Góp phần nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Lyess. ex Fr.) Karst.) ở Việt Nam

Cho đến nay, với trên 200 công trình nghiên cứu, các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện ra rất nhiều hoạt chất ở nấm Linh chi, trong đó có những nhóm hoạt chất rất quan trọng như: s

B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

_ *

rĐ à m ^7h i r~Jltíi 'TôcưựỊ,

GÓP PHẦN NGHIÊN cứu

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC• • • 7

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI

(Ganoderma lucidum (Lyess ex Fr.) Karst.) Ở VIỆT NAM

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997- 2002)

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

_ *

Sinh viên (ĩ)àjrvL & h ị ^7liu Tỉỗầntị

GÓP PHẦN NGHIÊN cứu

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC• • • 7 •

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI

(Ganoderma lucidum (Lyess ex Fr.) Karst.) Ở VIỆT NAM

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997- 2002)

Nẹười hướng dẫn: TSKH Trần Văn Thanh

TS Nguyễn Viết Thân

Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu

Thời gian thực hiện: 1/2002 - 5/2002

MỜ3 @ c Á M ơ<n

ọ

cam/ ƠA X

\)&Às Ío íicị ílù lii tao mỊ ọit- ẵcết á^i/ ỏclu aẮo, tôx X/UV ẾlaiỊ to dưi

t o à n (Lôy c á c tli aij côy taojixj Ếtoy m Ạn/ Ccêxi OA cẮ c (La

íium IvKoa (xiaiv I uxiị

3 Ca ƠLô/ú, iv c ị Ả l ^ 2 ỷ 5.2 0 02

Ỗ u i i v OyLẲrv^ aưrvc ĩ í ụ , 3 ỉ i u 3 Ù ™ ,

1.2 Đặc điểm hình thái cơ bản của họ Ganodermataceae Donk 4

1.4 Tác dụng trị liệu cơ bản của nấm Linh chi 10

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của nấm Linh chi trồng ở 14Việt Nam

3 1 1 Nghiên cứu về hình thái bên ngoài 14

3.2.5 Thuỷ phân cắn B (cắn tù' dịch chiết n-butanol) 263.2.6 Sơ bộ xác định số các chất trong sản phẩm thuỷ phân của 26

căn B bằng sắc ký lớp mỏng3.2.7 Phân lập các chất trong sản phẩm lliuỷ phân của cắn 13 28

bằng sắc ký CỘI3.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxy lioá của dịch chiết nấm 29Linh chi

3.3.1 Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp 3 I

Blagodorop3.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan 33

theo phương pháp của Jawiga Robak và Misno Tanaka

i

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

CHCI3 : Cloroíorm

HTCO : Hoạt tính chống oxy hoá

MDA : Malonyl dialdehyd

MeOH : Methanol

POL : Peroxy hoá lipid

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

ĐẶT VÂN ĐỂ

Nấm Linh chi (Ganoderma lucỉdum (Lyess ex Fr.) Karst.) là một loại

dược liệu quý hiếm, được sử dụng từ rất lâu trong y học cổ truyền của các nước Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và một số nước Á Đông khác trong đó

có Việt Nam Linh chi đã được y học cổ truyền Trung Quốc xếp đứng đầu trong nhóm “Thượng dược” với chức năng điều hoà hoạt động chuyển hoá, kéo dài tuổi thọ, tăng khả năng đề kháng của cơ thể đối với những biến động của môi trường xung quanh

Cho đến nay, với trên 200 công trình nghiên cứu, các nhà khoa học trên

thế giới đã phát hiện ra rất nhiều hoạt chất ở nấm Linh chi, trong đó có những nhóm hoạt chất rất quan trọng như: saponin triterpenoid, polysaccharid, steroid, acid amin, nguyên tố hiếm germanium Đây là những nhóm hoạt chất

có vai trò quyết định trong việc điều tri các bệnh về tim mạch, bệnh gan mật, bệnh ung thư, chống oxy hoá và tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể

Chính vì những giá trị quý báu đó mà nhu cầu sử dụng thuốc từ nấm Linh chi trên thế giới nói chung và ở nước ta nói riêng ngày càng tăng

