Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học

Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter Để phân loại Acetobacter các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây: - Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng

trờng đại học s phạm hà nội 2

khoa sinh – ktnn

**********

phạm thị quyên

phân lập, tuyển chọn và tối u hóa điều kiện nuôi cấy cho

Lời cảm ơn

Để có được thành công của đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ quý báu, tận tình của các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, đặc biệt là cô giáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung và thầy giỏo, TS Nguyễn Khắc Thanh

Đề tài còn có sự đóng góp của các bạn cùng nhóm vi sinh, sự giúp đỡ của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến các thầy cô giáo Xin chân thành cảm ơn sự phối hợp, giúp đỡ của các bạn cùng nhóm vi sinh!

Hà Nội, ngày 29 tháng 4 năm 2008.

Sinh viên

Phạm Thị Quyên

LêI CAM §OAN

Em xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng em, c¸c sè liÖu, kÕt qu¶ trong kho¸ luËn lµ trung thùc, kh«ng trïng lÆp víi bÊt kú c«ng tr×nh nghiªn cøu nµo kh¸c./

Hµ néi, ngµy 29 th¸ng 4 n¨m 2008

Sinh viªn:

Ph¹m ThÞ Quyªn

môc lôc ĐẶT VẤN ĐỀ… … ……… … ……… …… … ……… ……… Trang 06 CHƯƠNG 1……… ………….…… … ….……… Trang 07 1.1 Lược sử nghiên cứu……… …….……… ……… … ……….Trang 07

1.2 Phân loại Acetobacter……….…… ……… ………Trang 08

1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter……… Trang 11

1.4 Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter……… Trang 14 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… …Trang 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu……… ……… … … …………Trang 17 2.2 Trang thiết bị và hóa chất……… ……… ……….………….……… Trang 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu……… ………… … ……….Trang 18 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……… … Trang 31

3.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter

từ các nguồn nguyên liệu……… … ……… …….Trang 31

3.2 Tuyển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum…….……….…….…….…Trang 34 3.3 Nghiên cứu động thái phát triển

của chủng Acetobacter xylinum N1 ……… ………….………Trang 41 3.4 Khảo sát sự thay đổi pH trong dịch nuôi cấy

của chủng Acetobacter xylinum N1……… … ……….… ……… Trang 43 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở

các môi trường nuôi cấy khác nhau……….….……… Trang 44 3.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy……… … ……… …….……… Trang 45 3.7 Xử lý màng và bước đầu dùng màng

Danh môc b¶ng vµ h×nh

B¶ng

Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter so sánh với Pseudomonas

Bảng 2.1 Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm với 2 yếu tố

Bảng 2.3 Cách xử lý màng

Bảng 3.1 Hàm lượng axit axetic của một số chủng vi khuẩn Acetobacter

Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm khuẩn

lạc của các chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập được

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Bảng 3.4 Thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào

Bảng 3.5 Tỷ lệ pH và axit axetic trong dịch lên men

Bảng 3.6 Khảo sát khả năng tạo màng của chủng Acetobacter xylinum N1 trên các môi trường khác nhau

Bảng 3.7.Các yếu tố và mức khảo sát ở chủng Acetobacter xylinum N1

Bảng 3.8 Ma trận thực nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1

Bảng 3.9 Mô hình thí nghiệm của chủng Acetobacter xylinum N1

Bảng 3.10 Bảng ma trận với lược đồ tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy chủng

vi khuẩn Acetobacter xylinum

H×nh

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc thuộc nhóm III

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hàm lượng axit axetic của một số chủng vi

khuẩn Acetobacter

Hình 3.3 Một số hình ảnh mẫu thu được qua thí nghiệm

Hình 3.4 Ảnh tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III khi nhuộm Gram

Hình 3.5 Đồ thị sinh trưởng của chủng Acetobacter xylinum N1

Hình 3.6 Phần trăm axit axetic trong dịch lên men

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ lành vết thương ở thỏ

Hình 3.8 Tiến trình lành vết thương ở thỏ thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acetobacter xylinum là một trong những chủng vi khuẩn mà con người

