 μl dịch

màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10-4 đến 10-7) nhỏ vào hộp peri, sau

đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng,

bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28°C - 30°C Sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát

khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền

mép quanh khuẩn lạc), vòng phân giải CaCO3 quanh khuẩn lạc

Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy

trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều

được làm trong box cấy vô trùng

2.4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza

theo phương pháp của Graxinop

Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng

cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên

ngọn lửa đèn cồn) gợi lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã được đổ môi

trường thạch (môi trường số 2, đặt nghiêng, để nguội ) theo đường ziczăc Mỗi

ống là một ký hiệu riêng Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển

theo đường cấy Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn sẽ phát triển theo

đường cấy Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi

trường oxy hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Cho 1 ml nước cất

Trang 24

thanh trùng vào ống giống (ống nghiệm thạch nghiêng chứa các tế bào vi

khuẩn đã được hoạt hoá bằng cách cấy chuyển ống giống được bảo quản trong

tủ lạnh sang ống thạch nghiêng khác, khi tế bào vi khuẩn đã phát triển theo

đường cấy sẽ được kiểm tra khả năng tạo màng), dùng que cấy vô trùng gợt

các tế bào ra khỏi đường cấy hoà tan vào nước, dùng pipet vô trùng hút dịch vi

khuẩn đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng Dựa vào khả

năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch thể tuyển chọn sau

ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai, mỏng, trong

thời gian ngắn

Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này

sang ống thạch nghiêng khác với chu kỳ 2 tháng một lần

2.4.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết

2.4.3.1 Phương pháp quan sát tế bào

Sau khi sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này tiếp

tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển

vi quang học để xác định xem chúng có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm

không Quan sát hình dạng tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram: phương

pháp này gồm các bước sau:

+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4

+ Rồi rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô

+ Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng

trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi

cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa

đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 cm)

+ Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ

trong 1 - 2 phút

Trang 25

+ Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu

hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút

+ Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước

+ Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữa trong 1 - 2 phút

+ Rửa lại tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram

âm (Gr-) với vi khuẩn Gram dương (Gr+) Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào

bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr- Ngược lại nếu bắt màu tím thì đó là vi

khuẩn Gr+ Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- khác nhau là

do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từ một loại protein

đặc biệt chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol

một phức chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế

bào của vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Gentian Trong khi đó những vi khuẩn Gr

-không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên

dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr- bắt màu

hồng màu của Fucshin

a b

Trang 26

c Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III

a Hình thái màu sắc tế bào của chủng C1

b Hình thái màu sắc tế bào của chủng C2

c Hình thái màu sắc tế bào của chủng C5

Từ những mẫu vi khuẩn axetic thu được ở trên chúng tôi tiến hành

tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng

tạo màng dai trên môi trường nuôi cấy dịch

2.4.3.2 Kiểm tra đặc tính sinh học của Acetobacter

* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic

Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng xenluloza trên

môi trường oxy hoá chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn

Acetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn

lạc trên hai môi trường A và B

Môi trường A: dịch chiết nấm men 3%, CaCO3 2%, Agar-agar 2%,

rượu etylic 15% - 2ml Khi nuôi cấy giống vi khuẩn axetic trên môi trường

này nếu là Gluconobacter thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là

Acetobacter thì vòng sáng rõ hơn và có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc

hướng về phía vòng sáng do vi khuẩn sinh trưởng và phát triển sẽ tạo ra axit

axetic – axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn và tạo

ra lớp cặn đục thấy rõ

Trang 27

Môi trường B: dịch chiết nấm men 3%, Agar – agar 2%, rượu etylic

15% - 1ml, xanh lục bromocresol 2,2% - 1 ml Khi cấy giống vi khuẩn axetic,

nếu là Gluconobacter sẽ làm cho môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là

Acetobacter cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng nhưng có một

vành màu xanh lơ do quá trình oxy hoá các axit

* Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit axetic bằng chuẩn

độ với NaOH 0,1N có Phênolphtalein làm chỉ thị màu

Cho vào bình tam giác loại 100 ml hoặc 200ml, 10 ml dung dịch đã lên

men, thêm vào đó 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Tính

số gam axit axetic trong 100 gam dung dịch lên men.Cứ 1ml NaOH 0,1N

tương ứng với 0,006 gam axit axetic Chú ý khi chuẩn độ ta lắc nhẹ đến khi

dung dịch chuyển sang màu hồng là được

Cách tính:

10

1000

.K V

X: số gam axit axetic có trong 1 lít dung dịch lên men V: số ml NaOH 0.1 N dùng chuẩn 10 ml dung dịch lên men

* Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu được

tách từ dịch, nuôi cấy bằng li tâm 3000 vòng trong 20 phút Nếu thấy hiện

tượng sủi bọt thì chủng đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +), nếu

không thấy sủi bọt thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase

(catalase-)

2.4.3.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn

Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa tế bào vi khuẩn có thời gian nuôi cấy

khác nhau tuỳ theo yêu cầu của nghiên cứu, pha loãng theo phương pháp pha

loãng Pasteur, dùng micropipet hút 100 μl dịch pha loãng, trang đều trên môi

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	0,98 MB