Ở Việt Nam, việc điều tra, khai thác nấm Linh chi hoang dại còn hạn chế, trồng và bào chế nấm Linh chi mới chỉ được phát triển ở quy mô rất nhỏ, sản lượng còn thấp, năng suất chưa cao, đặc biệt hàm lượng hoạt chất chưa được đánh giá chi tiết Bởi vậy, nghiên cứu và khẳng định giá trị dược liệu của nấm Linh chi Việt Nam là rất cần thiết, giúp các nhà dược liệu đẩy mạnh việc điều tra, khai thác, phát triển công nghệ trồng và sản xuất thuốc từ nấm Linh chi của Việt Nam phục vụ tốt hơn nữa việc chăm sóc sức khoẻ nhân dân

Để góp phần vào việc thực hiện mục tiêu chung đó, chúng tôi đã tiến

hành nghiên cứu nấm Linh chi trồng ở Việt Nam vói một số nội dung sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

3 Thử tác dụng chống oxy hoá của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam.

Phần I

TỔNG QUAN

1.1 Vài nét lịch sử về hệ thông học họ Linh chi (Ganodermataceae Donk)

Nấm Linh chi đã được con người sử dụng từ rất lâu song những nghiên cứu về chúng thực sự mới chỉ bắt đầu từ cuối thế kỷ XVIII [8]

Năm 1781, w Curtis mô tả mẫu nấm đầu tiên đặt nền móng cho các nghiên cứu về nấm Linh chi sau này [8, 12, 16]

100 năm sau (1881) nhà nấm học người Phần Lan - Karste đã tách từ họ

Nấm Lỗ Polyporaceae ra một nhóm đặc biệt, xây dựng nên chi mới độc lập là Ganoderma Karst Chi này có cấu trúc bào tử đảm đặc trưng hình trứng cụt, có

lớp vỏ kép, bề mặt sần sùi mụn cóc [12, 13, 16]

Song song với chi Ganoderma Karst., vào năm 1905, Murill lại phát hiện

ra một nhóm nấm Polypore nữa và ông đề nghị xác lập một chi mới nữa độc lập là Amauroderma Murr Các loài của chi này cũng có độ đồng nhất cao trong cấu trúc bào tử đảm tương tự như các loài của chi Ganoderma Karst.,

duy chỉ có lỗ nảy mầm đã tiến hoá rõ rệt, khó nhận ra [12,16]

Sau này, nhà nấm học người Hà Lan - Donk - đã nghiên cứu tỉ mỉ quá

trình phân hoá của hai loài Ganoderma Karst và Amauroderma Murr và thấy

được mối quan hệ chặt chẽ giữa chúng về cấu trúc bào tử đảm Chính vì vậy

đến năm 1948, ông quyết định xây dựng họ Linh chi Ganodermataceae Donk tách ra từ họ nấm Lỗ (Polyporaceae) với hai chi lổn là Ganoderma Karst và Amauroderma Murr [12].

Tuy nhiên, với việc sử dụng kính hiển vi điện tử quét, vào những năm đầu

của thập niên 70, Steyaert đã xác lập thêm 2 chi nữa là Humphreya Stey và

Haddowia Stey làm phong phú thêm hệ thống phân loại của họ Linh chi Hai chi này có cấu trúc vỏ ngoài của bào tử đảm rất đặc biệt so với Ganoderma Karst và Amauroderma Murr Lớp vỏ bào tử của Humphreya Stey kết dày kiểu ô lưới đa tạp, còn ở Haddowia Stey lại có cấu trúc hình quả cam tẽ múi

[12, 16]

Cũng vào những năm đó (1971) Ainsvvorth G c dựa vào đặc điểm hình thái thể quả, cấu trúc bào tử đảm, đã đưa ra hệ thống phân loại một cách hoàn chỉnh Cho đến nay hệ thống phân loại này đã và đang được nhiều nhà khoa

học trên thế giói sử dụng [15] Chính vì vậy, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum (Lyess ex Fr.) Karst.) thuộc chi Linh chi (Ganoderma); Họ Linh chi (Ganodermataceae)', Bộ nấm Lỗ (Aphyllophorales); Lớp nấm đảm Basidiomycetesy, Ngành nấm đảm (Basidiomycotina) và thuộc Giới nấm (Mycetaỉia).