đã tìm ra và nhận thấy được ý nghĩa vô cùng to lớn của nó Vi khuẩn

Acetobacter xylinum có khả năng tổng hợp polysacarit phân tử lớn cellulose

Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng nó có thể hình thành lớp màng bao gồm các sợi cellulose giống như sợi bông rất khỏe và hoàn toàn có thể co giãn được trong môi trường nước nóng Vì đặc tính đó mà màng này được sử dụng chế tạo màng sinh học Bản chất của màng sinh học được cấu tạo từ thành

phần chính là cellulose kết hợp với sinh khối của tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Màng sinh học đảm bảo sự dẻo dai, độ bền, độ chắc khỏe bởi các sợi

cellulose được gắn kết với nhau hết sức chặt chẽ nhờ cầu nối là vi khuẩn

Acetobacter xylinum

Từ những đặc tính quý giá của màng sinh học mà các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra hàng loạt ứng dụng thực tiễn độc đáo trên rất nhiều các lĩnh vực khác nhau: trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ứng dụng làm thạch dừa, trong y học ứng dụng làm màng thay thế da tạm thời, trong công nghệ mỹ phẩm làm mặt nạ giúp tẩy trang, làm sáng da mặt, đặc biệt trong công nghệ khoa học vật liệu mới đã ứng dụng sản xuất micro với độ chính xác cao, bảo

vệ môi trường… các ứng dụng này đã mang lại lợi ích thiết thực đối với con người, bảo vệ sức khỏe cho con người Đó được coi là một phát kiến mới cho ngành vi sinh vật học, khẳng định vai trò, vị trí của ngành vi sinh vật học đối với các ngành khoa học khác

Với các ứng dụng thiết thực kể trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng Acetobacter xylinum, chế tạo màng sinh học”

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ các nguồn vật liệu khác nhau

2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng sinh học

đạt yêu cầu: đủ mỏng, dai chắc, bề mặt nhẵn

3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum

4 Chế tạo và ứng dụng màng sinh học để đắp lên vết thương hở ở thỏ

và dùng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu [6]

Từ rất lâu, con người đã biết cách làm giấm nhưng cơ sở khoa học của quá trình làm giấm thế nào, giải thích ra sao thì lúc đó con người vẫn chưa giải thích được, con người làm giấm chỉ đơn giản bằng kinh nghiệm thực tế của mình

Giấm (Vinaigre) là dung dịch nước chứa khoảng 3% axit axetic Từ Vinaigre bắt nguồn từ hai từ tiếng Pháp vin có nghĩa la vang, aigre là chua nên có thể giả định rằng người đời xưa dùng giấm chỉ đơn giản là rượu vang hỏng mà thôi Nhưng đến những năm đầu của thế kỷ 19 thì con người đã biết được giấm là sản phẩm của một nhóm vi sinh vật nhất định, xóa bỏ hoàn toàn những nghi ngờ nêu trên Ngày nay, người ta đã xác định nhóm vi sinh vật đó

là Acetobacter hay vi khuẩn axetic (vi khuẩn giấm)

Những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn axetic là của Person

1822 Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và đã

chứng minh đó là một loại vi sinh vật có tên là Mycoderma aceti

Đến năm 1837, Kiitzing làm thí nghiệm bằng cách loại bỏ hết các vi sinh vật trong các bình giấm sẽ không được tạo thành Từ đó, ông đã đi đến kết luận: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có vi sinh vật Cũng trong năm 1837 này, Hansen nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch đã tách được

từ màng giấm 2 loại vi khuẩn giấm thuần khiết là: Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum

Đến năm 1862- 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi

đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen Ông đã dùng kính hiển vi nghiên cứu màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là

Mycoderma aceti

Những nghiên cứu sau này trên vi khuẩn Acetobacter, tiếp tục làm rõ

thêm quá trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang từng bước phân loại

Acetobacter thành các nhóm khác nhau, nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa

cũng như ứng dụng của từng nhóm đó

1.2 Phân loại Acetobacter [6]

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

Để phân loại Acetobacter các tác giả dựa vào các tiêu chuẩn sau đây:

- Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di động, màu sắc sự hình thành tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc khi nhuộm Gram…

- Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính, tính chất, màu sắc…đặc điểm của khuẩn lạc trên môi trường thạch, khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường vàng nâu hay vàng nhạt…)

- Các đặc điểm sinh hóa theo khóa phân loại của Frateur 1950:

+ Khả năng tạo catalase

+ Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như: glierol, manitol, sorbitol

