Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của đậu xanh trong giai đoạn nảy mầm

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập bằng các phương pháp phổ... Trong công trình này, nhóm nghiên cứu đã tách được tinh dầu của cây Mần tưới trắng với hàm lượng 0,02%

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

.1 Giảng viên hướng dẫn khoa học:

Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ

ẩm cao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình 15-270C Điều kiện khí

hậu thuận lợi đó khiến Việt Nam có một hệ thực vật phong phú đa dạng với

10585 loài, thuộc 2342 chi, 337 họ (trong đó có 24 họ có từ 100 loài trở lên) Thực vật có vai trò hết sức quan trọng: Cung cấp thức ăn cho con người, động vật, điều tiết khí hậu, cung cấp nguyên vật liệu cho các ngành xây dựng, sản xuất giấy…và đặc biệt nhiều loại cây có tác dụng trị bệnh rất tốt dùng làm thuốc Thực tế cho thấy trong nguồn tài nguyên thực vật phong phú kể trên có tới khoảng 4000 loài được nhân dân sử dụng làm thuốc Các bài thuốc có nguồn gốc thảo dược thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội trong điều trị bệnh đó là: ít độc tính, ít tác dụng phụ và ít ảnh hưởng đến môi sinh Vì vậy các nhà khoa học trong và ngoài nước đã, đang tích cực nghiên cứu, tìm hiểu thành phần hóa học và dược lí của các loại cây thuốc và tìm ra những bài thuốc giúp điều trị những căn bệnh hiểm nghèo cho con người, cải thiện chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ Ngày nay, khoa học kĩ thuật ngày càng phát triển mạnh mẽ, việc nghiên cứu ngày càng gặp nhiều thuận lợi

Lá, cây Mần tưới từ lâu đã được nhân dân sử dụng trong nhiều bài thuốc giải nhiệt, giải cảm, sát trùng, lợi tiểu, kích thích tiêu hóa, mụn nhọt, sang lở, kinh nguyệt không đều, các chứng sản hậu (chóng mặt, sốt, ho, mệt mỏi, kém

ăn, suy nhược, đau bụng, ứ huyết, rong huyết, bế kinh, hãn thương…) Ngoài

ra phụ nữ còn dùng để gội đầu cho sạch tóc, và dùng để trừ mạt gà, bọ chó Tuy nhiên việc nghiên cứu về lá, thân cây Mần tưới vẫn còn những hạn chế nhất định Vì vậy tôi đã chọn đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn chiết hexane của cây Mần tưới” nhằm góp phần tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên, tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, từ đó tìm ra những ứng dụng hợp lí cho cây Mần tưới, góp phần phát triển nền y học cổ truyền dân tộc

Nội dung khóa luận gồm:

1.Nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học có trong cây Mần tưới

2 Phân lập một số hợp chất từ cây Mần tưới bằng phương pháp chiết, sắc kí

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập bằng các phương pháp phổ

Họ cúc chia làm ba bộ lớn:

- Heliantheceae

- Lactuceae

- Senecionceae

Chi Eupatorium có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố tập trung ở

vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở Việt Nam có khoảng 10 loài

Có 10 loài trong chi này [2]:

* Eupatorium cannabinum: Yên bạch lá gai, Hoa nốt, Trạch lan lá gai

mèo, Thạch lam, Bạch sơn

* Eupatorium capillifolium: Yên bạch lá kim

* Eupatorium chinense: Tổ mạ, Trạch lan Trung Quốc, Yên bạch Trung

Quốc

* Eupatorium coelestinum: Mỹ sơn, cỏ lào tím

* Eupatorium fortunei: Mần tưới, lan, hương thảo

* Eupatorium heterophyllum: Thạch lam, Trạch lan khác lá

* Eupatorium japonicum: Sơn lan, Trạch lan, Yên bạch nhật

* Eupatorium lindleyanum: Bội lan, Yên bạch, lindley

* Eupatorium odoratum: Cỏ lào, Chó đẻ, Bớp bớp, Yên bạch

* Eupatorium triplinerve: Bả dột, Mần tưới, cà dốt, ba dót

1.2 Sơ lược về cây mần tưới

1.2.1 Giới thiệu chung

Tên khoa học là : Eupatorium fortunei Turcz

Tên đồng nghĩa : Eupatorium staechadosmum Hance

Phân lớp thực vật :