Ở Việt Nam, nấm Linh chi phân bố chủ yếu ở miền Bắc nước ta đặc biệt

là những nơi có rừng Lim xanh [16] Ngoài ra còn có ở một số vùng của miền Nam Các mẫu đều được sưu tầm từ tháng 3 đến tháng 12 ở miền Bắc và vào mùa mưa ở miền Nam Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước như Trần Văn Mão, Trịnh Tam Kiệt, Đàm Nhận, Phạm Quang Thu, Lê Xuân Thám đã phát hiện được trên 40 loài Linh chi ở lãnh thổ nước ta trong

đó chiếm ưu thế và thường gặp nhất là nấm Linh chi (Ganoderma lucidum

(Lyess ex Fr.) Karst.)

1.2 Đặc điểm hình thái cơ bản của họ Ganodermataceae Donk

Nấm Linh chi là một loài thực vật bậc thấp thuộc ngành Nấm

(Basidiomycotina) nên có đặc điểm chung của ngành là được cấu tạo bởi các

tế bào có nhân thật không có diệp lục, nhận thức ăn từ môi trường bên ngoài bằng cách hấp thu (sống dị dưỡng) [1] Ngoài ra còn có các đặc điểm riêng:

+ Sợi nấm gồm nhiều đoạn ngăn cách với nhau bởi các vách ngang Mỗi đoạn được coi như một tế bào có một hay nhiều nhân Trên các vách ngang

đó có lề nhỏ, từ đó chất nguyên sinh và cả nhân có thể đi qua [11]

+ Cuống thể quả biến dị lớn: Các loại đa niên thường không cuống còn các loài có cuống thì rất phong phú: Từ loài có cuống rất ngắn (0,5 cm), rất mảnh (0,2 cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài (20-25 cm), to và mập (đường kính có thể tói 3,3 cm) [11, 13] Cuống nấm có thể phân nhánh hoặc không, màu sắc thay đổi khác nhau tuỳ từng loài Cuống thường đính bên, đôi khi đính gần tâm do quá trình liên tán mà thành [14]

+ Mũ nấm: Dạng thận, gần tròn đôi khi xoè thành hình quạt hoặc ít nhiều

dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc

từ vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - đỏ tím - nâu đen, nhẵn, bóng, láng như vecni, sẫm màu dần khi già Lớp vỏ láng phủ suốt trên mặt mũ và chạy dài theo cuống nấm Kích thước tán biến động từ 2-30 cm, dày 0,8-2,5 cm tuỳ từng loài Phần đính với cuống hoặc gồ lên hoặc lõm xuống [7, 10,12,14, 16]

+ Thịt nấm dày từ 0,4-1,8 cm màu vàng kem - nâu nhạt - trắng Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc, cứng và nhẹ Hệ sợi có đầu tận cùng phình hình chuỳ, màng rất dày, đan kết vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt

mũ [12, 16]

+ Bào tầng là một lớp ống dày từ 0,2-1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng - vàng ánh xanh [8, 12]

+ Đảm đơn bào mang 4 bào tử đảm hình trứng - trứng cụt [16]

+ Bào tử đảm có cấu trúc vỏ kép, màu vàng mật ong sáng, ở giữa tụ dạng giọt dầu, kích thước (5-6) X (8,5-12) I^m v ỏ bào tử khá dày cỡ 0,7-1,2 |dm, có cấu trúc phức tạp: Màng ngoài trong suốt, màng trong sần sùi mụn cóc, gai nhọn - gò trống [5, 12, 15, 22] Đặc biệt, dù hình thái bên ngoài của nấm biến

đổi rất đa dạng, song về cấu tạo của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù

là chủng nuôi trồng ở Nhật Bản, Trung Quốc hay chủng Lim Hà Bắc, Đà Lạt

[10, 11, 12].

Các bào tử đảm đơn bào, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo ra hệ sợi

sơ cấp rồi qua một loạt sự phát triển tạo tán nấm Tán nấm hình thành bào tầng rồi lại phát tán bào tử đảm tạo thành chu trình sống của nấm Linh chi [5,

7, 11] Chu trình sống này tương tự như chu trình sống của những nấm đảm khác [12, 18]

Nấm Linh chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ Đậu Fabales) sống hay đã chết Thể quả gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11), có thể mọc trên thân cây, quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây, thích hợp với

Hình 1 : Chu trình sống của nấm Linh chi

bóng rợp, ánh sáng khuyếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà Nên ở các vùng núi đồi cao trên 1000 m so với mực nước biển, thường có các chủng thích hợp nhiệt