+ Khả năng oxi hóa axetat thành CO2 và H2O

+ Khả năng oxi hóa glucozơ thành gluconic

+ Khả năng sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ trong môi trường của hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon

+ Khả năng sử dụng sắc tố nâu

+ Khả năng tổng hợp cellulose

1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter

Ngay từ thế kỷ XIX các tác giả đã tiến hành phân lập Acetobacter thành

các chủng thuần khiết và tiến hành phân loại chúng

Trong đó khóa phân loại của Beijernck (1899) là đáng chú ý nhất, ông đã chia vi khuẩn thành 4 nhóm cơ bản Đến năm 1916, Janke đã kế tiếp công

trình của Beijerinck, Janke đã phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa trên hai dấu

hiệu cơ bản sau:

- Một là: khả năng sử dụng đạm amon để thực hiện quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter

- Hai là: có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển

Khi nghiên cứu nơi sinh sống đặc trưng của vi khuẩn axetic năm 1926

Henenberg đã phân loại chúng thành 4 nhóm sau đây:

- Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon có độc với chúng

- Nhóm 2 : vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia

- Nhóm 3 : vi khuẩn phát triển trên dung dịch rượu vang

- Nhóm 4 : vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Đến năm 1934 theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học Hoa kỳ vi

khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ Nitrobacteriaceae

Đến năm 1936 các tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel đã đề xuất ý kiến

ghép vi khuẩn Acetobacter vào học vi khuẩn Pseudomonas do chúng có hiện

tượng ghép cực xoắn ở phần di động

Đến năm 1948, Vanghn đã công bố những kết quả thu được sau khi

quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum

Ông kết luận những loại trên cùng thuộc một loại có đơn mao ở cực và đã xác

định vị trí của vi khuẩn Acetobacter ở trong họ vi khuẩn Pseudomonadacae

Cùng năm 1948, Krasilnicov với nghiên cứu về xạ khuẩn và vi khuẩn cùng với tác giả người Mỹ trong các bài báo của mình đều thống nhất xếp vi

khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae

Năm1914, Bergeys đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2

loại:

- Loại 1 : có khả năng oxi hóa axit axetic thành CO2 và H2O loại này gồm: + Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch hoyer) đại

diện là vi khuẩn Acetobacter acetic

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa cellulose điển hình là vi

khuẩn Acetobacter xylinum; trên bề mặt môi trường dịch nuôi cấy không tạo màng nhầy có chứa cellulose điển hình là Acetobacter rancenss, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizgianus

- Loại 2 : không có khả năng oxy hóa axit axetic

+ Tạo sắc tố trên môi trường glucozơ:

 Sắc tố nâu đến đen nhạt: Acetobacter melanogeus

Năm 1960, Shilwel và Car nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hóa

của vi khuẩn Acetobacter và đưa ra kết luận không có sự phân loại đồng nhất

vi khuẩn Acetobacter

Những nghiên cứu đặc điểm về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter này

đã tạo cở sở cho những nghiên cứu tiếp theo đồng thời là cơ sở cho việc ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào thực tiễn đời sống Hiện nay, người ta đã sử dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo ra nhiều sản phẩm có ý nghĩa

1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axit

axetic Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học thấy rằng chúng thuộc vào hai giống:

- Vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao

- Glucono bacter đơn mao

Theo Bergey 1989 và Larpent et al 1990 Acetobacter và Gluconobacter là

2 giống vi khuẩn axetic quan trọng nhất của họ Acetobacteriacae Hai giống

vi khuẩn trên gặp rất nhiều trong tự nhiên như ở trên bề mặt lá cây, hoa quả

Cả 2 giống đó đều có khả năng tạo axit axetic từ rượu nhưng trong tế bào

Gluconobacter không có chu trình ATC nên không thể diễn ra quá trinh oxi

hóa axetat, thay vào đó có một số chu trình khác như chu trình Glyoxinat, quá

trình photphoril hóa, còn Acetobacter lại xảy ra các quá trình trên

Khi so sánh hai giống trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng Tuy nhiên chúng cũng khác với Pseudomonas

có những đặc điểm sau: có thể chịu độ axit cao hơn, khả năng chuyển hóa pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn Một số loài vi khuẩn axetic khi sống trên môi trường nghèo dinh dưỡng hay thời gian nuôi cấy lâu ngày tế bào dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh)

Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axetic vào nhóm độc lập là khả năng oxi hóa rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5 Ngoài ra chúng còn thực hiện quá trình oxi hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường

và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng.Vi khuẩn axetic chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ thích hợp từ 25oC-30oC, pH thích hợp từ 4,5- 6,8, hóa dị dưỡng hữu cơ

Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

so sánh với Pseudomonas

Đặc điểm so sánh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas

1.Vị trí tiên mao Đơn mao ở cực

hoặc không

Chu mao hoặc

dấu(+/-): có hoặc không

Về hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que

hay hình elip, kích thước từ 0,6 - 0,8μm Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ

Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có

hình bán nguyệt Vi khuẩn Acetobacter không có khả năng sinh bào tử, tạo

màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ tiên mao, một số không có khả năng này

1.3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter

Có rất nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc, trên môi trường đặc vi khuẩn axetic phát triển thành các khuẩn lạc tròn đều đặn, đường kính khuẩn lạc

trung bình là 3mm, riêng có một số loài như: Acetobacteraceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ hơn (đường kính d = 1mm), bề mặt trơn bóng, ở

giữa khuẩn lạc dày hơn và màu sắc đậm hơn các phần xung quanh

Nhưng với một số loài khác khuẩn lạc lại lớn hơn (đường kính d = 4,5)

bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng, như những hạt sương nhỏ, có thể dùng que cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng Tuy nhiên cũng có khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường khó có thể gạt ra bằng que cấy

1.3.2 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

Sự hình thành màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường dịch rất

đa dạng, trên bề mặt môi trường dịch có thể tạo nên các loại màng có độ dày mỏng khác nhau

Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn, khi lắc nhẹ sẽ chìm xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, có loại màng mỏng như các tờ giấy xelofan, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình và tiếp tục hình thành nên lớp màng mới, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu Khi nghiên cứu các màng này thấy có nhiều sợi cellulose giống như các sợi bông,

chắc khỏe được đan với nhau bởi chính các vi khuẩn Acetobacter tạo nên độ

dẻo dai, tính đàn hồi tốt và độ chắc khỏe của màng

Có những loại màng lại rất mỏng, dễ vỡ, không nhẵn hoặc nhăn nheo, bám theo thành bình, dịch nuôi cấy thường đục có màu vàng nâu, không trong, không có mùi thơm dễ chịu, từ những quan sát về khuẩn lạc và các loại

màng ở trên cũng góp phần sơ bộ định loại các loài của vi khuẩn Acetobacter 1.3.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn Acetobacter có nhu

cầu đối với một số chất dinh dưỡng và sinh trưởng rất phong phú Nguồn cacbon có thể được cung cấp từ các hợp chất đường, rượu etylic và các axit

hữu cơ Vi khuẩn Acetobacter có thể sử dụng các muối amon làm nguồn cung

cấp nitơ Các chất kích thích sinh trưởng như: axitamin (izoloxin, alanin, prolin, valin), β-aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantotenic, axit folic, biiotin, nicotinamid…đều có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn Acetobacter

Một số vi khuẩn Acetobacter (Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti…)

có khả năng tự tổng hợp các polisaccarit phân tử lớn như cellulose, dextran…

điển hình là vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể tổng hợp được những sợi

cellulose giống như những sợi bông

1.3.4 Con đường chuyển hóa cacbon

Nghiên cứu về khả năng chuyển hóa cacbon các tác giả đã đi đến kết luận vi khuẩn axetic có thể oxi hóa cacbon theo những con đường sau:

- Con đường thứ nhất: không có sự photphoril hóa cơ chất và sự tham gia của các enzim đặc hiệu

- Con đường thứ hai: oxi hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong con đường pentozo photphat

- Con đường thứ ba: Entner-Doudoroff( ED)

- Con đường thứ tư: chu trình krebs hoặc glyoxinat

1.4 Một số đặc điểm của các nhóm vi khuẩn Acetobacter

1.4.1 Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn hình que, xếp thành chuỗi dài, kích thước 0,4 - 0,8 x 1,0 - 1,2μm không di động, bắt màu gram âm, bắt màu hồng với thuốc nhuộm iot, khuẩn lạc sáng, trên nền gelatin, dịch lên men chứa 10% đường saccarozơ tạo thành màng nhầy nhẵn, chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu cao (11%) và có thể tích lũy đến 6% axit axetic trong môi trường, chúng thường phát triển là bia với nhiệt độ thích hợp là 30oC