Ngành : Magnoliophyta

Lớp Magnoliopsida

Mô tả: Cây thuộc thảo, cao trung bình 50cm có thể đến 1m Thân trụ

tròn, thân và cành nhẵn, cành phân nhiều nhánh Lá mọc đối thuôn, hình dải rộng, dài 7-11 cm, rộng 1,2-2,5 cm, nhọn ở đầu, thon hẹp ở gốc, mép lá có răng cưa nhỏ, gân lá hình lông chim, gân chính nổi ở giữa, có nhiều gân phụ phân nhánh và khi vò lá có mùi thơm đặc biệt

Toàn thân: cành, cây, cuống lá có màu hơi tím, lá bắc nhỏ, tù và tròn; cụm hoa là ngù kép, hoa tím hồng, đôi khi có màu hơi trắng hồng, màu ở đầu cành hay kẽ lá, tràng hoa loe dần về phía đầu, mào lông dài 3cm, bao phấn không có tai ở gốc Quả bế, màu đen, có năm cánh lồi Mùa hoa vào tháng 7-

11, mùa quả vào khoảng tháng 9-12

Phân bố: Cây mọc hoang ở nhiều nơi, cây được trồng rải rác trong một

số vườn ở nông thôn các tỉnh Miền Bắc Ở Trung Quốc Mần tưới mọc nhiều ở các tỉnh: Giang Tô, Tô Châu, Nam Kinh, Phúc Kiến

Hình 1.1: Cây Mần tưới Eupatorium fortunei

Bộ phận sử dụng: Toàn thân, hay dùng là cành lá, ngọn là chủ yếu và

dùng tươi tốt hơn dùng khô Có thể thu toàn cây khi cây mới ra hoa, loại bỏ tạp chất cắt 3-4 cm phơi khô trong bóng râm hoặc sấy ở 45-500C đến khô rồi dùng dần

Cách trồng:

+ Cây mọc hoang và rộng khắp nơi do cánh hoa bay và mang theo hạt

+ Cách trồng đơn giản, cắt từng đoạn dài khoảng 20-30cm cắm xuống đất, để 2-3 đốt chìm dưới đất, cành hơi nghiêng Sau một tuần là cây bén rễ

1.2.3 Công dụng y học dân tộc

- Công năng: Vị cay, tính bình, hơi ấm, vào hai kinh: can, tì tác dụng

hoạt huyết, phá ứ huyết, thông kinh, lợi tiểu, sát trùng

- Công dụng:

+ Chữa sốt, chữa mụn nhọt lở ngứa

+ Nhân dân ta thường dùng lá Mần tưới non ăn sống, ăn gỏi như các loại rau thơm Cũng dùng lá nấu canh ăn cho mát, giải cảm, giải nhiệt Lá cũng dùng hãm nước uống lợi tiêu hóa, kích thích ăn ngon miệng và làm rau thơm

+ Người ta dùng Mần tưới để trừ ho gà, mạt gà, rệp, bọ chó Đặt cành lá Mần tưới vào hũ đựng đậu xanh, đậu đen, cau khô để trừ mọt và sâu, hái cành

lá Mần tưới cho vào ổ gà, ổ chó sau khi đã làm vệ sinh sẽ trừ được bọ gà, bọ chó có trong ổ, cứ vài ngày lại làm vệ sinh và thay lá một lần Giường có rệp sau khi giũ và diệt rệp, rải cành lá Mần tưới vài lần sẽ diệt hết rệp

+ Người ta dùng lá Mần tưới giã nhỏ cho vào túi vải và xát trực tiếp lên tay hay chân để xoa muỗi và dĩn (con bộ mát) có hiệu quả tốt trong vòng hai

ba giờ Phụ nữ nông thôn cũng dùng Mần tưới nấu nước gội đầu cho sạch tóc [1],[5]

-Bài thuốc [2]:

+ Chữa máu hôi không ra sau khi đẻ: Mần tưới (cả gốc và lá), Ngải tím, Quế chi, đều nhau Tán thành bột, lấy chừng 80g, chia làm 2 lần uống với rượu

+ Chữa phù thũng sau khi đẻ: Mần tưới, Phòng kỉ, đều bằng nhau tán nhỏ, mỗi lần uống 8g với giấm làm thang

+ Chữa mụn nhọt, vết thương ứ huyết: Mần tưới, Huyết giác đều 20g Sắc uống Ngoài thì dùng lá Mần tưới giã nhỏ và đắp lên vết thương

+ Chữa sốt, tiêu hóa kém: Mần tưới khô 20g, sắc với 600ml còn 200ml, chia làm 2 lần uống 15 phút trước hai bữa ăn chính