độ thấp từ 21- 26° như các vùng Đà Lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên ở nước ta

[12]

1.3 Thành phần hoá học của nấm Linh chi

Trong khi ở Tây Âu, các nhà khoa học hầu như chỉ đi sâu vào nghiên cứu

hệ thống học, điều tra cơ bản và các đặc điểm sinh học của các nấm Linh chithì ở các nước châu Á, các nhà khoa học lại dẫn đầu về nghiên cứu thành phần hoá học, trồng và bào chế các loại thuốc từ nấm Linh chi Thực tế một số tác giả đã quan tâm phân tích thành phần cấu tạo lớp vỏ láng ở các loài

Ganoderma và Amauroderma vào những năm cuối của thập niên 20 đã phát hiện các ergosterol và các enzym phenoloxydase, peroxydase ở G lucidum

(Krebs G., 1911; Subramanian s., 1961) [12]

Đặc biệt, trong khoảng 20 năm gần đây, nhiều cơ sở nghiên cứu của một

số nước đã xác định thành phần và cấu trúc hoá học của nấm Linh chi và thu được một số kết quả sau:

- Về định tính: Trong thể quả của nấm Linh chi có polysacarid, acid amin, họp chất steroid, saponin, protein, alcaloid, dầu béo [5] Ngoài ra còn

có thành phần / ỉavonoid, song theo những tài liệu chúng tôi tham khảo được thì flavonuid trong nấm Linh chi còn chưa được nghiên cứu nhiều.

- Về định lượng tổng quát, nấm Linh chi có chứa các chất sau [4]: Lignin

13 - 14%, hợp chất có nitơ 1,6 - 2, 1%, chất béo (kể cả dạng xà phòng hoá) 1,9

- 2%, hợp chất phenol 0,08 - 0,1% (có thể tới 0,4% trong cao), hợp chất sterol toàn phần 0,14 - 0,16% (có thể có tới 0,52 trong cao), saponỉn toàn phần 0,3 - 1,23%, hàm lượng ergosterol 0,3 - 0,4%, chất khử 4 - 5 %, xeỉlulose 54 -56%,

nước 12 - 13% (trong cao mềm của Việt Nam thì tới 22,32%) Ngoài ra theo

những công trình nghiên cứu mới nhất của các nhà khoa học Trung Quốc, nấm

Linh chi có chứa hàm lượng germanium cao hơn hàm lượng germanium trong

Nhân sâm từ 5 đến 8 lần [5]

Cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật và bằng các phương pháp hiện đại: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), sắc ký khí - Khối phổ liên hợp (GS - MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (đánh dấu với H3 và c 13)

(NMR) và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP) từ những năm 1980 đến nay, người ta đã xác định chính xác rất nhiều thành phần hoá học trong nấm Linh chi [12] Có thể khái quát trong bảng sau:

B ảng 1: Thành phần hoá học nấm Linh chi

Ganosporelacton A, B Triterpenoid

Điều đáng lun ý là các nhóm hoạt chất chính này gặp khá phổ biến ở các loài Ganodema Karst và ở cả các loài Amauroderma Murr như luận điểm về tính thống nhất của họ Ganodermataceae Donk về phương diện hoá sinh học

(Lê Xuân Thám, Đàm Nhận, 1994) [11] Đáng lưu ý nữa là các nhóm hoạt chất này cũng gặp phổ biến trong cấu trúc (màng bào tử, bào tử đảm, hệ sợi) của nấm tự nhiên và nuôi trồng

Trong số các nhóm hoạt chất đó, nhóm có bản chất Proteỉn nổi bật nhất

là Lin%zhi - 8 do các nhà khoa học Nhật Bản (Kino K.et al.19'89 - 1991) tìm ra

đã được chứng minh là một tác nhân chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch rất hữu hiệu [12]

Nhóm Nucleosid có các dẫn xuất của Adenosin vói tác dụng thư giãn cơ,

giảm đau và ức chế sự kết dính tiểu cầu [12, 16]

Nhóm Aỉcaloid có hàm lượng rất đáng kể trong thể quả của G.lucidum Alcaloid và Glucosid' 1,82 - 3,06% [16].