1.4.2 Acetobacter xylinum

Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo màng nhẵn và khá dai, màng này bắt màu xanh với thuốc nhuộm iot

vì màng này có chứa cellulose tích lũy được khoảng 4% axit axetic trong môi

trường, Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong một loại

nước giải khát dân gian làm bằng nước chè đường loãng gọi là “thủy hoài sâm”, người Trung Quốc gọi là “hải bảo” hay “ vị bảo”, người Nga gọi là

1.4.4 Acetobacter acetosum

Trực khuẩn có kích thước từ 0,7- 0,9 x 1,5- 1,8μm, hay đứng riêng rẽ, không di động Khuẩn lạc trên môi trường nước chiết đậu nành dạng hạt nhỏ, tròn, màu sáng, sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men: tròn, màu trắng sữa về sau chuyển thành màu nâu, phía mép ngoài khuẩn lạc màu vàng nhạt có thể chuyển hóa axit gluconic từ dextroza, nhiệt

độ thích hợp cho sự phát triển là 30oC-35oC

1.4.6 Acetobacter orleanense

Trực khuẩn dài vừa phải, không di động, khi gặp nhiệt độ cao có thể sinh

ra các tế bào dị hình: tế bào kéo dài hay phình to hơn Có khả năng phát triển được trên môi trường có nồng độ rượu cao từ 10%- 12% và tích lũy được 9,5% axit axetic, nhiệt độ thích hợp 25oC- 30oC

1.4.7 Acetobacter plancatum

Trực khuẩn kích thước 0,4 - 0,6 x 1,4- 1,6μm, tế bào có thể tạo thành những dạng phình to, kéo dài, không di động Khuẩn lạc tròn đều, hơi lồi lên, sáng, ẩm ướt, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25oC- 30oC

1.4.8 Acetobacter asendens

Trực khuẩn không di động, khuẩn lạc trên glucozơ, gelatin khô trắng, có vầng sáng chói Trên môi trường lỏng tạo thành màng dầy, chắc, hướng lên thành bình, nhiệt độ thích hợp là 25oC

1.4.9 Acetobacter lindrenii

Trực khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, không di động, một số tế bào phồng to như hình cầu Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men: nhỏ, tròn, màu vàng Ở trên môi trường lỏng váng màu vàng nâu, nhớt, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 25oC

1.4.10 Acetobacter Shiitzenbachii

Tế bào hình que: 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6μm, đứng riêng lẻ hay xếp thành đôi,

có thể tạo thành những tế bào đặc biệt Ở môi trường già có thể tạo thành váng dày, không bền vững, axit axetic tích lũy được trong môi trường khoảng 11,5%

1.4.11 Acetobacter kiitzingianum

Có màng nhầy, nhẵn ở mép và được nâng lên theo thành bình Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ, tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm, thích hợp phát triển ở 30oC

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm từ: bia, rượu vang, dịch hoa quả Từ các chủng này chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn ra được một chủng vi khuẩn có khả năng cho màng mỏng nhất: chủng

Acetobacter xylinum N1, sau đó tối ưu điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn này,

ứng dụng vi khuẩn trong chế tạo màng sinh học

2.2 Trang thiết bị và hóa chất

2.2.1 Trang thiết bị [1] [2] [3]

Khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng những thiết bị và dụng

cụ hộp lồng, ống nghiệm, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, cốc thủy tinh, que cấy, đèn cồn, lam kính, lamen, bình cầu, bình tam giác, pipet, nồi hấp, Autovlave, buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi quang học có

độ phóng đại 1000 lần, máy lắc, máy li tâm, máy Vontex… và một số thiết bị khác

2.2.2 Hóa chất [1] [2] [3]

Các chất thông dụng: Glucozơ (C6H12O6), cao nấm men, cao thịt, pepton, axit axetic, rượu etylic, NaOH, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, KHPO4, CaCO3, agar, phenolphtalein, thuốc nhuộm tím gentian, dung dịch fucshin, dung dịch lugol…

Axit axetic: 2% (bổ sung sau khử trùng)

Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khử trùng)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vino Gradski

[1] [2] [3]