+ Chữa bệnh phụ nữ (thiếu máu, suy nhược, đau bụng kinh, kinh nguyệt không đều): Mần tưới phối hợp với củ Gấu, Ích mẫu, Ngải cứu, Nhọ nồi (mỗi thứ 120g) phơi khô, tán nhỏ, rây thành bột min, trộn với bột gạo và đường kính (nấu thành sirô), làm thành viên to bằng hạt ngô Ngày uống hai lần, mỗi lần 25-30 viên

+ Chữa rong huyết: Mần tưới, Ké hoa vàng, Chỉ thiên, Mã đề mỗi loại 20g thái nhỏ sao vàng sắc với 400ml còn lại 100ml, uống làm hai lần trong ngày, dùng 3-5 ngày

+ Chữa bệnh phụ nữ sau khi đẻ (bị sốt, ho, kém ăn, mệt mỏi): Mần tưới 20g, Mạch môn 20g, Ngải cứu 10g, Nhân trần 6g, Rẻ quạt 4g, vỏ quả bưởi đào khô 4g, sắc uống trong ngày, dùng 10 ngày liền

+ Chữa bệnh ra máu sau khi đẻ: Đan sâm, Mần tưới mỗi thứ 9gam, Xuyên khung 12gam, Kinh giới 6gam Sắc uống

+ Đẻ xong huyết hư: Mần tưới 9gam, lá Ngải (sao) 6gam, đường đỏ 30gam Sắc đặc, uống hết một tuần

+ Đau bụng sau khi đẻ: Diên hồ sách, lá Mần tưới mỗi thứ 9gam Sắc thêm rượu vào uống

+ Trúng phong sau khi đẻ: Kinh giới, lá Mần tưới mỗi thứ 9gam, Xuyên khung 4,5gam, Đẳng sâm 18gam Sắc uống

1.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học có trong cây Mần tưới 1.3.1 Vài nét về hợp chất Phenolic

1.3.1.1 Giới thiệu chung

Phenolic là nhóm các hợp chất trong cây mà chứa ít nhất một vòng thơm

bị thế ít nhất một nhóm hydroxyl, nhóm này tự do hay liên kết với các nhóm chức khác như: este, ester hoặc glycoside Các hợp chất phenol có màu sắc tự

nhiên nên có thể lợi dụng màu sắc của chúng để theo dõi quá trình chiết suất

và phân lập

Có hai hướng chính thơm hóa để sinh ra các phenolic thực vật:

- Hướng phổ biến nhất là đi qua Shikimate (axit Shikimic), từ các monosaccarit tạo thành các aminoaxit (Phenyl amin và Tyrosime), sau đó loại nhóm amin cho các axit Cinnamic và các dẫn xuất của chúng gồm: Axit benzoic, Acetophenone, Lignan, Lignin và Caumarin

- Con đường thứ hai là đi từ axetat và dẫn đến tạo thành các ketoester của các Polyketit dài bằng các phản ứng đóng vòng (phản ứng ngưng tụ Claisen hoặc Andol) Các sản phẩm thường là polycyclic gồm: Choromen, Isocaumarin, Orcinol, Depside, Depsidoen, Xanthone, Quinone Cấu trúc đa dạng của các hợp chất phenol có được là do quá trình sinh tổng hợp và bởi sự tăng dần tần số kết hợp giữa hai con đường Shikimate và acetate đối với các hợp chất được tạo thành trong hỗn hợp Khả năng tham gia các thành tố thứ ba là hoàn toàn có thể mặc dù với tần số thấp hơn Sự kết hợp này được tạo bởi các thành tố tạo bởi hai con đường Shikimate và Mevalonate, ví dụ như một số loại Quinone hoặc khung Furano và Poly-coumarin

Poly-β-1.3.1.2 Một vài đặc điểm của hợp chất Phenol

Một vài hợp chất của Phenol có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thường như các Anthocyanin từ hoa, các hợp chất khác có thể nhận biết dưới ánh sáng đèn UV hoặc bởi các phản ứng màu đặc trưng Các phản ứng màu này được sử dụng trong quá trình sắc kí, phân lập các hợp chất Phenolic Tuy nhiên, việc sử dụng các phản ứng màu trên các dịch chiết thường khó phát hiện và không nhạy bởi các tương tác của các yếu tố gây nhiễu kết quả thực nghiệm Các hóa chất thường được sử dụng phát hiện các chất phenol đó là: Clorit sắt, Vanllinin, Phosphomolybdate-phosphotungstate Đối với một vài

hóa chất, việc sử dụng các hợp chất có cấu trúc phenol được thực hiện theo tính đặc hiệu như thời gian phản ứng, sự chuyển màu, những điều này góp phần làm tăng khả năng nhận biết các hợp chất phenol