Nhóm Steroid rất phong phú ở nấm Linh chi với tác dụng chủ đạo ức chế sinh tổng hợp cholesterol Đặc biệt từ bào tử đảm ngoài 2 lacton A và B còn 5

sterol đã được xác định chính xác công thức phân tử [12]

Nhóm Polysaccharid cũng rất phong phú ở nấm Linh chi và có hoạt tính

cao Tăng tính miễn dịch, hạ đường huyết.[12]

Bên cạnh đó, các tài liệu tham khảo cho thấy nhiều acid béo tạo nên thành tố chính của nấm Linh chi đã được định danh Những acid này có đặc tính bảo vệ hồng cầu và ngừa được ung loét [3]

Đa dạng nhất và tác dụng dược lý mạnh là nhóm Saponine - trierpenoid

Trong nhóm này, người ta đã chứng minh được tác dụng giảm đau đến 37,9% trên chuột thực nghiệm của các acid ganoderic A, B, c và H [23] Mặt khác,

các kết quả nghiên cứu cho thấy từng Trierpenoỉd tinh khiết riêng rẽ thể hiện

hoạt lực thấp hơn khi dùng các phân đoạn tách chưa tinh chế, nghĩa là tổ hợp các đồng phân của chúng có hiệu quả hơn Do vậy, ngưòi ta thường dùng dịch chiết toàn phần từ nấm Linh chi [6, 24].

1.4 Tác dụng trị liệu cơ bản của nấm Linh chi

Theo kinh nghiệm truyền thống của người phương Đông, các tác dụng chi tiết, cụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng sau đây : Kiện não, bảo can, cường tâm, kiện vị, giải cảm, trường sinh [16]

Năm 1988, tại Nhật Bản đã có 300 bệnh nhân bị nhược cơ được điều trị thành công bằng dịch chiết từ nấm Linh chi trên nguyên tắc điều hoà miễn dịch [12, 16]

- Đối với bệnh về hệ tim mạch: Kết quả thông báo mói đây của Wangchi

và cộng sự năm 1994 có trên 35 bệnh nhân bị bệnh mạch vành tỏ ra triển vọng với tỷ lệ tiến triển tốt trên 85,7% Hàng loạt các hoạt chất của nấm Linh chi đã

chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol Thực nghiệm ở Việt Nam trên chuột cho thấy hiệu quả giảm tói 50% lượng cholesterol khi áp dụng

liều lượng 0,4g dược liệu trên một kilôgam thể trọng trong 30 ngày (Bùi Chí Hiếu và cộng sự năm 1993)

Hiệu quả kìm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu bởi dịch chiết nước của nấm Linh chi được chứng minh rõ bằng invitro bởi nhiều công trình nghiên cứu Đến năm 1990 lại được một số các nhà khoa học Nhật Bản thử nghiêm với 33 bệnh nhân xơ cứng động mạch và cho kết quả khả quan.[12, 13,16]

- Đối với bệnh đái tháo đường ở người có tuổi, nấm Linh chi giúp ổn

định đường huyết Đây là một hướng nghiên cứu rất cần được phát triển đặc biệt khi tỷ lệ bệnh tiểu đường so với các bệnh khác ngày càng tăng cao trong những thập niên trở lại đây [16]

- Bệnh gan và tiết niệu cũng được điều trị bằng chế phẩm từ nấm Linh chi[16].

- Đối với bệnh về hô hấp: Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt trong điều trị viêm phế quản dị ứng cho gần 80% các trường hợp [7, 16] Ngoài ra, dịch chiết nước của nấm Linh chi còn được chứng minh làm giảm mệt mỏi trong điều kiện thiếu oxy [25]

- Về khả năng chống oxy hoá của nấm Linh chi, ngay từ thập niên 80, ở Trung Quốc các nhà khoa học đã chứng minh khả năng khử gốc tự do của

hydroxyl với đặc tính antioxydant, chống lão hoá của G lucidum [4] ở Việt

Nam, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường và cộng sự - Trường Đại học Dược Hà Nội đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng nấm Linh chi có chứa các hoạt chất chống oxy hoá, chúng có khả năng ức chế quá trình oxy hoá ở chuột khi gây stress ở nhiệt độ cao, đã làm giảm 25,5% lượng MDA ở não chuột (P < 0,01) Đây chính là cơ sở để khẳng định giá trị của nấm Linh chi - vị thuốc trường sinh đối với bệnh của người già và kéo dài tuổi thọ [21]