Để thu được những chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi tiến hành

phân lập từ các nguồn nguyên liệu là bia hơi, rượu vang, dịch hoa quả theo phương pháp phân lập của VinoGradski

Trước khi tiến hành phân lập cần thực hiện quá trình lên men giấm từ các nguồn nguyên liệu trên, các nguồn nguyên liệu này được đựng trong các hình tam giác khác nhau, tiến hành lên men giấm sau 4 đến 5 ngày thì xuất hiện một lớp màng màu trắng trên bề mặt Tiếp theo, lấy màng đó đưa vào môi trường số

3 Môi trường này được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autolave ở 0,5atm, để nguội, chia vào các hình cầu hoặc hình tam giác Sau khi thả màng vào giữ ở tủ ấm 28oC đến 300C trong 4 đến 5 ngày, trên môi trường xuất hiện một lớp màng mới Tiến hành vớt màng này rửa qua bằng nước cất, sau đó lấy một chút màng đã được rửa cho vào các ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng rồi đưa vào máy Vôntex lắc đều trong một phút thu được các ống nghiệm chứa mẫu màng gốc Từ các ống nghiệm chứa mẫu màng

gốc, chúng tôi tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter

Khi tiến hành phân lập cần pha loãng nồng độ vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng của Pasteur: chuẩn bị 10 ống nghiệm đậy nút bông đã sấy khử trùng, nước cất 2 lần, tiến hành thao tác pha loãng ở trong bốc cấy vô trùng Sử dụng pipet vô trùng chia vào các ống nghiệm đã vô trùng mỗi ống nghiệm 9ml dung dịch nước cất 2 lần, sau đó lấy pipet vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng máy Vôntex trong 1 phút sẽ thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng mức 10-1 Tiếp theo, lại hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1cho vào ống nghiệm thứ hai với các thao tác lặp lại như trên sẽ thu được dịch

pha loãng mức 10-2, cứ như vậy sẽ thu được các dịch pha loãng từ 10-1 đến

10-10 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu chúng tôi chọn mẫu có độ pha loãng 10-4 - 10-6 để tiến hành các bước tiếp theo Sau đó phân lập trên môi trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng và đổ vào các hộp petri để nguội, dùng pipet vô trùng hút 100µl dịch màng đã chuẩn ở trên( có

độ pha loãng 10-4- 10-6) nhỏ vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch Bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28oC - 30oC Sau 3-4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng

Tách các khuẩn lạc đứng riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng (môi trường 1 đã loại CaCO3) đã được vô trùng, sau đó chuyển các ống nghiệm đã được cấy khuẩn lạc vào tủ ấm 28oC-30oC Sau 3- 4 ngày lấy các khuẩn lạc ở ống nghiệm đó quan sát và làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

2.3.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng theo phương pháp của Graixnôp [1] [2] [3]

Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách:

từ các khuẩn lạc đã chọn trên môi trường thạch đĩa, dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợt lấy khuẩn lạc cấy trên môi trường thạch nghiêng (môi trường 1) theo đường ziczắc Mỗi ống nghiệm là một mẫu riêng biệt tương ứng với từng khuẩn lạc và được mã hóa bằng kí hiệu riêng Để vào

tủ ấm 4-5 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy Tiếp theo là tuyển

chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter trong môi trường oxi hóa Môi trường oxi hóa dùng để tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter là môi trường lỏng

Dựa trên khả năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch thể tuyển chọn sau 3 lần liên tiếp chúng tôi chọn ra những chủng có khả năng tạo màng tốt nhất

Để giữ giống cần tiến hành chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kì là 2 tháng

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuần khiết

2.3.3.1 Tuyển chọn vi khuẩn theo phương pháp thử khả năng ôxy hóa etanol trên 2 môi trường A và B [9]

Sau khi đã có các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng, dai,

chắc trên môi trường oxi hóa chúng tôi tiến hành tuyển chọn vi khuẩn

Acetobacter thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn

lạc trên hai môi trường A và B

có một lớp cặn đục ở viền khuẩn lạc hướng về phía vòng sáng

Môi trường B: nuôi cấy vi khuẩn axetic nếu là Gluconobacter làm môi trường biến đổi thành màu vàng, nếu là Acetobacter cũng làm môi trường

biến đổi thành màu vàng nhưng có một màu xanh lơ do quá trình oxi hóa axit

2.3.3.2 Phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram [1] [2] [3]

Vi khuẩn Acetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép), lấy

màng mỏng, dai, màu trắng hoặc dịch nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng làm tiêu bản