Ở Việt Nam, hiện chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào được

công bố về loài Mần tưới (Eupatorium fortunei) Mới chỉ có một công trình nghiên cứu về loài Mần tưới trắng (Eupatorium staechadosmum Hance) được

nhóm nghiên cứu của Lê Văn Hạc công bố vào tháng 10 năm 2004 Trong công trình này, nhóm nghiên cứu đã tách được tinh dầu của cây Mần tưới trắng với hàm lượng 0,02% và xác định được thành phần hóa học của tinh dầu này có 67 hợp chất, trong đó 40 hợp chất đã được xác định danh, thành phần chính của tinh dầu là β-caryophylen (21,2%), methylthymyl ether (13,7%), thymohydroquinondiethyl ether (10,2%) [3]

Năm 1986, Mitsumasa Haruna cùng các cộng sự đã xác định được cấu trúc và lập thể của Eupafortunin, một Germacrane mới thuộc loại

Sesquiterpene lactone phân lập từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei)

Eupafortunin là một Sesquiterpene lactone mới, được phân lập từ Mần

tưới (Eupatorium fortunei), cấu trúc hóa học lập thể của nó được xác định

bằng cách kết hợp các phương pháp hóa lý

Các hợp chất phân lập được: Eupatofortunin, Eupatoriopicrin [7]

Năm 1992, K.Liu và các cộng sự đã phân lập được 3 alkaloid

pyrrolizidine từ loài Mần tưới, cấu trúc của 3 hợp chất này được xác định

bằng các phương pháp phổ Một trong số chúng là chất mới và cấu trúc của

hợp chất này được chứng minh bằng phổ hai chiều NMR [8]

Sau đây là cấu trúc của 3 alkaloid này:

Hình 1.6 O-7-acetylrinderine

Năm 2001, Motoo Tori cùng các cộng sự đã xác định và phân lập được cấu trúc của 16 dẫn xuất thymol mới từ cây Mần tưới Những hợp chất này được phân thành 3 nhóm phụ thuộc vào mức độ oxi hóa: một nhóm chức oxi hóa ở vị trí 9, hai nhóm chức oxi hóa ở các vị trí 8 và 9, ba nhóm chức oxi hóa

ở các vị trí 8,9,10.[6]

Sau đây là cấu trúc của 16 hợp chất phân lập được này:

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học một số dẫn xuất thymol từ cây Mần tưới Năm 2005, Hai Xia Jiang và Kun Gao đã phân lập được hai

monotecpen từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei) và đã xác định được cấu

trúc của hai hợp chất này là [9] Dưới đây là cấu trúc của hai monotecpen này:

Năm 2006, Hai Xia Jiang cùng các cộng sự đã công bố công trình phân

lập các tecpenoid từ loài Mần tưới (Eupatorium fortunei) Theo đó bốn tecpenoid mới có tên là rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, rel- (1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6,tetrol, 9-hydroxythymol 3-O-angelate

và (3β,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl-palminate cùng với 14 hợp chất đã

biết được phân lập từ phần AcOEt của dịch chiết MeOH của Eupatorium

fortunei Thêm vào đó, 2 monotecpenoid khác là axetone thymol-8,9-diyl

ketal và 8-methoxy-9-hydroxythymol 3-O-angelate cũng được xác định [10] Dưới đây là một số cấu trúc của một số hợp chất được công bố trong công trình này:

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ cây Mần tưới 1.3.2.2 Hoạt tính sinh học

Mần tưới (Eupatorium fortunei) là một loại thuốc truyền thống của

người Trung Hoa, loài này mọc phổ biến ở Trung Quốc và được sử dụng để chữa trị bệnh phù thũng, các chứng cản lạnh, giảm sốt, được dùng như một loại thuốc lợi tiểu [9] Một nhóm nghiên cứu người Nhật đã tìm thấy một loạt

các dẫn xuất của Thymol phân lập từ Eupatorium fortunei, các dẫn xuất

Thymol đó kháng được 8 loại vi khuẩn theo phương pháp pha loãng agar [1] Năm 2005 Hai Xia Jiang và Kun Gao có một công trình công bố 2 monotecpen có tính oxi hóa cao, được phân lập từ phần EtOAc của dịch chiết MeOH của mẫu cây này Phần EtOAc cho thấy cytotoxicity yếu: IC50 = 69,5

và 86,1 µg/ml chống lại các tế bào HL-60 và SMMC-7721 bằng phương pháp

SRB [9] 4tecpenoid mới có tên là tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6,tetrol, 9-hydroxythymol 3-

rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6-O-angelate và (3β,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl-palminate, chúng có hoạt tính xitotoxic chống lại các dòng tế bào HL-60, SMMC-7721 và LO2[10]