Hiệu quả chống ưng thư của nấm Linh chi đã được chứng minh từ lâu, với các bệnh nhân ưng thư phổi, ưng thư vú và ưng thư dạ dày được điều trị bằng các phương pháp xạ trị, hoá trị và giải phẫu được kết hợp với trị liệu nấm Những bệnh nhân này thòi gian sống kéo dài, tỷ lệ người sống trên 5 năm cao hơn nhóm không sử dụng nấm Hiệu quả chống ưng thư cũng thể hiện rõ với các tế bào ưng thư khoang miệng, ưng thư gan, đặc biệt kết hợp với taxol từ cây Thông đỏ [16]

Phần II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên liệu

- Nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst trồng ở Đà Lạt.

- Nấm Linh chi hoang dại thu hái được ở miền Bắc Việt Nam.

- Nấm Linh chi Trung Quốc và Hàn Quốc mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

* Quan sát mô tả hình thái nấm Linh chi nuôi trồng, so sánh với hình thái của nấm Linh chi hoang dại, nấm Linh chi Trung Quốc, Hàn Quốc theo phương pháp ghi trong tài liệu Thực tập Thực vật [20] và Thực tập Dược liệu[19]

* Quan sát và so sánh cấu tạo bào tử đảm của các mẫu nấm trên kính hiển vi

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Lỉnh chi trồng ở Việt Nam

* Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hoá học theo phương pháp của các tài liệu [2], [4], [19]

* Xây dựng sơ đồ chiết xuất các hợp chất theo phương pháp của các tài liệu [2], [4], [19]

* Phân lập một số chất trong thành phần hoá học của nấm Linh chi trồng

ở Việt Nam bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là Silicagen sắc ký cột, kích thước hạt từ 60 - 200 |Lim của hãng Mecrk

* Phổ tử ngoại đo trên máy VARIAN 1E - CARY và phổ hồng ngoại đo trên máy FT - IR NEXUS 870 tại phòng Phân tích tiêu chuẩn - Viện Dược liệu.

2.2.3 Thử tác dụng chông oxy hoá của dịch chiết nấm Linh chi

a Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp Blagodorop

* Nguyên tắc của phương pháp:

Tiến hành peroxy hoá acid béo chưa no (Tween 80) ở một nhiệt độ nhất

định Sau một khoảng thời gian, phản ứng tạo ra MDA (Malonyl dialdehyd) MDA phản ứng với acid Thiobacbituric tạo ra hợp chất trimethin màu hồng

Đo cường độ màu của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng X = 532 nm Hoạt

độ chống oxy hoá được tính bằng phần trăm (%) MDA bị ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng (coi HTCO của mẫu đối chứng bằng không)

b Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan của dịch chiết toàn phần nấm Linh chi theo phương pháp của Jawiga Robak và Misno Tanaka (tại phòng Đông y thực nghiêm - Viện Y học cổ truyền).

* Nguyên tắc của phương pháp:

Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của chất thử (dịch chiết nước toàn phần của nấm Linh chi) bằng khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid (POL) trên cơ chất (gan chuột) khi so sánh với quá trình POL không có mặt chất thử ở cùng điều kiện Thực hiện phản ứng POL trên dung dịch đồng thể

gan chuột ở những nồng độ khác nhau của chất thử Định lượng MDA tạo

thành trên nguyên tắc cho MDA phản ứng với acid Thiobarbituric tạo hợp chất Trimethin màu hồng, đo cường độ màu của dung dịch sau phản ứng ở bước

sóng X = 532 nm Hoạt độ chống oxy hoá được tính bằng phần trăm (%) MDA

bị ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng (coi HTCO của mẫu đối chứng bằng không)

Phần III

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam

3.1.1 Nghiên cứu về hình thái bên ngoài:

* Khi quan sát về hình thái bên ngoài của nấm Linh chi nuôi trồng ở Việt

Nam cho thấy một số đặc điểm sau:

- Thể quả có cuống

- Mũ nấm:

+ Màu nâu đỏ, láng bóng như vécni

+ Khi còn non có dạng u lồi, hơi tròn, sau này phát triển thành dạng thận hay hình quạt, kích thước mũ nấm dao động từ 6 đến 1 lcm

+ Trên mặt mũ nấm có những vân vòng đồng tâm ít lượn sóng và có tia rãnh phóng xạ xuất phát từ tâm

+ Mép mũ nấm gợn sóng và hơi cong về phía trong

+ Mũ nấm dày nhất ở phần sát vói cuống và mỏng dần về phía mép,

trung bình từ 0,6 cm đến 1,3 cm Mặt dưới của mũ nấm có màu trắng vàng

- Cuống nấm:

+ Dài từ 6 đến 10 cm, hình trụ hoi dẹt, đường kính từ 1,5 cm đến 2,0 cm + Cuống đính bên và thường đính vào phần lõm của mũ nấm

+ Cuống có màu nâu đỏ, láng và đậm hơn màu của mũ nấm

+ Cuống có thể phân thành 2 hoặc 3 nhánh tuỳ thuộc vào số lượng mũ nấm

* Cắt dọc mũ nấm quan sát thấy:

- Thịt nấm: Màu vàng kem, dày từ 0,2 cm đến 0,6 cm gồm rất nhiều sợi nấm đan kết vào nhau tạo thành màng dầy, đai và nhẹ (ảnh 4).

- Bào tầng: Màu nâu nhạt, dày từ 0,4 cm đến 1,0 cm, cấu tạo bởi các ống nhỏ, hình trụ xếp khít nhau tạo thành một khối vững chắc Có khoảng 4 đến 5 ống trên lm m 2 bề rộng bào tầng (ảnh 4)

3.1.2 Quan sát bào tử đảm:

* Quan sát bào tử đảm của nấm dưới kính hiển vi thu được kết quả sau

- Bào tử đảm màu nâu sẫm, hình trứng, lõm một đầu, ở giữa có dạng giọt dầu lớn

- Bào tử đảm được cấu tạo bởi hai lớp màng: Lớp màng ngoài trong suốt không màu; Lớp màng trong mầu sẫm, gồ ghề có các ụ nhỏ nổi sát ra màng ngoài (ảnh 5a)

3.1.3 So sánh với nấm Linh chi hoang dại, Trung Quốc, Hàn Quốc:

* Khi so sánh hình thái bên ngoài và cấu tạo bào tử của nấm Linh chi nuôi trồng ở Việt Nam với nấm Linh chi hoang dại, Trung Quốc, Hàn Quốc, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 2

Bảng 2: So sánh hình thái bên ngoài và cấu tạo bào tử đảm của nấm Linh chi

nuôi trồnẹ ở Việt Nam với nấm Linh chi hoang dại, Hàn Quốc, Trung Quốc

Đặc điểm Linh chi trồng

ở Việt Nam

Linh chi

VN hoang dại

Linh chỉ Trung Quốc

Linh chi Hàn Quốc

Hầu như tròn hay dạng thận

15 - 25cm

Dày 1,8 -2,5cm

- Màu sắc Nâu đỏ

Mặt dưới vàng kem

Nâu đenMặt dưới trắng đục

Nâu đỏMặt dưới vàng

Vàng nâuMặt dưới vàng lưu huỳnh

Mũ nấm có vòng đổng tâm

Đính bên, không phân nhánh, hình trụ tròn

Đính bên,hình trụ tròn hay hơi dẹt

Đính bên, đôi khi đính tâm, hình trụ tròn

* Bào tử đảm

- Hình dạng Hình trứng Hình trứng Hình trứng Hình trứng

- Đặc điểm 2 lớp màng, màng ngoài không màu, màng trong dẩy,màu nâu sẫm,

ở giữa có hình giọt dầu

Nhân xéli

Dựa vào bảng phân tích như trên, chúng tôi thấy rằng về hình thái bên ngoài các loại nấm trên có một số điểm khác nhau (hình thái thể quả (ảnh 1,2 ,3), cuống nấm (ảnh 1,2)), nhưng về cấu tạo bào tử đảm thì không có sự khác biệt rõ rệt (ảnh 5)

Ảnh 1: Nấm Linh chi trồng ở Việt Nam

Ảnh 3: Nấm Linh chi nhập nội (a), (b) Linh ,

chi Trung Quốc; (c), (d) Linh chi Hàn Quốc Anh Các lát cắt nấm Linh chi

Ảnh 2: Nấm Linh chi hoang dại

0 ,0 I m m

Ảnh 5: Bào tử đảm nấm Linh chi

(a) Bào tử đảm nấm Linh chi trổng ở Việt Nam; (b) Bào tử đảm nấm Linh chi