Phương pháp nhuộm Gram gồm các bước sau:

- Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCl hoặc H2SO4 rồi rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô

- Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng mỏng ,dai, màu trắng hoặc dịch nuôi cấy hoăc giống vi khuẩn hòa vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10- 15cm)

- Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ trong 1-2 phút

- Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống, nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút

- Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước

- Nhỏ dung dịch fucschin nên giữ trong 1-2 phút

- Rửa tiêu bản bằng nước hong khô tự nhiên

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm( Gr-) với vi khuẩn Gram dương( Gr+) Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr- Ngược lại nếu bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gr+ Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr- và Gr+ khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từ một loại prôtêin đặc biệt chứa muối nuclêatmagiê có khả năng tạo tím với Gentian và lugol một phức chất bền khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tím của Gentian trong khi đó những vi khuẩn Gr- không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm Gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó khi nhỏ Fucshin lên tế bào vi khuẩn Gr- bắt màu hồng- màu của Fucshin

2.3.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng [5]

Mục đích nghiên cứu là tuyển chọn được những chủng vi khuẩn

Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai để chế tạo màng sinh học dùng cho

trị bỏng và dùng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ Do vậy tuyển chọn chủng

vi khuẩn Acetobacter xylinum thông qua các chỉ tiêu sau:

- Kích thước và hình dạng tế bào qua nhuộm Gram

- Kiểm tra các đặc tính sinh hóa

- Quan sát quá trình tạo màng

- Kiểm tra tính chịu lực của màng tạo thành

2.3.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương pháp đo mật độ quang (Optical Density- OD) Lấy 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum cho vào ependof,

li tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút để loại bỏ dịch Phần cặn là các tế bào lắng xuống, ta giữ lại và bổ sung 1ml nước cất vô trùng rồi lắc đều bằng máy Vontex, tiếp tục li tâm 10000 vòng/ phút, lặp lại liên tiếp 3 lần Sau đó ta thu phần cặn tế bào rồi hòa tan vào 1ml nước cất vô trùng, lắc đều bằng máy

Vontex thu được dung dịch huyền phù vi khuẩn Acetobacter xylinum Pha

loãng dịch huyền phù đó ở các độ pha loãng khác nhau Ở nồng độ pha loãng

10-4-10-7 hút 100μl dịch huyền phù trên trang đều vào các hộp petri có đổ môi trường đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm sau 4 ngày đếm số lượng khuẩn lạc Phần dịch ở mỗi độ pha loãng khác nhau đó đem đo OD610, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần Từ đó thiết lập mối tương quan giữa giá trị OD với số lượng tế bào vi khuẩn (thông qua đếm số lượng khuẩn lạc)

2.3.6 Xác định khả năng tổng hợp axit axetic của vi khuẩn Acetobacter bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenol phtalein làm chất chỉ thị màu (phương pháp Therme)[6]

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) 10ml dịch lên men, thêm vào đó 1-2 giọt phenol phtalein chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Chú ý khi chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhẹ là được Sau đó tính số gam axit axetic trong 100ml dung dịch lên men theo công thức: X =V.K.100

10 (g/ml)

Trong đó: X: số gam axit axetic trong 100ml dung dịch lên men V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch lên men K: lượng axit axetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1 N 10: số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.3.7 Phương pháp quy hoạch toán học thực nghiệm (phương pháp Box- Wilson) [4] [6] [8]

Phương pháp Box- Wilson là phương pháp dẫn dắt các yếu tố đến vùng tối ưu hóa khi các biến số thay đổi cùng một lúc Phương pháp này cho phép xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình lên men axetic, sự phát

triển của vi khuẩn Acetobacter xylinum đồng thời tạo màng sinh học Phương

pháp này gồm 2 bước:

2.3.7.1 Thiết lập mô hình toán học

Thiết lập mô hình toán học cho phép thấy được mối liên hệ giữa hàm liên tục với các kiến thức dưới dạng mặt đồng mức

Mặt đồng mức có thể được biểu diễn bằng phương trình hồi quy có dạng:

y = b0 + b11 + b22 + … + bin (1)