Các loài thực vật trong chi Eupatorium thể hiện nhiều hoạt tính sinh học

thú vị, đặc biệt các dẫn xuất thymol có khả năng kháng được 8 loại vi khuẩn Việc nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi này còn mới nên

còn nhiều hạn chế, phần lớn mới tập trung vào loài Eupatorium

staechadosmum Hance Việc tiếp tục đi sâu nghiên cứu thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của các chất có trong loài thuộc chi Eupatorium có tác

dụng làm thuốc là một vấn đề thú vị đang cần các nhà khoa học quan tâm

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1 Phương pháp chiết

2.2.1.1 Đặc điểm chung

Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình

chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó

Mục đích: Sử dụng phương pháp chiết để chuyển một lượng nhỏ chất

nghiên cứu trong một lượng lớn thể tích dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất ra khỏi một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Phương pháp này thường được dùng để phân tách các hợp chất tự nhiên có trong thực vật

2.2.1.2 Cơ sở của quá trình chiết

Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:

KA = CA/CB

Với KA là hằng số phân bố

CA, CB: nồng độ chất hòa tan trong hai pha lỏng A, B không tan lẫn

2.2.1.3 Quá trình chiết thực vật

2.2.1.3.1 Hợp chất tự nhiên trong cây

Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây thành hai nhóm lớn:

- Chất chuyển hóa sơ cấp (primary metabolite)

- Chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolite)

Chất chuyển hóa sơ cấp là chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của cây như hydrat cacbon, lipit, axit amin Nói chung là chúng không thể thiếu trong cây cỏ

Chất chuyển hóa thứ cấp là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng không phải để nuôi sống và phát triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này và vắng mặt ở cây kia Có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng trong thực vật

Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây (ancaloid, tinh dầu), góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây (flavonoid, saponin, tinh dầu, terpenoid…), hoặc góp phần tạo màu sắc, quyến

rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nòi giống (flavonoid, carotenoid…)v.v…

Do có tác dụng sinh lý và dược lý như tác dụng kháng sinh, diệt nấm, tác dụng ức chế hoặc tác dụng gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng và các tác dụng khác mà các chất trao đổi bậc hai là đối tượng nghiên cứu quan trọng trong các lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp

Trong cây các hợp chất hữu cơ có tính chất hóa lý rất khác nhau, chúng tồn tại ở dạng hòa tan trong nước, dầu béo hoặc tinh dầu Các chất hòa tan trong nước (dịch tế bào) là các hydrat cacbon phân tử bé (monosaccarit, oligosaccarit), một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin, flavonoid…), muối ancaloid của các axit hữu cơ, axit vô cơ, axit amin, muối

amin Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydro cacbon, monoterpen, secquiterpen, sterol, carotenoid và các dẫn xuất phenyl propanoid Dầu béo và tinh dầu được khu trú trong các bộ phận riêng biệt của cây như ở hạt (dầu béo), ở hạch tiết của lá, vỏ thân (tinh dầu)

Ngoài ra trong cây còn chứa các muối vô cơ Các muối vô cơ này ít tham gia vào tác dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên đây chính là các nguồn nguyên tố vi lượng không thể thiếu đối với cây cỏ Ở một số loài các muối vô

cơ cũng có một số tác dụng như tác dụng lợi tiểu của muối kali (natri) trong râu ngô, tác dụng trị vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ cải, tác dụng trị bướu cổ của các hợp chất Iot của các loại tảo biển

Mặt khác trong cây cũng có các loại enzyme, do đó trong quá trình nghiên cứu, nếu không khống chế sự hoạt động các enzyme này thì các glycozit có thể bị thủy phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân cực, do đó thay đổi độ hòa tan của hợp chất trong dung môi

2.2.1.3.2 Chọn dung môi chiết

Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi thường cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các đặc điểm là cần hòa tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với các chất nghiên cứu), những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Một số chất dẻo lẫn

tributylphosphat…do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật Clorofom, metanol và etanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng

tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào Ngược lại, khả năng phân cực của Clorofom thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào

Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng các chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị hòa tan đồng thời Thường thì dung môi cồn trong nước dường như có đặc tính tốt nhất trong quá trình chiết sơ bộ

Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 450C, với các chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2.2.1.3.3 Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

- Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:

Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục

và để tiết kiệm dung môi

- Chiết ngâm:

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách sau:

+ Với ancaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với các chất đặc trưng như: Dragendorff, Mayer…

+ Với flavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy ra không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

+ Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ tim phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon

và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao nhất

2.2.2 Các phương pháp sắc kí

2.2.2.1 Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí

Sắc kí là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra hai pha: một pha có bề mặt rộng gọi là pha tĩnh (hay là pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là pha động (hay là pha di động), di chuyển đi qua pha tĩnh Trong quá trình sắc

kí, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại Kết quả là các chất

có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác yếu hơn Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc

kí

2.2.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = n∞bC/(1+bC)

Với:

• n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

• n∞: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào

đó

• b: Hằng số

• C: nồng độ của dung dịch

2.2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm: sắc kí khí và sắc kí lỏng

lí

Với phương pháp hóa học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho từng loại hợp chất Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ thích hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc nhúng giấy vào thuốc thử

Với phương pháp vật lí, có thể hiện màu bằng cách soi vào đèn UV vì nhiều hợp chất hữu cơ hấp phụ được các tia cực tím

b, Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tách các dung dịch chất phân tách di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các

vị trí khác nhau

Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là silicagel tráng trên

đế nhôm hay đế thủy tinh Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ chiếm ở mỗi vị trí khác nhau trên bản mỏng

Để tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi trên đèn UV Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac hoặc dung dịch axit sunfuric 10% Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết xuất hiện từ từ Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột

Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp Ở phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, soi UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp silicagel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất

Ký hiệu DC-Alufolien 60 F254 có nghĩa là bản mỏng được tráng silicagel

có kích cỡ rỗng là 60 A0 (đọc là ăng-s-trông) và có trộn với chất phát huỳnh quang ở bước sóng 254nm

Ký hiệu RP18 F254 có nghĩa là bản pha đảo có chất hấp phụ gắn mạch alkan 18 đơn vị cacbon, có trộn với chất phát huỳnh quang ở bước sóng 254nm

c, Sắc kí cột

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha thường và pha đảo (YMC, ODS, dianion) Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của các chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách các chất hấp phụ Độ nhỏ của các chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước các hạt càng nhỏ thì tốc độ nhạy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì sẽ gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng

áp suất để kích thích dung môi chảy (áp suất trung bình – MPC, áp suất cao – HPLC)

Tỷ lệ đường kính so với chiều cao cột (L/D) phụ thuộc vào yêu cầu tách (phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể)

Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi chất khác nhau giá trị Rf khác nhau Nhờ sự khác nhau này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô tới hoàn toàn và sau đó đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

• Nhồi cột khô: Theo cách này thì chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột còn khô sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong cột Dùng dung môi chạy cột để rửa giải

• Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần chiết

Khi chuẩn bị cột thì cần lưu ý không để có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí sẽ gây hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gẫy, rò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Nếu tốc độ chảy quá chậm sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

2.2.2.3.2 Sắc kí khí

Đây là phương pháp sắc kí dùng chất khí làm pha động Chất thử có thể

là chất lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một luồng chất trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh:

• Nếu pha tĩnh là chất rắn thì được gọi là sắc kí khí – rắn

• Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì được gọi là sắc kí khí – lỏng

+ Ở sắc kí khí – rắn, chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như silicagel, than hoạt tính, nhôm oxit

+ Ở sắc kí khí – lỏng, chất lỏng được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền

Khi chất thử được khí tải dẫn qua pha tĩnh, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử đối với pha tĩnh

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Khi đã phân lập được hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác định được cấu trúc của chúng Để có được điều này cần phải phân tích bằng nhiều phương pháp kết hợp với nhau

2.3.1 Đo điểm chảy

Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng, nó là tiêu chuẩn kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa so với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết thì phải tinh chế và kết tinh lại Trong nhiều trường hợp, với việc xác định được điểm chảy có thể đưa ra được kết luận hoặc nhận định sơ bộ về hợp chất cần nghiên cứu bằng cách đem đi so sánh, đối chiếu với các tài liệu đã có sẵn

Đo điểm nóng chảy bằng mao quản: Ống mao dẫn đường kính 1=>2mm, dài 8=>120mm một đầu bịt kín, một đầu hở Cách đo:

Cho chất rắn vào ống mao dẫn khoảng 0,001=>5g (chất rắn thật khô, tán nhỏ) cột chất trong mao dẫn cao khoảng 2-5mm là được Buộc ống mao dẫn vào nhiệt kế bằng dây cao su, chất rắn trong ống mao dẫn nằm ngang bầu thủy ngân Đốt nóng với tốc độ gia tăng nhiệt chậm đều (1phút tăng chừng

20C), tới một nhiệt độ nào đó thì chất rắn bắt đầu hóa lỏng, và sau đó nhiệt độ tại đó chất rắn chảy hết Trị số trung bình cộng của hai điểm chất bắt đầu hóa lỏng và nóng chảy hết chính là điểm nóng chảy của chất đó

Lưu ý:

- Đảm bảo mức chất cần đo trong ống mao quản ngang bằng với mức thủy ngân trong nhiệt kế: để nhiệt độ giữa hai bên đồng nhất sẽ cho kết quả đo chính xác

- Gia tăng nhiệt độ chậm đều để kịp thời vừa quan sát sự biến đổi của chất cần đo vừa theo dõi được chỉ số của nhiệt kế

Hiện nay đã có máy đo điểm chảy đốt nóng bằng điện rất tiện dụng đảm bảo nhiệt độ đồng nhất giữa chất đo và nhiệt kế Lưu ý duy nhất là quan sát thật kĩ để xác định đúng thời điểm chất bắt đầu nóng chảy và lúc tan chảy hoàn toàn

2.3.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Các hợp chất hữu cơ hấp phụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng 10 000 – 100 000cm-1 và biến thành năng lượng dao động của phân tử Phổ hồng ngoại được xây dựng trên sự khác nhau của các dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của các tia hồng ngoại Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp phụ của hai dạng năng lượng là năng lượng dao động và năng lượng quay

Tần số hay độ dài sóng hấp phụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng Với mỗi hợp chất khác nhau chứa các liên kết khác nhau thì sự hấp phụ hồng ngoại là khác nhau Dựa trên những đặc điểm này mà ta có thể xác định được các nhóm chức trong hợp chất hữu cơ bằng cách đo và phân tích phổ hồng ngoại

Dựa vào sự hấp phụ đặc trưng của các nhóm chất mà có thể chia phổ hồng ngoại thành 3 vùng: vùng sóng ngắn từ 4000 – 1300 cm-1, vùng sóng dài

từ 909 – 650 cm-1 và vùng sóng trung bình từ 1300 – 909 cm-1

Trong vùng sóng ngắn các nhóm chức hữu cơ bị hấp phụ là OH, NH, CO… Nếu không có dải hấp phụ trong vùng 1850 – 1540 cm-1 là không có nhóm CO, không có dải hấp phụ ở 3650 – 3200 cm-1 là không có nhóm OH phenol hoặc ancol Các hợp chất thơm hoặc tạp thơm thường có dải hấp phụ nằm trong khoảng 1600 – 1300 cm-1

Vùng sóng dài đặc trưng cho các hấp phụ của dao động biến dạng Nếu không có dải hấp phụ trong khoảng 909 – 605 cm-1 là hợp chất không có cấu trúc thơm Các hấp phụ của dao động biến dạng của vòng thơm và biến dạng C-H ngoài mặt phẳng của các hợp chất thơm và tạp thơm xuất hiện với cường

độ mạnh và thường có liên quan đến nhóm thế của các hợp chất Nếu có dải hấp thụ rộng với cường độ mạnh thì rất có thể có mặt của các dime của axit cacboxylic, của amin, amit Nếu có các dải ở gần 1000cm-1 thì rất có thể có cấu trúc olefin

Vùng sóng trung bình được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó được dùng để

so sánh hình dạng các dải hấp thụ với mẫu chuẩn xem có đồng nhất hay không Ví dụ: nếu có dải hấp thụ OH ở 3550 – 3200 cm-1 thì vị trí dải hấp thụ

C – O tại đây sẽ giúp ta phân biệt được chi tiết hơn về cấu trúc của phenol hoặc andol đó

2.3.3 Phổ tử ngoại (UV – Vis)

Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử rừ obitan ở trạng thái cơ bản lên các obitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc sử dụng phổ UV cũng chỉ giới hạn trong một số lớp chất mà chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp

Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với phổ của một chất đơn giản nếu hai chất ấy có cùng một nhóm cấu trúc giống nhau Chính vì thế phổ tử ngoại dùng để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ một cách sơ bộ

2.3.4 Phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân

tử chất nghiên cứu dưới sự bắn phá của một chùm ion từ bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác nhau và dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và từ đó dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng và các phương pháp phổ biến vẫn được dùng là:

• Phổ EI – MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm electron bắn phá có năng lượng khác nhau Thông thường là 70eV

• Phổ ESI – MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI – MS Do đó dữ liệu phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

2.3.5 Phổ cộng từ hạt nhân (NMR)

Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance (NMR) là một phương pháp quang phổ dựa trên mức năng lượng của các spin hạt nhân trong các nguyên tử định hướng theo một từ trường của một nam châm vĩnh cửu

Do tương tác của các spin này với một điện từ trường bổ sung, các hạt nhân chuyển lên một mức năng lượng cao hơn Tín hiệu sinh ra do sự thay đổi vị trí

từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức năng lượng thấp hơn được ghi lại và cường độ của tín hiệu tỷ lệ với mức chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái

Đối với hóa học các hợp chất thiên nhiên, hai phổ NMR phổ biến nhất là phổ cộng từ proton 1H-NMR và phổ cộng từ cac-bon 13C-NMR Trong phổ 1H-NMR, hai thông số quan trọng là tích phân và hằng số liên kết Chỉ số tích

phân cho ta biết số lượng tương đối của proton có hằng số liên kết đặc trưng cho sự tương tác của các proton với nhau

Phổ 13C-NMR cho biết thông tin về số lượng nguyên tử cac-bon trong cấu trúc chất, ngoài ra còn phổ DEPT cho biết những vạch tín hiệu nào là

CH3, CH2, CH hay C, từ đó cho phép dự đoán khung cấu trúc của hợp chất nghiên cứu

Khi đo phổ NMR, để có tín hiệu tốt thì mẫu cần được pha loãng trong dung môi ít ảnh hưởng đến tín hiệu của chất Khi đó để đo phổ 1H NMR thì cần dùng dung môi không chứa hydro như CCl4, CS2 hoặc dùng dung môi đã được đơ-tơ-ri hóa (nghĩa là nguyên tử hydro H đã được thay thế bằng đơ-tơ-ri D)

Chương 3 : THỰC NGHIỆM

3.1 Phương pháp tách chiết

Sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu

DC-Sắc kí cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel 240-430 mesh, Merck) hoặc đảo pha (ODS-60-14/63, Fujisilisa-Nhật Bản) 3.2 Các phương pháp phổ

Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT

1200 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.3 Phân lập các chất

Phần trên mặt đất của cây Mần tưới sau khi thu hái về được phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ (3,5g) và ngâm chiết với methanol (101x3 lần) bằng thiết bị siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-500C (3x20 phút) Dịch chiết sau khi được cô đặc bằng máy cất quay với áp suất giảm thu được 300g cặn chiết methanol Cặn chiết này được hòa tan với nước và chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan và ethylaxetat thu được cặn chiết n-hexan (60g) và ethylaxetat (30g) tương ứng Tiến hành sắc kí cột silicagel đối với cặn chiết n-hexan rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-hexan-acetone (100:1 v/v→100% acetone) thu được năm phân đoạn ký hiệu là F1→F5 Tiến hành phân lập

phân đoạn F3 trên sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagel pha thường, hệ dung

môi rửa giải là n-hexan-etyl axetat 4:1 thu được hợp chất 1 (40mg) Hợp chất

2 (7,0 mg) được tách ra từ phân đoạn F5 bằng sắc ký cột silicagel pha thường

rửa giải bằng n-hexan-acetone 2:1 và tinh chế lại trên cột pha đảo RP18 với

hệ dung môi metanol-nước 10:1

Hợp chất 1: 9-angeloyloxy-8,10-dihydroxythymol (1)

Chất dầu không màu

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS của 1 xuất hiện pic [M + Na]+

tại m/z 302.9 cho phép xác định 1 có công thức phân tử là C15H20O5 (M=280)

Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (pp): 6,69 (1H, d, 1,0, H-2); 6,94 (1H, d, 8,5, H-5); 6,64 (1H, dd, 8,5, 1,0, H-6); 2,25 (3H, br s, H-7); 4,49 (1H, d, 11,0, H-9); 4,56 (1H, d, 11,0, H-9); 3,88 (1H, d, 12,0, H-10); 3,83 (1H, d, 12,0, H-10); 6,12 (1H, qq, 1,5, 7,0, H-3’); 1,92 (3H, dq, 1,5, 7,0, H-4’); 1,84 (3H, d, 1,5, H-5’)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (pp): 139.9 (C-1); 118.5(C-2) ; 156.5(C-3); 119.8(C-4); 126.3(C-5); 120.5(C-6); 20.9(C-7); 78.9(C-8); 67.3(C-9); 66.0(C-10); 168.7(C-1’); 140.2(C-2’); 126.9(C-3’); 15.8(C-4’); 20.4(C-5’)

Hợp chất 2: 9-angeloyloxy-10-acetoxy-8-hydroxythymol (2)

Chất dầu không màu

Phổ ESI-MS: m/z 321.1 [M-H]-, công thức phân tử C17H22O6 (M=322)