Trong đó: y: Hàm mục tiêu

n: Biến số mã (kod)

bi: Các hệ số

Phương pháp Box-Wilson chỉ có hiệu quả khi mô hình tuyến tính, các

hệ số của phương trình đều có nghĩa Nếu hệ số nào không có nghĩa thì cần loại khỏi mô hình

Để thiết lập mô hình toán học bằng phương pháp toán học thực nghiệm thì phải tiến hành các bước sau: (6 bước)

- Xác định các chỉ tiêu để tối ưu

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu tối ưu

b: giới hạn trên của khoảng xác định

Mức dưới: tương ứng là: i-1< io

Mức trên: tương ứng là: i+1> io

- Xác định khoảng biến thiên của các yếu tố: đó là khoảng bé nhất mà khi biến số thay đổi một lượng biến thiên thì hàm mục tiêu có sự thay đổi trông thấy

- Ma trận thực nghiệm: số thực nghiệm cần phải làm (N) để thiết lập mô hình thực nghiệm với n yếu tố là: N = 2n (trong đó 2 là số mức) Ví dụ: với 2 yếu tố thì số thí nghiệm cần tiến hành N = 2n = 22 Ma trận thực nghiệm có thể được thiết lập như bảng sau:

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm với 2 yếu tố

- Tính các hệ số của phương trình hồi quy

Từ số liệu thực nghiệm thu được, cần tiến hành 2 bước:

+ Bước 1: Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu

+ Bước 2: Kiểm tra sự có nghĩa

* Kiểm tra sự hội tụ của các số liệu:

- Mục đích: để kiểm tra xem các số liệu có cùng một độ chính xác như nhau không Đầu tiên tính phương sai:

Trong đó: k: số lần đo lại của thí nghiệm

yf: số đo trung bình của thí nghiệm thứ f

yfi: số đo lần thứ i của thí nghiệm f

Tiếp tục tính Gtt

2 f N TT

2 f

f 1

max SG

Các hệ số hồi qui được xác định:

N 2

Đối với những hệ số quá bé có thể coi là không có nghĩa nên hầu như không ảnh hưởng gì tới hàm mục tiêu và được loại khỏi mô hình

* Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số:

Các hệ số thu được đánh giá dựa vào tiêu chuẩn Student, các hệ số không có nghĩa thì bị loại khỏi mô hình Hệ số có nghĩa thì yêu cầu phải thỏa mãn bi  S tb

Với t: giá trị chuẩn Student được xác định bằng cách tra bảng khi biết trước N và bậc tự do f = N (k-1)

b

S S

b: số hệ số của phương trình hồi qui

Thông thường giữa số liệu thực nghiệm và mô hình bao giờ cũng có những sai lệch nhất định, để đánh giá độ sai lệch giữa thực nghiệm và mô hình ta dùng tiêu chuẩn Fisher

Mô hình chỉ thích ứng khi FTT < FB, trong đó FB tìm được bằng cách tra bảng Fisher khi biết: F1 = n-1

F2 = N (k-1)

Để tính toán chuẩn Fisher theo mô hình ta phải tính toán giá trị của hàm

số theo mô hình đã tìm được và tính phương sai thích ứng theo công thức sau:

2 2

T ¦ y

Max S ;S Min S ;S (11)

Trong đó: S2y được xác bằng công thức (8) (FTT = F tính toán)

2.3.7.2 Tối ưu hóa

Quá trình tối ưu hóa được thực hiện gồm 2 bước:

+ Bước 1: Lập ma trận thực nghiệm tối ưu hóa

+ Bước 2: Tiến hành thí nghiệm theo ma trận

1) Lập ma trận thực nghiệm tối ưu hóa:

Dựa vào phương trình hồi quy ta soạn ra một hệ thống các thí nghiệm với giá trị các yếu tố thay đổi

Để lập được ma trận thực nghiệm tối ưu hóa ta tiến hành:

- Tính |bizi|

Trong đó: bi : hệ số của phương trình hồi quy

zi: khoảng biến đổi các yếu tố tương ứng

- Sau đó ta chọn được giá trị: max |bizi| tương ứng là biến cơ sở Bước nhảy của biến cơ sở (ΔXcs) do ta tự lựa chọn Đối với các biến khác bước nhảy được tính theo công thức: